TALLER VECTORES DE CLONACION

ITEMS

1) estructura general de un fago

2) cuales son las fases de replicación de un fago

3) terapia con fagos lisogénicos o líticos, cual es la mejor opción?

4) la conversión lisogénica es benéfica o no? Para la bacteria o el huésped

5) describe las secuencias cos y que función tienen

6) características más importantes de los siguientes tipos de bacteriófagos.

7) condicionantes que se deben tener en cuenta para el uso de fagos como terapia

8) cómo se ensambla un bacteriófago de un plásmido.

SOLUCION

1.
2. Los fagos pueden recurrir a alguno de los siguientes ciclos de replicación:
2.1. Ciclo lítico
En el ciclo lítico, un fago actúa como un virus típico: secuestra a su célula anfitriona y utiliza
los recursos de la célula para hacer muchos fagos nuevos, lo que causa que la
célula lise (estalle) y muera en el proceso.
 2.1.1. Fijación: las proteínas en la cola del fago se unen a un receptor específico (en este caso,
un transportador de azúcar) en la superficie de la célula bacteriana.
2.1.2. Penetración: el fago inyecta su genoma de ADN bicatenario dentro del citoplasma de la
bacteria.
2.1.3. Copia del ADN y síntesis de proteínas: se copia el ADN del fago y los genes del fago se
expresan para hacer proteínas, como las proteínas de la cápside.
2.1.4. Ensamblaje del nuevo fago: las cápsides se ensamblan a partir de las proteínas de la
cápside y se rellenan con ADN para hacer nuevas partículas de fago.
2.1.5. Lisis: en las últimas etapas del ciclo lítico, el fago expresa los genes para las proteínas
que hacen agujeros en la membrana plasmática y la pared celular. Los agujeros dejan que entre
agua, y hacen que la célula se expanda y estalle como un globo con demasiada agua. El
estallamiento celular o lisis, libera cientos de nuevos fagos, que pueden encontrar e infectar
otras células hospederas cercanas.
2.2. Ciclo lisógenico
El ciclo lisogénico permite que un fago se reproduzca sin matar a su anfitrión. Algunos fagos solo
pueden utilizar el ciclo lítico, pero el fago que estamos analizando, lambda (\lambdaλlambda), puede
cambiar entre los dos ciclos.
En el ciclo lisogénico, los primeros dos pasos (fijación e inyección del ADN) ocurren tal como sucede
en el ciclo lítico. Sin embargo, una vez que el ADN del fago está dentro de la célula, no se copia ni
se expresa inmediatamente para hacer las proteínas. En cambio, se recombina con una región
particular del cromosoma bacteriano. Esto hace que el ADN del fago se integre al cromosoma.
 Ciclo lisogénico:

 Fijación. Los bacteriofagos se acoplan a la célula bacteriana

 Penetración. Los bacteriofagos inyectan ADN dentro de la célula bacteriana.

 Integración. El ADN del fago se recombina con el cromosoma bacteriano y se integra dentro del
cromosoma como un profago.

 División celular. Cada vez que una célula que contiene un profago se divide, sus células hijas
heredan el profago.

El fago con el ADN integrado, llamado profago, no es activo: sus genes no se expresan y promueve
la producción de fagos nuevos. Sin embargo, cada vez que una célula anfitriona se divide, el profago
se copia junto con el ADN anfitrión, sin hacer esfuerzo alguno. El ciclo lisogénico es menos llamativo
(y menos violento) que el ciclo lítico, pero al final del día, es solo otra manera para que el fago se
reproduzca.
En las condiciones apropiadas, el profago puede volverse activo y salirse del cromosoma bacteriano,
lo que acciona los pasos restantes del ciclo lítico (copiado del ADN y síntesis de proteínas,
ensamblado del fago y lisis).

3. Actualmente los fagos empleados en fagoterapia tienden a ser líticos debido a que generan la
destrucción del microorganismo y, con lo anterior, detienen el curso de su infección en el
individuo afectado. Así mismo, cabe mencionar que los fagos líticos tienen una rápida acción
frente a los organismos blanco lo que favorece la observación de respuesta visible en corto
tiempo; mientras que los fagos lisogenos (usualmente vinculados al DNA bacteriano) han de
aguardar a que la bacteria ingrese a ciclo celular.
4. La relación perjuicio/beneficio para la bacteria al estar expuestas a fagos de conversión lisógena
es un asunto discutible. Desde una óptica de expresión fenotípica y adaptativa puede ser muy
benéfica para el microorganismo, debido a que muchos fagos lisógenos portan consigo genes
que favorecen la supervivencia de bacterias en ambientes extremos y aportan de ese modo
“fitness”.
Como escenario antagonico, se puede citar como ejemplo a Vibrio cholerae y su tóxina colérica.
Esta tóxina esta codificada dentro del operon ctxAB que forma parte del genoma de un
bacteriofago filamentoso CTXf, lisogenizado en la bacteria. Este genoma fagico esta compuesto
por dos dominios funcionalmente distintos, la region central o "core" y la region RS2. En la region
central se encuentran, entre otros, los genes de la toxina colerica (ctxAB), los genes implicados
en la morfogenesis del bacteriofago (psh, cep, orfU, y ace) y un gen que codifica una proteina
necesaria para el ensamblaje del virion (zot).
5. En la bacteria, las extremidades cos del fago se aparejan para formar una molécula circular. Los
enlaces diésteres se realizan por la ligasa y el ATP de la bacteria hospedadora del fago. En éste
estado, el fago puede seguir sea la vía lítica ó la vía lisogénica.

6.
 El fago λ o bacteriófago lambda es un virus que infecta a la bacteria Escherichia coli;
descubierto en 1950.1 Se trata de un virus complejo de DNA lineal bicatenario. Los
 extremos de su material genético son cohesivos y ello hace que tras la infección su genoma
se haga circular, comportándose, en caso de seguir un ciclo lisogénico, como un plásmido y
aprovechando las enzimas de la recombinación de la bacteria para integrarse en el genoma
de ésta

 El fago T4 o bacteriófago T4 es un virus de tipo I con ADN que infecta bacterias Escherichia
coli. Tiene un tamaño aproximado de 200 nm. El fago T4 pertenece al grupo T, que incluye
también los enterobacteriófagos T2 y T6. El fago T4 posee un ciclo vital lítico únicamente, y
no lisogénico. Su ADN es bicatenario y lineal, mide 169 kb y puede codificar hasta 289
clases de proteínas. El ciclo de replicación de un bacteriófago T4 se puede dividir
esquemáticamente en distintas etapas, las que son comunes a otros virus bacterianos y
eucarióticos. 1. Adsorción 2. Inyección del material genético viral 3. Replicación del material
genético viral 4. Síntesis de las envolturas proteicas 5. Empaquetamiento del DNA dentro de
la envoltura proteica y ensamblaje de la envoltura 6. Lisis y liberación de las partículas viral
 El fago M13 es un bacteriófago filamentoso compuesto por una única molécula de ADN
monocatenario circular la cual tiene aproximadamente 6407 nucleótidos de longitud; esta
molécula se encuentra encapsulada en una cubierta proteica formada por aproximadamente
2700 copias de la proteína mayor de recubrimiento P8, y encapuchada en los extremos por
cinco copias de dos diferentes proteínas de recubrimiento menores (P9, P6, P3). La proteína
de recubrimiento menor P3 permite que el fago se una a un receptor presente en la punta de
los pilli del hospedador Escherichia coli. La infección con bacteriófagos filamentosos no es
letal para las bacterias; sin embargo la infección causa placas turbias en los cultivos de E.
coli. Aunque no se trata de un virus lítico, si se ha observado una disminución en la
velocidad de reproducción de las células infectadas. Los plásmidos M13
llamados fagémidos son utilizados en numerosos procesos de recombinación de ADN, y el
virus ha sido estudiado por las posibles aplicaciones
en nanoestructuras y nanotecnología de los principios que dominan su proceso de
encapsulamiento.
 Fago Mu: Pertenece a la misma familia que T4, pero con peculiaridades importantes. El
genoma contiene secuencias terminales del hospedador, debido a que puede integrarse en
cualquier sitio del cromosoma bacteriano. Tienen alrededor de 37 kb de secuencia
específica del fago, flanqueado por 0.5-3 kb de segmento covalentemente unido del
huesped (50-150 bases a la izquierda y entre 1-2 kbp a la derecha (de donde estuvo
integrado). Tras la infección de la enterobacteria el DNA circulariza y se puede producir ciclo
lítico ó lisogénico (ambos requieren integración del genoma). Para la integración se corta de
forma “cohesiva” el DNA celular, con 5 bases desplazadas, que, al integrarse el fago, se
rellenarán, duplicándose en 5 bases el DNA celular. El nombre de Mu se debe a que es un
fago MUTADOR. Actúa como un elemento TRANSPOSÓNICO. El DNA viral integrado, se
corta unas pocas bases a la derecha del genoma, que empieza a llenar la cápsida, con
material celular extra. La transcripción corre a cuenta de la RNApol celular y se separa en
tránscritos tempranos y tardíos. Tras el ensamblaje, se produce la lisis celular.
 Fago phi6: Φ6 (Phi 6) es el bacteriófago mejor estudiado de la familia de virus Cystoviridae.
Infecta a las bacterias Pseudomonas (típicamente P. syringae patógeno de plantas). Tiene
un genoma de ARN bicatenario, dividido en tres partes, segmentado, con un total de ~ 13.5
 kb de longitud. Φ6 y sus parientes tienen una membrana lipídica alrededor de su
nucleocápside, un rasgo poco común entre los bacteriófagos. Es un fago lítico, aunque en
ciertas circunstancias se ha observado que muestra un retraso en la lisis que se puede
describir como un "estado de portador".
 FagoN4: Se caracteriza por poseer un genoma con DNA de cadena doble como ácido
nucleico y por albergar dicha información genética en una cápside carente de envoltura viral
y estructuralmente definida por una simetría binal, poseyendo una cabeza icosaédrica y una
cola helicoidal corta.

7. El principal condicionante que se presenta a la hora de considerar la terapia con fagos es la

necesidad de conocer con anterioridad la cepa bacteriana que hay que tratar. Esto implica
normalmente el aislamiento y caracterización de la misma, junto con la selección del fago que la
infecta a partir de colecciones de fagos previamente caracterizadas. Es decir, se necesita hacer
un test previo in vitro y la colección de fagos debe ser lo suficientemente buena como para
asegurar que se cubre el espectro de patógenos conocidos. Los fagos aislados de esta forma
tienen que ser exclusivamente líticos en su propagación y se deben tomar las medidas
necesarias para excluir la posible propagación de genes virulentos en ciclos lisogénicos. En el
mejor escenario posible, el fago escogido debe ser secuenciado para asegurar que no incluye
genes para toxinas o genes que revelen una integración no deseada de su ADN en el genoma
bacteriano. Aunque la resistencia bacteriana a la infección por fagos es mucho menor que la que
se produce contra los antibióticos, no cabe duda de que existe y de que debe minimizarse este
riesgo. Como prevención, se recurre a mezclas o cócteles de fagos, haciendo virtualmente
imposible que la bacteria mute sus receptores para hacerlos resistentes a toda la población que
compone el cóctel. Por tanto, otro de los requerimientos para una buena terapia basada en
fagos es la construcción de una mezcla adecuada.
8. La inserción de un bacteriófago dentro de un plásmido, es conocido como fásmido. Este es un
tipo de vector de clonación empleado en biotecnología, compuesto por un plásmido al que se le
ha incorporado el origen de replicación de un fago filamentoso (fagos de ácido
desoxirribonucleico (ADN) monocatenario), tales como el fago M13 o F1. De este modo
mantiene todas las utilidades de los plásmidos pero además tiene la capacidad de producir ADN
monocatenario.