Informe Nanodrop

INFORME DE PRÁCTICA
LABORATORIO TALLER SIMULACIÓN CAMPO
NOMBRES: Gutierrez Sebastián -Darwin Llumigusín –-María Isabel Sánchez
CARRERA: Ingeniería Bioquímica
ASIGNATURA: Ingenieria Genética

NIVEL: 8 PARALELO: A
ÁREA ACADÉMICA: Profesional DOCENTE: Ing. Yunis Pérez

CICLO ACADÉMICO: Marzo – septiembre 2017
PRÁCTICA N: 3
TEMA: “MEDICIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ADN EN NANODROP”
I. OBJETIVOS:
1.1 OBJETIVO GENERAL
Cuantificar la concentración de una muestra de DNA genómico obtenidas con el mini kit
Invitrogen, mediante el uso del Nanodrop.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Comparar los resultados de las diferentes muestras de DNA genómico en estudio.
Identificar las muestras de DNA que sean puras en relación a los radios 260/280nm.
II. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
(Ver página siguiente)

Figura 1. Radio 260/280nm para primer grupo
Figura2. Radio 260/280 para segundo grupo

Figura3. Radio 260/280 para tercer grupo
Se trabajó con tres muestras distintas de DNA extraído de células de la mucosa bucal,
purificado en una práctica anterior ayudándose del uso de un kit para obtención de DNA
Invitrogen.
Las muestras se mantuvieron en congelación a -4°C hasta ser usadas, se descongelaron a

temperatura ambiente e inmediatamente se tomó una gota (aproximadamente 1uL) por
cada una y se colocó dentro del equipo Nanodrop.
El instrumento de análisis Nanodrop, se vale del radio 260/280 como una medida para
cuantificar la pureza de mezclas de DNA.
Basado en teoría espectrofotométrica, los ácidos nucleicos debido a su composición y

geometría de sus moléculas absorben luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nm.
En su parte, las proteínas, dadas las diferentes características de sus residuos de
aminoácidos absorben luz ultravioleta a una longitud de onda de 280 nm. (Gorog. S.
1995)
La muestra es analizada a ambas longitudes de onda y la absorbancia es entonces

cuantificada a cada una de estas.
De este concepto se deduce que si la absorbancia medida a 260 nm es mucho mayor a

aquella medida a 280 nm, en cociente 260/280 incrementará, mientras que si la
absorbancia medida a 280 nm es mayor que aquella medida a 260 nm, en cociente
disminuirá. La muestra se considera pura si el cociente presenta valores entre 1.8 a 2.
(Nemcova. I. 1996)
En el primer caso, existirá un mayor contenido de DNA y por lo tanto menor contenido de
proteínas, en el segundo caso, habrá menor contenido de proteínas y mayor contenido de
DNA.
De las tres muestras analizadas, dos se encuentran dentro del rango óptimo de pureza de
la muestra, el grupo 1 y 2 con valores de cociente de 1.94 y 1.83 respectivamente, el grupo
3 sin embargo, presento un valor de cociente menor al límite mínimo, de 1.77. Esto indica
que la muestra posee una cantidad alta de proteínas o una cantidad muy baja de DNA.
Adicional al radio ya mencionado, el Nanodrop también ofrece la concentración de DNA en

µg/µl, se observa que el valor alcanzado para el grupo 3, cuyo radio no fue superior al
mínimo tolerado fue de 0,1µg/µl, en comparación con los valores de 0,3177 y 0,4455 para
los grupos 1 y 2 respectivamente, lo que sugiere que el valor bajo del cociente presente no
fue por una cantidad excesiva de proteína sino por un cantidad baja de DNA en muestra, es
decir, errores procedimentales al momento de la extracción con el kit.
Se observa además que aparte del radio 260/280, el Nanodrop también ofrece como
resultado el radio 260/230, utilizado para cuantificar la contaminación con solventes
orgánicos, los cuales en su mayoría absorben luz ultravioleta a 230 nm. (Sharma. K. 1985)
Para que una muestra se considere libre de solventes orgánicos, debe presentar valores de
cociente entre 2 a 2.2. (Asami. A. 2015)
Ya que el cociente es de la forma 260/230, y los valores alcanzados por los grupos 1 y 2
fueron de 1.3 y 1.61 respectivamente, esto es un indicio de que la concentración de DNA
en muestra fue relativamente menor a la concentración alcanzada por solventes orgánicos,
por lo que una fuerte presencia de estos se constata, a diferencia del grupo 3, cuyo valor de
radio fue muy grande, lo que sugiere que la concentración relativa de DNA en muestra fue
mucho mayor a la concentración de solventes orgánicos alcanzada en esta, por lo que una
contaminación por parte de estos se descarta.
III. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

- Se cuantificó la concentración de DNA genómico de tres muestras en ug/uL, los
cuales expresan valores de 0,4455 como mayor para el grupo 2 y 0,3177 para el
grupo 3, esta concentración da indicio de la cantidad de ácidos nucleicos presentes
en el experimento, los cuales son aceptables y afirman que la extracción realizada
por el mini kit Invitrogen fue la adecuada.
- Se comparó los resultados obtenidos en el cociente 260/280nm, los cuales
expresan la pureza del DNA presente en el análisis del experimento, un resultado
favorable está en un rango de 1,80 – 2,00, los cuales dos de las muestras están en
ese rango. Para el cociente 230/280 nm, se expresa la cantidad de ácidos orgánicos
presentes en las muestras y deben estar en el mismo rango, siendo la muestra que
no está pura en el análisis del 260/280, la que contenga mayor presencia de ácidos
orgánicos, ya que esta por fuera del rango debido a que tiene 3,09, la muestra del
grupo 3.
- Se identificó mediante el cociente de 260/280 la pureza de DNA, siendo la muestra
1 y 2 las que están en el rango de 1,8 – 2,0, esto debido a una buena extracción de
DNA previa con el mini Kit, corroborando así de manera cuantitativa la pureza de
dicho DNA.
Recomendaciones:
- Realizar pruebas posteriores para identificación de los compuestos que hayan

contaminado el DNA genómico y ver si se puede remediar el error
- Descongelar las muestras de DNA con mucha precaución, ya que este se puede
degradar por un cambio brusco de temperatura.
- Tomar una cantidad relativamente necesaria para la cuantificación en el
Nanodrop, ya que se necesita de más DNA genómico para pruebas posteriores
como una PCR.
CUESTIONARIO
Indique otra manera de cuantificar la concentración de ADN.
 Cuantificación por Hibridación con una sonda

Este tipo de técnica se puede obtener en diferentes presentaciones según la casa comercial
y el objetivo que se persigue. Lz cuantificación por Slot blot más conocida en el mercado es
el Quantiblot. La cuantificación por Slot blot es tal vez el método más utilizado en el
ámbito forense. Su objetivo es el medir la cantidad de “ADN humano”, por comparación
con un patrón. La técnica consiste en la hibridación de una sonda específica de 40 pb
(pares de bases) complementaria a la secuencia D17Z1, localizada en el cromosoma 17.
Este ensayo requiere de varias horas, pero es muy certero ya que puede detectar ADN
humano de cadena simple y doble. Además permite la cuantificación de varias muestras al
mismo tiempo.
Figura 4. Membrana de cuantificación (Quantiblot)
(Sibaja,2002)
 ¿Qué indican los valores de pureza mayores y menores al rango óptimo (1,8 –
2)?
Cualquier valor considerablemente por debajo de lo establecido es indic io de
contaminación por proteínas o carbohidratos; mientras que en el caso contrario
valores mayores indican contaminación por ARN .
(Saltos,2012)
 ¿Qué indica la relación entre la absorbancia a 260nm / 230 nm?
El valor de la lectura a 230nm que es la longitud de onda mínima, está influenciada por la
cantidad de sales presentes en la muestra en relación a los 260 nm de absorbancia de los
ácido nucleicos.
(Acosta,2013)
IV. BIBLIOGRAFÍA:
Acosta,S. (2013). Biomasa: extracción y cuantificación de ácidos

desoxirribonucleicos(adn). Recuperado 20 de Junio del 2017 de:
http://www.uprm.edu
Asami. A. 1015. Spectrophotometry. Quantification of Nucleic Acids. Recueprado de:

http://hpc.ilri.cgiar.org/beca/training/IMBB_2015/lectures/Spectrophotometry
_IMBB_2015.pdf
Gorog. S. 1995. Ultraviolet-Visible Spectrophotometry in Pharmaceutical Analysis.

Universidad de Michigan. Editorial Illustrated. 2da Edicion. Recuperado de:
https://books.google.com.ec/books/about/Ultraviolet_Visible_Spectrophotometr
y_in.html?id=ugRtAAAAMAAJ&redir_esc=y
Saltos , N .(2012). Extracción de ADN genómico y amplificación de la región ITS por PCR en
el ascomicete marino. Recuperado 20 de Junio del 2017 de:
http://repositorio.urg.edu.ec
Sibaja,C.(2002). Comparación de Tres Métodos de Extracción de ADN de Restos Óseos.

Recuperado 20 de Junio del 2017 de:
http://bibliodigital.tec.ac.cr/bitstream/handle/2238/31/BJFIB200227.pdf?sequ
ence=1&isAllowed=y
Sharma. K. 1985. Spectroscopy. Editorial Prakashan Media. 3ra Edición. Recuperado de:
https://books.google.com.ec/books/about/Spectroscopy.html?id=qYEw-
OKqNCwC&redir_esc=y
Nemcova. I. 1996. Spectrophotometric Reactions. Editorial Illustrated. 3ra Edición.

Recuperado de:
https://books.google.com.ec/books/about/Spectrophotometric_Reactions.html?i
d=FHsV2la0vzQC&redir_esc=y

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NOMBRES: Gutierrez Sebastián -Darwin Llumigusín –-María Isabel Sánchez

CARRERA: Ingeniería Bioquímica

ASIGNATURA: Ingenieria Genética

ÁREA ACADÉMICA: Profesional DOCENTE: Ing. Yunis Pérez

TEMA: “MEDICIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ADN EN NANODROP”

1.1 OBJETIVO GENERAL

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Comparar los resultados de las diferentes muestras de DNA genómico en estudio.

II. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

(Ver página siguiente)

Figura2. Radio 260/280 para segundo grupo

Las muestras se mantuvieron en congelación a -4°C hasta ser usadas, se descongelaron a

Basado en teoría espectrofotométrica, los ácidos nucleicos debido a su composición y

La muestra es analizada a ambas longitudes de onda y la absorbancia es entonces

De este concepto se deduce que si la absorbancia medida a 260 nm es mucho mayor a

Adicional al radio ya mencionado, el Nanodrop también ofrece la concentración de DNA en

III. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

- Realizar pruebas posteriores para identificación de los compuestos que hayan

Indique otra manera de cuantificar la concentración de ADN.

 Cuantificación por Hibridación con una sonda

Figura 4. Membrana de cuantificación (Quantiblot)

 ¿Qué indica la relación entre la absorbancia a 260nm / 230 nm?

Acosta,S. (2013). Biomasa: extracción y cuantificación de ácidos

Asami. A. 1015. Spectrophotometry. Quantification of Nucleic Acids. Recueprado de:

Gorog. S. 1995. Ultraviolet-Visible Spectrophotometry in Pharmaceutical Analysis.

Sibaja,C.(2002). Comparación de Tres Métodos de Extracción de ADN de Restos Óseos.

Nemcova. I. 1996. Spectrophotometric Reactions. Editorial Illustrated. 3ra Edición.

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