Extraccion de DNA

PRACTICA 1: EXTRACCIN DE ADN Y VISUALIZACIN DEL ADN
a
Jacobo Prez, bMaria Cecilia Morcillo, cSebastian Vasquez
a
jacoperez11@hotmail.com, bmmariace@gmail.com,
c
vasquezsebastian049@gmail.com
Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales, Programa de Qumica,
Laboratorio de Bioqumica
Santiago de Cali, Colombia
Enero 27 de 2017-1
RESULTADOS. Una protena se puede purificar

sometiendo la mezcla impura del
Se depositan en una probeta material de partida a una serie de
aproximadamente 5mL de saliva de separaciones basadas en las
los cuales se toman propiedades fsicas como el tamao y
aproximadamente 2,5mL y se la carga (Stryer, Berg, & Tymoczko,
depositan en un tubo Falcn. Se 2016). Cada uno de estos agentes
adicionan 2,5mL de solucin SDS al tiene una funcin especial a la hora
10% y se agita. Posteriormente se de reaccionar con la muestra y son
adicionan 50L de solucin de NaCl los responsables de poder llevar a
5M y se agita nuevamente. Luego de cabo este tipo de experimentacin.
esto se agregan 10mL de etanol frio Se debe fraccionar la clula en sus
para retirar las sales del compuesto y componentes y precisar qu
terminar su precipitacin. componente est enriquecido en la
Despus de realizar el procedimiento protena de inters. Las protenas se
previamente enunciado se observa la pueden purificar de acuerdo a su
aparicin de un precipitado turbio solubilidad, tamao, carga y afinidad.
color blanco que queda suspendido (Stryer, Berg, & Tymoczko, 2016)
en medio de la solucin. En la adicin de SDS se logra
Usando una micropipeta se toman comenzar el proceso de lisis celular
5L de DNA con 10L de SYBR y se obligada debido a su carcter
lleva esto al espectrofotmetro y se detergente; este proceso rompe la
esperan los resultados. En este caso estructura tridimensional de las
en ambas longitudes (240-260) los macromolculas como las protenas o
resultados fueron mayores a dos por los cidos nucleicos y se consigue su
lo que se procedi a realizar una desnaturalizacin (Brinboim, 1979).
dilucin. Posterior a la realizacin de La posterior adicin de NaCl (cloruro
la dilucin los resultados no de sodio) a la solucin incentiv el
cambiaron significativamente por lo proceso de purificacin del DNA. El
que se dio por terminada la prctica. NaCl logra tornar insoluble la mezcla,
porque el sodio neutraliza la carga
ANLISIS DE RESULTADOS negativa de los grupos fosfatos
(Ornstein, 1964).
A lo largo de la prctica se emplearon Luego se utiliz el alcohol para seguir
varios agentes qumicos con el fin de con la purificacin del DNA. El DNA
purificar y homogeneizar una muestra es insoluble en alcohol, por lo que se
de DNA y posteriormente analizarla. puede precipitar en una solucin de
etanol fro y recuperar haya quedado homognea,
posteriormente. El alcohol del dificultando el paso de la luz y
sobrenadante se lleva las sales explicando los valores tan elevados
aadidas previamente. Esto permite de absorbancia.
empezar a evidenciar pequeas La tcnica de espectrofotometra se
hebras de ADN que luego se rige bajo la ley de Lambert-Beer. Esta
utilizaron para la tincin con SYBR propone que la absorbancia de una
(Davis, 1964). Es importante tener en muestra a determinada longitud de
cuenta que cada reactivo se debe onda depende de la cantidad de
aadir completamente a la solucin, especie absorbente con la que se
sin ello es posible que la solucin no encuentre la luz al pasar por la
precipite completamente. muestra. Es decir, la absorbancia
La adicin de SYBR Green hace que depende de la concentracin de la
la sustancia se intercale entre las muestra y de la longitud de la
bases aromticas nitrogenadas a lo trayectoria de la luz a travs de la
largo de las cadenas de DNA. Al ser muestra. La ley de Lambert-Beer se
una sustancia fluorescente, el SYBR define como:
logra la tincin del DNA y finalmente
la visualizacin de este bajo luz UV. Donde:
Se tiene que recordar que entre ms absorbancia de la muestra
cantidad de DNA se haya logrado
precipitar en el paso anterior, ms
Intensidad de la radiacin
DNA se va a lograr evidenciar en la
que entra en la muestra.
tincin.
Intensidad de la radiacin
Con base a los resultados obtenidos
que sale de la muestra.
en la prctica se pueden empezar a
analizar las razones por las cuales los Concentracin de la
muestra en moles/litro.
resultados no fueron los esperados.
Por ejemplo, se puede llegar a Longitud de la trayectoria
considerar que el instrumento de la luz a travs de la
utilizado no es lo suficientemente muestra, centmetros.
sensible para el caso, se debe absortividad molar,
recalcar que el instrumento apropiado litros/(mol*cm)
para realizar la prueba es un (Yurkanis Bruice, 2008)
nanodrop, el cual trabaja con
CONCLUSIONES
muestras extremadamente pequeas,
como 1L, mientras que el La calidad de la determinacin
instrumento usado fue un de un compuesto depende de
espectrofotmetro. Por otro lado, la las condiciones en que este
muestra pudo haber estado tenga y loa forma en la que
contaminada con carbohidratos, este se trate.
protenas y con las sustancias Un factor relevante en la
qumicas usadas para su determinacin de compuestos
precipitacin lo cual pudo causar es que el instrumento que se
resultados tan altos sin importar que use sea el ms adecuado para
se realizara una dilucin. Lo ms el proceso que se llevara a
seguro es que la muestra nunca
cabo y que su sensibilidad y
calibracin sean las mejores.
Los resultados obtenidos
dependen casi por completo
de los mtodos y los
elementos que se empleen
para llegar a ellos.
Bajo condiciones no tan
buenas, como fue el caso de la
prctica, los resultados pueden
salirse bastante de los rangos
esperados, con lo que se
llegan a considerar
infructuosos.
REFERENCIAS
- Ornstein L (diciembre de 1964). DISC

ELECTROPHORESIS. I. BACKGROUND
AND THEORY.. Ann N Y Acad Sci. 121:
321-349.
- Davis BJ (diciembre de 1964). Disc
Electrophoresis. 2, Method and
application to human serum
proteins. Ann. New York Acad. Sci 121:
404-427.
- Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid
alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid DNA.
Nucleic Acids Research 7: 1513-1523.
Artculo original que describe el mtodo
de lisis alcalina.
- Stryer, L., Berg, J. M., & Tymoczko,
J.L.(2016). BIOQUMICA CON
APLICACIONES CLNICAS Volumen I
(Sptima ed). Barcelona - Espaa:
Editorial Revert.
- Yurkanis Bruice, P. (2008). QUMICA
ORGNICA (Qunta edic). Mexico D.F.:
Pearson Educacin.

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