Apuntes de Control de Calidad Y Análisis de Grasas

Control de Calidad y Análisis de Grasas.
Tema 1: Composición de una grasa 1
TEMA 1: COMPOSICIÓN DE UNA GRASA

(desde el punto de vista analítico)
1. Generalidades.
La diferencia entre grasa y aceite desde el punto de vista químico es mínima.

Grasas: son sólidas a temperatura ambiente.
Aceites: son líquidos a temperatura ambiente.
Por tanto difieren en el estado de agregación, siendo la diferencia principal el
punto de fusión (P.F.) de sus componentes mayoritarios, los triglicéridos, que es más
alto en grasas que en aceites.
1.1. Definición de grasa.
Una grasa no es un compuesto puro. Es una mezcla compleja constituida

fundamentalmente por triésteres de glicerina y ácidos grasos. Estos triésteres se
denominan triglicéridos o triacilglicéridos.
La fórmula de la glicerina es:
CH2 OH
CH OH
CH2 OH
Y la de un ácido graso:
R1 COOH o bien CH3 (CH2)n COOH

R1
El ácido graso se compone de una cadena carbonada y un grupo carboxílico

terminal.
Los 3 grupos –OH de la glicerina pueden ser esterificados, uniéndose a ellos 3
ácidos grasos que pueden ser iguales o diferentes.
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 1: Composición de una grasa 2
Esta unión nos da un triglicérido:
O
CH2 O C R1
O
CH O C R2
O
CH2 O C R3
Estos triglicéridos constituyen aproximadamente el 99% de la grasa.

También podemos tener mono o diglicéridos, pero en un porcentaje muy bajo.
Estos surgen debido a la hidrólisis parcial de los triglicéridos debidos a humedad,
enzimas, etc...
Un monoglicérido sería:
CH2 OH
CH OH
O
CH2 O C R
Y un diglicérido:
CH2 OH
O
CH O C R1
O
CH2 O C R2
Cuando se sintetiza una grasa se forman triglicéridos, por eso forman parte de
casi la totalidad de la grasa.
Cuando se hidroliza un triglicérido volvemos a tener grupos –OH libres así

como ácidos grasos libres. La acidez muestra este procedimiento, por ello un aceite de
mayor grado de acidez es de menor calidad porque tiene mayor cantidad de ácidos
grasos libres. El aceite se va degradando.
CH2 OH à R1 – COOH
CH OH à R2 – COOH
O
acidez
CH2 O C R3
1.2. Clasificación de triglicéridos.
Se clasifican en 2 grupos:
a) Simples: son aquellos en los que los 3 grupos –OH de la glicerina están
esterificados con el mismo ácido graso.
Ej:
CH2 O ác. oleico

CH O ác. oleico
CH2 O ác. oleico
trioleína
b) Mixtos: son aquellos en los que al menos 1 de los radicales de ác. graso es
diferente de los otros dos.
Ej:
Nota: Las posiciones extremas se nombran con
α ó 1 CH2 O ác. palmitoleico
los números 1 y 3, o por las letras α y α’.
β ó 2 CH O ác. oleico La posición central se nombra con el nº 2 ó la
α' ó 3 CH2 O ác. palmitoleico letra β.
2-oleodipalmitina
β-oleodipalmitina
1.3. Características de una grasa.
Su densidad es menor a la del agua. Posee carácter oleaginoso porque tiene una
alta viscosidad debido a la estructura en cadena larga de los triglicéridos ya que existe
un gran rozamiento entre cadenas.
Es insoluble en agua, pero soluble en la mayor parte de los disolventes
orgánicos. Ej: éter etílico, C2S, éter de petróleo, etc...
Son saponificables por álcalis fuertes.
Saponificación:
Supongamos tenemos una mezcla de triglicéridos. Si hidratamos con una base

fuerte en caliente se produce la saponificación, que es una hidrólisis en medio básico.
O
CH2 O C R1
- +
O CH2 OH R1 COONa
− +
CH O C R2 OH
 →
( Na )
CH OH + R2 COONa
- +
O saponificación
CH2 OH R3 COO-Na+
CH2 O C R3
Sales sódicas de los ácidos grasos à jabones.
La saponificación es un proceso muy importante para separar los triglicéridos

del resto de componentes.
La mayoría de los compuestos de una grasa son insolubles en agua. Solo se
saponifican los triglicéridos (aunque también hay otros ésteres).
2. Composición de una grasa.
Cualquier grasa o aceite se constituye por 2 grupos de compuestos:
- Triglicéridos (ácidos grasos) à 98-99% de la grasa.

- Componentes o constituyentes menores à 0’1 – 1% de la grasa.
Estos componentes menores son los responsables de comunicarle el flavor

(aroma y sabor) a los aceites. También le dan estabilidad y permiten la detección de
posibles adulteraciones.
2.1. Triglicéridos y ácidos grasos.
2.1.1. Ácidos grasos.
Son cadenas hidrocarbonadas muy largas, con un grupo carboxilo terminal, un

metilo y n etilenos à CH3 – (CH2)n – COOH.
Pueden ser:
Ø Saturados:
Ø Insaturados: son predominantes.
La cadena suele ser lineal y con un nº par de átomos de carbono, predominando

los de 16 y 18 átomos de C.
Para nombrarlos se utiliza un nº que indica la longitud de la cadena, es decir, el
nº de átomos de C que contiene, y a continuación un segundo número (separado del
primero por “:”) que indica el nº de instauraciones. En el caso de que posea
instauraciones se aconseja poner como superíndice el nº del átomo de C en donde está la
instauración. Ej: 18:19 à ácido oleico.
El doble enlace C=C suele estar en configuración CIS, siendo pues el % de
isómeros TRANS muy pequeño.
En el aceite de oliva el porcentaje de isómeros TRANS del 18:1 es ≤ 0’05%,
igualmente la suma de isómeros TRANS del 18:2 y 18:3 es también ≤ 0’05%.
Estos datos nos van a servir para poder detectar tratamientos extraños efectuados
al aceite de oliva, pues por ejemplo durante la refinación del aceite aumenta el % de
isómeros TRANS, así de esta forma podemos detectar si una partida de aceite en
principio de oliva virgen es mezclado con aceite refinado.
En el aceite de oliva los ácidos grasos mayoritarios son 3:
16:0 à ácido palmítico.
18:1 à ácido oleico (que es el predominante).
18:2 à ácido linoleico.
(Ver fotocopia nº 1, Tabla 3.1)
Aquí podemos ver el intervalo de % de ácidos grasos que aparecen en el aceite

de oliva. Vemos que el oleico aparece entre 55-83% por ejemplo.
Pero, ¿de qué depende que el % de ácidos grasos varíe de un valor a otro?
Depende de:
a Variedad de la aceituna: en Jaén predomina la picual.
a Clima, latitud, etc...
a Estado de madurez de la aceituna, es decir, del momento de
recolección de la aceituna.
Algunos autores dividen el tipo de aceite de oliva en 2 grupos:
ü España, Italia, Grecia à con alto contenido en ácido oleico, y bajo

contenido en ácidos palmítico y linoleico.
ü Túnez à con alto contenido en ácidos palmítico y linoleico, y bajo
contenido en ácido oleico.
2.1.2. Triglicéridos (TG).
En el aceite de olvida, el TG mayoritario es el triéster del ácido graso oleico, es

decir la trioleína:
CH2 O ác. oleico

CH O ác. oleico
CH2 O ác. oleico
trioleína
Los ácidos grasos insaturados en el aceite de oliva esterifican preferentemente la

posición β (ó 2) de la glicerina. Ej: 18:1, 18:2, 18:3. En cambio, los saturados esterifican
las posiciones externas 1 y 3 (ó α y α’).
α ác. graso saturado
β ác. graso insaturado
α' ác. graso saturado

En la biosíntesis intervienen enzimas que hacen que esta forma de esterificación

en posiciones determinadas sea así. En cambio, cuando sintetizamos el TG en el
laboratorio los ácidos grasos esterifican a las posiciones de la glicerina al azar.
El % de ácidos grasos saturados en este caso es mayor.
Así también podemos detectar adulteraciones viendo el % de ácidos grasos en
posición b que tiene el aceite que se estudia, pues puede ir mezclado aceite natural con
aceite sintetizado en el laboratorio. El máximo permitido por la ley de este porcentaje es
del 2%.
2.2.Constituyentes menores: materia insaponificable.
Se dividen en 2 grupos:
a) Derivados de ácidos grasos.

b) No relacionados con ácidos grasos.
En los primeros podemos a su vez tener:
- Mono y diglicéridos.
- Ceras: son ésteres constituidos por un alcohol alifático y un ácido graso.
CH3 – (CH2)n – CH2OH ------ COOH – (CH2)n – CH3
enlace éster
- Ésteres de esteroles: pueden estar libres o esterificados.

- Fosfátidos o fosfolípidos.
Y en los segundos:
- Esteroles.
- Tocoferoles.
- Alcoholes.
- Hidrocarburos.
- Pigmentos.
- Compuestos fenólicos.
- Constituyentes volátiles.
El poder determinar la cantidad y composición de estos constituyentes menores

es difícil de realizar por 2 motivos:
- El % de ellos es muy bajo.

- Son compuestos de estructura muy diferente, con lo que casi cada uno se
debe separar de una forma. Por ejemplo, son compuestos de polaridad
variable, desde apolares hasta muy polares.
Por tanto como mucho se determina el insaponificable, en el cual NO están

todos los constituyentes menores.
Insaponificable:
Lo forman aquellos compuestos que una vez saponificada la grasa son insolubles
en el disolvente orgánico utilizado para la extracción de los constituyentes menores.
Cuando realizamos la saponificación de una grasa empleamos una disolución
básica. Esta disolución contiene agua. En este agua serán solubles los jabones que
forman los ácidos grasos al igual que la glicerina. En cambio quedarán como insolubles
los constituyentes menores.
Glicerina
- TG solubles en agua
+ −
,∆
KOH → Jabones (K+)
GRASA saponificable
- Constituyentes Constituyentes
insolubles en agua
menores menores
Seguidamente hacemos una extracción con un disolvente orgánico para disolver

los componentes menores. Pero NO todos los componentes menores son insolubles en
agua, por ejemplo los fenoles lo son, luego se pierden, quedando pues en la disolución
acuosa junto a la glicerina y jabones. También las ceras se pierden, pues al estar
formadas por ésteres de ácidos grasos y alcohol, tales ésteres se saponifican, pasando
los ácidos grasos a ser también jabones, en cambio el alcohol no se pierden, pues es
insoluble en agua, forma parte pues del insaponificable. Por último también se pierden
los ésteres de esteroles. El resto de componentes menores forman el insaponificable.
2.2.1. Esteroles.
Pertenecen a los esteroides. Son alcoholes esteroideos. Todos contienen al

ciclopentano perhidro Fenantreno:
12 17 Tenemos:
11 13 16
• En el C3 un –OH
1 9
2 10
14 15 • En el C10 y C13 un –CH3
8
• En el C17 un radical –R
3 5 7
4 6
El radical –R es lo que les hace ser diferentes. Además, algunos esteroles

presentan dobles enlaces en alguno de los anillos.
En el caso del aceite de oliva tenemos:
(Ver fotocopias nº 2, parte superior, nº 3, Figura 3.4., y nº 4, Tabla 3.145)
Estigmasterol, β-sitosterol, colesterol y lanosterol como principales.

El β-sitosterol constituye entre 75-90% de esteroles.
El contenido en β-sitosterol en otros aceites es muy superior al de oliva, además
el perfil de los esteroles difiere mucho de un aceite a otro, con lo que estas 2
observaciones nos pueden servir para detectar adulteraciones, tanto por el contenido
total de esteroles como por el % relativo (el contenido) de cada uno de los esteroles.
La ley regula tanto el contenido total en esteroles, es decir, el máximo admitido,
así como el contenido máximo o mínimo de cada uno de ellos.
Ej: El brastastenol aparece en mayor proporción en el aceite de soja.
Cuando un aceite se refina disminuye el contenido total en esteroles. Esta
particularidad la utiliza quien adultera los aceites, para que así se parezca más al de
oliva, pero existen otros métodos para detectar dicha adulteración.
Por tanto la determinación de esteroles es un análisis de rutina que se hace al
aceite de oliva. Más tarde diferenciaremos los diferentes tipos de análisis que hay.
2.2.2. Tocoferoles.
La estructura básica de un tocoferol es:
R1
OH
CH3
R2 O
R
R3
Como podemos ver contienen un grupo alcohol, luego son fenoles.

R1, R2 y R3 son átomos de H o metilos, siendo R una cadena hidrocarbonada.
En el aceite de oliva tenemos 4 tocoferoles:
El α-tocoferol, β-tocoferol, γ-tocoferol y ∆-tocoferol.
(Ver fotocopia nº 1, Figura 3.2.)
El mayoritario es el α-tocoferol (vitamina E à es un antioxidante).
- En el α-tocoferol à R1≡R2≡R3≡CH3. (Ver fotocopia nº 2, VIT E)

- En el β-tocoferol à R1≡R3≡CH3; R2≡H.
- En el γ-tocoferol à R2≡R3≡CH3; R1≡H.
- En el ∆-tocoferol à R1≡R2≡H; R3≡ CH3.
Son los compuestos de una grasa que la defienden frente a la oxidación. Dicha
oxidación se lleva a cabo mediante radicales libres.
Los tocoferoles retrasan el envejecimiento celular, además reducen el riesgo de
enfermedades coronarias.
El aceite de oliva destaca frente al resto de aceite porque contiene mucha
vitamina E (95% del total de esteroles).
En general los aceites vegetales contienen un % en tocoferoles superior al de los
aceites o grasas animales. Por ello los aceites vegetales tardan más en oxidarse que las
grasas animales.
Cuando un aceite se refina pierde prácticamente todos los tocoferoles que lleva,
luego un aceite refinado tiene mayor posibilidad de ser oxidado.
El contenido en tocoferoles en la aceituna va disminuyendo a lo largo de la
campaña de recogida de la aceituna. Es decir, existe un valor óptimo del contenido en
tocoferoles, lo cual hace que un aceite tenga mayor o menor calidad.
A un aceite de oliva virgen no se le puede adicionar antioxidantes.
2.2.3. Alcoholes.
Distinguimos entre 2 grupos: (Ver fotocopia nº 2, parte inferior)
a) Alcoholes grasos o alifáticos.

b) Alcoholes terpénicos.
Alcoholes alifáticos:
Son cadenas hidrocarbonadas largas, con un grupo alcohol primario. Tienen

entre 8-30 carbonos.
CH3-(CH2)n-CH2OH
En el aceite de oliva tenemos:
C22 (dicosanol), C24 (tetracosanol), C26 (hexacosanol), C28 (octacosanol), ...
Cuando un aceite se obtiene por extracción (con un disolvente orgánico), el

contenido en alcoholes alifáticos aumenta.
Si el aceite es de orujo su contenido en alcoholes alifáticos es mayor al del aceite
de oliva, por tanto podemos detectar adulteraciones del aceite de oliva con aceite de
orujo.
La ley establecía para el aceite de oliva un contenido máximo en alcoholes
alifáticos. Decimos que “establecía” porque ahora este análisis ha sido sustituido por el
de ceras.
Alcoholes terpénicos: (Ver fotocopias nº 4 y nº 8, Figura 3.7.)
Se basan todos en el isopreno o 2-metil-1,3-butadieno.
H2C C CH CH2
CH3
Son unidades de cadenas formadas por isopreno con 1 ó 2 grupos alcoholes.

Pueden ser tanto lineales como cíclicos.
Tenemos:
- Monoterpenos à tienen 2 unidades de isopreno (C10).

- Diterpenos à tienen 4 unidades de isopreno (C20).
- Triterpenos à tienen 6 unidades de isopreno (C30).
- Etc...
En el caso del aceite de oliva tenemos:
• Alcoholes diterpénicos. Ej: fitol.

• Alcoholes triterpénicos. Ej: butirospermol.
• Dialcoholes triterpénicos. Ej: eritrodiol y uvaol.
Estos últimos, el eritrodiol y uvaol son muy importantes porque aparecen en un

% muy superior en los aceites de orujo al % en el aceite de oliva. Por tanto la normativa
legal establece un contenido máximo en estos dialcoholes para el aceite de oliva.
Aquí haremos un pequeño inciso para hacer la clasificación de los diferentes

tipos de aceite de oliva que hay:
Extra
Oliva virgen Corriente
OLIVA Lampante *
Oliva (virgen + refinado)
Oliva refinado *
Orujo virgen
ORUJO Orujo refinado
Orujo de oliva (orujo refinado + oliva virgen)
* à aceite no comercializado para su consumo.

2.2.4. Hidrocarburos.
Tenemos:
a) Saturados.
b) Insaturados.
Los mayoritarios en el aceite de oliva son 2: el escualeno y el β-caroteno.
Escualeno:
(Ver fotocopias nº 5 y nº 6)
Es un hidrocarburo triterpénico, es decir, está formado por 6 unidades de

isopreno à C30.
Tiene 6 dobles enlaces, no conjugados.
El único aceite vegetal que lo contiene es el de oliva. Solo existe en aceites de
animales marinos.
Ej: aceite de hígado de tiburón à de ahí el nombre de escualeno, de “escualo”.
En el aceite de oliva constituye el 40% del insaponificable.
β-caroteno:
Es un hidrocarburo tetraterpénico à C40. Es insaturado. En este caso los dobles

enlaces son conjugados.
Al haber conjugación tiene grupos cromóforos, luego absorbe en el visible. Por
tanto presenta color à amarillo, anaranjado, rojo.
Son los pigmentos de los aceites.
2.2.5. Ésteres de esteroles y ceras.
Su estructura es la siguiente:
R
R
O
HO
CH3 (CH2)n C O
radical del ác. graso
Pueden estar libres o esterificados con un ác. graso.

Para saber el contenido total en esteroles tengo que saponificar la grasa.
+ −
T.G. Na
OH
→ Jabones + Glicerina
saponificación
+ Componentes menores
Extracción del insaponificable

con disolventes orgánicos
parte esterólica
Las ceras son ésteres de ác. grasos + alcoholes alifáticos.
O
CH3 (CH2)n C O (CH2)n' CH3
ác. graso alcohol alifático
Las ceras también se hidrolizan en la saponificación, quedando libre el alcohol

alifático (que pasa al insaponificable) y los ácidos grasos como jabón.
En el aceite de oliva las ceras mayoritarias son:
C36, C32, C40, C42, C44, C46.

Los aceites de oliva obtenidos por extracción, es decir, los aceites de orujo
tienen un contenido en ceras muy superior al de los aceites de oliva.
Según la normativa, la determinación de ceras se utiliza para detectar
adulteraciones del aceite de oliva con el de orujo.
Para el análisis de ceras no podemos saponificar la grasa para separarlas, pues
las destruiríamos como ya hemos visto.
2.2.6. Monoglicéridos y diglicéridos.
Aproximadamente el 98% de la grasa son TG. Existe un % muy bajo de mono y

diglicéridos los cuales provienen de la hidrólisis parcial de los TG o bien de una
biosíntesis incompleta de TG.
El % de DG es mayor que el % de MG, lo cual es lógico porque si se empieza a
hidrolizar un TG hay más dificultad de hidrolizar el primer ácido graso que para el
segundo.
2.2.7. Fosfolípidos, fosfátidos o fosfoglicerina.
Son derivados de la glicerina en la cual 2 de los grupos -OH se encuentran

esterificados con un ác. graso. En el tercer grupo -OH tenemos una molécula de ác.
ortofosfórico y un aminoalcohol.
Todos los fosfolípidos tienen 2 colas apolares (ác. grasos) y una cabeza apolar
(es el ác. ortofosfórico + el aminoalcohol). Son pues lípidos polares.
(Ver fotocopia nº 5, parte inferior derecha)
En una disolución acuosa cabe pensar que son insolubles, pero permanecen de
alguna forma solubles formando miscelas. Para ello orientan la cabeza polar hacia el
exterior dejando las colas apolares hacia el interior.
En el aceite de oliva hay: cefalina, lecitina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol.
(Ver fotocopias nº 5 y nº 6).
Cuando un aceite se refina los fosfolípidos se eliminan.

2.2.8. Pigmentos: clorofilas y carotenos.
Se emplean para evaluar la calidad a partir del contenido total de ellos. Además
le dan color al aceite.
Un aceite de oliva refinado es de menor calidad que un aceite de oliva virgen,
pues apenas tiene color.
Tenemos 2 tipos de pigmentos:
• Clorofilas y feofitinas.
• Carotenoides.
Clorofilas:
Hay 2 tipos de clorofilas: (Ver fotocopias nº 6 y nº 7)
a) Clorofila a à tiene un grupo -CH3. Es de color verde.

b) Clorofila b à tiene un grupo -CHO.
La clorofila se compone de un anillo porfirínico con un átomo de Mg en el

centro y una cadena lateral de fitol.
Por hidrólisis pierden el átomo de Mg dando lugar a la feofitina correspondiente:
+
Clorofila (a) 2

H
→ Feofitina (a) + Mg2+
Al final de la recolección de aceituna el contenido en clorofila es pequeño,

prácticamente hay feofitina, es decir, la clorofila se va degradando a feofitina.
Carotenoides:
Son compuestos terpénicos con muchos dobles enlaces conjugados.

Son de color rojo, amarillo, anaranjado.
(Ver fotocopia nº 8, Figura 3.11)

En el aceite de oliva tenemos:
β-caroteno, luteína (el de mayor proporción y responsable principal del color del
aceite de oliva obtenido de aceitunas negras), violaxantina, neoxantina.
2.2.9. Compuestos fenólicos o "polifenoles".
Hemos denominado a los compuestos fenólicos por polifenoles entre comillas “”

porque no todos lo son, es decir, no todos tienen 2 ó más grupos -OH, aunque la
mayoría son polifenoles.
Es una fracción muy compleja, pues la forman una gran cantidad de compuestos.
Son responsables de la estabilidad de los aceites, es decir, de su resistencia frente
a la oxidación, pues son fenoles, y responsables del flavor (aroma + sabor),
concretamente del sabor amargo del aceite. Ej: picual, variedad de aceituna que hay en
Jaén, de alto contenido en polifenoles, por ello el aceite es tan amargo.
Tenemos pues como antioxidantes naturales a los tocoferoles y ahora añadimos a
los polifenoles.
Los polifenoles son polares, luego son solubles en agua. Se encuentran disueltos
en el agua de vegetación.
En la maduración en el almacén, estos polifenoles se pierden, el aceite se vuelve
menos amargo. Se pierden por decantación del agua en donde están disueltos.
También, a lo largo de la campaña de recogida, el contenido de polifenoles va
disminuyendo, siendo al principio el aceite de mayor calidad al ser más resistente a la
oxidación (más cantidad de polifenoles).
En el proceso de obtención del aceite se emplea agua, por tanto también en esta
agua podemos perder polifenoles, por tanto según el sistema empleado en la obtención
del aceite así será la cantidad de polifenoles que se pierdan. El sistema actual de
obtención de aceite es por centrifugación. En el sistema de 3 fases se empleaba más
agua, por tanto pierde más cantidad de polifenoles que el sistema de 2 fases en el cual se
emplea menos agua.

En el aceite de oliva tenemos tirosol e hidroxitirosol como mayoritarios, y ácido

vaníllico, oleoeuropeína, ... En el propio fruto, en la aceituna tenemos como mayoritario
la oleoeuropeína con 2 grupos -OH y un glicóxido (G).
Si se hidroliza lo hace por el enlace éster
2.2.10. Constituyentes volátiles.
Suelen ser aldehídos, cetonas, ésteres, alcoholes, hidrocarburos, fenoles.

Algunos son responsables del aroma del aceite.
(Ver fotocopia nº 10)
2.3.Componentes anómalos. (Ver fotocopia nº 11)
No pertenecen a la grasa, es decir, su pertenencia no es natural. El % en que

aparecen es muy bajo.
Se encuentran debido a la manipulación durante el proceso de obtención del
aceite o grasa.
Podemos citar:
- Agua: proviene como humedad procedente de las aguas de vegetación, o

bien de la semilla o fruta durante su almacenamiento.
El agua es un compuesto indeseable puesto que favorece la hidrólisis de los TG,
con lo que aumenta la acidez de la grasa o aceite.
Hay una determinación del contenido en agua que se llama “Determinación de la
humedad y materia volátil”. Vemos pues que incluimos también a la materia volátil.
- Metales: Fe y Cu fundamentalmente.
Provienen del contacto de la grasa con partes metálicas del aparataje utilizado
durante su elaboración.
Hoy en día se recomienda que cualquier contenedor sea de acero inoxidable.
Se encuentran los metales en la grasa formando jabones, es decir, se unen a ác.
grasos libres: (R–COO-)nMn+.
Son sustancias indeseables pues catalizan la oxidación de las grasas.
Cualquier grasa se oxida espontáneamente, pero con estos metales esta
oxidación es más rápida.
Para su determinación se utiliza una técnica que es la absorción atómica con

horno de grafito, técnica que es más sensible que la absorción atómica con llama, pues
la concentración de los metales en las grasas es del orden de ppm o p.p.b., por ello se
emplea la primera al ser más sensible.
- Disolventes halogenados volátiles: provienen de la extracción del aceite.

Los disolventes usados suelen ser halogenados. Ej: tetracloro etileno.
El disolvente tras la extracción se ha de eliminar, aunque puede quedar un resto.
Es tóxico y comunica sabores desagradables al aceite.
En el aceite de oliva está regulado el % máximo de disolventes halogenados.
Como método para su determinación tenemos la cromatografía de gases.
- Jabones: de Na+, Ca2+, etc..., distintos a los jabones de Fe y Cu.

Provienen del proceso de refinación. En la refinación una de las etapas es la
neutralización del aceite:
RCOO-H+ + Na+OH- 
→ RCOONa + H2O
ác. grasos libres jabones
Este proceso se hace para neutralizar la acidez, es decir, a los ác. grasos libres.
Estos jabones que se forman posteriormente se eliminan, aunque puede quedar
un pequeño %.
Existe un método oficial para la detección de jabones en el aceite de oliva
refinado. Este método también se puede aplicar al aceite de oliva virgen, pues éste no
sufre ninguna manipulación. Es un método cualitativo pero muy sensible.
También tenemos:
Ø Tierras decolorantes: suelen ser arcillas que se utilizan en la refinación para

decolorar los aceites.
Tenemos pues una etapa de decoloración de pigmentos. Estas tierras se
pueden eliminar por filtración.
Ø Ácidos oxidados y productos de polimerización: provienen de la oxidación
de la grasa o aceite.
Los ácidos grasos oxidados dan al aceite un color oscuro. Son indeseables
porque dan un olor y sabor desagradables.
Existe un método oficial para la determinación de ácidos oxidados.
3. Metódicos analíticos relacionados con la determinación de ciertos

componentes anómalos.
3.1. Impurezas.
Esta determinación se hace generalmente cuando existe un contrato de compra-

venta.
Las impurezas se definen como aquellas sustancias que son insolubles en el
disolvente utilizado en su determinación sin incluir la humedad y materia volátil.
Se determinan por gravimetría.
Se pesa una cantidad (P) de una grasa o aceite y se disuelve en una determinada
cantidad de disolvente que puede ser S2C, éter de petróleo o éter etílico. Se filtra
quedando un residuo insoluble el cual se seca en una estufa a 103ºC (P').
disolución filtrada
residuo insoluble se seca en estufa a 103ºC
P' P: gramos de materia grasa.

% Impurezas = · 100 P’: gramos de residuo insoluble seco.
P
No se incluyen la humedad y la materia volátil que se determina previamente,

pues la grasa empleada en la determinación de impurezas ya no tiene ni humedad ni
materia volátil.
El contenido en impurezas se descuenta del precio.
En las impurezas tenemos:
• Jabones.
• Ácidos oxidados.
• Tierras decolorantes.
Según la norma oficial se emplean los 3 disolvente mencionados anteriormente,

pero en el caso de que la grasa sea comestible se emplea éter de petróleo.
Los resultados obtenidos en el análisis de impurezas varían según el disolvente
empleado, por ello hay que indicar en el certificado qué disolvente se usó.
3.2. Cenizas.
Se definen como el residuo inorgánico que queda una vez incinerada la grasa. Se
expresan en %.
Para su determinación se pesa una cantidad (P) de grasa. Se calienta a 400ºC (se
incinera). El residuo que queda se pesa (P'). Quedan metales que se encontraban en la
grasa en forma de jabón y que quedarían en forma de óxido. También es una
gravimetría.
P: gramos de materia grasa.

Grasa (P) ∆ → residuo inorgánico (P’)
400º C
P’: gramos de residuo inorgánico
P'
% Cenizas = · 100
P
Al igual que el % de impurezas, el % de cenizas también está en el contrato de

compra-venta.
Hay sustancias que puedan estar incluidas tanto en impurezas como en las
cenizas, es decir, se pueden contar 2 veces. Por tanto las cenizas se determinan en la
disolución obtenida en la determinación de impurezas (en la disolución filtrada).
disolución filtrada determinación de cenizas
residuo insoluble determinación de impurezas
3.3. Antioxidantes (aditivos).
Sabemos que los antioxidantes naturales son los tocoferoles y los polifenoles. En
un aceite de oliva virgen, al tener gran cantidad de estos antioxidantes, no es necesario
añadirle más antioxidantes, esta vez no naturales.
Pero en la elaboración de productos alimenticios es posible que se necesiten
añadir antioxidantes.
Tenemos por ejemplo fenoles reductores: galato de propilo (GP), galato de octilo
(GO), galato de dodecilo (GD), butilhidroxitolueno o butilhidroxitoluol (BHT),
butilhidroxianisol (BHA), ácido nordihidroguaiarético (DNG).
En el boletín se asignan por la letra E (de "Europe"), un guión "-" y un número.
También se considera como antioxidante al ácido cítrico, el cual no tiene

capacidad reductora, lo que ocurre es que compleja al Fe y Cu los cuales favorecen la
oxidación. Además el ácido cítrico potencia a otros antioxidantes.
También se emplea α-tocoferol sintético, lecitina que tampoco es un
antioxidante, es un fosfolípido que favorece la disolución en la grasa de otros
antioxidantes que son muy insolubles.
Para la determinación de antioxidantes en grasas comestibles hacemos lo

siguiente: se disuelve la grasa en hexano, se extraen los antioxidantes con acetonitrilo.
Eliminamos éste en rotavapor y disolvemos con metanol. Los antioxidantes se
fraccionan por CCF en fase normal.
Fase estacionaria: SiO2.
Fase móvil: hexano:benceno:AcH (40:40:20).
fracción
 dehexano

→
Grasa disoluvemo
  s con hexano
→ extracción
    →
con acetonitrilo
acetonitri
    →
lo con los antioxidan tes
CCF (fase normal)
determinación por HPLC
El componente más polar queda más retenido en la sílice. Los menos retenidos
son el BHT y BHA, y los más retenidos son los que tienen más grupos –OH, en este
caso el DNG.
El de menor Rf es el más polar.
Así es cómo se detectan los antioxidantes, su determinación se realiza a través
de HPLC.
3.4. Disolventes.
En la extracción de aceite de orujo se emplean disolventes halogenados como ya

hemos dicho varias veces.
Existe un método oficial para determinar la cantidad de disolventes halogenados
volátiles.
Vamos a ver un ensayo cualitativo para la detección de compuestos clorados.
Este ensayo es muy antiguo y es un ensayo a la llama.
Buscamos restos de disolventes clorados, funguicidas, insecticidas, etc...
En un ensayo a la llama (ensayo de Belstein) el cloro da una llama verde.
Se emplea un alambre de cobre introducido en una varilla de vidrio. Con el
alambre se recoge un poco de muestra y se lleva al mechero Bunsen.
alambre de Cu
varilla de vidrio
Es un ensayo poco sensible, pues no podemos detectar cantidades de cloro de

concentraciones muy bajas, por tanto este ensayo permite hasta un mínimo de
concentración.
Cabe señalar que el alambre de Cu antes de tomar la muestra debe introducirse
en HCl para limpiarlo.
3.5. Jabones.
Pueden existir como restos de la refinación durante la neutralización de los ác.

grasos libres con una base fuerte.
RCOO-H+ + Na+OH- → Jabones + H2O
Para la detección de jabones en un aceite refinado se toma un tuyo de ensayo en

el que adicionamos acetona y un indicador ác-base à azul de bromofenol (ABF).
La forma ácida del indicador es amarilla, siendo la básica azul.
Esta disolución de ABF en acetona tiene un color amarillento. Añadimos el
aceite de estudio y agitamos. Si la capa cetónica (fase orgánica) se colorea de azul
indica la presencia de jabones.
Si hay jabones, estos pasan a la fase orgánica cambiando el pH, por ello el
indicador varía de color, pasando a su forma básica que es azul.
capa cetónica jabones, acetona e indicador

grasa
Este ensayo también es poco sensible.

En el caso de que haya poco jabón la capa cetónica será verdosa, si hay mucho
jabón será azul.
Los ác. grasos libres también son solubles en acetona, por tanto si hay una
cantidad apreciable de ellos también se extraerán durante esta experiencia y
neutralizarán a los jabones, con lo que el ensayo para ver si hay jabones será negativo.
Por tanto la norma dice que se puede aplicar este ensayo en una grasa que tenga pocos
ác. grasos libres, es decir, baja acidez, < 1. Aunque ya dijimos al comienzo que este
ensayo se aplica a un aceite refinado cuya acidez no supera la unidad.
3.6. Metales.
Mayoritariamente son de procedencia no natural à Fe, Cu, ...

Para su determinación antiguamente se empleaba espectrofotometría en UV-
VIS, en donde el metal formando un derivado coloreado que absorba en UV-VIS podrá
ser detectado. Pero en este caso la matriz que rodea al metal es orgánica, con lo que no
podré formar ese derivado coloreado. Por ello debo eliminar anteriormente la matriz
mediante una mineralización.
Se pueden aplicar métodos electroanalíticos o espectroscopía de absorción
atómica, técnica que lleva implícita una mineralización de la matriz orgánica.
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 2: Índices acidimétricos 27
TEMA 2: ÍNDICES ACIDIMÉTRICOS
1. Acidez.
1.1. Concepto de acidez.
Es debida a la presencia de ác. grasos libres que provienen de la hidrólisis

parcial de los TG.
R1COOH
TG + 3H2O 
→ Glicerina + R2COOH
R3COOH
La glicerina se descompone, y los ácidos grasos permanecen dando la acidez al

aceite.
La hidrólisis es indeseable por varias razones:
- Pérdida de materia grasa.

- Si la grasa es comestible, la acidez le comunica sabores desagradables.
- Los ác. grasos libres se oxidan más rápidamente que los que forman parte de
los TG.
Para que se produzca la hidrólisis es necesaria la presencia de agua.

Para el almacenaje de un aceite de semilla es necesario un sitio seco, aunque
siempre queda un poco de humedad.
Esta reacción de hidrólisis está catalizada mediante enzimas à lipasas.
La hidrólisis se ve favorecida con temperaturas altas. Igualmente la luz y el aire
también la favorecen.
1.2. Formas de expresión: grado de acidez, índice de acidez e índice de

neutralización.
El contenido de ác. grasos libres se expresa de varias formas según sea el uso
que le demos al aceite.
Grado de acidez:
Es el % en peso en ác. grasos libres de una muestra de grasa o aceite.
g. de ác. graso libre mg. de ác. graso libre

, o bien
100 g. de muestra 1 g. de muestra
Se hace una volumetría ác-base:
RCOO-H+ + K+OH- 
→ RCOO-K+ + H2O
Para hacer esta volumetría es necesario saber el peso molecular de los ácidos
grasos. Como puede haber mezcla de varios lo que se hace es tomar por convenio el
peso molecular del ác. graso más abundante. En el aceite de oliva es el ác. oleico:
C18:1 à M = 282
En el caso de los aceites comestibles el ácido oleico es muy abundante (no el

mayoritario, solo en el de oliva) en todos.
En el aceite de girasol se toma el ác. linoleico:
C18:2 à M = 280
Hay 2 excepciones en los aceites comestibles:
- Aceite de coco à ác. laúrico à C12:0 à M = 170

- Aceite de palma à ác. palmítico à C16:0 à M = 226
Si tengo una mezcla de varios aceites se emplea el concepto de índice de acidez.
Índice de acidez:
Es el nº de mg de KOH necesarios para neutralizar los ác. grasos libres de 1 g de

grasa.
Índice de neutralización.
Es el nº de mg de KOH necesarios para neutralizar los ác. grasos libres de 1 g de

grasa.
Se emplea para relacionar el grado de acidez con el índice de acidez:
Vamos a ver las expresiones matemáticas para obtener las formas de expresión
de la acidez así como la relación existente entre ellas.
Grado de acidez:
Sea:
N: normalidad del KOH.
V: volumen en ml de KOH consumido en la valoración.
P: peso en gramos en la muestra grasa.
M: peso molecular del ác. graso que coincide con el peso equivalente
pues los ác. grasos contienen 1 grupo carboxílico, con lo que la valencia es 1.
Entonces:
g. de ác. graso V · N · 10 -3 · M V· N·M

Grado de acidez = = · 100 =
g. de grasa P 10P
Se multiplica por 10-3 para pasar el volumen a litros.

Si tomamos el ácido oleico:
V · N · 282 V · N · 28'2
Grado de acidez = =
10P P
Este parámetro es el que aparece en las botellas de aceite.
Índice de acidez:
mg. de KOH V · N · MKOH V · N · 56'1

Índice de acidez = = =
g. de grasa P P
Índice de neutralización:
Índice de acidez mg. de KOH/g. de grasa mg. de KOH

Índice de neutralización = = =
Grado de acidez g. de ác. graso/g. de grasa g. de ác. graso
1.3. Métodos oficiales de determinación de la acidez: “Valoración

colorimétrica y valoración potenciométrica”.
Para determinar la acidez existen muchos métodos.

Cada país tiene un método oficial, con muchas normas de determinación.
Las normas españolas son las normas UNE.
La entidad AENOR (Agencia Española de Normalización) dicta los métodos
oficiales, las normas a seguir, etc...
Cada país tiene una entidad similar.
Por encima de las normas de España están las normas de la Comunidad Europea,
y por encima de estas tenemos las normas del COI (Consejo Oleícola Internacional), es
la entidad máxima en la normativa para grasas y aceites.
En los métodos oficiales se realiza una valoración ác-base de los ác. grasos
libres:
RCOO-H+ + B+OH- 
→ RCOO-B+ + H2O
ác. grasos libres jabones
Base valorante:
Se emplea una base fuerte à NaOH, KOH. No se emplea NH3 porque vamos a
valorar ác. grasos de carácter débil.
Si empleamos una base débil observaríamos la siguiente gráfica:
pH
punto de equivalencia
ml de base débil gastados
Como podemos observar el salto no es brusco, con lo que sería menos preciso el
conocer el volumen gastado de base.
Si empleamos una base fuerte observaríamos la siguiente gráfica:
pH
p.e.
ml de base fuerte gastados
En esta gráfica observamos que cuando usamos una base fuerte el salto, el viraje
del indicador se aprecia muy bien, pues es un salto brusco. En las proximidades del
punto de equivalencia basta con un poco de volumen de base para virar. De esta manera
se obtiene un error menor.
Indicador del punto final de la valoración:
Se emplea un indicador ác-base cuyo viraje ha de tener un salto brusco de pH.

Como estamos valorando un ác. graso débil con una base fuerte, en el punto de
equivalencia tendremos un pH básico.
• Si valoro un ácido fuerte (no es nuestro caso):
HCl + NaOH 
→ NaCl + H2O
• Si valoro un ácido débil (nuestro caso):
RCOOH + NaOH 
→ RCOONa + H2O
RCOONa + H2O RCOOH + OH- (pH básico)
Por ello no puedo usar un indicador que vire en un intervalo que no sea básico
como le ocurre al naranja de metilo (pH 3–4). Empleamos por tanto fenolftaleína cuyo
intervalo de viraje es 8–9’6, básico.
La forma ácida de la fenolftaleína es incolora, siendo la básica violeta o púrpura.
Al comienzo la disolución es de color amarilla, debida al color del aceite, para

pasar luego a un color violáceo, paso que no siempre se ve bien.
Sobre todo, si el aceite es de color oscuro (aceite de palma à rojo, de algodón,
de pescado) no podemos usar la fenolftaleína, pues no podemos observar bien este
cambio. En estos casos empleamos la timolftaleína que vira de incoloro a azul, o el azul
de timol que pasa de amarillo a azul, estos virajes se observan algo mejor que el de la
fenolftaleína.
En caso de que este viraje sea muy complicado de observar es mejor hacer
medidas potenciométricas.
Disolvente de la valoración:
No podemos emplear agua, pues tendríamos una hidrólisis parcial de ác. grasos,
con lo que el valor de acidez que obtendríamos no sería el verdadero, sino mayor.
Podemos emplear:
- Etanol: es el disolvente por excelencia de los ác. grasos. El problema que
tiene es que no disuelve los TG, lo cual dificulta el viraje ya que tendríamos
2 capas, una en donde están los ác. grasos y otra en donde están los TG, por
tanto tendríamos que ver el viraje en ambas capas.
- Propanol y butanol: estos disuelven además los TG, pero el problema que
tienen es que producen una saponificación apreciable de los TG, con lo que
la acidez daría un valor mayor.
El método oficial (tanto de la UNE como de la CE) emplea una mezcla de

etanol-éter etílico (1:1). Con este disolvente no se produce una saponificación, además
disuelve tanto los ác. grasos libres como los TG.
Valoración colorimétrica:
Se pesa una cantidad (P) de grasa y se disuelve una mezcla de etanol-éter etílico
(1:1) previamente neutralizado. Valoramos con una disolución de KOH 0’1 ó 0’5 M
(según la acidez que se prevea) disuelta en etanol utilizando como indicador
fenolftaleína.
Hemos dicho que la mezcla etanol-éter etílico debe ser neutralizada

anteriormente porque en principio tienen una cierta acidez, con lo que consumirían parte
de la potasa (KOH) utilizada. Por ello se hace un blanco, es decir, preparamos la
experiencia pero sin muestra, entonces tendríamos el disolvente (etanol-éter etílico) y el
indicador (fenolftaleína). Voy añadiendo KOH hasta que vire. En este momento ya
tenemos neutralizado el disolvente. Es ahora cuando hacemos la experiencia con
muestra y empleando el disolvente neutralizado.
Dijimos que empleamos KOH 0’1 ó 0’5 M según la acidez que se prevea en la
experiencia. Para un aceite refinado (de baja acidez) se emplea 0’1 M, pues así
tendremos que gastar más volumen. Es decir, si empleáramos una concentración 0’5 M
podríamos pasarnos en la valoración. Esto no ocurre con aceites de alta acidez, en los
cuales sí podremos utilizar KOH de concentración 0’5 M.
La KOH va disuelta en etanol porque no podemos emplear agua pues se
produciría una hidrólisis.
El esquema sería el siguiente:
Grasa e    → KOH

tan ol-éter etílico (1:1)
   → V(ml)
/ EtOH 0'1 ó 0'5 M
(P) fenolftaleína
Valoración potenciométrica:
Se emplea como ya dijimos cuando el color o turbidez de la muestra no permite

ver el viraje del indicador.
Se pesa una cantidad (P) de grasa, se disuelve en metilisobutilcetona (MIBK), se
introducen los 2 electrodos y valoramos con KOH en isopropanol.
Cambiamos de disolvente porque con la mezcla anterior de etanol-éter etílico el
salto del p.e. es mayor, con lo que necesitaríamos una mayor precisión para detectarlo.
El esquema sería el siguiente:
Grasa MIBK
→ KOH
  → V(ml)
/ Isopropanol
(P) electrodo de vidrio combinado

El electrodo de vidrio combinado contiene un electrodo de vidrio y otro de

referencia que puede ser de calomelanos ó Ag0/AgCl.
Electvidrio – Electrefer = ∆Elect = f([H+])

cte
(Ver fotocopia nº 13, Tabla 21)
Podemos ver en esta tabla los distintos métodos de determinación de ácidos

grasos libres. Podría llamarnos la atención la determinación de ácidos minerales en
grasas y aceites, pues emplea naranja de metilo como indicador, y según antes dijimos
que no se podía emplear dicho indicador al tener un intervalo de viraje dentro de un pH
ácido (ver página 31). Se puede emplear tal indicador porque la determinación se realiza
a ácidos minerales.
En esta tabla podemos ver la diferencia existente entre emplear métodos

colorimétricos o potenciométricos a una batería de 15 muestras. Como vemos la
diferencia es prácticamente nula.
1.4. Acidez como criterio de calidad. Normativa legal.
La acidez es uno de los parámetros más importantes.

En el aceite de oliva es un parámetro de calidad.
Los parámetros de calidad determinan la categoría comercial de un aceite, es
decir, su denominación. La ley marca el valor de estos parámetros.
Los criterios de pureza se emplean para examinar la pureza de una muestra, es
decir, para detectar adulteraciones.
Categorías del aceite de oliva según la acidez:
(Ver fotocopia nº 14, Anexo I)

2. Determinación de ác. grasos volátiles solubles e insolubles en agua.
Hay grasas con ác. grasos de bajo punto de ebullición, es decir, volátiles los
cuales se pueden separar de las grasas mediante destilación. Son ác. de bajo peso
molecular y saturados.
• Ác. butírico (C4), ác. caproico (C6) à solubles en agua.

• Ác. caprílico (C8), ác. cáprico (C10) y ác. laúrico (C12) à insolubles en agua.
Los que son solubles en agua existen en gran proporción en la mantequilla, sobre
todo el butírico.
Los que son insolubles en agua existen en los aceites de coco y palma.
La sal de Ag+ del ác. butírico es soluble en agua, en cambio la del ác. caproico es
insoluble. Esta condición la podemos aprovechar para poder separar ambos ácidos
grasos.
El resto de aceites casi no contienen nada de estos ác. grasos, luego éstos solo
aparecen en mantequilla, aceite de coco y aceite de palma. Por este motivo se hicieron
determinaciones para caracterizar a la mantequilla, y a los aceite de coco y palma.
Si un aceite de oliva se adultera con aceite de palma la concentración de estos
ác. grasos en el aceite de oliva debe aumentar considerablemente.
Podemos definir 3 tipos de índices para determinar el contenido de estos ác.
grasos:
2.1. Índice de ácidos grasos volátiles solubles en agua (AVS) ó índice de

Reichert-Meissl.
Este índice mide la cantidad de ác. butírico (C4) y ác. caproico (C6).
2.2. Índice de ácidos grasos volátiles insolubles en agua (AVI) ó índice de

Polenske.
Este índice mide la cantidad de ác. caprílico (C8), ác. cáprico (C10) y ác. laúrico
(C12).
2.3. Índice de manteca ó índice de Kirschner.
Este índice mide la cantidad de ác. butírico (C4).

2.4. Método oficial de determinación de los índices de Reichert-Meissl,

Polenske y Kirschner.
Para determinar el contenido de estos ác. grasos se realiza la destilación de ellos

a partir de una muestra de grasa saponificada (para así determinar tanto los ác. grasos
libres como los que forman parte de los TG).
Partimos de una muestra de grasa, aproximadamente 5 g. Saponificamos con una
base fuerte en caliente. Los TG se hidrolizan, quedándonos los jabones y glicerina. Si
dejamos cristalizar los jabones se quedan hechos una pasta, por ello los disolvemos
añadiendo agua. Seguidamente liberamos los ác. grasos de los jabones hidrolizando en
medio ácido, para ello empleo un ác. fuerte à H2SO4. De esta manera obtengo todos
los ác. grasos que hay posibles (tanto los libres como los que formaban parte de los
TG), junto a la glicerina, ... Destilamos y obtenemos los ác. grasos C4, C6, C8, C10 y
C12. Parte de estos ácidos son solubles en agua, otros no, pero en agua caliente también
lo son. Luego así tendremos los 5 ác. grasos que recogemos en un matraz de destilación.
Una vez fríos se separan aquellos que son insolubles por filtración.
Así obtenemos una fracción soluble, que contiene aquellos ác. grasos solubles en
agua à C4 y C6, y otra fracción insoluble con aquellos que lo son à C8, C10 y C12.
• Tomamos la fracción insoluble con los ác. grasos C8, C10 y C12, y se
disuelven en etanol, así ya no estarán precipitados, sino en disolución.
Seguidamente hacemos una valoración ác-base empleando NaOH 0’1M.
Para esta valoración hemos empleado un volumen V1. Así hemos
determinado el índice de Polenske ó AVI.
• Tomamos la fracción soluble con los ác. grasos C4 y C6 y realizamos
nuevamente una valoración ác-base con NaOH 0’1M. Para esta valoración
hemos empleado un volumen V2. Así hemos determinado el índice de
Reichert-Meissl ó AVS. Tras la valoración tenemos jabones de Na+ de los
ác. grasos C4 y C6 a los cuales añadimos una sal de Ag+ para así poder
separarlos. Como fracción soluble quedará el jabón de Ag+ del C4 y como
fracción insoluble el jabón de Ag+ del C6. A la fracción soluble le añadimos
H2SO4, destilamos para eliminar el disolvente y valoramos con NaOH 0’1M.
Para esta valoración hemos empleado un volumen V3. Así hemos
determinado el índice de manteca o de Kirschner.
Un esquema podría ser el siguiente:
Grasa    → Jabones + Glicerina 

→ →
Saponifica ción H 2O H 2SO 4
Ác. grasos libres + ...
NaOH/∆
(≈5 g.)
destilación
C4 , C6, C8, C10 y C12

filtración
Fracción soluble Fracción insoluble

C4 y C6 C8, C10 y C12 ↓
Valoración ác-base NaOH 0’1M à V2 EtOH
C8, C10 y C12

(disueltos)
Índice de Reichert-Meissl
Jabones de Na+ de C4 y C6 Valoración ác-base NaOH 0’1M à V1
H2SO4
Índice de Polenske
C4
destilación
C4
Valoración ác-base NaOH 0’1M à V3
Índice de manteca ó de Kirschner
(Ver fotocopia nº 15, Figura 10)
Aquí podemos ver un aparato de destilación para determinación de los índices de

Reichert-Meissl y de Polenske.
- AVI ó índice de Polenskeà es el nº de ml de base 0’1 N necesarios para valorar los

ác. grasos volátiles insolubles en agua destilados a partir de 5 g. de grasa à V1.
- AVS ó índice de Reichert-Meisslà es el nº de ml de base 0’1 N necesarios para
valorar los ác. grasos volátiles solubles en agua destilados a partir de 5 g. de grasa
à V2.
- Índice de manteca ó índice de Kirschnerà es el nº de ml de base 0’1 N necesarios
para valorar los ác. grasos volátiles solubles en agua cuya sal de Ag+ es además
soluble en agua (C4) destilados a partir de 5 g. de grasa à V3.
(Ver fotocopia nº 13, Tabla 25 y tabla parte inferior)
Aquí podemos ver que el valor numérico en el AVI es muy grande en la

mantequilla, aceite de coco y de palma, siendo menor a 1 en el resto de aceites.
Igualmente esta tendencia sigue en el AVS e índice de manteca.
La utilidad de estos índices está en buscar adulteraciones de la mantequilla con
otras grasas, generalmente con aceite de coco y de palma al tener valores similares.
De manera que:
• Si la muestra de mantequilla contiene un aceite cualquiera, ya sea aceite de

coco, palma u otro à el índice de manteca y el AVS disminuyen.
• Si la muestra de mantequilla contiene un aceite que no sea ni aceite de coco
ni de palma à el AVI disminuye.
• Si la muestra de mantequilla contiene un aceite ya sea aceite de coco o de
palma à el AVI aumenta.
La determinación de estos índices presenta algunos inconvenientes:
- Utilización de material de vidrio atacable por las bases.

- Saponificación incompleta en algunas muestras.
No existe ninguna forma clara para saber cuándo se ha saponificado una
muestra totalmente. Por ello lo que se suele hacer es forzar las condiciones
de saponificación (aumentando el tiempo de operación).
- No se llegan a separar completamente los ác. grasos, pues los que no son
insolubles en agua en realidad sí lo son aunque sea un poco.
- Se pueden sufrir pérdidas de ésteres volátiles.
Por tanto la determinación de ác. grasos se hace actualmente mediante C.G.,

técnica que además de ser más precisa y exacta, se pueden obtener todos los ác. grasos.
3. Índice de saponificación.
3.1. Definición.
El índice de saponificación se define como el nº de mg de KOH necesarios para

saponificar 1 g. de grasa. Recordar que para saponificar debemos hacerlo en caliente.
Si realizamos esta operación en frío lo que estamos haciendo una valoración de
ác. grasos libres, con lo que estaríamos determinando la acidez y no el índice de
saponificación.
+ −
T.G. Na
OH
→ Jabones + Glicerina à Saponificación
en caliente
+ −
T.G. Na
OH
→ Jabones + Glicerina à Valoración de ác. grasos libres
en frío
En la saponificación la base hidroliza a los TG, pero también una pequeña

cantidad de ella hidroliza a otros ésteres como son: ésteres de esteroles, ceras (que son
ésteres de ác. grasos y alcoholes alifáticos), además de los ác. grasos libres.
El procedimiento general del índice de saponificación consiste en tratar la grasa
con un exceso de base fuerte, calentando a reflujo. Posteriormente el exceso de base se
valora por retroceso empleando un ác. fuerte de concentración conocida en presencia de
fenolftaleína.
+ −
T.G. Na
OH
→ Jabones + exceso de NaOH + Glicerina
en exceso y
en caliente
fenolftaleína HCl, N
Con el valor de V calculo la cantidad de KOH que no ha reaccionado, es decir,

el exceso. Para calcular el índice de saponificación restamos esta cantidad a la que
pusimos inicialmente. El problema está en que las disoluciones de KOH son inestables,
además calentamos a reflujo. Por ello paralelamente hacemos un blanco y valoramos la
KOH en exceso. Obtenemos un volumen V’ para esta valoración.
Entonces, siendo:
V: ml de ácido empleado en valorar la muestra.

V’: ml de ácido empleado en valorar el blanco.
N: normalidad del ácido.
P: peso de la muestra.
nº de equivalente de muestra
para pasar a litros
Índice de saponificación =
(V'-V) · 10 -3
· N · 56'1· 10 3 peso equivalente
P
para pasar a mg
Índice de saponificación =
(V'-V) · N · 56'1
P
3.2. Ventajas e inconvenientes.
- Saponificación incompleta:
Cuando ocurre una saponificación incompleta se obtiene un índice de

saponificación menor al real. Ocurre en muestras que contengan alto contenido en ceras,
las cuales son difíciles de saponificar à aceites de animales marinos (ballena, bacalao,
tiburón).
Cuando la cantidad de materia insaponificable es alta también la saponificación
es incompleta. Hay muestras de hasta un 3% de insaponificable, cabe recordar que la
mayoría de las grasas o aceites tienen hasta un 1%. Ej: aceite de salvado de arroz.
Hay pues que forzar en estos casos las condiciones de saponificación, por
ejemplo aumentando el tiempo de operación.
- Pérdida de ésteres volátiles a través de las juntas del refrigerante.
Por ejemplo, muestras con ác. butírico (C4) à mantequilla, pueden perder dicho
ácido en forma de butirato de etilo, con lo que el índice de saponificación disminuye.
- Ataque del vidrio por el álcalis (la base) que se emplea en la saponificación
à KOH.
- Por el disolvente utilizado en la saponificación.
Se suele emplear etanol, aunque en casos en que la muestra sea difícil de

saponificar será necesario utilizar un disolvente de un mayor peso molecular que la del
etanol: propanol, butanol, ..., pues de esta forma aumentará la solubilidad de la grasa y
la temperatura de ebullición, por tanto la velocidad de la reacción será también mayor.
3.3. Métodos oficiales de determinación del índice de saponificación:

“Método colorimétrico y método potenciométrico”
Valoración colorimétrica:
A la muestra de grasa se le añade un exceso de KOH disuelto en etanol.

Calentamos a reflujo durante 1 hora. De esta forma obtenemos los jabones, glicerina y
el exceso de KOH. Dejamos enfriar un poco, añadimos fenolftaleína como indicador y
valoramos con HCl 0’5M.
Hemos dicho que se deja enfriar un poco por 2 motivos: porque la fenolftaleína
no vira en caliente y porque si se enfría mucho los jabones se gelatinizan.
Paralelamente hacemos un blanco.
Muestra KOH
 → Jabones + exceso de KOH + Glicerina
/ EtOH
en exceso y
(P)
en caliente
(1 hora)
fenolftaleína HCl, 0’5 M
Blanco KOH
 → Ídem
/ EtOH
en exceso y
en caliente
(1 hora)
Este método se aplica únicamente cuando el contenido en ceras es menor al 5%.

Si es mayor al 5% la muestra es difícil de saponificar con lo que habría que usar
un método típico para este tipo de muestras.
Valoración potenciométrica:
Se emplea cuando por el color o turbidez de la muestra no se permite visualizar

con claridad del viraje del indicador.
Se emplea por tanto un electrodo de vidrio combinado, es decir, un pHmetro.
Recordar que el disolvente KOH se diluye en isopropanol porque en estas
circunstancias el salto del pH es más brusco, con lo que también es más claro.
La muestra se calienta también a reflujo, pero el tiempo de operación es la
mitad, es decir, 30 minutos (antes era 1 hora), pues al haber empleado un disolvente de
mayor peso molecular (isopropanol) la potasa (KOH) se disuelve mejor en él, con lo
que no se requiere calentar más tiempo.
El índice de saponificación se emplea como criterio de pureza.
(Ver fotocopia nº 16, Tablas 3, 1 y 5)

Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 3: Índices enométricos 43
TEMA 3: ÍNDICES ENOMÉTRICOS
1. Insaturación en las grasas: generalidades, métodos para su medida.
La instauración en su práctica totalidad es debida a la presencia de los ácidos

grasos en la grasa o aceite.
Para medir la instauración se ha utilizado generalmente la capacidad que tiene el
doble enlace C=C de adicionar: halógeno (X2), hidrógeno (H2), tiocianógeno ((SCN)2).
X2
H2
C C
(SCN)2
Son por tanto métodos de adición.

Existen otros métodos utilizados para medir la instauración como son:
a) Medidas del índice de refracción
Cuando se hidrogena una grasa (margarina por ejemplo) para saturarla de nuevo
podemos seguir dicha hidrogenación haciendo medidas del índice de refracción ya que
éste va variando.
b) Medidas de la absorción U.V.
Se emplea para medir enlaces dobles conjugados C=C–
c) Cromatografía de gases.
Nos permite determinar el contenido en ác. grasos totales de una muestra tanto
de saturados como de insaturados.
Dentro de los métodos de adición los más usados son los de adición de
halógenos, tanto por la CE como por el COI utilizan este tipo de adición para plantear
sus métodos oficiales.
C C →
X2
C C
X X
Además de adición puede producirse una reacción parásita como es la

sustitución, con lo que implicaría un error:
C C C C X
El que se lleve en mayor o menor medida esta reacción parásita depende de la

reactividad del halógeno.
Si el halógeno es muy reactivo se dará más sustitución.
Cl2 > Br2 > I2
reactividad
Por tanto deberíamos emplear I2 que es el menos reactivo, pero lo es demasiado

por lo que se emplean combinaciones de halógenos. Ej: ICl, IBr. Aunque los resultados
siempre se expresan en gramos de I2.
2. Índice de yodo.
2.1. Definición.
Es el peso de I2 adicionado (absorbido) por 100 partes en peso de grasa
g. I2
(%)
100 g. grasa
2.2. Determinación: procedimiento general y causas de error.
En primer lugar se pone la muestra en contacto con un exceso de reactivo

halogenante, suficiente como para adicionar halógenos en todos los dobles enlaces:
C C + X2 en exceso C C + exceso X2
X X
Este exceso de X2 se reduce con KI también en exceso:
exc X2 + 2KI en exceso 

→ 2KX + I2
(se ha generado tanto I2
como exceso de X2 había)
Finalmente se valora el I2 generado con S2O3-2 usando como indicador almidón:
I2 + 2S2O3-2 almidón
→ 2I- + S2O2-2
Nota: vemos que por cada mol de I2 reaccionan 2 moles de
tiosulfato, por tanto la valencia en el nº de equivalentes es 2
(ver más abajo la expresión del índice de yodo).
Sea:
V: ml de Na2S2O3 consumidos en la muestra, para valorar el exceso de X2.

V’: ml de Na2S2O3 consumidos en el blanco, para valorar todo el X2.
M: molaridad del Na2S2O3.
P: peso de la muestra.
Hay pues que hacer un blanco por ser inestable el X2.

nº de equivalente de muestra
para pasar a litros
(V'-V) · 10 -3 · M 2 · 254 peso equivalente

Índice de yodo = · 100
P
Índice de yodo =
(V'-V) · 10 -3 · M ·12'7
P
Causas de error:
• Son debidos fundamentalmente a impedimentos estéricos, pues

adicionamos un halógeno, una molécula que es voluminosa.
Existe pues impedimento estérico debido a que el doble enlace (en donde se
adiciona el halógeno) está muy cerca del grupo carboxílico:
O
CH CH C
OH
X2
• También hay impedimento estérico si tenemos un triple enlace –C≡C–.
En este caso serán 2 las moléculas de I2 que deben adicionarse, con lo que tras la
1ª adición será muy difícil que se produzca la 2ª, como consecuencia bajaría el índice de
yodo. Aunque es raro encontrar triples enlaces en los ác. grasos.
• También habrá impedimento estérico cuando los dobles enlaces a los que
se adiciona el halógeno son conjugados.
–C=C–C=C–
En estos casos se emplea un método específico que aparece más abajo.

Como ejemplo de una muestra grasa con una cantidad apreciable de enlaces
conjugados tenemos el aceite de Tung o de madera de China. Este aceite contiene el
ácido eleosteárico (18:3 9,11,13)que es un isómero del ácido linoleico (18:3 9,12,15).
En este caso, la presencia de 3 dobles enlaces conjugados hace que de las 3
moléculas de I2 solo se adicionen 2, con lo que el índice de yodo obtenido sería 2/3 del
real. Por tanto debemos utilizar un procedimiento distinto al general como ya habíamos
indicado anteriormente.
Aquí podemos ver la comparación de los resultados obtenidos por este método
alternativo y los valores teóricos. Este método denominado método Wijs lo veremos en
el siguiente apartado.
Por ejemplo, para la determinación del índice de yodo del ác. elaídico (18:19,t),
que es isómero del ác. oleico (18:19):
282 g. (1 mol) de ác. elaídico adiciona

 → 254 g. (1 mol) de I2
100 g. de ác. elaídico adiciona
 → X g. de I2 = Índice de yodo
254 g. de I2 · 100 g. de ác. elaídico

Índice de yodo = X g. de I2 = = 90'07
282 g. de ác. elaídico
Aquí podemos ver el índice de yodo para 2 isómeros del ác. esteárico, para el
aceite de Tung y el aceite de Tung hidrogenado. Además aparece el índice de
hidrógeno, índice que nos da valores más exactos de la insaturación.
2.3. Métodos oficiales de determinación del índice de yodo: “método de

Wijs y método de Hanus”.
Hemos dicho que hemos de añadir siempre un exceso de reactivo halogenante,

suficiente como para asegurarme que todos los dobles enlaces C=C se han saturado con
X2. Pero este exceso no debe ser demasiado alto porque se favorecerían las reacciones
de sustitución.
Según el índice de yodo esperado, así será la cantidad de grasa a emplear con
una determinada cantidad de reactivo halogenante. Por lo que:
- Si la muestra es muy saturada à pesaremos más muestra.

- Si la muestra es muy insaturada à pesaremos menos muestra.
Método de Wijs:
Este es el método oficial tanto para la CE como para el COI.

El procedimiento que sigue es como el método general, la diferencia está en la
cantidad y tipo de reactivos.
Se añade a la muestra ciclohexano en ác. acético y añado ICl en exceso. Esta
mezcla se mantiene al abrigo de la oscuridad pues el reactivo es muy inestable a la luz
durante 1 ó 2 horas. El tiempo dependerá de las insaturaciones que tenga la muestra.
Añadimos KI en exceso para reducir el reactivo que no ha reaccionado con la muestra,
es decir, el exceso de ICl. Se valora el I2 formado con S2O3-2 y empleamos almidón
como indicador.
Paralelamente realizo un blanco.
Muestra ciclohexan
 o → ICl
en → 1 ó 2 horas KI
exceso
en → KCl + I2
exceso
HAc
(P)
valoración con
almidón
S2 O3-2
Método de Hanus:
Es igual al de Wijs con la diferencia de que se emplea BrI en lugar de ICl como
reactivo halogenante. Se empleaba en España (UNE) pero se abandonó porque en
algunos casos daban resultados menores a los que daba el método de Wijs.
2.4. Índice de yodo como criterio de pureza.
El índice de yodo sirve para caracterizar una grasa o aceite.

Hace tiempo se empleaba para detectar adulteraciones.
Según el índice de yodo obtenido se pueden clasificar los aceites en 3 grupos:
- Secantes à I.Y. > 130 (se emplean para pintar)

- Semisecantes à 100 < I.Y. < 130
- No secantes à I.Y. < 100
(Ver fotocopia nº 18, Tablas 13.1 y 13.2)
Aquí podemos ver esta clasificación de grasas y aceites según el índice de yodo.
3. Índice de hidrógeno.
Se usa solo en algunos casos determinados.

Cualquier grasa insaturada es capaz de adicionar H2 en presencia de un
catalizador. En esta técnica se basa la hidrogenación comercial. Como catalizador se
emplea Ni.
Sirve para obtener una grasa sólida o fluida a partir de una líquida. Esto ocurre
porque al saturar los dobles enlaces se obtienen compuestos con punto de fusión más
altos.
Los norteamericanos usan el aceite de soja para su consumo. Este aceite contiene
un alto porcentaje en ác. linolénico (18:3). El problema está en que este aceite cuando se
almacena y cuando se fríe es muy inestable, pues se oxida rápidamente al ser muy
insaturado. Por ello hidrogenan dicho aceite y así tener menos insaturaciones (ác.
linoleico (18:2)) para ser más estable.
Para determinar la insaturación de una grasa se utiliza el índice de H2 cuando
exista un % apreciable de dobles enlaces conjugados. Ej: aceite de Tung.
Antes vimos que la adición de una molécula de X2 era difícil por impedimento
estérico, ahora la molécula de H2 es más pequeña, con lo que no existe ese impedimento
estérico. Por tanto, siempre que el índice de I2 dé problemas se emplea el índice de H2.
No se hace esta determinación a cualquier tipo de aceite porque es muy costosa

y la técnica es muy delicada (requiere especialización).
3.1. Definición.
Es análoga a la del índice de yodo.

Es la cantidad de H2 expresada en gramos de I2 adicionada (absorbida) por 100
partes en peso de grasa.
g. H2 (en g. de I2)
(%)
100 g. grasa
Para determinar el índice de hidrógeno la muestra se pone en contacto de un

volumen conocido de H2 en presencia de un catalizador. Calentamos hasta asegurarnos
que todos los dobles enlaces se hayan saturado.
Paralelamente se hace un blanco.
Así se determina el volumen de H2 absorbido por la muestra.
Para su realización se requiere de un dispositivo.
Veamos la expresión del índice de hidrógeno, sean:
V: ml de H2 absorbido por la muestra.

V’: ml de H2 absorbido por el blanco (catalizador y disolvente).
Entonces el volumen absorbido por la grasa es V – V’.
[V - V'] ( ml ) · 254 (g mol )

Índice de hidrógeno = ·100
22.400 (ml mol ) · P ( g )
Índice de hidrógeno =
[V - V']· 1'134
P
Se expresa el índice de H2 referida a la cantidad de H2 expresada en g. de I2 para

así poder compara ambos índices.
3.2. Ventajas e inconvenientes frente al índice de yodo.
Como ventaja podremos citar que este método es el único para determinar la
insaturación total de grasa con conjugación.
Como inconveniente tenemos que su determinación es costosa y complicada
(pues un gas es más difícil de manejar que un sólido).
3.3. Método oficial de determinación del índice de hidrógeno.
La muestra una vez pesada se disuelve en acético y la ponemos en contacto con

una cantidad conocida de H2 en presencia de un catalizador (Ni, Pd, Pt, ...). La mezcla
se calienta y la cantidad de H2 adicionada se determina volumétricamente por
diferencia. Se hace también un blanco porque el catalizador y el disolvente pueden
absorber H2. (Ver fotocopia nº 19, Tabla 32) à variaciones del procedimiento del I.H.
4. Índice de tiocianógeno.
El tiocianógeno (SCN)2 es un compuesto que se comporta de manera similar a

los halógenos, por ello se le conoce como un pseudohalógeno.
Se emplea para medir la insaturación de una grasa.
- En el caso de tener un ácido graso monoinsaturado, por ejemplo el ác. oleico

(18:1), se adiciona la misma cantidad de (SCN)2 que de I2 usábamos en el
índice de yodo. Por tanto en este tipo de ácidos grasos:
I.Y. ≈ I.T.
- En el caso de tener un ácido graso poliinsaturado

v para un ácido diinsaturado, el ácido linoleico (18:2), se adiciona
aproximadamente la mitad de (SCN)2 de la cantidad de I2 que usábamos
para el índice de yodo. Por tanto en este tipo de ácidos grasos:
I.Y. ≈ 2 · I.T.
v para un ácido triinsaturado, el ácido linolénico (18:3), se adiciona (SCN)2

sólo a 2 de los 3 dobles enlaces. Entonces se adiciona aproximadamente
3/2 de (SCN)2 de la cantidad de I2 que usábamos para el índice de yodo.
Por tanto en este tipo de ácidos grasos:
I.Y. ≈ 3
2 · I.T.
Esto puede deberse a que la molécula de (SCN)2 es muy grande en comparación

con el I2.
4.1. Definición.
Es el peso de (SCN)2 expresado en gramos de I2 absorbido por 100 partes en

peso de grasa.
Veamos la expresión del índice de tiocianógeno, sean:
V: ml de Na2S2O3 absorbido por la muestra.

V’: ml de Na2S2O3 absorbido por el blanco (catalizador y disolvente).
M: molaridad del Na2S2O3 en moles/litro.
P: peso de la muestra en gramos.
[V - V'] · 10 -3 · M · 254
Índice de tiocianógeno = 2 · 100
P
Índice de tiocianógeno =
[V - V'] · M · 12'7
P
(Ver apartado 4.3. , página 53, para entender mejor esta expresión)
4.2. Ventajas e inconvenientes frente al índice de yodo.
Como inconveniente decir que al no adicionarse todo el tiocianógeno en ác.

grasos poliinsaturados, tan solo sirve para determinar la insaturación en ác. grasos
monoinsaturados.
Por el contrario, como ventaja está la determinación cuantitativa de ciertas
mezclas de ácidos grasos.
Aquí podemos ver las comparaciones entre los distintos índices que hay.
Kauffmann desarrolló una serie de ecuaciones para poder determinar la

composición cuantitativa de ciertas mezclas de ácidos grasos.
Lo hizo para 2 tipos de mezclas:
a) Cuando no hay ác. linolénico.
181'1 · Y + 89'9 · Z = 100 · I.Y.

96'7 · Y + 89'9 · Z = 100 · I.T.
100 = S + Y + Z
b) Cuando hay ác. linolénico.
273'7 · X + 181'1 · Y + 89'9 · Z = 100 · I.Y.

167'1 · X + 96'7 · Y + 89'9 · Z = 100 · I.T.
100 = S + X + Y + Z
“S” es el % de ácidos grasos saturados, luego por otro lado hay que calcularla.
Este método no es del todo preciso, pero nos sirve como aproximación.
4.3. Método oficial de determinación del índice de tiocianógeno.
Es norma UNE. Es un método análogo al de determinación del índice de yodo.

Lo que varía es el reactivo.
La muestra se pone en contacto con un exceso de tiocianógeno, se deja actuar
durante 24 horas hasta que se produzcan todas las adiciones posibles a los dobles
enlaces. Posteriormente el exceso de (SCN) 2 se reduce con KI, así obtenemos I2 el cual
se valora con Na2S2O3 en presencia de almidón. Paralelamente se hace un blanco.
El reactivo (SCN)2 no se comercializa porque es muy inestable, hay que
prepararlo cuando vayamos a usarlo.
Preparación del reactivo:
Se mezcla Ac2Pb y KSCN. Se obtiene un precipitado (Pb(SCN)2) el cual se

filtra, seca y guarda para el momento de su uso. Cuando se vaya a usar se disuelve en
acético y se mezcla con una disolución de Br2/acético hasta que se decolore (lo cual
indica que hay un exceso de Br2). Se obtiene:
(SCN)2 + PbBr2↓ (insoluble)
5. Índice de dienos.
Se emplea para medir el contenido en dobles enlaces C=C conjugados. Por tanto
no sirve para determinar la insaturación total. Se usa pues para casos particulares,
incluso hay otros métodos (por ejemplo absorción en U.V.) para ello.
Por ejemplo se usa con el aceite de Tung (o de madera de China) que contiene el
ácido eleosteárico, que es como el linolénico, pero con los dobles enlaces conjugados en
las posiciones 9, 11 y 13 à 18:39,11,13. También se usa con el aceite de oitica (que
además contiene un grupo ceto).
Para la determinación del índice de dienos se emplea como reactivo el anhídrido
maleico. Este reactivo se adiciona a dobles enlaces conjugados llevándose a cabo una
cicloadición de Diels-Alders.
Determinación:
La muestra se pone en contacto con un exceso de anhídrido maleico y se calienta

a reflujo hasta obtener el aducto correspondiente. Posteriormente el exceso de reactivo
se hidroliza añadiendo agua y calentando, de esta forma obtenemos el ácido a partir del
anhídrido. Finalmente el ácido maleico generado se valora con NaOH en presencia de
fenolftaleína. De esta valoración obtengo la cantidad de reactivo no adicionado, por ello
paralelamente se realiza un blanco.
CH2 O CH2 O O
CH CH C ∆ CH CH C CH C
+ O O + O
CH CH C reflujo CH CH C CH C
CH2 O CH2 O O
anhídrido exceso de
dieno maleico en aducto anhídrido
exceso maleico
Veamos la expresión del índice de tiocianógeno, sean:
V: ml de NaOH absorbido por la muestra.

V’: ml de NaOH absorbido por el blanco.
M: molaridad de NaOH en moles/litro.
P: peso de la muestra en gramos.
[V - V']· 10 -3 · M · 254
Índice de dienos = 2 · 100
P
Índice de dienos =
[V - V'] · M · 12'7
P
Definición:
Es el peso de anhídrido maleico en gramos de I2 absorbido por 100 partes en

peso de grasa.
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 4: Fracción insaponificable 57
TEMA 4: FRACCIÓN INSAPONIFICABLE.

DETERMINACIÓN Y ANÁLISIS
1. Componentes menores y fracción insaponificable: conceptos,

composición y expresión.
El contenido del insaponificable está entre el 2-3 % del total de la grasa.

La fracción insaponificable son aquellas sustancias que una vez saponificada la
grasa quedan insolubles en agua, siendo solubles en el disolvente utilizado para su
determinación.
(Ver componentes en Tema 1, páginas 7-18)
La determinación total de los componentes menores es muy difícil por su diversa

naturaleza (recordar que cada componente es distinto, por ejemplo en cuanto a polaridad
varían mucho unos de otros), por tanto lo más parecido a esta determinación es la
determinación del insaponificable.
La mayoría de los componentes del insaponificable se determinan por
cromatografía de gases.
En el aceite de oliva se determina el insaponificable para determinar su pureza,
por tanto es un análisis de rutina.
La forma de expresarlo es en g/Kg (‰).
2. Determinación del “insaponificable”. (Ver fotocopia nº 23, Tabla 23)
2.1. Procedimiento general y causas de error.
Se toma una muestra (P) de grasa, se le somete a saponificación con KOH en

etanol y en caliente. De esta forma obtenemos los jabones potásicos y la glicerina
disueltos en H2O/EtOH, permaneciendo insolubles parte de los componentes menores
que extraemos con un disolvente orgánico apropiado. Decimos que permanecen parte
como insolubles porque algunos componentes menores como pueden ser los
polifenoles, ácidos grasos de ceras y de esteroles, etc..., sí son solubles en agua.
De esta forma tenemos 2 fases:
a) Fase H2O/EtOH: en donde permanecen los jabones, glicerina y algunos de

los componentes menores (o parte de ellos).
b) Fase etérea (pues se extrae con éter de petróleo o etílico): a donde pasa la
fracción insaponificable.
Seguimos con la fase etérea. El insaponificable se lava para eliminar los restos
de jabón que queden (pues estos son solubles en agua, pero no se emplea únicamente
agua pues se pueden hidrolizar los ácidos grasos del jabón, por ello lleva una pequeña
cantidad de KOH, para que la reacción de hidrólisis se invierta, ya veremos más
adelante que esta es una de las causas de error). A continuación eliminamos el
disolvente orgánico empleado en la extracción mediante una operación de secado.
Pesamos el producto final, ya seco, y obtenemos una cantidad P’, que es el
insaponificable.
La expresión para calcular el % de insaponificable es:
P'
% Insaponificable = · 100
P
Grasa enKOH
caliente
 → Jabones (K+) + Glicerina + Componentes menores
/ EtOH
(P)
disolvente orgánico extracción
fase etérea fase H2 O/EtOH
Insaponificable Jabones (K+) + Glicerina

+ algunos componentes menores o parte de ellos
lavado
secado
pesada
P’
(insaponificable)
Causas de error:
Saponificación incompleta: algo que también era un problema en la

determinación de los índices AVI, AVS y de manteca. Para evitar esto se fuerzan
las condiciones de operación, por ejemplo aumentando el tiempo de la
saponificación.
Si la saponificación es incompleta, el error en la determinación del % de
insaponificable es por exceso, pues parte de lo que se saponifica pasa a la fracción
insaponificable, con lo que aumentaría la cantidad de éste y por tanto el porcentaje.
Extracción incompleta: pues una extracción líquido-líquido nunca es completa,

ya que siempre hay parte que no se extrae. Además en la muestra hay muchos
analitos, cada uno con diferente polaridad, luego la extracción dependerá
también del disolvente empleado, el cual deberá tener una constante de reparto
muy alta, y que sea un buen disolvente en general para la mayoría de los
compuestos.
Como disolventes empleamos:
- Éter de petróleo: es una mezcla de hidrocarburos.

- Éter etílico.
El éter de petróleo es menos polar que el éter etílico, por tanto disolverá mejor,
(extraerá mejor) a aquellas sustancias semejantes a él, es decir, a los compuestos menos
polares de todos à los hidrocarburos.
Formación de emulsiones: éstas se rompen añadiendo KOH, HCl, ..., en

definitiva, un electrolito fuerte que aumente la fuerza iónica de la fase acuosa
haciéndola más insoluble en el éter.
Impurificación del extracto con jabones: el extracto puede arrastrar parte de

los jabones, por ello lavamos en agua, pero no solo con agua, pues se pueden
hidrolizar los jabones según la siguiente reacción:
RCOO-K+ RCOO- + H2O RCOOH + OH-

Por ello se emplea agua con un poco de potasa para invertir la reacción de
hidrólisis.
Cuando ya no quedan jabones se sigue lavando con agua hasta que el agua de
lavado no dé color con la fenolftaleína.
Pérdida de componentes volátiles en el secado: al calentar la muestra se

pueden perder componentes volátiles (por ejemplo aldehídos), por ello para la
eliminación del disolvente orgánico se trabaja a P y T reducidas empleando un
rotavapor.
2.2. Métodos oficiales: “Método del éter de petróleo” y “Método del éter
etílico”. Comparación. (Ver fotocopia nº 23, Tabla 25)
Método del éter de petróleo:
Se produce la saponificación de la muestra durante una hora añadiendo potasa en

etanol. Obtenemos jabones, glicerina y una parte insaponificable. Disolvemos los
jabones con agua y extraemos 3 veces con éter de petróleo. Destilamos para eliminar el
disolvente y secamos en una estufa a 105 ºC para eliminar restos de agua y disolvente.
Pesamos. El extracto etéreo suele quedar impurificado por jabones, por ello lavamos
con agua y etanol.
Método del éter etílico:
Es similar al anterior, pero en este caso el extracto etéreo queda impurificado por
ácidos grasos libres al ser más solubles estos en tal disolvente. Por ello lavamos con
agua y sosa. El disolvente se elimina por rotavapor, pues no destilamos al ser muy
inflamable.
3. Metodología oficial para el fraccionamiento del insaponificable.
Se emplea la cromatografía como método de fraccionamiento del insaponificable.

Se emplea la cromatografía como método de fraccionamiento, tanto la
cromatografía en columna y la cromatografía de capa fina (CCF). También se emplea la
cromatografía de adsorción, pero no la veremos.
Polaridad del insaponificable:
Xantofilas (el O2 les da esa polaridad elevada) > esteroles (que llevan el
eritrodiol y el uvaol, que a pesar de ser alcoholes terpénicos por la polaridad aparecen
en este grupo) > alcoholes (grasos y terpénicos) > tocoferoles > hidrocarburos
(saturados e insaturados, siendo los carotenos los más polares).
3.1. Análisis de hidrocarburos: “Cromatografía en columna”.
Se emplea como fase estacionaria la sílice(SiO2) ó la alúmina (Al2O3),

previamente activados. Son fases estacionarias que son polares.
Como fase móvil se emplean disolventes orgánicos o mezcla de ellos, según sea
la polaridad de los componentes a separar:
Hexano o éter de petróleo < CCl4 < benceno < éter etílico < EtOH < MeOH
polaridad
Fijo la muestra en la columna y añado eluyentes para obtener los distintos

componentes. Se emplea para analizar la fracción que eluye antes, es decir, la menos
polar del insaponificable.
Se suelen emplear eluyentes apolares o poco polares, por ejemplo el hexano,
para separar a los hidrocarburos que son los componentes menos polares, por tanto se
separan muy bien. Añadimos otro eluyente que aumente la polaridad de la mezcla para
seguir con el fraccionamiento de otros componentes más polares, por ejemplo con
benceno, éter etílico, etc ..., pero como decimos se usa para analizar la fracción que
eluye antes, para el resto se emplea la CCF.
Si empleamos el método del éter etílico uso alúmina pues los ácidos grasos
pueden interferir en la cromatografía al ser la alúmina básica (retiene los ácidos).
También puedo usar sílice tratada con potasa. Como eluyente empleo hexano con lo que
eluimos los hidrocarburos, si uso hexano–benceno (1:1) son los carotenos los que lo
hacen.
3.2. Análisis de esteroles, eritrodiol y uvaol, (alcoholes alifáticos) y

tocoferoles: “Cromatografía en capa fina” (CCF).
Usamos alúmina o sílice, y si el extracto proviene del método del éter etílico uso
potasa para cubrirlos. Como fase móvil empleo hexano–éter etílico (2:1) o benceno–
acetona (95:5).
Aparecen en la placa 5 manchas:
1
1 Hidrocarburos
2
2 Tocoferoles
3
3 Alcoholes
4
4 Esteroles
5
5 Xantofilas
Definimos el Rf como:
distancia recorida por el compuesto

Rf =
distancia recorida por el frente del disolvente
En el caso de hidrocarburos, Rf ≈ 1.
Nota: el eritrodiol y uvaol son alcoholes terpénicos importantes para detectar

adulteraciones en el aceite de oliva con aceite de orujo como ya dijimos.
El contenido en insaponificable se usa como criterio de pureza:
Aceite de oliva ≤ 15 g/Kg; Aceite de orujo ≤ 30 g/Kg
Las xantofilas son productos de oxidación de los carotenos:
Carotenos [→
O 2]
 Xantofilas
Los carotenos son hidrocarburos apolares, que tras la oxidación pasar a ser
xantofilas que contienen O2 que le da la polaridad.
En un análisis de rutina, de los 5 grupos que hay, solo se analizan 2 como

criterios de pureza para detectar adulteraciones:
- Hidrocarburos
- Esteroles (E + U)
Además también se analizan las ceras, pero estas no forman parte del
insaponificable.

(Ver fotocopia nº 21, estructura del uvaol)
Fase estacionaria: (polar)
Se emplea sílice (SiO2) que ha sido tratada con KOH porque el extracto de éter
etílico dijimos que puede ir impurificado con ácidos grasos de jabones, dichos ácidos
pueden interferir en la cromatografía con lo que la mancha que dan puede solaparse con
la del resto de componentes. Si empleo KOH estos ácidos grasos quedan retenidos en la
fase estacionaria.
Fase móvil: (apolar)
Suele emplearse una mezcla hexano:éter etílico (65:36)
Patrones:
Se emplean patrones de cada grupo de compuestos para poder identificarlos.
Revelador:
Se emplea 1’,2’-diclorofluoresceína (llamada normalmente por fluoresceína)

pulverizándola sobre la placa. El color de la fluoresceína es amarillo, pero la
fluorescencia es verde. El revelado se observa bajo luz ultravioleta en una habitación
oscura. Se puede observar un fondo verde fosforito con manchas oscuras debidas a que
los compuestos orgánicos absorben parte de la luz ultravioleta de la lámpara.
El dibujo podría ser el siguiente:
placa
lámpara U.V.
4. Análisis de los constituyentes del insaponificable y/o componentes

menores.
Nota: daremos en primer lugar los esteroles, pues vamos a seguir el orden de
importancia de análisis, siendo en los primeros casos análisis de rutina.
4.1. Esteroles.
Consiste en determinar el contenido total de esteroles o bien la composición de

cada uno de ellos.
Determinación del contenido total: “precipitación con digitonina”.
Existe una norma UNE que utiliza la precipitación con digitonina, el cual es un
compuesto orgánico con un nº muy elevado de átomos de carbono que reacciona con los
esteroles de forma específica (con estequiometría 1:1) para dar unos compuestos
insolubles en etanol llamados digitónidos. Para la determinación se saponifica la grasa,
añado etanol y digitonina con lo que los digitónidos precipitan, filtramos, lavamos,
pesamos estos digitónidos.
Para pasar de peso de digitónidos a peso de esteroles se multiplica por un factor

que es 0’25. Así podemos expresar el % de esteroles total:
P · 0'25
% esteroles = ·100
P'
siendo:
P: peso en gramos de digitónidos.
P’: peso en gramos de grasa.
Este método no es un método muy exacto, pues el factor que empleamos es un

factor medio de cada factor correspondiente a cada esterol. Además, estamos haciendo
una gravimetría, y nunca una gravimetría será totalmente exacta.
Determinación de la composición de la fracción: “cromatografía de gases”

(método oficial).
Es norma COI (CE). Se emplea para la determinación fraccionada de cada uno

de los componentes
El procedimiento consta de 4 etapas:
1º Saponificación de la grasa, con KOH/EtOH, calentamos a reflujo.

2º Extracción del insaponificable empleando el método del éter etílico.
3º Fraccionamiento por CCF. En ella empleamos:
Ø Fase estacionaria: SiO2 (KOH)
Ø Fase móvil: hexano–éter etílico (65:35)
Ø Revelador: 1’,2’–diclorofluoresceína.
Ø Patrones: colesterol + fitosteroles.
Lo que se hace es raspar la fracción de esteroles con una espátula y se lleva a

una columna de elución para separar los esteroles. (Ver fotocopia nº 21, Figura 1).
4º Cromatografía de gases.
Antes de realizar la C.G. se deben derivatizar los esteroles, pues no son lo
suficientemente volátiles.
Se hace la determinación de esteroles porque el aceite de oliva se diferencia del

resto de aceites vegetales en el contenido total en esteroles y en la composición de cada
uno de ellos. En general en el resto de aceites vegetales este contenido total es muy
superior al que aparece en el aceite de oliva. Por tanto una muestra adulterada con aceite
de girasol debe dar un valor más alto al normal. Quien adultera el aceite de oliva, para
“disimular” la esa subida de esteroles lo que hace es desesterolizar el aceite de girasol
mediante una refinación a condiciones fuertes (aumentando la temperatura), de esta
manera el contenido en esteroles. Pero esta bajada del contenido en esteroles es
demasiado grande, con lo que incluso quedan por debajo del contenido en el aceite de
oliva. Por tanto la ley marca un mínimo en el contenido de esteroles.
El aceite de girasol alto oleico es un aceite de girasol manipulado genéticamente

para que tenga un mayor contenido en ácido oleico (18:1), así este aceite puede hacerse
pasar por oliva si se desesteroliza, pero como decimos pierde demasiados esteroles.

En esta tabla podemos ver claramente lo que acabamos de decir. Además vemos
que el contenido en cada uno de los esteroles también varía, siendo el contenido en β-
sitosterol y ∆-estigmasterol los más claros.
4.2. Alcoholes alifáticos y terpénicos.
- Los alcoholes alifáticos son cadenas lineales largas, con un grupo alcohol
primario à CH3–(CH2)n–CH2–OH
- Los alcoholes terpénicos son grupos de unidades de isopreno lineales o
cíclicas à H2C C CH CH2
CH3
Hasta hace poco se determinaban los alcoholes alifáticos como criterio de
pureza, ahora son las ceras las que se determinan con tal fin
Su determinación se utiliza como criterio de pureza para detectar adulteraciones

de aceite de orujo de oliva en el aceite de oliva, puesto que el contenido en alcoholes
alifáticos en el aceite de orujo es mayor que en el aceite de oliva, pues en la extracción
del orujo se extrae mayor cantidad de ellos.
También podemos determinar el contenido total o cada fracción.
Separación de alcoholes alifáticos y terpénicos: “precipitación con urea”.
A partir de la fracción de alcoholes obtenida del fraccionamiento por CCF se

trata esa mezcla con urea de forma que los alcoholes alifáticos formen compuestos
insolubles con la urea, siendo los alcoholes terpénicos solubles quedando en disolución
(pues contienen dobles enlaces que hacen que reaccionen con la urea).
Índice de hidroxilo:
Es norma UNE. Es una medida del contenido en grupos hidroxilo, proveniente

fundamentalmente de los alcoholes y esteroles. Se basa en la reacción del grupo –OH
con ácido acético o anhídrido acético.
O O
R–OH + CH3 C (exceso) à CH3–COOR + CH3–COOH + exceso CH3 C
O O
CH3 C CH3 C
O O
anhídrido acético
Se hierve la muestra con un exceso de anhídrido acético, se añade agua y

calentamos para hidrolizar el anhídrido acético que no ha reaccionado. Valoramos con
una base fuerte en presencia de fenolftaleína. Paralelamente se realiza un blanco.
O
CH3 C
O 2CH3COOH
CH3 C
O
La definición del índice de hidroxilo es:
Son los mg de KOH empleados en neutralizar el ácido acético que se combina

por acetilación por gramo de grasa.
(V' - VA) · 10 -3 · N · 56'1· 10 3

Índice de hidroxilo = =
P
N · 56'1 N · 56'1 N · 56'1
Índice de hidroxilo = · (V' - (V - VB)) = · (V' - V) + · VB
P P P
siendo:
P: peso de la muestra en g.
V: ml de KOH gastados en la muestra (exceso de anh. acético + acidez)
V’: ml de KOH gastados en el blanco. VA VB
N: normalidad del KOH.
Para conocer el % de alcohol se utiliza la C.G.

En CCF se usa una mezcla de alcoholes alifáticos de 20 a 28 átomos de carbono
como patrones.
Determinación de la composición de la fracción de alcoholes alifáticos:

“cromatografía de gases” (método oficial).
Si quiero determinar la fracción completa de alcoholes alifáticos se hace de

forma análoga a la determinación de esteroles.
Determinación de Eritrodiol y Uvaol: “cromatografía de gases” (método oficial).
El eritrodiol y uvaol se determinan para detectar orujo en aceite de oliva. Salen

con los esteroles al final de la cromatografía. Y el % está referido al contenido de
esteroles y la suma de uvaol y eritrodiol.
E+U
%E+U =
esteroles + E + U

4.3. Ceras.
En este caso, para analizar las ceras no podemos saponificar la muestra, pues se
destruirían al ser ésteres:
CH3–(CH2)n–COO–(CH2)n’–CH3
Las ceras se separan del resto de la grasa por cromatografía en columna, para
ello la muestra se disuelve en hexano y se añade a una columna de sílice suspendida en
hexano.
Las ceras son poco polares, algo más polares que los hidrocarburos.
El hexano es apolar, por tanto quedan en él disueltos los hidrocarburos. Por tanto
tras separar los hidrocarburos aumentamos la polaridad del disolvente añadiendo éter
etílico, hasta tener una mezcla hexano:éter etílico (99:1). Así obtenemos hidrocarburos
y ceras.
Determinación del contenido total: “cromatografía de gases” (método oficial).
Una vez la fracción hidrocarburos + ceras se analiza en cromatografía de gases.

Cabe decir que los hidrocarburos no influyen en la determinación de ceras, por ello no
hace falta separarlos.
La determinación de ceras se emplea para detectar adulteraciones de aceite de
oliva con aceite de orujo, igual que con la determinación de eritrodiol + uvaol. En
ambos casos sólo sirve para detectar adulteraciones en el aceite de oliva únicamente.
4.4. Hidrocarburos.
En el insaponificable un 30-50% son hidrocarburos, siendo un 80% de ellos

escualeno.
Escualeno: índice de escualeno.
El escualeno caracteriza al aceite de oliva, ya que el resto de aceites vegetales no

lo tienen.
El índice de escualeno nos mide la cantidad en mg de escualeno por cada 100

partes en peso de grasa.
Para analizar el escualeno hay que separarlos del resto de la grasa por
saponificación, para ello empleo KOH en etanol. La extracción del insaponificable la
realizo mediante el método del éter de petróleo que es el único caso en el que solo se
disuelven los hidrocarburos. Tras tener los hidrocarburos separados hacemos el
fraccionamiento en columna, para ello uso como fase estacionaria sílice (SiO2) y como
fase móvil hexano. El 80% del contenido total será escualeno. Para ver la cantidad de
escualeno mido el índice de I2 a la muestra eluida, ya que el escualeno tiene 6
insaturaciones (el resto de hidrocarburos no tienen 6 insaturaciones). Mido el índice de
I2 mediante el método de Wijs:
C C + ClI en exceso 
→ C C + exceso de ClI
Cl I
KI en exceso
I2
valoración con
almidón
S2O3-2
Paralelamente se hace un blanco el cual valorará todo el ClI puesto al inicio, así
por diferencia sabremos el que ha reaccionado con la muestra. El volumen gastado de
blanco lo denotaremos por V’.
(V'-V) · 10 -3 · M · 1 · 410 · 103

Índice de escualeno= 2 6 · 100
P
(V'-V) · M · 410
Índice de escualeno= 12 · 100
P
Dividimos por 6 porque el escualeno al tener 6 dobles enlaces adiciona 6 moles

de I2, luego los moles de escualeno serán la sexta parte de los de yodo.
El índice de escualeno se ha empleado como índice de pureza del aceite de oliva.

El aceite de oliva tiene un alto índice de escualeno. Es una norma UNE, pero no se hace
en análisis de rutina, pues en tal caso se hace la determinación de estigmastadienos.
Determinación de estigmastadienos: “cromatografía de gases” (método oficial).
Se hace en los análisis de rutina. Los estigmastadienos tienen la misma

estructura que los esteroles, y provienen de la deshidratación de éstos en la refinación.
En el aceite de oliva el 93% de los esteroles es β-sitosterol.
-H2O
β-sitosterol estigmastadieno
Se emplea para determinar adulteraciones de aceite de oliva virgen con aceites

refinados.
Es una norma internacional à COI.
Primero se ha de saponificar la muestra, seguidamente hacer una extracción con
éter de petróleo. Se separan con una columna empleando hexano como fase móvil y
analizamos su fracción por cromatografía de gases.
4.5. Polifenoles.
Son componentes con más de un grupo fenol. Para su determinación, al ser

compuestos muy polares se extraen de la grasa empleando una solución MeOH-H2O.
Seguidamente se pueden determinar de formas:
- Espectrofotometría UV-VIS à para determinar el contenido total.

- HPLC à para determinar la composición de la fracción.
Determinación del contenido total: “espectrofotometría UV-VIS”.
Se prepara un derivado de los polifenoles coloreado, y se le hace reaccionar con

el folin-ciacolteu dando un compuesto coloreado de color azul, pudiendo medir su
absorbancia en torno a los 725 nm (zona del azul).
Determinación de la composición de la fracción: “cromatografía de líquidos de

alta resolución”.
A partir de la fracción de MeOH-H2O obtendríamos la composición de la

fracción. No empleamos cromatografía de gases porque los polifenoles no son lo
suficientemente volátiles, además son difíciles de derivatizar para que sí lo sean.
Aún hoy en día no existe un método oficial, pues no se conocen todos los
polifenoles que hay en una grasa.
4.6. Tocoferoles.
Son un grupo de antioxidantes naturales que aparecen en las grasas o aceites.

Deben al grupo fenólico su actividad reductora o antioxidante.
R1
HO
CH3
O R
R2
R3
Para su determinación procedemos de forma análoga a esteroles y alcoholes,
pero en condiciones en los que se evite su oxidación.
Tenemos 4 etapas:
1- Saponificación empleando KOH/EtOH y pirogalol.
OH
OH OH
El pirogalol es un compuesto antioxidante, más aún que el resto de tocoferoles.
2- Extracción del insaponificable por el método del éter etílico.

3- Fraccionamiento por CCF. Se hace bajo luz roja para evitar la oxidación de la
muestra ya que la luz roja tiene λ altas.
En la CCF como revelador empleamos una mezcla de Fe3+-dipiridilo.
à dipiridilo
N N
Fe3+ tocoferole
 s → Fe2+ dipiridilo
 → compuesto rojo
Pero antes de pulverizar la placa colocamos encima una contraplaca que tape
toda la placa excepto los bordes en donde están los patrones.
contraplaca
patrón
muestra
Ya tenemos la fracción separada.
4- En este paso tenemos 2 técnicas a emplear:
- Espectrofotometría UV-VIS à determinación del contenido total.

- Cromatografía de gases à determinación de la composición de la fracción.
En la industria empleamos la reacción de Emmerie–Engel, donde los tocoferoles

son capaces de reducir el Fe3+ a Fe2+.
Determinación del contenido total: “espectrofotometría UV-VIS: método

Emmerie-Engel” (método oficial).
En esta técnica se hacen reaccionar los tocoferoles con Fe3+ y dipiridilo

obteniéndose un compuesto rojo al cual medimos su absorción a 520 nm según la
reacción anteriormente descrita.
Como patrón empleo una mezcla de α, β, δ–tocoferol (no empleamos el γ al ser
isómero del β).
Por convenio expreso los resultados como contenido en α–tocoferol.
Determinación de la composición de la fracción: “cromatografía de gases”

(método oficial).
Este método es norma del COI. En este caso sí podemos emplear C.G. al ser los
tocoferoles suficientemente volátiles, algo que no ocurría con los polifenoles.
Según la normativa del COI, en el caso del aceite de oliva, los aceites vírgenes
no pueden contener α-tocoferol añadido, igualmente le ocurre al aceite de oliva crudo.
Sí pueden contener α-tocoferol los aceites siguientes:
• aceite de oliva refinado.

• aceite de oliva (refinado + virgen).
• aceite de orujo de oliva refinado.
• aceite de orujo de oliva (refinado + virgen).
Pueden llegar a contener hasta 200mg/Kg de α-tocoferol.
4.7. Pigmentos.
Pigmentos hay muchos, por lo que solo estudiaremos los que aparecen en el
aceite de oliva. En él tenemos clorofilas (y sus derivados, las feofitinas) y carotenoides.
Determinación de la composición de la fracción: “cromatografía de líquidos de

alta resolución”.
No existe un método oficial de determinación de pigmentos. Tanto las clorofilas

como el β-caroteno al ser poco polares se pueden extraer con una mezcla de hexano-
acetona, y se determinan por HPLC. El color se emplea como criterio de calidad.
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 5: Estudio de la adulteración 75
TEMA 5: ESTUDIO DE LA ALTERACIÓN Y

ADULTERACIÓN DE LOS CUERPOS GRASOS
1. Oxidación de los cuerpos grasos: generalidades.
Hay 2 razones por las que una grasa se altera, se transforma:
a) Procesos de hidrólisis à da lugar a la aparición de ácidos grasos libres.

b) Oxidación.
La oxidación de una grasa es un proceso espontáneo debido a la presencia de O2

atmosférico.
Cualquier grasa desde el momento de su obtención ya empieza a oxidarse, por
tanto la oxidación no se puede evitar.
Hay una serie de factores que favorecen esta oxidación:
- Presencia de metales à Fe, Cu, ...

- Presencia de luz.
- Etc...
La oxidación de una grasa es muy importante en la industria alimentaria y

cosmética, pues es quien determina la caducidad de un producto.
Si una grasa se oxida durante un tiempo determinado aparecen compuestos que
le comunican olores y sabores desagradables, lo cual se debe a la presencia de aldehídos
y cetonas dando lugar al fenómeno de rancidez.
Al estudiar la oxidación de una grasa nos puede interesar 2 cosas distintas:
- Conocer el estado de oxidación actual de una grasa. Esto se hace midiendo

algunos de los productos de oxidación.
- Conocer la resistencia de la grasa frente a su oxidación, es decir, su
estabilidad.
La oxidación depende del grado de insaturación y contenido en antioxidantes

naturales (polifenoles y tocoferoles).
Podemos tener una grasa que nada más extraerla esté poco oxidada y que sea
poco estable, o bien lo contrario, que tengamos una grasa que nada más extraerla esté
muy oxidada pero sea muy estable.
Para medir la oxidación, y por tanto la estabilidad de una grasa se provoca una
oxidación acelerada y determinamos cuánto tiempo tarda en enranciarse.
En una grasa se oxidan los ácidos grasos insaturados.
2. Proceso de oxidación.
2.1. Etapas.
La oxidación se lleva a cabo en 2 etapas distintas:
- Producción de hidroperóxidos.
Desde siempre a estos compuestos se les han llamado peróxidos, pero no lo son,
pues son hidroperóxidos, que son distintos.
En esta etapa el contenido en hidroperóxidos aumenta de forma muy lenta pero
gradual. A esta etapa se le denomina periodo de inducción.
Aunque la grasa se está oxidando no se observa un cambio apreciable, pues aún
no hay olores ni sabores desagradables que sean apreciables.
- Aumento exponencial de la producción de hidroperóxidos.
En esta etapa ya aparecen esos olores y sabores desagradables de los que

hablamos anteriormente à rancidez.
Si representamos cómo varía la producción de hidroperóxidos frente al tiempo
de oxidación tenemos:
[Hidroperóxidos]
periodo de
inducción
tiempo
Cuanto mayor sea el periodo de inducción, mayor estabilidad presentará la grasa.

En general, los aceites vegetales tienen un periodo de inducción mayor que las
grasas animales, esto es debido a que contienen muchos más antioxidantes.
Para comparar la estabilidad de distintas grasas se provoca la oxidación
acelerada y medimos su periodo de inducción.
2.2. Productos de oxidación primarios y secundarios.
A) Productos primarios:
Son los productos que aparecen durante el periodo de inducción. Son los
hidroperóxidos.
12 13 14 15 11 12 13 14 15
C C C C + O2 C C C C C
O OH
Vemos que se produce un desplazamiento del doble enlace, con lo que se

produce un isómero con dobles enlaces conjugados à dienos conjugados que absorben
en la zona U.V.
B) Productos secundarios:
Son los productos que proceden de la oxidación posterior de los hidroperóxidos.

Tenemos: aldehídos, cetonas, hidroxiácidos, cetonas α-insaturadas, α-dicetonas,
trienos conjugados. Los 3 últimos compuestos nombrados al tener dobles enlaces
conjugados también absorben en la zona U.V. como los productos primarios.
3. Medida del estado de oxidación de una grasa.
3.1. Índice de peróxidos.
A pesar del nombre empleado para este índice, lo que mide realmente son los
hidroperóxidos.
Este índice utiliza la medida del contenido de productos primarios de oxidación,

los hidroperóxidos. Para los productos secundarios tenemos otra determinación que
complementa a ésta.
Este índice se basa en la capacidad que tienen los hidroperóxidos de oxidar una
disolución de KI a I2.
−
Grasa
(hidroperóxidos)
→
I I2
A mayor cantidad de I2 formado à mayor cantidad de hidroperóxidos tiene la

muestra de grasa.
Este índice se define como el nº de meq de O2 activo por Kg de grasa.
El O2 activo es el que proviene de los hidroperóxidos.
Procedimiento:
Es norma UNE y COI.

La grasa se disuelve en CH3Cl y AcH, y se le añade un exceso de disolución de
KI. El I2 generado se valora posteriormente con Na2S2O3 en presencia de almidón.
Grasa
(hidroperóxidos) CH
 3 Cl
→ KI
en →
exceso
I2 + exceso de I-
AcH
almidón Na2S 2O3
La reacción entre el I- y los hidroperóxidos es instantánea, el procedimiento dice

que son 5 minutos.
Obtenemos un volumen gastado en la valoración de I2, dicho volumen se da en
ml.
Sean:
V: ml de Na2S2O3.
P: peso de muestra (g).
N: normalidad del Na2S2O3.
Como vemos, esta valoración no es por retroceso como en casos anteriores.

Los equivalentes de tiosulfato serán los de yodo, y éstos a su vez los de

hidroperóxidos.
La norma dice que se haga un blanco, pero sólo se hace como comprobación de
que en ausencia de muestra no se genera yodo.
Cuando la muestra se introduce en el matraz de valoración es necesario
desplazar el aire que contenga, para ello le hago pasar una corriente de un gas inerte:
CO2, N2, ...
La expresión del índice de hidroperóxidos es:
V · N · 10 3
Índice de peróxidos =
P
Éste índice se usa como criterio de calidad.

Las reacciones implicadas son:
2I- 
→ I2
4H+ + O22- 
→ H2O
Como vemos, el medio ha de ser ácido para que se dé la reacción redox, por ello
añado el cloroformo en ácido acético.
El índice de peróxidos en un aceite de oliva virgen ha de ser bajo. En un aceite
refinado incluso es menor, pues en la refinación, una de las etapas es la neutralización
(eliminación de ácidos grasos libres que se oxidan), por ello la ley marca un valor
menor al del aceite de oliva virgen.
En los orujos pasa igual.
En esta determinación se pueden cometer 2 errores:
- Oxidación del KI a I2 por el O2 atmosférico, dando lugar a un error por

exceso.
- En el caso de grasa muy insaturadas se puede producir la adición de parte del
I2 generado a los dobles enlaces C=C de la grasa, dando lugar a un error por
defecto.
3.2. Determinación de ácidos oxidados.
Son fundamentalmente hidroxiácidos à productos secundarios de oxidación.

Es norma UNE.
Los hidroxiácidos se diferencian de los no oxidados en la polaridad.
Los hidroxiácidos son polares debido al grupo hidroxilo (–OH) que contienen,
en cambio los ácidos grasos no oxidados son apolares.
Al ser polares son insolubles en éter de petróleo (que es poco polar).
En el procedimiento debo obtener todos los ácidos grasos de la muestra, para
luego separar los ácidos grasos oxidados y no oxidados usando éter de petróleo.
Los pasos a seguir son los siguientes:
1- Saponificación con KOH/EtOH. Obtengo jabones + glicerina +

insaponificable.
2- Separación por extracción del insaponificable con éter etílico.
Obtenemos:
- Fracción etérea con el insaponificable.

- Fase EtOH-H2O con los jabones + ...
Nota: Antes del siguiente paso debemos eliminar el EtOH y la parte etérea que
pueda haber pasado a la fase acuosa.
3- Adición de la sal (jabón), de HCl para hidrolizarla y así liberar los ácidos
grasos.
Tenemos así los ácidos grasos oxidados y los no oxidados.
4- Extracción con éter de petróleo.
Obtenemos:
- Fracción soluble: ácidos grasos no oxidados (apolares).

- Fracción insoluble: ácidos grasos oxidados (polares).
Seguidamente ambos tipos de ácidos grasos se secan y pesan.

3.3. Determinación del contenido total en compuestos carbonílicos.
Más tarde daremos este apartado.
3.4. Medida de la absorción en la región ultravioleta.
La absorción en U.V. se emplea también como criterio de calidad.

En el caso del aceite de oliva los ácidos grasos insaturados mayoritarios son:
18:1 à se puede oxidar, pero no forma dienos conjugados.

18:2 à se oxida y forma el hidroperóxido correspondiente que es un dieno
conjugado que absorbe en el U.V. (λ = 232 nm).
18:3 à se oxida y forma el hidroperóxido correspondiente que es un dieno
conjugado que absorbe en el U.V. (λ = 232 nm).
Los productos primarios de oxidación, los hidroperóxidos, absorben en la región

de 232 nm, luego la medida de absorción de una grasa a esa λ nos sirve para conocer el
contenido en productos primarios de oxidación. Esta medida se relaciona al índice de
peróxidos, pero son diferentes.
Por el contrario, los productos secundarios de oxidación (cetonas, aldehídos,
trienos conjugados, hidroxiácidos, etc…) absorben a una λ = 270 nm, luego nos sirve
para determinar el contenido en productos secundarios de oxidación.
Midiendo solo el índice de peróxidos no podemos saber el estado de oxidación
de una grasa, para esto nos sirve la determinación a 270 nm.
Los K232 y K270 son 2 determinaciones que se hacen en análisis de rutina en el
aceite de oliva.
Según la ley de Lambert-Beer:
A=ε·b·c
siendo:
ε: coeficiente de absortividad molar.
b: longitud de la cubeta à 1 cm.
c: concentración en mol/l.
Si la concentración se expresa en g/100 ml la ley de Lambert-Beer se escribiría

así:
A=K·b·c
es decir, K es el equivalente de ε pero con la concentración expresada de esta

forma.
Así se obtiene el valor de K232 y K270.
Estos determinan disolviendo la grasa en ciclohexano y midiendo la absorbancia
a 232 y 270 nm.
A 232
A232 à K 232 =
1 cm · c(g/100 ml)
A 270
A270 à K 270 =
1 cm · c(g/100 ml)
La ley marca para cada calidad de aceite el máximo valor que pueden tomar K232
y K270.
Podemos ver que un aceite de buena calidad tiene una absorbancia a 232 nm
alta, pero conforme aumenta la temperatura el valor de dicha absorbancia disminuye,
además el valor de la absorbancia a 270 nm aumenta.
Por tanto, si aumenta la temperatura à ↓ A232 y ↑ A270.
Además si caliento en presencia de aire à ↓ A232 y ↑ A270.
En un aceite neutralizado (refinado) el valor de A270 disminuye respecto del

aceite original.
En la decoloración del aceite (en la refinación) se producen trienos conjugados
que absorben a 270 nm, por ello el valor de A270 aumenta. Este valor aumenta más si se
decolora el aceite con carbón activo en lugar de tierras decolorantes.
También aumenta el valor de A270 en aceites desodorizados.
Es difícil medir como vemos el estado de oxidación en un aceite refinado a

través del valor de K270, pues por distintos motivos este valor puede aumentar o
disminuir dentro del mismo proceso de refinación. Además en esta zona absorben tanto
los productos secundarios como trienos conjugados que aparecen en la refinación. Es
decir, si en un aceite virgen el valor de su K270 es muy alto puede deberse a que esté
oxidado o bien a que esté adulterado con aceite refinado.
Aquí podemos ver la representación de un aceite de oliva lampante (aceite de

mala calidad) en avanzado estado de oxidación, un aceite de oliva lampante refinado y
un aceite de orujo refinado.
Como vemos en los aceites refinados aparecen unos picos debidos a la aparición
de trienos conjugados como productos secundarios de oxidación o bien debidos a
procesos de refinación.
El pico de λmáx se sitúa en torno a 270 nm, los picos anterior y posterior a este
valor se sitúan aproximadamente a un valor +4 y –4 del valor máximo (266 y 274 nm).
Para determinar el ∆K se disuelve la muestra en ciclohexano, se extrae y
obtenemos el valor de λm. Calculamos el valor de Km para esa λm y esa Am.
A continuación se calcula el valor de K a una λ mayor en 4 nm y el valor de K a
una λ menor en 4 nm:
λm-4 
→ K m-4 (Am-4)
λm+4 
→ K m+4 (Am+4)
Km + 4 + Km − 4
∆K = Km − media aritmética de los
2 valores en el máximo
∆K
Km-4 Km Km+4
A mayor cantidad de trienos conjugados, mayor es el pico de Km y por tanto

mayor es ∆K.
El valor de ∆K está regulado, siendo el aceite de peor calidad el de mayor ∆K.
Por ejemplo, si a un aceite de oliva virgen le mido su ∆K y obtenemos un valor
de 0’6, debido a que su valor tendría que ser ≤ 0’01 entonces pueden haber pasado 2
cosas: que el aceite se haya oxidado, con lo que habrá gran cantidad de trienos, o bien
que se haya adulterado con aceite de orujo o aceite de oliva refinado. Para saber
exactamente qué es lo que le ha pasado a este aceite de oliva virgen se le habrá de hacer
otras pruebas, perdiendo la categoría de “oliva virgen”.
Como criterios de calidad tenemos:
- Acidez.
- Índice de peróxidos.
- K270.
- Valoración organoléptica.
Este último criterio aún no lo hemos visto, es la puntuación que le da el catador a

un aceite.
4. Medida de la resistencia a la oxidación de una grasa.
Si en la industria alimentaria se ha de elegir entre 2 grasas para utilizarlas como

ingredientes, debe de elegir la mejor. A igualdad de otras características elegirá aquella
de mayor estabilidad, por lo que su caducidad será más tardía.
La resistencia a la oxidación depende fundamentalmente de la composición en
ácidos grasos y del contenido de antioxidantes que tenga el aceite. Por ejemplo, el aceite
de oliva variedad picual es el más estable a la oxidación, pues tienen un % de ácido
oleico muy alto, de los más altos, además tienen un alto contenido en polifenoles y
α-tocoferol (antioxidantes naturales).
Para medir la resistencia a la oxidación podemos almacenar la grasa un cierto
tiempo y realizar periódicamente medidas de la oxidación (índice de peróxidos por
ejemplo).
Los métodos utilizados aceleran la oxidación bajo unas condiciones específicas.
4.1. Ensayo de la estufa de Schaal.
La grasa se introduce en una estufa a un temperatura entre 65-70ºC.

Periódicamente se mide el índice de peróxidos. Así determino el final del periodo de
inducción.
También se puede ir catando el aceite hasta detectar la aparición de la rancidez,
lo que indica el fin del periodo de inducción.
El inconveniente de este método es que las condiciones de operación (de
oxidación) no están controladas. Además, en el interior de la estufa pueden quedar
restos de compuestos volátiles de anteriores muestras que contaminarán nuestra muestra
de estudio, con lo que el periodo de inducción determinado será menor al real.
Además solo podemos introducir una muestra en la estufa.
4.2. Ensayo de Sylvester o método de la absorción de oxígeno.
La muestra se introduce en un recipiente cerrado y medimos mediante un

manómetro la variación de la presión de O2 en el interior de la estufa, dicha presión irán
disminuyendo. La muestra se calienta en un baño termostatizado y se agita
mecánicamente de forma que la oxidación sea lo más homogénea posible.
En este caso las condiciones de oxidación están más controladas que en el caso
anterior, además aquí no hay contaminación.
La detección de la rancidez se hace observando el punto de inflexión en la
gráfica de PO2 frente al tiempo.
PO2
t (min)
4.3. Ensayo de Swift o método del oxígeno activo.
Es el método oficial. Se emplea un aparato llamado Rancimat. La muestra se

introduce en un recipiente cerrado y se burbujea a través de ella aire. Dicho aire además
de oxidar la muestra la agita.
El aire que sale de cada recipiente se hace llegar a otro recipiente que contiene
agua destilada.
aire muestra aire H2O destilada
Se calienta la muestra en un baño termostatizado a 100ºC. Aquí medimos la

conductividad del agua destilada. Cuando aparece la rancidez (por presencia
fundamentalmente de aldehídos y cetonas) se produce un cambio brusco en la
conductividad.
Aquí tenemos un aparato Rancimat para 6 muestras.
5. Reacciones químicas para la detección de adulterantes.
Son determinaciones cualitativas.

Distinguimos entre:
a) Ensayos específicos: detecta la presencia de un compuesto que contiene el

aceite adulterante y no contiene el aceite adulterado. Son reacciones
coloreadas.
b) Pruebas: la sustancia detectada o compuesto detectado puede existir en el
aceite adulterado pero en una proporción muy inferior al del aceite
adulterante.
5.1. Ensayos específicos.
5.1.1. Reacción de Halphen.
Se utiliza para detectar aceite de algodón en aceite de oliva.

Se basa en la existencia en el aceite de algodón de 2 ácidos grasos con un anillo
de ciclopropano:
CH2
- Ácido esteúrico: CH3 (CH2)7 C C (CH2)7 COOH
CH2
- Ácido malvático: CH3 (CH2)7 C C (CH2)6 COOH
Estos ácidos grasos dan una reacción específica con azufre dando un color rojo.
Esta reacción no es muy sensible, con lo que se requiere de gran cantidad de
aceite adulterante.
El aceite de Kapok también da esta reacción.
Estos anillos de ciclopropano se destruyen con el calor y la luz.
Si el aceite de oliva (adulterado) es refinado puede ser que la coloración sea muy
poco intensa, luego no podríamos saber si hay adulteración de este tipo. Como vemos es
una determinación semicuantitativa.
5.1.2. Reacción de Fitelson.
Se emplea para detectar aceite de semilla de té adulterando aceite de oliva pues

ambos tienen similares índices de yodo, densidades, índices de saponificación, índices
de refracción, etc...
Se basa en la reacción con anhídrido acético y ácido sulfúrico de un alcohol
terpénico que contiene el aceite de semilla de té y no el aceite de oliva (butirospermol).
Anhídrido acético + H2SO4 + butirospermol 

→ color rojo característico
Algunos aceites de oliva de mala calidad (lampantes, etc...) pueden dar una
coloración rosa, puesto que pueden contener bajas cantidad de butirospermol. La
coloración rosa la presenta el ensayo negativo.
5.1.3. Reacción de Villavecchia.

5.1.4. Reacción de Pavolini.
Reacción de Villavecchia-Pavolini:
Se emplea para detectar aceite de semilla de sésamo en aceite de oliva.

El aceite de semilla de sésamo contiene en el insaponificable la sesamolina y la
sesamina.
Aquí podemos ver las estructuras de dichos compuestos.

La sesamolina por hidrólisis en media ácido origina el sesamol y la samina.
• La reacción de Villavecchia es una reacción específica para el sesamol.

• La reacción de Pavolini es una reacción específica para la sesamina.
+
sesamolina H/ → sesamol + samina
H 2O
Insaponificable
(aceite de sésamo)
sesamina
- La reacción de Villavecchia se basa en una reacción específica del sesamol

con furfural, que origina (casi siempre) una coloración roja.
sesamol + furfural H


2O
→ ROJO
O CHO
- La reacción de Pavolini se basa en la reacción de la sesamina con anhídrido

acético y furfural, que origina una coloración azul prusia.
AZUL
sesamina + anhídrido acético PRUSIA
5.1.5. Índice de Bellier.
Se usa como criterio de pureza para el aceite de oliva y además para detectar
adulteraciones con aceite de cacahuete del aceite de oliva.
5.2. Pruebas.
5.2.1. Prueba de Hauchecourne.
Se emplea como criterio de pureza en general y en cierto modo como criterio de

calidad del aceite de oliva (en todas sus calidades).
Se basa en la reacción de ciertos productos de oxidación que contiene el aceite,
bien por autooxidación o por su mala conservación, con HNO3 concentrado.
Muestra 1  →

) Decoloración
2)Adición
 de  →
HNO 3 conc.
tierra activada ρ = 1’40 g/ml
Al cabo de 15 minutos se observa el color de la capa superior oleosa.

Dependiendo del tipo (calidad) de aceite de oliva se observarán diferentes colores:
• Aceite de oliva virgen à amarillo claro.

• Aceite de oliva refinado y aceite de oliva à amarillo tostado.
• Aceite de orujo (crudo refinado o mezcla) à marrón.
Si a un aceite de oliva virgen le hacemos la prueba y sale marrón puede que:
a) el aceite se haya conservado muy mal.

b) al aceite se le haya añadido orujo.
En cualquier caso el aceite dejaría de ser aceite de oliva virgen.

5.2.2. Prueba de Bellier-Marcille.
Sirve para detectar aceite de orujo en aceite de oliva.

Para la determinación cualitativa se hace esta prueba (de Bellier-Marcille) junto
a la que veremos a continuación en el apartado 5.2.3. (prueba de Vizern).
Para la determinación cuantitativa se determina la cantidad en ceras y en dos
alcoholes à eritrodiol + uvaol. ¡OJO, EXAMEN!
Marcille descubrió que la precipitación prematura que aparecía a veces en la
determinación del índice de Bellier correspondía a la presencia de alcoholes alifáticos o
alcoholes grasos.
Estos alcoholes existen en un % muy superior en el aceite de orujo que en
cualquier aceite de oliva, lo cual sirve como un claro indicio en el caso de adulteración
de aceite de oliva con orujo.
Proceso:
1.- Saponificación con KOH/EtOH.

2.- Adición de EtOH/AcH à liberación de ácidos grasos + jabón (K+).
3.- Calentar hasta los 50 ºC à enfriar posteriormente.
Si aparece una precipitación (turbidez) por encima de 40ºC à esto indica la

presencia de aceite de orujo.
5.2.3. Prueba de Vizern.
Se realiza de forma análoga, pero antes de calentar hasta los 50ºC se extrae el
insaponificable. La ventaja de hacer esta prueba es que la sensibilidad es mayor, es
decir, podemos detectar cantidades pequeñas de aceite de orujo, pero como
inconveniente tenemos que la prueba es más larga al tener que extraer el
insaponificable.
La prueba de Vizern se utiliza cuando existen dudas en la prueba de Bellier-
Marcille.
Proceso:
1.- Saponificación con KOH/EtOH.

2.- Adición de EtOH/AcH à liberación de ácidos grasos + jabón (K+).
3.- Extracción del insaponificable
4.- Calentar hasta los 50 ºC à enfriar posteriormente.
Si tenemos un aceite de oliva genuino, la temperatura será más baja que en un

aceite con ácidos grasos insolubles, produciéndose la precipitación a mayor
temperatura.
- Aceite de oliva à índice de Bellier (HCl) ≤ 9ºC.

- Aceite de cacahuete à índice de Bellier (HCl) ≥ 35ºC.
El índice de Bellier además permite hacer una determinación semicuantitativa de

la cantidad de aceite de cacahuete añadido.
En ciertos aceites, al liberar los ácidos grasos a veces se da una precipitación
prematura antes de enfriar. Dicha precipitación no corresponde a los ácidos grasos ni a
los jabones sino que se debe a otros componentes del insaponificable.
5.2.4. Prueba de Vizern-Guillot o prueba del tetrabromuro.
Se emplea detectar aceites semisecantes en el aceite de oliva.

Recordar que los aceites semisecantes tienen un IY entre 100-130, ejemplos
pueden ser el aceite de maíz, girasol, soja, ...
El aceite de oliva tienen su IY < 100, luego es no secante.
En los aceites de girasol y maíz el ácido graso mayoritario es el linoleico (18:2),
en cambio en el aceite de oliva es el oleico (18:1).
La prueba se basa en la reacción de los TG con más de un ácido graso
poliinsaturado (existentes en un alto % en aceites semisecantes) con Br2. Los productos
de adición resultantes son insolubles en el medio donde se realiza la prueba (éter de
petróleo).
Muestra (éter de petróleo) + Br2 (éter de petróleo)
Precipitado ↓↓ Indica la presencia de aceites semisecantes

Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 6: Medidas físicas en el AG 93
TEMA 6: MEDIDAS FÍSICAS EN EL ANÁLISIS DE

GRASAS
1. Métodos superficiales.
1.1. Densidad.
Se emplea en grasas y aceites con valor identificativo, es decir, para caracterizar.

Es por tanto un criterio de pureza. Además está relacionada con otras propiedades como
es la insaturación. De forma que en general conforme aumenta la insaturación lo hace
también la densidad.
Según la clasificación de aceites que vimos:
- Secantes IY > 130 à d > 0’930.

- Semisecantes 100 < IY < 130 à 0’930 > d > 0’920.
- No secantes IY < 100 à 0’920 > d > 0’910.
Hay alguna excepción como es el aceite de ricino cuya densidad es

aproximadamente de 0’960 y no es secante. Esto se debe a que contiene un ácido
derivado del oleico.
Método oficial para la determinación de la densidad tanto en grasas líquidas

como en grasas sólidas:
No es norma UNE ni COI.
- Para grasas líquidas:
Para ello se emplea el picnómetro.

Se pesa el picnómetro vacío (P), se llena de agua destilada hasta el enrase a una
determinada temperatura y se pesa (P’). Luego se llena del aceite de estudio hasta el
mismo enrase y a la misma temperatura y se pesa (P”).
Un picnómetro es un matraz Erlenmeyer de pequeño tamaño como indica la

figura:
picnómetro vacío picnómetro lleno de aceite picnómetro lleno de agua

(P) (P’) (P”)
Entonces la densidad del aceite a una temperatura t (ºC) será:
P"−P P"−P
· dH 2 O (t º C )
maceite
daceite (tº C) = = =
vaceite mH 2 O P'−P
dH 2O (t º C )
El valor de la densidad del agua a diferentes temperaturas está tabulado.

En el caso de que queramos referirlo a otra temperatura de referencia à t’, la
variación de la densidad por cada ºC es de 0’00068 g/ml:
Si t’ > t à d’(t’ºC) = d(tºC) – 0’00068 · (t’ – t)

Si t’ < t à d’(t’ºC) = d(tºC) + 0’00068 · (t – t’)
Aquí podemos ver cómo varía la densidad del agua en función de la temperatura.
- Para grasas sólidas:
También se emplea el picnómetro.

Se pesa el picnómetro vacío (P), se llena de agua destilada hasta el enrase a una
determinada temperatura y se pesa (P’). Luego se llena del aceite de estudio unas ¾
partes del total, se pesa (P”). Finalmente completamos con agua destilada y pesamos
(P’’’).
La densidad de la grasa a la temperatura de determinación será:
mgrasa P"−P P"− P P"−P

dgrasa (tº C) = = = = =
vgrasa vpicnómetro − v 2 mH 2 O P'−P P' ' '−P ' '
− v2 −
dH 2 O (t º C ) dH 2O (t º C ) dH 2O (t º C )
P"−P
dgrasa (tº C) = · dH 2O(t º C )
(P'−P ) − (P' ' '−P' ')
Sea:
v1 : el volumen de la grasa.
v2 : el volumen restante con el que completo el enrase.
Entonces:
v1 + v2 = vpicnómetro
La corrección en este caso es igual que para grasas líquidas, es decir, el factor de
corrección es 0’00068 g/ml por cada ºC de diferencia.
1.2. Viscosidad.
Se puede emplear también como criterio de pureza, es decir, como valor

identificativo, pero se emplea mucho menos que la densidad.
Interesa sobre todo en grasas que se usen como combustibles o lubricantes.
Todas las grasas contienen una alta viscosidad debida a la estructura de cadena
larga de los TG. El carácter oleaginoso es la alta viscosidad.
Realmente la viscosidad (η) es una resistencia al deslizamiento de unas cadenas
sobre otras.
El aceite de ricino es de los aceites más viscosos debido a que contiene un ácido
graso que le da esa características.
Aquí podemos ver cómo varía la densidad según sea la grasa animal o vegetal.
Hay varios métodos de determinación de la viscosidad:
1) Medida de la velocidad de flujo.
Se emplea el viscosímetro de Ostwald, un esquema podría ser el siguiente:
V enrases
Se mide el tiempo (en segundos) que tarda el menisco del líquido a medir desde
un enrase hasta otro. Sea V el volumen en ml que hay entre las señales de enrase, y d la
densidad del aceite en g/ml.
Para determinar la viscosidad (η) empleamos la ecuación de Poiseuille que
incluye los factores que influyen en la viscosidad:
V π· r4 · d ·g π· r4 ·g
= à η= ·d · t
t 8·η 8·V
donde g es la fuerza de la gravedad y r el radio del viscosímetro.
A continuación medimos el tiempo que tarda en verterse el bulbo de volumen V

para el agua destilada y después para la muestra de aceite. La densidad del agua es
conocida a cualquier temperatura, pues ya dijimos que está tabulada, con lo que
podemos calcular el valor de su viscosidad.
Podemos dividir las expresiones de viscosidad para el aceite y para el agua:
π · r4 ·g
· daceite · taceite
ηaceite daceite · taceite
= 8· V =
ηagua π· r ·g
4
dagua · tagua
· dagua · tagua
8· V
ηaceite daceite · taceite daceite · taceite
= à ηaceite = · ηagua
ηagua dagua · tagua dagua · tagua
Vemos que podemos calcular de una forma muy sencilla la viscosidad de un

aceite, el problema surge cuando el aceite es demasiado viscoso.
2) Método de la esfera descendente.
Se emplea para aceites con una η muy alta à aceites de la industria de los
lubricantes.
En este método se mide el tiempo que tarda una esfera patrón en recorrer un
determinado espacio en el seno de un fluido cuya viscosidad vamos a medir.
Se mide realmente la velocidad lineal (v), de manera que cuanto mayor es la
viscosidad à la velocidad lineal es más pequeña.
r Sea d1 la densidad del aceite, d 2 la

densidad de la esfera patrón y η la
viscosidad del aceite.
Aplicamos la ecuación de Stokes:
2 · r2 · (d2 - d1) · g
V=
9·η
de aquí despejamos el valor de η:

2 · r2 · (d2 - d1) · g
η=
9·V
Hemos dicho que se emplea para aceites muy viscosos, pues de lo contrario la
esfera bajaría demasiado deprisa y no podríamos medir el tiempo de forma apreciable.
3) Método de la burbuja ascendente.
Es un método aproximado, no es preciso.

Se preparan varios patrones, que consisten en recipientes con líquidos de
viscosidad conocida.
Se mide el tiempo que tarda una burbuja de aire en recorrer un determinado
espacio. La burbuja se genera en el seno del aceite.
En el caso de los patrones ese tiempo es conocido (está tabulado).
Lo que hacemos es interpolar el valor obtenido en el aceite de estudio con el de
los patrones.
2. Métodos térmicos.
2.1. Punto de fusión y de solidificación.
Teóricamente ambos puntos son coincidentes, y es la temperatura a la que se

encuentran en equilibrio la fase líquida y la fase sólida a la presión de 1 atmósfera.
Experimentalmente ambos puntos no coinciden, pues siempre hay una pequeña
diferencia entre esas temperaturas.
En el caso de las grasas ocurre esto que acabamos de decir, la diferencia entre
ambas temperaturas es muy grande, puesto que hay un intervalo de temperatura en el
que se produce un ablandamiento gradual de la grasa. El aceite de palma tiene un
intervalo desde 27ºC hasta 43ºC, nada menos que 16 grados de diferencia. Ese intervalo
de temperatura depende del tratamiento que se le someta a la grasa.
Las grasas son mezclas de compuestos, por ello no tenemos un punto brusco de
solidificación o fusión.
Los puntos de solidificación y de fusión de una grasa no nos sirven como criterio
identificativo, sin embargo, el punto de solidificación de los ácidos grasos que contiene
una grasa sí que es muy reproducible, y se utiliza sobre todo en el campo de fabricación
de jabones.
Hay 2 normas UNE:
a) Preparación de ácidos grasos insolubles.

b) Título de una grasa.
2.1.1. Preparación de ácidos grasos insolubles.
Los ácidos grasos insolubles se separan haciendo una saponificación a la grasa:
Grasa       →    →    → ÁCIDOS GRASOS INSOLUBLES

saponifica ción con KOH/EtOH eliminació n del EtOH adición de H2SO4
Los ácidos grasos se separan de la fase acuosa y se secan con Na2SO4. Se deja
reposar hasta cristalizar.
En esta mezcla de ácidos grasos faltan los ácidos C4 y C6.
El punto de solidificación se determina enfriando y viendo la temperatura a la
cual empieza a solidificar.
2.1.2. Título de una grasa.
El punto de solidificación de los ácidos grasos se denomina título de la grasa.

Para poder calcular dicho punto debemos separar los ácidos grasos
saponificando la grasa. Una vez hecho esto se deja enfriar hasta alcanzar una
temperatura constante.
Agitamos el tubo de ensayo hasta romper los cristales. Podremos ver que la
temperatura sube para posteriormente bajar. El punto máximo de temperatura que
alcanza la muestra es lo que hemos llamado título de una grasa.
2.2. Prueba del frío.
Esta prueba se le hace a aceites que vayan a ser utilizados a la temperatura de un

frigorífico (4-5ºC), y para aceites que vayan a ser utilizados en la fabricación de
mayonesas, margarinas o ensaladas.
Hay ciertos aceites que a temperaturas bajas precipitan, formando una fracción
sólida constituida por TG saturados de alto punto de solidificación o ceras. A estos
aceites se les hace la prueba del frío, pero antes se les somete a un proceso denominado
winterización que consiste en eliminar parte de estas ceras y TG. La winterización es
una cristalización fraccionada y dicho proceso se incluye dentro de la refinación.
A estos aceites que les hemos la winterización se les denomina winter oil, ahora
ese “winter oil” sufre la prueba del frío para ver si soporta temperaturas bajas.
La aparición de los primeros núcleos cristalinos (nucleación) se ve favorecida
por un descenso rápido de la temperatura y por la agitación.
La winterización consta de 3 etapas:
1- Descenso brusco de la temperatura a la vez que se agita la muestra para

favorecer la aparición de núcleos de cristalización (nucleación).
2- Descenso mucho más lento de la temperatura sin agitación, para favorecer el
crecimiento de los cristales.
3- Filtración del aceite para eliminar los cristales formados.
La prueba del frío consiste en introducir el winter oil en un tubo de ensayo y

mantenerlo en un baño de hielo a 0ºC durante varias horas. Si se observa y hay turbidez
entonces el winter oil no ha sido bien winterizado.
Antes de realizar la prueba del frío se debe filtrar el aceite y eliminar la humedad
con Na2SO4.
(Ver fotocopia nº 28, Figura 19.1) à Esquema de una planta de winterización.

(Ver fotocopia nº 28, Figura 19.2) à Curva de enfriamiento de la winterización.
(Ver fotocopia nº 29, Figura 3) à Aparato para determinación del punto de
solidificación de ácidos grasos.
2.3. Dilatometría: índice de grasa sólida.
Es una técnica de trabajo basa en la diferencia de volumen entre la fase sólida y

la líquida de una grasa. Este aumento de volumen se debe a expansión térmica y
dilatación de fusión. Si calentamos una grasa que se encuentre en estado sólido hasta
una temperatura a la que está totalmente fundida y representamos la variación del
volumen con la temperatura, obtendremos una curva denominada curva dilatométrica.
El la curva dilatométrica podemos distinguir 3 partes:
a) Línea de sólido: en esta zona el aumento de volumen es únicamente debido

a la expansión térmica.
b) Línea de líquido: la grasa está totalmente fundida, también el aumento de
volumen es debido a la expansión térmica.
c) Curva de fusión: el aumento de volumen en esta zona se debe a 2 causas: a
la expansión térmica y a la dilatación por fusión (que es el aumento de
volumen por el paso de sólido a líquido).
Mediante esta curva se puede conocer la plasticidad de una grasa, por ejemplo
para margarinas interesa que lo sean.
La plasticidad se calcula por dilatometría. En cualquier punto de la curva de
fusión podemos calcular el % de grasa sólida a cualquier temperatura:
x
→ % =
T ºC  · 100
y
Siendo:
x: distancia desde la curva de fusión a la línea de líquido.
y: distancia desde la línea de sólido a la línea de líquido.
Conforme aumenta la temperatura esta variación se hace más pequeña, con lo

que el % de grasa sólida es menor. Donde empieza la línea de líquido x = 0, y donde
termina la línea de sólido x = y. Es un método aproximado, pues las líneas de sólido y
líquido no son paralelas. Por ello existe un índice mucho más preciso que es el Índice
de grasa sólida: es el aumento de volumen debido a dilatación por fusión medido en
ml/Kg que experimenta una grasa parcialmente fundida a una temperatura T cuando se
calienta hasta una temperatura T’ donde esté totalmente fundida debido únicamente a la
dilatación de fusión. (Ver fotocopia nº 30, Tabla 12).
Dilatación total = Expansión térmica + Dilatación por fusión (ml/Kg)
Este índice disminuye conforme nos acercamos a la línea de líquido.

Este índice de grasa sólida se mide con un dilatómetro, el cual es un tubo de
vidrio capilar en forma de “U”. La parte derecha del tubo tiene un volumen medido V, y
la izquierda es un depósito. Introducimos una cierta cantidad pesada de grasa en el
dilatómetro el cual metemos en un baño de agua a distintas temperaturas. Para cada una
de las temperaturas se anota el volumen que marca el menisco en le rama de la derecha.
Antes de introducir la grasa introducimos un líquido que tenga color, por ejemplo una
disolución de rojo de metilo.
(Ver fotocopia nº 29, Figuras 11a y 11b)
El dilatómetro se introduce en 3 baños a distinta temperatura:
- Un baño a la temperatura T que es la temperatura de determinación del

índice de grasa sólida.
- Dos baños a la temperatura T’ y T’’ en los cuales la grasa esté totalmente
fundida.
El volumen a cada temperatura será:
V L
T T’ T’’ T
Se expresa:
Dilatación total (T - T" º C ) = Expansión térmica + Dilatación por fusión

Dilatación total (T - T" º C ) = V(T" º C ) - V(T' º C )
V (T" º C ) − V (T ' º C )
Dilatación total (T - T" º C ) = · (t"-t ) + Dilatación por fusión
(T"-T' º C)
De aquí calculo la dilatación por fusión y dividimos por la masa de grasa (en
Kg), así obtenemos el resultado en ml/Kg de muestra.
A mayor pendiente de la línea à menor plasticidad al estar la grasa menos
tiempo parcialmente fundida.
(Ver fotocopia nº 30, Figura 6d)
2.4. Temperatura de inflamación.
Vamos a ver tres temperaturas:
- Punto de humo.
- Punto de ignición.
- Punto de combustión o temperatura de inflamación.
Estas temperaturas están relacionadas con la volatilidad térmica de una grasa y

se utiliza para grasas empleadas en refritos, es decir, grasas usadas para freír.
2.4.1. Punto de humo.
Es la temperatura más baja en la cual los productos volátiles de descomposición

de una grasa se desprenden en cantidad suficiente como para ser visibles . En un aceite
para freír interesa que sea lo más alto posible.
Los aceites con ácidos grasos volátiles no son óptimos para freír porque empieza
a humear a baja temperatura. Ej: aceite de coco, palma, mantequilla, etc...
Este punto de humo depende de:
a) Composición química del aceite.
A mayor cantidad de materia orgánica volátil à menor valor de los parámetros.
b) De la acidez libre.
La acidez se debe a los ácidos grasos provenientes de la hidrólisis parcial de un

TG libre.
TG H

2O
→ MG ó DG + ác. grasos libres
Los TG son más estables que los ácidos grasos libres, los MG y los DG.
Luego a mayor rancidez (nº de ácidos grasos libres) à menor estabilidad, y
menores son los parámetros.
2.4.2. Punto de ignición.
Es la Tª más baja a la que la velocidad de desprendimiento de productos

gaseosos volátiles de descomposición es suficiente como para que se produzca en la
superficie de la grasa una ignición instantánea.
Este punto se usa para detectar la presencia de restos de disolventes halogenados
usados en la extracción à en aceites de orujo. La presencia de disolventes disminuye el
punto de ignición.
2.4.3. Punto de combustión o temperatura de inflamación.
Es la temperatura más baja a la cual los productos volátiles de descomposición

se desprenden con velocidad suficiente como para producir una combustión continua en
la superficie de la grasa.
Determinación del punto de humo:
Se introduce la grasa en una vitrina de interior negro y con la parte frontal

abierta. Se ve la temperatura a la que aparece humo azulado al calentar la grasa con un
mechero Bunsen. La velocidad de calentamiento es de 5-6 ºC/min.
Determinación del punto de ignición:
Se calienta la grasa de forma controlada (5-6ºC/min). Se observa a qué

temperatura se produce esa ignición instantánea en la superficie.
Determinación del punto de combustión o temperatura de inflamación:
Se determina a continuación del punto de ignición. Tras calentar la grasa de

forma controlada (5-6ºC/min), a intervalos regulares de temperatura (cada 3ºC) se
acerca a la superficie una pequeña llama que se desplaza en línea recta sobre la
superficie. La llama está normalizada. Se observa a qué temperatura se produce una
combustión en la superficie al menos durante 5 segundos.
Estas determinaciones se hacen 2 ó 3 veces.
En el caso de aceite de oliva existe un método norma UNE mediante el cual se
determina el punto de ignición y el punto de combustión en un recipiente cerrado. Es
igual que las determinaciones anteriores, pero ahora los vapores formados quedan
acumulados en un recipiente especial y cerrado diseñado por Pensky-Martins.
Hay aparatos automáticos que hacen esta determinación.

3. Métodos ópticos.
3.1. Color de aceites y grasas: Índice de color ABT.
El color es un aspecto muy importante, es un criterio de calidad, pero no está

incluido en las normas internacionales. Solo el COI en su normativa incluye el color que
debe tener el aceite de oliva, el aceite de oliva refinado y los aceites de orujo de oliva y
refinado.
El color es debido a la presencia de: carotenoides que dan tonalidades amarillas,
rojas, naranjas, ..., de las clorofilas que son verdes, las xantofilas que son amarillas, las
ficobilinas que son azules y algunas proteínas en el algodón y la soja que son marrones.
Como vemos la medida del color es difícil pues es debido a la contribución de
compuestos muy diferentes.
Los métodos que se usan para medir el color se basan en la comparación con
patrones de vidrio coloreado (amarillo y rojo), se les asigna un nº arbitrario. Se observan
simultáneamente el aceite y los patrones hasta que se superpongan los colores.
Aquí podemos ver los diferentes métodos de medición del color según sea la
muestra.
Dentro de los métodos está el de Lovibond que emplea patrones amarillos y
rojos. Este método no sirve por tanto para el aceite de oliva pues éste no presenta
coloración roja. Se emplea para el aceite de soja que sí la tiene.
En España existe una norma UNE para medir el color en el aceite de oliva que se
denomina índice de color A.B.T. (donde ABT son las siglas de Azul de BromoTimol).
En este método los patrones se preparan a partir de disoluciones de ABT con
distintos pH.
El A.B.T. como indicador ácido-base que es tiene 2 formas:
- Forma ácida: es amarilla.

- Forma básica: es azul.
Entonces, según el pH tendremos una disolución entre el color amarillo y el azul

de los extremos.
Para ir variando el pH empleamos una disolución tampón de KH2PO4 y
Na2HPO4 · 2 H2O.
Según las cantidades relativas de las especies, los patrones tendrán colores
diferentes para así abarcar una amplia gama.
(Ver fotocopia nº 30, Tabla del Índice A.B.T.)
Se emplean unos tubos de ensayo mayores a los normales de 25 mm de espesor a

los que añadimos una cantidad de KH2PO4, otra de Na2HPO4 · 2 H2O y otra de A.B.T.
Cabe indicar que todos los patrones llevan fija la cantidad de A.B.T. à 2 ml
0’04%, las cantidades que varían son las de KH2PO4 y Na2 HPO4 · 2 H2O.
Conforme ↑ el pH à ↓ el índice de A.B.T. à ↓ la cantidad de KH2PO4 y ↑ la
cantidad de Na2HPO4 · 2 H2O.
La mezcla en total es de 50 ml.
El índice abarca un rango desde el valor 0 hasta el valor 200.
El índice A.B.T. se define como los ml de disolución de Na2 HPO4 · 2 H2O
1/15 M que debe contener por litro una disolución mezcla de ésta con otra de KH2PO4
para que por adición de una cantidad determinada de A.B.T. se obtenga la misma
coloración que la del aceite examinado por transparencia un espesor de 25 mm del
mismo.
Los patrones se introducen en tubos de ensayo al igual que el aceite observado.
Se colocan ambos tubos juntos y se comparan visualmente:
patrón aceite patrón

Algunas veces nos encontramos con patrones de igual tonalidad a la muestra

pero con distinta intensidad. En estos casos lo que hacemos es preparar a partir del
patrón más parecido otros patrones con distinta cantidad de A.B.T. lo cual hará que la
intensidad varíe.
Ej: 25 (4), el nº 25 indica el índice de color A.B.T., y el nº 4 entre paréntesis
indica los ml de A.B.T. empleados en el patrón.
Aquí aparece un aparato empleado en el método de Lovibond.
También aparece un aparato empleado en el método de Lovibond pero éste es

automático.
3.2. Índice de refracción.
Se utiliza como criterio de pureza. Sirve para caracterizar una grasa o aceite.
El índice de refracción en un medio a es:
c
na =
va
donde:
na: índice de refracción de un medio a.
c: velocidad de la luz en el vacío.
va: velocidad de la luz en el medio a.
Este índice de refracción es absoluto. Se suele trabajar con el índice de

refracción relativo tomando el índice de refracción del aire de referencia:
c
nb va
nb , a = = vb =
na c vb
va
Estos valores aparecen tabulados.

El índice de refracción está relacionado con la insaturación, de forma que se
pueden relacionar ambos.
Recordar que a mayor insaturación à mayor densidad. Entonces, a mayor
insaturación à mayor índice de refracción.
El índice de refracción depende de la temperatura y de la longitud de onda de la
luz en la cual medimos dicho índice. Luego el índice de refracción debe llevar indicado
la temperatura y λ de determinación.
Generalmente para aceites se suele medir a 20ºC y a una la longitud de onda de
la línea D del sodio:
n 20
D
Para las grasas sólidas se suele hacer a 40ºC:
n 40
D
En el caso de no aparecer a qué λ se ha realizado la determinación se supone que

es a la λ de la línea D del sodio.
3.2.1. Determinación.
Se determina con un refractómetro de tipo ABBE como el que aparece a

continuación:
Este aparato lleva 2 prismas, en uno de ellos se coloca una gota de la muestra y
bajamos el segundo prisma, de esta forma la gota queda aprisionada entre ambos. El
refractómetro se coloca en un baño a temperatura constante.
Lo que observamos es un frente que hay que hacer coincidir con el cruce de 2
líneas a través de 2 tornillos (macrométrico: que sube y baja la línea, y micrométrico:
que enfoca la línea):
En el caso de aceites debemos de dar 4 ó 5 cifras decimales.

Hemos dicho que el índice de refracción depende de la temperatura de
determinación. Si a partir de la obtención del índice a una temperatura T queremos
calcularlo a referido a otra temperatura T’ debemos aplicar un factor de corrección:
Si T’ > T à nT’ = nT – (T’ – T) · 0’00035

Si T’ < T à nT’ = nT + (T – T’) · 0’00035
(Ver fotocopia nº 33, Tablas 7 y 8)
Aquí podemos ver los métodos de preparación preliminar de las muestras para la
determinación refractométrica del contenido en aceite de una muestra así como los
propios métodos de determinación.
3.2.2. Aplicaciones: Determinación del contenido en aceite de

distintos productos. Seguimiento de la hidrogenación por
determinación del IY; Determinación de mezclas de aceites.
1ª aplicación:
Se puede emplear el índice de refracción para seguir la hidrogenación en la

fabricación de margarinas. Recordar que partimos de una grasa insaturada a la cual
añadimos H con lo que el P.F. disminuye. La insaturación se podía medir a través del IY
de la grasa, pero esto requiere mucho tiempo, por ello se mide el índice de refracción
que tan solo requiere 5 minutos de tiempo. Hoy en día existen refractómetros en los que
la escala viene graduada también en unidades de IY.
2ª aplicación:
Otra aplicación es conocer el contenido en aceite de diferentes productos:

semillas de cacahuete, de girasol, etc...
Para ello se utiliza un principio refractométrico que dice:
“Cuando se mezclan 2 líquidos inmiscibles entre sí el índice de refracción de la
mezcla es función de los índices de refracción de los 2 líquidos y de la concentración de
los mismos en la mezcla”.
A à nA (CA)
B à nB (CB)
100 · nmezcla = CA · nA + CB · nB
Si el producto es una semilla, ésta se moltura hasta un tamaño apropiado y se le

añade un volumen conocido de un disolvente orgánico que disuelva al aceite a extraer.
La mezcla se tritura para extraer el aceite, se filtra y se mide el índice de refracción de la
fase líquida (disolvente orgánico + aceite extraído).
Según el principio refractométrico el índice de refracción de la mezcla
(disolvente orgánico + aceite) dependerá de la concentración y del índice de refracción
del disolvente orgánico y del aceite.
Después de la medida del índice de refracción de la mezcla se hace un calibrado
preparando patrones constituidos por disoluciones del aceite en el disolvente orgánico
de concentración conocida.
A cada patrón se le mide el índice de refracción.
npatrón
nmezcla
% aceite
Construida la recta de calibrado se interpola el valor del índice de refracción de

la mezcla y obtenemos así el % en aceite que tiene la semilla.
El porcentaje obtenido no es tan preciso como en otros métodos, por ejemplo el
método oficial Soxhlet, aunque es suficiente como 1ª aproximación.
En este caso nA y nB deben ser muy diferentes.
3ª aplicación:
Otra aplicación es la determinación de mezclas de aceites.

Cuando tengamos mezclas binarias de 2 aceites de índice de refracción conocido
se puede calcular el % de cada aceite en la mezcla aplicando el principio
refractométrico.
Sea una mezcla de girasol (A) + oliva (B).
Como nA y nB son conocidos, y además CA + CB = 100, midiendo el índice de
refracción de la mezcla puedo despejar los valores de CA y CB.
100 · nmezcla = CA · nA + CB · nB
CA + CB = 100
Para poder hacer esto los índices de refracción de los 2 aceites deben ser
suficientemente distintos para que el % obtenido de cada uno de ellos sea bastante
aproximado.
Ej1: aceite de oliva à no secante.

es válido pues los aceites son distintos
aceite de girasol à semisecante.
Ej2: aceite de oliva à no secante. no es válido pues ambos aceites son no

secantes, con lo que tendrán un índice de
aceite de té à no secante. refracción similar.
Los disolventes más empleados para el calibrado son el α-naftaleno y el α-

bromonaftaleno. Estos disolventes deben ser poco volátiles, pues el valor del índice de
refracción de la mezcla estaría variando continuamente al hacer la medida.
3.2.3. Rotación específica.
Hay algunas sustancias con actividad óptica, son aquellas sustancias capaces de
desviar el plano de polarización de la luz. De los 2 vectores de la luz (vector campo
magnético y vector campo eléctrico) es el vector campo eléctrico al que también
denominamos vector óptico, el cual vibra en todas direcciones.
La luz polarizada es aquella en la que el vector eléctrico vibra en una sola
dirección, es decir, se ha eliminado el resto de direcciones.
Para obtener luz polarizada hay diversos tipos de polarizadores como pueden ser
los prismas.
Las sustancias que presentan actividad óptica tienen un carbono asimétrico o
quiral, es decir, sus 4 sustituyentes son diferentes.
El ácido oleico no presenta actividad óptica, es más, hay pocos ácidos grasos que
la presenten. Un ejemplo de ácido graso que sí la presenta es el ácido ricinoleico que
representa entre un 80 y 90% del aceite de ricino.
Ácido ricinoleico à 12 – hidroxi – 9 – octadecenoico.
El carbono nº 12 es el quiral, veámoslo:
H
R2 C12 OH
R1
siendo:
R1 ≡ COOH – CH2 - ...

R2 ≡ CH3 – CH2 - …
La actividad óptica se define como: “el ángulo girado por una columna de una
disolución de la sustancia a medir de 1 decímetro de longitud y concentración 1g/ml”.
La rotación específica se mide con un polarímetro que lleva un cilindro en el
cual se introduce el aceite. Delante lleva el polarizador y detrás el analizador.
columna
aceite OJO
polarizador l à longitud de la columna analizador
Sea c la concentración de la muestra de aceite.

Cuando el aceite desvía el haz, entonces varía el ángulo α, habría por tanto que
mover la columna de nuevo para ver la luz.
columna
α
aceite OJO
polarizador l à longitud de la columna analizador
ángulo girado (α )
rotación específica =
l (dm ) · c (g/ml)
Como vemos tenemos una relación entre la actividad óptica y el % de ácido

graso que presenta.
4. Métodos físico-químicos: Espectrofotometría U.V. –Visible (Tema 4).
Ver tema 4, páginas 72-74.

Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 7: Aplicaciones del análisis enzimát.115
TEMA 7: APLICACIONES DEL ANÁLISIS ENZIMÁTICO

AL ANÁLISIS DE GRASAS
1. Estudio de la posición de los ácidos grasos en la glicerina.
Se trata de conocer la posición en la que los ácidos grasos esterifican, si lo hacen

en la posición α ó α’ (1 ó 3) o bien en β (2).
O
α CH2 O C R1
O
β CH O C R2
O
α' CH2 O C R3
En todos los TG naturales el % de ácidos grasos saturados en la posición β es

muy pequeño, es decir, esterifican preferentemente las posiciones externas à α y α’
(1 y 3).
En el caso del aceite de oliva, sea cual sea la calidad, el % de ácidos grasos
saturados (16:0 à palmítico y 18:0 à esteárico) en la posición β no supera el 2%.
Sin embargo, si se obtiene un aceite de síntesis mediante mezcla de glicerina +
ácidos grasos y calentamos con un catalizador, los TG formados tienen sus ácidos
grasos distribuidos al azar en las 3 posiciones de la glicerina. A esto se le conoce
distribución RANDOM (palabra que significa “al azar”).
Este hecho es debido a que el catalizador utilizado no es estereoespecífico, algo
que en la biosíntesis sí ocurre, es decir, las enzimas son estereoespecíficas.
La obtención de un aceite sintético es ilegal, por ejemplo, a un aceite lampante
(que tiene muchos ácidos grasos libres) le puedo añadir glicerina y calentar con un
catalizador, de esta forma obtengo un TG con distribución random. Esto es un fraude,
por ello se mide el % de ácidos grasos, pero en posición β, que sabemos que en el aceite
de oliva es ≤ 2%. En el caso de obtener un % mayor al 2% puede deberse a que hemos
añadido aceite de síntesis.
El % en posición β de ácidos grasos también puede aumentar si sometemos al

aceite a un tratamiento anómalo, es decir, calentando a altas temperaturas ocurre un
reordenamiento de ácidos grasos hacia la posición β.
2. Determinación (cualitativa y cuantitativa) de los ácidos grasos situados

en la posición β de los triglicéridos en aceites y grasas.
2.1. Fundamento
La medida de ácidos grasos saturados en posición β se hace tratando el aceite

con un enzima, la lipasa pancreática (del páncreas del cerdo) que hidroliza
preferentemente las posiciones externas de la glicerina en un TG, con lo que
obtendríamos los ácidos grasos libres de las posiciones externas y la glicerina con ácido
graso en posición β, es decir, los β–monoglicéridos:
α
ácidos grasos (α, α’) + β–monoglicéridos
α'
El esquema del procedimiento incluye:
a) Tenemos 2 etapas de preparación de la muestra:
- Neutralización del aceite para eliminar ácidos grasos libres que puedan
interferir en el procedimiento.
- Purificación en columna de alúmina (Al2O3) de los posibles ácidos grasos

libres que no se hayan eliminado en la neutralización.
b) Tenemos 1 etapa de síntesis:
- Hidrólisis con lipasa pancreática para obtener los β–monoglicéridos.
c) Tenemos 1 etapa de análisis:
- Análisis de los β–monoglicéridos por C.G.

Las etapas de preparación de la muestra no siempre se tienen que llevar a cabo,

es decir:
• Si la acidez es ≤ 3% à se hace solo la purificación.

• Si la acidez es > 3% à se hace la neutralización y la purificación.
2.2. Preparación de la muestra: neutralización alcalina y purificación.
- Neutralización:
La muestra se disuelve en hexano y añadimos en un embudo de decantación. Se

le adiciona una disolución de NaOH suficiente como para neutralizar la acidez más un
ligero exceso. Añadimos como indicador fenolftaleína. Se agita bien y una vez
separadas las 2 fases se elimina la fase acuosa que contendrá a los jabones.
La fase orgánica se lava varias veces hasta que no dé color con la fenolftaleína,
es decir, lavamos hasta que la coloración rosa desaparezca.
- Purificación:
La purificación en columna se realiza pasando el aceite ya neutralizado disuelto

en hexano a través de una columna de alúmina (suspendida en hexano). Como la
alúmina es básica, si han quedado algunos ácidos grasos libres sin eliminar en la
neutralización, estos quedarán retenidos, por eso si la acidez es muy pequeña no hace
falta neutralizar, pues la simple purificación es suficiente para su eliminación.
2.3. Procedimiento.
2.3.1. Hidrólisis enzimática.
Hidrolizamos la muestra en presencia de lipasa pancreática, se hidrolizan

preferentemente las posiciones externas de la glicerina:
2 lipasa
  → 1–
pancreática
+ 3– + 2
3
Para llevar a cabo la hidrólisis, el aceite ya neutralizado se mezcla con una

cantidad (P) determinada de lipasa pancreática en condiciones de temperatura y pH
controlados.
Añadimos además el colato sódico (es una sal biliar) como emulsionante de la
grasa, también añadimos CaCl2 (donde el Ca2+ es un cofactor del enzima, es decir,
acelera la hidrólisis de la enzima lipasa pancreática), añado un tampón para controlar el
pH trishidroximetilaminometano (pH = 8). Toda la mezcla se pone a 40 ºC.
El colato sódico se añade para mezclar bien la fase acuosa con la fase orgánica,
y el enzima ataque bien a los TG.
Toda la mezcla se deja reaccionar durante un tiempo determinado y al cabo de
ese tiempo se detiene la hidrólisis cambiando el pH y la temperatura, es decir, enfriamos
y añadimos HCl. Si no detenemos la hidrólisis se pueden hidrolizar parte de los TG en
posición 2.
2.3.2. Separación de los β–monoglicéridos por Cromatografía de

Capa Fina.
Extraemos los ácidos grasos (1– y 3–) y los β–monoglicéridos con éter etílico y
los separamos por CCF.
• Fase estacionaria: SiO2 (polar)

• Fase móvil: hexano:éter etílico:ácido fórmico.
• Revelador: diclorofluoresceína.
Añadimos ácido fórmico para protonar los ácidos grasos y tenerlos como forma
no disociada, pues el equilibrio se desplazaría hacia la izquierda:
R–COOH 
→ R–COO- + H+
La forma de migración en la placa en ambas formas (disociada y sin disociar) es

diferente, siendo las manchas de la forma disociada más alargadas que las manchas de
la forma sin disociar.
La mancha que queda justo por encima de donde se aplica la muestra (la de
menor Rf) es la de los β-monoglicéridos (son los más polares), es decir, no necesitamos
del uso de patrones, pues esta mancha es muy identificativa.
2.3.3. Análisis de los β–monoglicéridos por Cromatografía de Gas-

Líquido.
Este apartado lo estudiaremos más adelante.
2.4. Preparación de la lipasa pancreática.
La lipasa pancreática que se utiliza debe tener una actividad comprendida entre
0’8 – 2 para que los resultados de una muestra a otra sean comparables, es decir, no se
pueden emplear lipasas con actividad muy diferente en experiencias que pretenden ser
comparables.
Vamos a ver cómo se determina la actividad de la lipasa pancreática.
Una unidad lipásica es la cantidad de enzima que libera 10 µeq de ácidos grasos
por minuto.
La actividad enzimática de una enzima se define como el nº de unidades
lipásicas por mg de enzima.
Para saber la actividad de nuestra enzima se prepara una mezcla que lleva: un
aceite patrón neutro (¡ojo!, no es la muestra), colato sódico, NO añadimos CaCl2 pues
no interesa que la hidrólisis sea rápida, NaOH 0’1 N para ajustar el pH a un valor de 8’3
(por tanto no añadimos un tampón) y lipasa pancreática en una cantidad P (en mg).
2.5. Control de la actividad lipásica y expresión de la misma.
Como el pH no está tamponado, al añadir la lipasa bajará su valor por aparición

de los ácidos grasos libres. Esta mezcla que hemos preparado la tenemos en un matraz,
entonces, cuando el pH sea de 8’3 desde una bureta añado NaOH 0’1 N con velocidad
suficiente como para mantener el pH a ese valor de 8’3, es decir, la aparición progresiva
de ácidos grasos hará que el pH baje, pero si conforme estos ácidos grasos aparecen
nosotros añadimos NaOH los neutralizaremos, con lo que el pH no se verá modificado,
por eso hay que añadir la base a una velocidad determinada. Una vez ya controlamos la
adición de NaOH se mide cuánto volumen de sosa hemos añadido cada minuto y
hacemos una representación gráfica del V (en ml) frente al tiempo (en minutos).
La gráfica que se obtiene es del tipo:
V(ml) de
NaOH 0’1N
tg α = pte = V’
α
t (min)
V’ es la pendiente de la recta, y es el volumen de NaOH añadido por minuto

para neutralizar los ácidos grasos libres producidos por la lipasa.
Nota: Hemos puesto “V’” para diferenciarlo del volumen de NaOH en ml (V),
pero como el valor numérico de V y V’ es el mismo en la expresión de más abajo
pondremos V en lugar de V’.
Para pasar a litros multiplico por 10-3, si multiplicamos por la normalidad de la
sosa pasamos de l/min a eq/min, ahora pasamos a µeq/min multiplicando por 106, la
expresión nos queda:
V(ml / min ) · 10 -3 (l/ml) · 0'1(eq/l) · 10 6 (meq/eq) = V · 100(meq/min )
Como 1 unidad lipásica son 10 meq/min:
V · 100(meq/min ) = V · 10 unidades lipásicas
La actividad enzimática sería:
V · 10 unidades lipásicas
Actividad enzimática =
P(mg )
Esta determinación se realiza en análisis de rutina según la normativa del COI.
(Ver fotocopia de la normativa, Apartado 11, página 16)
- Para aceites de oliva virgen el máximo de ácidos grasos saturados (incluidos

el C4 y C6) en posición β es del 1’5%.
- Para aceites de oliva refinado y mezcla el % aumenta, es del 1’8%.
- Para aceites de orujo de las 3 calidades el % aumenta, es del 2’2%.
3. Análisis estereoespecífico de triglicéridos.
Para el análisis estereoespecífico de TG vamos a ver 2 métodos:
Método de Brockerhoff:
Se parte de un TG al cual tratamos con un reactivo de Grignard, bromuro de etil

magnesio (EtMgBr), y se lleva a cabo una hidrólisis cualquiera de las posiciones
externas (la 1 ó la 3) sin ninguna preferencia pues obtendremos una mezcla
equimolecular de los α,β–diglicéridos. Realizamos la síntesis de un fosfolípido,
obteniendo 1,2–diacil–glicerofosfátido + 2,3–diacil–glicerofosfátido. Seguidamente
realizamos una hidrólisis de estos fosfolípidos en presencia de una enzima
estereoespecífica, la fosfolipasa que hidroliza la posición 2 de los fosfolípidos naturales.
Esta enzima se encuentra en los venenos.
Finalmente se obtienen 3 fracciones de distinta polaridad que se separan
mediante CCF y analizan por CG:
• De la 1ª fracción se obtienen los ácidos grasos de la posición 1.

• De la 2ª fracción se obtienen los ácidos grasos de la posición 2.
• De la 3ª fracción se obtienen los ácidos grasos de las posiciones 2 y 3.
Así, por diferencia entre la 3ª y la 2ª fracción obtengo la fracción de los ácidos

grasos de la posición 3.
Un esquema sería el siguiente:
1 1 1 P–C
2  → 2
EtMgBr
+ 2 → 2
síntesis
+ 2
3 3 P–C 3
TG α,β–diglicéridos fosfolípidos
fosfolipasa A
lipasa
pancreática
1 P–C
CH3 + 2– + 2
C≡ CH2OH CH2 N CH3
P–C 3
2 CH3
(colina)
Método de Lands:
Se parte de un TG, realizo la hidrólisis con EtMgBr y obtengo una mezcla

equimolecular de los α,β-diglicéridos (igual que en el método anterior hasta aquí). Se
realiza una fosforilación enzimática en presencia de la diacilglicerolquinasa la cual es
estereoespecífica. El ácido ortofosfórico entra únicamente en la posición 3.
Así se obtienen 2 fracciones de distinta polaridad que se separan mediante CCF
y analizan por CG:

Como vemos no podemos saber la fracción de los ácidos grasos en cada

posición, por eso hacemos el tratamiento con lipasa pancreática y así obtener la fracción
de los ácidos grasos en la posición 2, teniendo esta fracción y por diferencia obtengo los
ácidos grasos en la posición 3 (de la 1ª fracción) y en la posición 1 (de la 2ª fracción).
Un esquema sería el siguiente:
1 1 1
2  → 2
EtMgBr
+ 2     
→ 2
fosforilac ión enzimática
+ 2
diacilglicerolquinasa
3 3 H2PO4 3
TG α,β–diglicéridos 1,2–diacil–glicerofosfato
lipasa
pancreática
O
H2PO4 ≡ O P OH
2 - +
OH
(Ver fotocopia nº 34, Cuadro nº 111.6)
Aquí podemos ver datos bibliográficos sobre el reparto de ácidos grasos sobre
todo de los ácidos grasos saturados en posición β de los triglicéridos.
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 8: Determinación de cptes anómalos 123
TEMA 8: DETERMINACIÓN DE COMPONENTES

ANÓMALOS EN LAS GRASAS
Los componentes anómalos son sustancias que no aparecen de forma natural en

la grasa, y puede ser agua (humedad), metales, fósforo, antioxidantes, disolventes y
pesticidas.
1. Determinación de humedad.
Un aceite no debe contener agua. El fruto contiene agua de vegetación que

formará parte del alpechín en la obtención del aceite. Esta humedad la absorbe de la
atmósfera pero lo hace en baja cantidad.
La presencia de agua es indeseable pues favorece la hidrólisis de los TG, es
decir, favorece el aumento de la acidez del aceite.
Como el agua es inmiscible prácticamente con el aceite, siempre se encontrarán
como fases separadas bien en la superficie o en el fondo de la grasa.
La determinación de la humedad se utiliza como un criterio de pureza.
El contenido en humedad en el aceite de oliva está regulado por el COI.
Para la determinación de la humedad existen 4 tipos de métodos:
- Métodos de secado.
- Métodos de destilación.
- Métodos por absorción.
- Métodos volumétricos.
El criterio a seguir para escoger uno u otro método es ver la naturaleza de la

muestra y el contenido en humedad esperado, si es bajo, medio o alto.
1.1. Métodos de secado.
Son los métodos más utilizados pues son los más sencillos de aplicar.
Se calienta la muestra hasta una temperatura suficiente como para evaporar todo
el agua y se calcula la humedad gravimétricamente, es decir, por diferencia de pesada
entre la muestra original y la muestra desecada.
Los distintos métodos de secado que existen difieren en la temperatura que se

emplea, en la presión y en el tipo de calentamiento, es decir, el aparato empleado para
calentar.
En estos métodos a la vez que se elimina el agua también se elimina materia
volátil (no toda) como son aldehídos, cetonas, ésteres, etc...
En este tipo de métodos podemos encontrarnos varias causas de error:
- Salpicaduras producidas en el calentamiento de la muestra. Por eso estos

métodos no son buenos para contenidos altos en humedad (> 1%), tampoco
lo son para contenidos muy pequeños (< 0’05%), por tanto se emplea para
cantidades entre 0’05–1 %.
- Posible oxidación de muestras muy insaturadas como es el caso de aceites
secantes y semisecantes, ya que al calentar en contacto con el aire se puede
adicionar O2 atmosférico, con lo que aumentaría el peso de la muestra.
1.1.1. Humedad y materias volátiles (“método de la estufa de

aire”).
Se puede emplear para cualquier grasa o aceite comestible. Es norma UNE y

COI para el aceite de oliva.
Este método no se puede aplicar a aceites secantes y semisecantes porque las
condiciones de operación adicionarían O2 atmosférico en los dobles enlaces, y tampoco
para los aceites de coco y palma porque estos aceites contienen ácidos grasos volátiles
en gran cantidad (desde el butírico (C4) hasta el laúrico (C12)) y se perderían, además
esta pérdida de ácidos grasos es muy lenta con lo que podríamos tardar mucho tiempo
en realizar el método ya que es necesario que la pesada muestre un valor constante.
Procedimiento (para el aceite de oliva):
Se homogeneiza la muestra (pues el agua es insoluble con el aceite) y así poder

pesar una cantidad representativa. Se pesa una cantidad determinada en una cápsula de
vidrio, porcelana, acero inoxidable, etc... Introducimos la muestra ya pesada en una
estufa de aire a 105ºC. Al cabo de media hora se vuelve a pesar varias veces hasta tener
un peso constante, lo cual indicaría que ya no queda más humedad y materia volátil en
la muestra. Consideramos pesada constante cuando la diferencia entre 2 pesadas es

menor al 0’05%.
(Ver fotocopia de la normativa, Apartado nº 6, página 9)
Vemos que el contenido en humedad y materia volátil para las 3 calidades del
aceite de oliva es inferior o igual al 0’2%.
1.1.2. Humedad y materias volátiles (“método de la estufa de

vacío”).
Es norma UNE. Se aplica a todos los aceites y grasas comestibles incluidos los
aceites secantes y semisecantes, y los aceites de coco y palma con acidez < 1%.
Difiere del método anterior en que la estufa de desecación de la muestra está
sometida a vacío (P ≤ 100 Torr).
En este método la temperatura de operación es menor que en el anterior debido a
que trabajamos a menor temperatura à 75ºC. Se mantiene la muestra en la estufa
durante 1 hora. El resto del procedimiento es igual.
Se aplica a aceites secantes y semisecantes pues hemos eliminado el peligro a la
oxidación ya que ahora no hay O2 atmosférico al operar a vacío. También se puede
aplicar a aceites de coco y palma (los cuales perdían gran cantidad de ácidos grasos que
eran volátiles) con acidez pequeña porque así tendrá una baja cantidad de ácidos grasos
libres dentro de los cuales estarán incluidos los volátiles, además al trabajar a una menor
temperatura no se favorece la volatilización de dichos ácidos grasos (C4 à C12).
1.2. Métodos por destilación.
Se determina la humedad adicionando a la muestra un disolvente orgánico

inmiscible con el agua y destilamos. El disolvente orgánico forma con el agua una
mezcla azeotrópica. La adición del disolvente ayuda a la destilación del agua. Los
disolventes más empleados son: xileno, dimetilbenceno y tolueno.
1.2.1. Humedad (“método del xileno”).
Este método emplea un montaje de destilación especial.
(Ver fotocopia nº 35, Figuras 1.11 y 8.1)
El destilado se recoge en un tubo colector graduado en unidades de volumen. El

destilado incluye al principio xileno y agua, finalmente solo incluye agua. Como el
xileno tiene una densidad más baja en el tubo colector el agua queda en la fase de más
abajo. Una vez están bien diferenciadas las fases leemos el menisco el valor de volumen
(en ml) de agua.
Junto con el agua y el xileno también destila materia volátil, pero esta materia
volátil quedará disuelta en la fase del xileno (excepto aquellos compuestos que sean
solubles en agua).
Se emplea para muestras con cantidades altas de humedad, pero no es válido
para cantidades demasiado pequeñas, pues sería difícil de medir el volumen en el tubo
colector.
La humedad se calcula de la siguiente forma:
m
d= àm=d·v
v
Sabemos que la densidad prácticamente es constante ≈ 1 g/ml, entonces,

conocido el valor de d y tomando el volumen v en ml podemos conocer el valor de m
en gramos, valor que en este caso coincidirá numéricamente con el del volumen:
m = 1 (g/ml) · v(ml) = v(g)
Este método se puede aplicar al aceite de girasol en el caso de que éste no tenga
una humedad demasiado pequeña.
1.3. Métodos por absorción.
Estos métodos apenas se emplean, pues actualmente hay otros mejores y más
rápidos, además necesitan un montaje muy especial que es muy complejo y un gas
como el N2 el cual es difícil de manejar.
La muestra se calienta y se le hace pasar una corriente de un gas inerte y seco
(N2, ...). La humedad y materia volátil se hace llegar a un deshidratante (gel de sílice,
CaCl2, CuSO4, etc...). En este método se determina la humedad por diferencia de pesada
de la sustancia deshidratante antes y después de la llegada de la muestra.
1.4. Métodos volumétricos.
1.4.1. Método de Karl-Fischer.
La humedad en este caso se determina por valoración.

Existe un reactivo denominado de Karl-Fischer el cual reacciona de forma
estequiométrica y específica con el agua. Este reactivo es universal. Este método se
puede realizar utilizando un aparato automático.
Aquí aparece un aparato de Karl-Fischer automático.

Este reactivo de Karl-Fischer se compone de I2, metanol y piridina, y es de color
rojo cereza.
La muestra a determinar se mezcla con metanol el cual es un deshidratante,
después se valora con el reactivo de Karl-Fischer bien por titulación directa (muestra +
metanol) o por titulación por retroceso.
Para preparar el reactivo de Karl-Fischer se hacen las siguientes reacciones:
H SO2
I2 + SO2 + 3 N + H2O 2 N + N
I O
SO2 H
(b) N + CH3OH N
O SO4CH3
Dijimos que la titulación podía ser directa o por retroceso:
- Si es directa: se añade el reactivo de Karl-Fischer, siendo el viraje desde el

color de la muestra hasta un color rojo cereza. El reactivo actúa como
autoindicador.
- Si es por retroceso: adicionamos una cantidad medida y en exceso del
reactivo de Karl-Fischer. Posteriormente se valora el exceso de reactivo con
una disolución estándar de concentración conocida de metanol-agua. El
viraje ahora es al contrario, pasamos de un color rojo cereza al color de la
muestra.
Para la determinación del punto final se hace visualmente o eléctricamente (por

amperometría).
Se puede ver la variación de la cantidad de I2 con el tiempo.
Aquí aparece un montaje para la determinación del punto final.

Tanto la bureta como el matraz con el reactivo llevan un desecante, pues el
metanol que contiene el reactivo de Karl-Fischer al ser deshidratante absorbe agua, con
lo que el reactivo no debe llevar agua de la atmósfera.
Aquí podemos ver la determinación del punto final mediante amperometría,

vemos que durante la valoración la intensidad va desde 0 hasta el punto final que es
cuando empieza a aumentar:
I
t
Este método sirve para detectar cantidades de humedad < 0’1% y para
cantidades altas.
2. Metales.
2.1. Generalidades.
Los metales provienen del contacto de la muestra con material metálico durante
su manejo o elaboración. También pueden proceder de residuos de plaguicidas.
Fundamentalmente encontramos los siguientes metales:
- Cu que proviene de funguicidas, y Fe. Estos aparecen en mayor proporción.

- As y Pb provenientes de plaguicidas (son tóxicos), y Ni. Estos aparecen en
menor proporción.
Algunos son nocivos por ser tóxicos o bien porque catalizan la oxidación del
aceite con lo que favorecen su degradación.
Para su determinación no se pueden emplear los métodos analíticos clásicos
como son la volumetría y gravimetría debido a que son elementos que aparecen a nivel
de trazas o incluso ultratrazas, es decir, en muy baja concentración (ppm ó ppb).
Por tanto se emplean técnicas instrumentales. Además con anterioridad a su
determinación debemos destruir la materia orgánica (matriz).
Esta matriz se puede destruir mediante:
- Digestión por vía húmeda: es un tratamiento de ácidos (HNO3 y HClO4) en

caliente.
- Digestión por vía seca (calcinación): se somete la muestra a una temperatura
en torno a los 400 ºC.
Como técnicas instrumentales se emplean:
- Espectrofotometría.
- Polarografía: es un método electroanalítico muy sensible.
El método oficial que existe para la determinación de metales en aceites es la

Espectrometría de Absorción Atómica con horno de grafito. Mediante esta técnica no es
necesaria la destrucción previa de la matriz, pues este paso viene implícito en la propia
técnica.
Aquí aparece una tabla con la concentración de algunos elementos en aceites y

grasas determinados por Espectrometría de Absorción Atómica.
En general, en la Espectrometría de Absorción Atómica (AAS) la muestra se
atomiza para convertirla en un vapor atómico. Esto se hace sometiendo la muestra a
altas temperaturas. Posteriormente se ilumina con una fuente de radiación externa que
emita la frecuencia característica de absorción del metal a determinar.
Los átomos del vapor absorben una cierta energía pasando del estado
fundamental a estados excitados. La cantidad de energía absorbida está relacionada con
la concentración del metal en el vapor atómico de muestra.
En la atomización lo único que se consigue es vaporizar la muestra, pero no la
excita a niveles superiores al fundamental.
Un esquema del equipo sería:
Fuente de
Atomizador Monocromador Detector
radiación λFe, λCu, ...
Muestra
(Fe, Cu, ...)
Según sea la muestra a analizar así debo de emplear una radiación u otra. Es
decir, si la muestra es de Fe, se le hace llegar una radiación de longitud de onda la del
Fe, para ello empleamos una lámpara de cátodo hueco, cuyo cátodo es de Fe.
Empleamos un monocromador para elegir solo una λ de todas las que tiene la
lámpara de cátodo hueco.
El detector resta la energía que le llega con y sin muestra.
La atomización se puede llevar a cabo de 2 formas distintas según sea la

muestra:
- Con una llama à FAAS.

- Con un horno de grafito à EAAS.
En EAAS se emplea un tubo de grafito que está calentado eléctricamente, su

longitud es de 2 – 3 cm. En su interior se introduce la muestra.
2 – 3 cm
Ventajas de la EAAS frente a la FAAS:
- La eficiencia de la atomización (densidad de átomos en forma de vapor) es

mayor que en el caso de FAAS, es por tanto una técnica más sensible con lo
que se pueden medir concentraciones más bajas.
- Se pueden analizar directamente muestras sólidas o líquidas sin previa
destrucción de la materia orgánica.
Desventajas de la EAAS frente a la FAAS:
- Tiene más interferencias que la FAAS al ser una técnica más sensible.
En EAAS el análisis se hace con una programación de temperatura.

Primero se lleva a cabo un secado, es decir, se calienta a una temperatura

determinada a la que se elimina el disolvente. Seguidamente se calienta a una
temperatura suficiente como para eliminar la materia orgánica (pirólisis o calcinación),
a una temperatura entre 400 – 500 ºC durante 20 segundos aproximadamente.
Finalmente se hace la atomización, es decir, se eleva la temperatura a un valor
suficiente como para convertir la muestra en un vapor atómico en estado fundamental.
Esta temperatura varía entre 2.000 – 3.000 ºC según la muestra a tratar.
(Ver fotocopia nº 38, Figura 10-16)
Aquí podemos ver un aparato para EAAS.
Para el análisis de aceites la muestra no se deposita directamente sobre la pared

del horno, sino que se coloca en una plataforma metálica llamada plataforma de L’Vov.
De esta forma se consigue una mayor eficacia en la atomización, es debido a que la
temperatura de la pared externa es mayor que dentro del tubo que es por donde fluye un
gas inerte (Argón) para que no se queme el tubo y para purgarlo de posibles restos de
muestras anteriores. Entonces si dejo la muestra encima de la pared no todos los átomos
alcanzarán la temperatura óptima de atomización.
se calienta después
se calienta antes
Por eso se coloca la plataforma de L’Vov que se calienta por convección y

radiación un poco más tarde que la pared externa, entonces al interior del tubo le da
tiempo a que alcance la temperatura óptima de atomización, es como si retardáramos la
atomización hasta alcanzar todo el tubo la temperatura óptima de atomización.
La señal producida en FAAS es diferente a la que aparece en EAAS (en esta
aparece un máximo).
Interferencias del método a causa de la matriz:
- Formación de compuestos poco volátiles del analito.
El metal a determinar forma con otros compuestos de la matriz (aniones)

compuestos que son pocos volátiles, por tanto se reduce la eficiencia de la atomización.
Ej: Ca2+, si la muestra contiene PO4-3, éste actúa como interferente pues se forma
el pirofosfato cálcico à CaP2O7 que es muy poco volátil.
Estas interferencias se pueden eliminar de 2 formas:
• Por adición de una especie que reaccione preferentemente con el

interferente. Esta especie se llama agente liberador y puede ser por ejemplo
La3+. El fosfato de lantano es más estable que el de calcio.
• Por adición de una especie que forma con el metal a determinar un
compuesto más volátil y más estable que el que forma el metal con el
interferente. Esta especie se llama agente protector y puede ser por ejemplo
con EDTA se forma el complejo EDTA-Ca2+.
- Formación de compuestos muy volátiles.
El metal en ocasiones forma con otras especies de la matriz compuestos muy

volátiles. En este caso el problema es que en la etapa de pirólisis (donde aumentamos la
temperatura para destruir la materia orgánica) se puede perder parte del metal.
En este caso, para eliminar las interferencias se añade una sustancia que reduzca
la volatilidad del analito (del metal), formando con él un compuesto que no se
demasiado volátil. Esta especie que se añade se llama modificador de la matriz. Se
emplea sobre todo para la determinación de Pb y As. Como modificadores de matriz se
emplean: lecitina de huevo (es un fosfolípido, es el ácido ortofosfórico quien reacciona
con el Pb) y sales de Pd respectivamente.
Aquí podemos ver la señal transitoria de atomización en EAA.

2.2. Determinación de cobre, hierro, níquel y plomo por Espectroscopia

Directa de Absorción Atómica con Horno de Grafito.
Se introduce una cantidad medida de aceite en el horno de grafito sobre la

plataforma de L’Vov. Si la concentración del metal a determinar es muy alta y no entra
en la recta de calibrado se diluye la muestra con un aceite comercializado de bajo
contenido metálico, suele ser un aceite de girasol desmetalizado. Se hace la medida
correspondiente. Los patrones se preparan a partir de compuestos organometálicos
(también se comercializan), son de la marca CONOSTÁN.
En el caso de determinar Pb o As hay que añadir lecitina de huevo y sales de Pd
respectivamente como modificadores de matriz según ya hemos visto.
3. Determinación de fósforo.
Parte del P que contiene una grasa es de origen natural, proviene de los
fosfolípidos mayoritariamente.
O
CH2 O C R1
O
CH O C R2 X ≡ aminoalcohol
O
CH2 O P O X
OH
A partir de la determinación de P se puede determinar la cantidad de fosfolípidos

que contiene una grasa.
Se emplea un factor de conversión (F), que será diferente para cada tipo de
aceite:
% fosfolípidos = % fósforo · F
Así, de manera aproximada podemos obtener un cálculo del % de fosfolípidos.
Por ejemplo, para el aceite de soja F = 30.

Además de fosfolípidos naturales podemos encontrar fosfolípidos que se hayan

adicionado a un producto con la finalidad de actuar como emulsionante (en el chocolate,
la margarina, ...).
Los fosfolípidos tienen 2 cadenas apolares y 1 cabeza polar, reducen la tensión
superficial entre una fase acuosa y una fase oleosa.
El chocolate lleva parte de agua, leche y grasa, sustancias que son parcialmente
inmiscibles. Añadimos un emulsionante para reducir la tensión superficial existente
entre las fases formadas en la mezcla para así favorecer la mezcla, la emulsión.
Algunas cervezas llevan lecitina para disolver los antioxidantes que no son
solubles.
En el refinado del aceite la presencia de fosfolípidos origina problemas en la
neutralización y decoloración, por eso previamente han de eliminarse. Los problemas se
deben porque los fosfolípidos se encuentran en forma coloidal (formando miscelas).
Para eliminar los fosfolípidos adicionamos agua, calentamos sobre los 100 ºC y
agitamos. De esta forma los fosfolípidos se hinchan, posteriormente se coagulan y
finalmente precipitan, con lo que por filtración son fácilmente de eliminar. Para hacer
este paso es necesario conocer la cantidad de fósforo que tiene la muestra. Para ello
empleamos el método del azul de molibdeno, es el mismo método que se emplea en la
determinación de P en sueros.
Método del azul de molibdeno:
Consta de 3 pasos fundamentales:
a) Destrucción de la materia orgánica mediante calcinación a 500 – 600 ºC. De

esta forma el P queda en forma inorgánica à PO43-.
b) Adición al PO43- de molibdato amónico à (NH4)2MoO4, formándose el
fosfomolibdato amónico à PO4 · 12MoO3 (NH4)3.
c) Seguidamente añadimos un reductor con lo que el Mo(IV) pasa a Mo(V) y se
forma el azul de molibdeno cuya estructura se desconoce aún. Se mide la
absorbancia a 650 nm.
Se emplean patrones sin matriz oleosa, son disoluciones acuosas de KH2PO4.

4. Determinación de antioxidantes.
4.1. Determinación de antioxidantes por Cromatografía de Líquidos de

Alta Resolución (HPLC).
Estos antioxidantes que vamos a determinar son distintos a los tocoferoles y al

resto de antioxidantes naturales. Ya nos referimos a estos oxidantes (los cuales eran
adicionados) en el Tema 1, además vimos su detección.
(Ver apartado 3.3. Antioxidantes (aditivos), página 21)
Para detectarlos se hace un extracción con acetonitrilo. Después los analizamos

por CCF e identificamos las manchas. Los analizamos mediante HPLC.
En HPLC utilizamos un detector (U.V.) a la salida de la columna, es un
fotómetro que mide a 280 nm, que es donde absorben los antioxidantes dando un pico.
En cuanto a la elución se puede trabajar:
a) En gradiente: es cuando varía la concentración de la fase móvil durante la

experiencia. Aplicaremos esta forma de elución.
b) En régimen isocrático: es cuando la fase móvil es la misma en toda la
cromatografía, en todo el análisis.
5. Determinación de disolventes.
Concretamente veremos la determinación de disolventes halogenados.

Esta determinación se hace siempre al aceite de oliva, es una determinación de
rutina. La incluyen las normas internacionales del COI y CE.
En esta determinación se mide el contenido en disolventes halogenados (en
particular el tetracloroetileno à Cl2C=CCl2) procedentes de la extracción del aceite o
por contaminación.
La contaminación en el aceite de oliva virgen no se produce por contacto con el
disolvente al caer éste en el aceite, sino que se puede deber a que absorbe dicho
disolvente si hay un recipiente abierto que lo contenga, pues el aceite es como una
esponja.
La normativa indica el contenido máximo para el total de disolventes

halogenados así como el contenido máximo para cada uno de ellos.
La ley marca:
≤ 0’2 mg/Kg para el contenido total
≤ 0’1 mg/Kg para el contenido individual
El análisis cualitativo se determina mediante C.G., pues son volátiles.
(Ver fotocopia nº 39, Anexo XI)
Aquí vemos el procedimiento a seguir en la determinación del contenido en

disolventes halogenados volátiles en el aceite de oliva.
Procedimiento:
Se introduce la muestra en el vial (es un pequeño frasco similar al de las

inyecciones) y se mantiene a baño maría durante 1 hora a 70 ºC. Con esto conseguimos
la desorción de los disolventes halogenados dentro de la muestra, quedando en el
espacio de cabeza del vial:
espacio de cabeza
disolventes
El vial se conecta mediante un sistema de válvulas a un cromatógrafo de gases e

inyectamos un determinado volumen. Esta cromatografía se llama cromatografía de
gases con espacio de cabeza.
(Ver fotocopia nº 38, Figura B)

Los patrones se preparan disolviendo cantidades determinadas de los disolventes

a determinar en un aceite exento en principio de dichos disolventes.
Ahora este vial con el patrón se trata de igual forma que a la muestra, inyectando
en el CG el mismo volumen que antes.
El detector es de captura electrónica (ECD) el cual se emplea para especies
electronegativas. Dicho detector es muy sensible y específico para los halógenos.
6. Determinación de pesticidas.
Esta determinación no está incluida en la normativa del COI ni del CE.

Para la determinación empleamos la HPLC en fase reversa.
6.1. Determinación de benzopireno en aceites y grasas comestibles por

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución en Fase Reversa.
Uno de los pesticidas más conocidos es el benzopireno, es un hidrocarburo

policíclico (PHAs).
El benzopireno está presente en el humo de los cigarros, en los carbones de las
barbacoas, en los tubos de escape, en productos ahumados, etc...
En el caso del aceite de orujo, el benzopireno aparece por absorción durante el
proceso de desecado. En el proceso de secado al aceite se le hace pasar una corriente de
aire caliente que contiene benzopireno.
Mediante HPLC se pueden determinar cantidades muy pequeñas à 0’1 µg/Kg
(ppb).
La detección es fluorimétrica, pues estos compuestos presentan fluorescencia.
Esta técnica es más sensible que la espectrometría.
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 9: Aplicaciones de la espectros.139
TEMA 9: APLICACIONES DE LA
ESPECTROFOTOMETRÍA Y ESPECTROSCOPÍA AL
ANÁLISIS DE GRASAS
1. Espectrofotometría U.V.
1.1. Relación entre estructura y absorción en la región U.V.
Para que una molécula absorba en U.V. debe poseer dobles enlaces, ya sean
C=C, C=O, C=S.
Si esos dobles enlaces se encuentran aislados la absorción se produce en la zona
inferior a 220 nm (U.V. lejano), pero en esta zona absorben casi todas las moléculas,
además no aparece un máximo bien definido, con lo que no resulta útil.
Otro problema que nos encontramos es que la medida en esta zona sirve para
determinar la insaturación total de una grasa, y para dicha medida ya tenemos el método
del índice de I2.
En el caso de que la molécula presente dobles enlaces conjugados entonces sí
habrá un máximo de absorción bien definido. Además, el hecho de que aparezcan
dobles enlaces conjugados no es tan corriente en un aceite, pues solo aparecen en
aceites secantes à I.Y. > 130.
• Si la molécula es un dieno conjugado ese máximo aparece ≈ 232 nm.

• Si la molécula es un trieno conjugado ese máximo aparece ≈ 270 nm.
• Si la molécula es un tetraeno conjugado ese máximo aparece ≈ 315 nm.
Son dienos conjugados los productos primarios de oxidación, los

hidroperóxidos, de los cuales medíamos su K232, son trienos conjugados parte de los
productos secundarios de oxidación, de los cuales medíamos su K270.
Conforme aumenta la insaturación à el máximo de absorción aparece a mayor λ
à el valor de K (coeficiente de estimación específica) es mayor.
(Ver fotocopia nº 40, Tabla parte superior izquierda)

Ej: 18:29,11 à isómero del linoleico, absorbe en el U.V. pues tiene dobles
enlaces conjugados.
Ej: 18:29,12 à linoleico, no absorbe en el U.V. pues tiene dobles enlaces
aislados.
Ej: 18:39,11,13 à isómero del linolénico, absorbe en el U.V. pues tiene dobles
enlaces conjugados.
Ej: 18:39,12,15 à linolénico, no absorbe en el U.V. pues tiene dobles enlaces
aislados.
En la tabla anterior podemos ver que conforme aumenta el nº de insaturaciones

à aumenta el valor de K.
(Ver fotocopia nº 40, Figura I)
Aquí vemos los espectros de ácidos con poliinsaturaciones conjugadas, vemos

cómo aparecen los máximos en 232, 270 y 315 nm según sean dienos, trienos o
tetraenos conjugados.
Para los enlaces carbonílicos, ya sean de una cetona o de un ácido graso, sólo
absorberán en U.V. en el caso de que estén conjugados con otro doble enlace.
Ej: α-dicetona (producto secundario de oxidación) à absorbe a 270 nm.
O O
C C
Ej: cetona-α-insaturada (producto secundario de oxidación) à absorbe a 270

nm.
O
C CH C
Ej: ácido a-insaturado (producto secundario de oxidación) à absorbe a 270 nm.
O
CH CH C
OH
El enlace acetileno absorbe a 270 nm si está conjugado a otro enlace insaturado.

La medida de absorción en este caso tiene muy poca utilidad, pues son pocos los
aceites que tienen ácidos grasos con triples enlaces.
Estructuras cíclicas insaturadas:
Tenemos sustancias como los tocoferoles y polifenoles como las más

importantes, pero demás tenemos ciclopropenos, sesamol, ácidos abiéticos, ácidos
pimáricos, etc...
R1
OH
CH3
R2 O
R
R3
tocoferoles
R1, R2 y R3 son átomos de H o metilos, siendo R una cadena hidrocarbonada.
(Ver fotocopia nº 40, 7 estructuras cíclicas en parte central derecha)
Aquí podemos ver las estructuras de los ácidos abiéticos y ácidos pimáricos.
(Ver fotocopia nº 40, Figura II)
Podemos observar en esta figura los picos de absorción de las estructuras

cíclicas y vemos que dichos picos aparecen más definidos.
1.2. Aplicaciones:
1.2.1. Medida de enlaces etilénicos conjugados: Método

directo y método indirecto (ISOMERIZACIÓN
ALCALINA).
Cuando tenemos una molécula poliinsaturada que no presenta conjugación (por

ejemplo el ácido linoleico), si se trata con una base fuerte (por ejemplo KOH) en
caliente se produce una migración de los dobles enlaces C=C hacia el interior de la
molécula siempre en el sentido de la búsqueda de conjugación.
C C C C C
KOH, ∆
a b
C C C C C
a b
C C C C C C C C C C
De esta forma conseguimos que una molécula que no absorbe en U.V. (al no
tener dobles enlaces conjugados) sí lo haga.
Ej: linoleico à 18:29,12
9 10 11 12 13
C C C C C
KOH, ∆
a b
C C C C C
9 10 11 12 13
a b
C C C C C C C C C C
9 10 11 12 13 9 10 11 12 13
Ej: linolénico à 18:39,12,15
a
18:310,12,15 →
 18:310,12,14
base
trieno conjugado
(λ ≈ 270 nm)
b
18:39,11,15 →
 18:3 9,11,13
base
a b c d
C C C C C C C C base
→

9 10 11 12 13 14 15 16 c
18:39,13,15 trieno dieno
conjugado
18:39,12,15 (λ ≈ 232 nm)
d
18:39,12,14
Ej: araquidónico à 20:45,8,11,14

a tetraeno trieno
20:46,8,11,14 →
 20:46,8,10,14
base
conjugado
(λ ≈ 270 nm)
b tetraeno dieno
20:45,7,11,14 conjugado
(λ ≈ 232 nm)
c
20:45,9,11,14 →
 20:45,9,11,13
base
a b c d e f tetraeno trieno
conjugado
C C C C C C C C C C C base
→
 (λ ≈ 270 nm)
d
20:45,8,10,14 →
 20:46,8,10,14
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 base
20:45,8,11,14 e tetraeno dieno

20:45,8,12,14 conjugado
(λ ≈ 232 nm)
f tetraeno trieno
20:45,8,11,13 →
 20:45,9,11,13
base
conjugado
(λ ≈ 270 nm)
Los tetraenos trienos conjugados si se tratan 2 veces más con una base darán
lugar a tetraenos conjugados que absorben a 315 nm.
Este tratamiento con isomerización alcalina sirve para determinar la
concentración de una mezcla de ácidos grasos poliinsaturados no conjugados (no
absorben en U.V.).
Sea una mezcla de linoleico, linolénico y araquidónico de concentraciones c1, c2
y c3 respectivamente en g/100ml.
Para hallar la concentración en cada ácido graso la muestra se disuelve en
ciclohexano, dicha disolución tendrá una concentración c(g/100ml). Sometemos la
mezcla a isomerización alcalina con lo que ahora sí absorbería en U.V. Medimos la
absorbancia de la muestra a 3 longitudes de onda correspondientes a los máximos de
absorción de dienos, trienos y tetraenos à A233, A268, A315.
A 233 nm darán señal los ácidos grasos que originen dienos conjugados, en este
caso contribuirán los 3 ácidos grasos de la mezcla. La absorbancia de una mezcla es la
suma de las absorbancias de cada componente, es decir las absorbancias son aditivas.
Según la Ley de Lambert-Beer:
A = K · b · c, si b = 1 cm:
A233 = K233 · c1 + K’233 · c2 + K”233 · c3 (1)
donde K corresponde al valor para el ácido linoleico, K’ para el ácido linolénico

y K” para el ácido araquidónico.
A 268 nm darán señal los ácidos grasos que originen trienos conjugados, en este
caso contribuirán los ácidos linolénico y araquidónico.
A268 = K’268 · c2 + K”268 · c3 (2)
A 315 nm darán señal los ácidos grasos que originen tetraenos conjugados, en
este caso contribuirá el ácido araquidónico.
A315 = K”315 · c3 (3)
Como los valores de K, K’ y K” están tabulados, conocido c3 a partir de la

ecuación (3) podemos determinar el valor de c2 de la ecuación (2) y con estos 2 valores
(c2 y c3) podemos determinar el valor de c1 de la ecuación (1).
A233 = 921 · c1 + 616 · c2 + 569 · c3

A268 = 507 · c2 + 528 · c3
A315 = 215 · c3
Con patrones cuya concentración es conocida puedo determinar los valores de

absorbancia (A).
Si tomo un patrón de linoleico à p1 (conc. conocida en g/100ml) à A233.
A 233
K 233 =
p1
O bien podemos tomar varios patrones de concentraciones diferentes pero

conocidas (p1, p2, p3, ...) y mido sus absorbancias (A1233, A2233, A3233, ...). Esta forma
puedo representar A frente a p y así mediante la pendiente obtengo el valor de K:
Ap233
p
Isomerización alcalina (procedimiento):
Como base fuerte empleamos KOH (etilenglicol) a distintas concentraciones

(6’6 y 21 %). Según el tiempo empleado así será la isomerización.
(Ver fotocopia nº 40, Figura III)

(Ver fotocopia nº 40, Figura IV)
(Ver fotocopia nº 40, Tabla parte inferior derecha)
La temperatura se fija a 180 ºC, con lo que para controlar la isomerización

jugamos con el tiempo y las concentraciones.
Conforme aumenta la concentración de KOH à aumenta el % de trienos
conjugados.
En el caso del ácido linoleico, éste origina dienos y trienos conjugados.
En el caso de que una muestra contenga ácidos grasos poliinsaturados que
presenten conjugación y otros que no la presenten à Ej: mezcla de linolénico
(18:39,12,15) y ácido α-eleosteárico (18:39,11,13), se mide la absorbancia en U.V. antes y
después de la isomerización alcalina.
Antes de la isomerización solo contribuye a la absorbancia el ácidos eleosteárico
à A268.
Después de la isomerización contribuyen ambos ácidos grasos a la absorbancia
à A233 y A’268.
En el caso de que la muestra contenga ácidos grasos poliinsaturados conjugados

no se lleva a cabo la isomerización alcalina pues ya presentan absorción en U.V.
1.2.2. Medida del estado de oxidación (K270 y K232).
Ya vimos en el tema 5 el estado de oxidación de una grasa, donde los productos

primarios daban absorción a 232 nm pues son dienos conjugados y los productos
secundarios daban absorción a 270 y 232 nm pues son dienos y trienos conjugados.
(Ver fotocopia nº 41, Tabla de longitudes de onda para distintos enlaces)

2. Aplicaciones de la Espectrofotometría Visible.
Se emplea actualmente muy poco en el análisis de grasas.

Se utiliza para componentes de la grasa que absorben en el visible, es decir, que
tengan color: carotenos y clorofilas.
Y también para componentes que no tengan color y tengamos que derivatizarlos:
3+
- → Fe2+ α
Tocoferoles Fe
 , α ' - dipiridilo
 → compuesto rojo à λ = 520 nm.
(Determinación de Emmerie-Engel)
- Fósforo molibdato
    → azul de molibdeno à λ = 650 nm.
amónico (reductor)
- Esteroles anhídrido
   → compuesto verde à λ = 630 nm.
acético / H2SO4
3. Aplicaciones de la Espectroscopia I.R.: determinación de isómeros trans

y enlaces.
Se usa muy poco en análisis de grasas, tan solo en casos concretos.

La absorción en I.R. produce vibraciones o rotaciones de los átomos.
La energía de una radiación I.R. es menor ala energía de U.V. por eso no
produce tránsitos de electrones.
(Ver fotocopia nº 42, Figura VI)
Aquí vemos el espectro de I.R. del ácido laúrico (12:0), su éster metílico y el de
sus TG. Podemos ver las vibraciones de los grupo: metilo, metileno, carbonilo e
hidroxilo (en ácidos grasos libres).
Son difíciles de determinar, por ello solo se emplea la determinación en I.R. para
determinar isómeros trans: CH=CH à 10’34 µm.
También se emplea para la determinación de enlaces acetilénicos à –C≡C–.

Casi todos los ácidos grasos tienen configuración cis en el doble enlace C=C, los
isómeros trans aparecen cuando la muestra se somete a altas temperaturas, también
aparecen durante la hidrogenación parcial de una grasa y cuando se produce una
migración de un doble enlace C=C como ocurre en la isomerización alcalina. Puede

aparecer también como resultado de una mala conservación de la grasa.
En la hidrogenación parcial lo que se intenta hacer es endurecer la grasa:
Muestra Margarina
(cis) →
H2
(trans)
Los isómeros trans tienen un P.F. mayor que los cis.

La determinación de isómeros trans sirve para seguir la hidrogenación de una
grasa, pero sobre todo es importante para detectar un tratamiento anómalo de una grasa,
como puede ser someter a esta a altas temperaturas. En la etapa de batido no se deben de
sobrepasar los 30 ºC.
El % de isomerización trans en el aceite de oliva está regulado. Si este % se
supera esto puede ser debido a una adulteración con aceites con isómeros trans, etc...
El método oficial para determinar isómeros trans actualmente es la
cromatografía de gases.
En el aceite de oliva se miden los isómeros trans de:
- ácido oleico à 18:1.

- ácido linoleico à 18:2.
4. Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear:

determinación del “contenido graso”.
El método oficial es el método Soxhlet.

En la aceituna los componentes mayoritarios son: agua y aceite.
Luego a la aceituna se le hace:
- % de humedad.
- Contenido en aceite à % de contenido graso total.
El % de humedad se refiere al peso total del fruto:
gramos de aceite
% humedad = · 100
gramos de materia húmedad
Para el contenido graso total, ese porcentaje se puede referir bien a materia
húmeda o bien a materia seca.
g aceite
· 100
g materia húmeda
% contenido graso total
g aceite
· 100
g materia seca
Se hace el % de contenido graso para determinar el punto óptimo de recolección

de la aceituna sin tener en cuenta otros factores. La recogida se realizará cuando ese %
sea máximo.
Desde la formación de la aceituna hasta su maduración este contenido varía.
La formación del aceite se puede llevar a cabo en 3 etapas:
a) Biosíntesis lenta: durante este tiempo el contenido en aceite aumenta muy

lentamente. La aceituna se comporta como un tejido fotosintético. Suele
durar hasta que el hueso se endurece à finales de Agosto.
b) Biosíntesis acelerada: durante este periodo se produce un crecimiento
rápido del contenido en aceite. El momento de mayor actividad es en la 2ª
quincena de Septiembre.
c) Etapa estacionaria: a partir de un determinado momento el contenido de
aceite es máximo y no aumenta más.
Si represento % contenido en aceite frente al tiempo tenemos:
%aceite
contenido máximo
tiempo
Cuando se alcanza la etapa estacionaria la cantidad de agua disminuye (aunque

ya no aumenta la de aceite), es decir, la aceituna pierde humedad, entonces, si uso como
parámetro el contenido graso en la materia húmeda parecería que el % de contenido
graso aumentaría, pues el denominador de la expresión va disminuyendo.
Por tanto deberíamos de usar la expresión del contenido graso sobre materia
seca.
A parte de este parámetro para determinar el contenido graso existen otros como
el índice de madurez, etc...
Métodos de determinación del contenido graso:
Hay varios tipos de métodos:
a) Métodos físicos: emplean procedimientos mecánicos para extraer el aceite.

Tenemos el método Abencor.
b) Métodos químicos: emplean la extracción con un disolvente orgánico para
obtener el aceite. Tenemos el método Soxhlet.
c) Métodos físico-químicos: también se denominan analizadores. Utilizan la
medida de una propiedad físico-química para determinar el contenido en
aceite. Se emplea RMN y NIR.
Métodos físicos (Sistema Abencor):
Utiliza a escala más pequeña el procedimiento industrial que se lleva a cabo en

una almazara.
Las etapas de las que consta son:
- Molienda de la aceituna.
- Batido.
- Centrifugación.
- Decantación.
El sistema Abencor consta de distintos elementos:
- Molinillo de martillos de acero inoxidable.

- Batidora.
- Centrífuga de cesta.
- Probeta.
Se moltura 1 Kg de aceituna a un tamaño adecuado con el molinillo de martillos.

Se pesa entre 600 – 700 g de aceituna molturada. La masa pesada se añade a uno de los
recipientes de la batidora. En la parte inferior hay un baño termostatizado con varios
recipientes. Esa masa se bate (con paletas) durante 20 minutos a 25 ºC.
Se añade agua hirviendo (300 ml a 100 ºC) y se bate durante 10 minutos más, de
esta forma se favorece la extracción del aceite.
Esta masa ya batida se añade a la centrífuga donde se separará la fase sólida
(orujo) y la fase líquida (aceite, agua de vegetación y agua añadida).
La fase líquida se añade a una probeta y se deja decantar midiendo el volumen
de aceite en ml.
Como podemos ver no es un método muy preciso.
V (ml) · daceite V (ml) · 0'915 g/ml

% contenido graso total = · 100 = · 100
P(g ) P (g )
Métodos químicos (Método Soxhlet):
El Soxhlet se compone de:
- Matraz de fondo plano.

- Extractor.
- Refrigerante.
El extractor tiene comunicación con el matraz a través del tubo A y también a

través del tubo interno D (sifón).
Se pesan 60–70 g (P) de aceituna (en materia húmeda) ya machacada por un

molinillo de martillos. Se introduce en una estufa y se deseca a 105 ºC, así eliminamos
el agua. Una vez secada la aceituna se vuelve a pesar (P`), así mediante diferencia de
pesadas determinamos la humedad y materia volátil.
La aceituna ya desecada se introduce en un cartucho y se coloca dentro del
extractor (B). La parte superior de este cartucho no debe superar la altura del sifón.
La extracción se lleva a cabo en:
- Hexano à 6 horas de duración.

- Éter de petróleo.
2 horas de duración.
- Éter etílico.
A pesar de que se tardan 6 horas empleando hexano la extracción con este es

mucho mejor que con éter de petróleo o éter etílico.
Se añade el disolvente sobre el cartucho hasta que éste quede totalmente
sumergido. En este momento empieza la extracción del aceite desde el interior del
cartucho hasta el exterior. El disolvente como máximo llega al nivel del sifón, pues
cuando supere dicho nivel el sifón se encargará de vaciar el extractor haciendo pasar el
disolvente que sobre (junto a parte de aceite ya extraído) al matraz de fondo plano, de
esta forma nunca se rebasa el nivel que indica el sifón. Cuando calentamos el matraz
(pues está sobre una placa calefactora) el disolvente sobrante se evapora, dejando en el
matraz al aceite, pues tiene un punto de ebullición mayor, así, cuando el disolvente entra
en contacto con el refrigerante se condensa y cae nuevamente en el interior del cartucho,
de esta forma lo que se consigue es nuevamente extraer más aceite, pues cada vez que el
disolvente sobrepase al nivel del sifón éste junto al aceite que ha extraído pasará de
nuevo al matraz, así tendremos cada vez más aceite en el matraz de fondo plano.
Llegará un momento en el que el disolvente ha extraído todo el aceite, esto ocurre tras
las 6 horas de extracción. Entonces finalmente tenemos todo el aceite junto al disolvente
en el matraz de fondo plano. Lo que se hace ahora es sacar el cartucho y lo introducimos
en una estufa para eliminar los restos de disolvente que aún pueda tener. Así, por
diferencia de pesadas del cartucho antes y después de la extracción podremos saber la
cantidad de aceite que se ha extraído. También se puede calcular el aceite extraído
pesando el aceite obtenido, pero primero hemos de destilar todo el disolvente. El
disolvente que se va destilando condensa y vuelve a caer en el extractor, pero ahora al
no haber cartucho el nivel indicado por el sifón nunca se sobrepasará con lo que todo el
disolvente podrá ser destilado. Así obtenemos el aceite sin disolvente en el matraz de
fondo plano. Por diferencia de pesadas entre el peso del matraz con el aceite y vacío
obtenemos la cantidad de aceite extraído.
(Ver fotocopia nº 44, Fotos 14, 15 y 16)
Podemos ver un tubo de muestras, un analizador del contenido (rendimiento)

graso y un patrón de aceite.
Un dibujo de este esquema podría ser el siguiente:
refrigerante
cuerpo de extracción
(Soxhlet)
sifón
cartucho
matraz
placa calefactora
Otros métodos muy similares al Soxhlet son:
• Fosslet.
• Autelec.
Son aparatos comercializados.
En estos sistemas también se determina el contenido graso por extracción con

disolvente, empleamos tetracloroetileno para el método Fosslet y heptano para el
método Autelec.
Difieren del método Soxhlet en que la muestra de aceituna una vez desecada se
pone en contacto con un volumen determinado de disolvente y se realiza la extracción
por vibración.
Se mide la densidad de la miscela (mezcla del disolvente y el aceite).
Se determina el contenido graso mediante la calibración con miscelas de
concentración conocida en aceite.
Métodos físico-químicos (RMN y NIR):
En RMN la determinación se basa en la diferencia entre los H de la fase sólida y

los de la fase líquida. Fue establecida por 1ª vez por Pauli quién postuló que ciertos
núcleos atómicos podían poseer la propiedad de spin, es decir, podía girar sobre sí
mismos alrededor de un eje. Este tipo de núcleos tendrían asociado un momento
magnético (µ) pues son una carga en movimiento. También postuló que estos núcleos
serían capaces de absorber radiación situados en un campo magnético externo (B0)
intenso. Más tarde estos postulados fueron demostrados experimentalmente, se
demostró que átomos como 1H, 13
C, ..., cuando se ponían en el seno de un campo
magnético externo absorbían en la zona de radiofrecuencias à 4 – 600 MHz. Esta
absorción implicaba un desdoblamiento de los niveles de energía, habiendo por tanto
una diferencia de energía.
Se encontró que la absorción para cada núcleo de un mismo elemento no era la
misma, dependía del entorno molecular del núcleo.
Esta técnica se empleó para la determinación estructural de compuestos
orgánicos fundamentalmente.
También se emplea con fines cuantitativos que es lo que vamos a ver nosotros.
En ausencia de campo magnético (B0) los spines del núcleo y de los e- estarían
orientado al azar, pero al someterlos a un B0 el µ sufre distintas orientaciones. El nº de
orientaciones viene dado por la expresión 2I + 1, siendo I el nº cuántico de spín.
1 1
Ej: 1 H à I 1 H = à 2 · I + 1 = 2 · + 1 = 2 orientaciones.
2 2
Las 2 orientaciones son:
- A favor del campo.

- En contra del campo.
Y corresponde a 2 números cuánticos magnéticos distintos:
1
ms : + à a favor del campo.
2
1
ms : − à en contra del campo.
2
Vamos a tener un desdoblamiento de los niveles de energía los cuales en

ausencia de campo estaban degenerados.
Si a la muestra le suministro una radiación de frecuencia (ν 0) suficiente como
para que se produzca el tránsito desde el nivel inferior a niveles superiores, entonces la
muestra absorberá radiación.
h · γ · B0
∆E = = h · ν0
2π
siendo γ la relación giromagnética (o magnetogírica).
Esa frecuencia (ν0) se encuentra dentro del espectro en la zona de

radiofrecuencias à 4 – 600 MHz.
A esta frecuencia, parte de los núcleos en un nivel inferior de energía pasan a un

nivel superior.
Esa absorción de radiación será proporcional a la cantidad de núcleos atómicos
que hayan en el nivel inferior de energía. A mayor nº de núcleos à mayor absorción à
mayor señal.
Debe de haber una cantidad mayor de núcleos en el nivel superior.
Como vemos ∆E es proporcional al campo magnético externo aplicado (B0),
luego cuanto mayor sea este campo aplicado à mayor es la separación entre los niveles
(∆E) à tenemos mayor nº de núcleos atómicos en el nivel inferior de energía à mayor
es la absorción à mayor es la señal à mayor es la sensibilidad.
Por ello son más caros los equipos cuanto más potentes sean.
Si comparo esta técnica con la espectrofotometría me encuentro con 2
diferencias:
- La absorción la realizan los núcleos.

- La transición no es de electrones sino de núcleos, además esta absorción se
produce en la zona de radiofrecuencias.
Hay 2 tipos de equipos en RMN:
- De onda continua.
- De impulso o de transformada de Fourier.
Hoy en día es el 2º tipo el que más se usa, pues es mucho más sensible, además
también existen equipos para I.R.
Espectrómetro de onda continua:
El espectrómetro realiza un barrido de frecuencias, es decir, una variación

gradual de la frecuencia (ν 0) de la radiación suministrada, mientras mantenemos el
campo magnético constante.
Otra forma de trabajar es manteniendo constante la frecuencia y variando el
campo magnético aplicado.
Cada núcleo absorbe a un frecuencia, pues tienen un entorno diferente, es decir,

están apantallados de distinta forma.
Aquí podemos ver el esquema de un espectrómetro para RMN y la señal que

produce.
Para los núcleos de 1H de la fase sólida se obtiene una señal ancha y de baja
intensidad, y para los de la fase líquida se obtiene una señal estrecha y de alta
intensidad.
La diferencia entre las señales se debe a que los núcleos de 1H de la fase sólida
experimentan un mayor apantallamiento o desapantallamiento que los núcleos de 1H de
la fase líquida, es decir, va a haber una gama de ν0 más amplia con lo que el barrido de
frecuencias será mayor. En el caso de los núcleos de la fase líquida, éstos están menos
influenciados por el entorno al estar más en movimiento que los de la fase sólida.
El espectrómetro mide la señal del líquido y compara esta señal con la de un
patrón.
Espectrómetro por impulsos o Transformada de Fourier (FT):
Se proporciona a la muestra un impulso de radiofrecuencias durante unos µs. Es

decir, un impulso es una banda de radiofrecuencias suficiente como para que todos los
núcleos atómicos absorban radiación.
El espectrómetro mide cómo varía la señal obtenida en función del tiempo, esta
curva que aparece se le denomina FID (Free Induction Decay).
Hay un periodo de tiempo denominado tiempo muerto donde el aparato no mide

la señal producida, se produce por tanto la relajación que es cuando los núcleos pierden
energía pasando al nivel inferior.
La 1ª parte de la curva corresponde a la señal de los 1H de la fase sólida, y la 2ª
parte que es más ancha corresponde a los de la fase líquida.
Para que un núcleo atómico se relaje (y pase así al nivel inferior de energía)
puede seguir 2 caminos distintos:
a) Relajación spin-red.
El núcleo atómico que se relaja cede su energía al resto del entorno molecular
(red) en forma de energía vibracional o rotacional. De esta forma aumenta la
temperatura con lo que las moléculas se calientan.
b) Relajación spin-spin.
El núcleo atómico que se relaja intercambia su energía con un núcleo atómico

adyacente de forma que se produce un intercambio de los números cuánticos
magnéticos.
Para cada caso existe un tiempo de relajación à T1 y T2.
En el caso de los núcleos atómicos para la fase sólida, el tiempo de relajación es
mucho más pequeño que para los líquidos, de ahí que se obtenga ese tipo de señal à
ver Figura 4.11.
El método para la determinación del contenido graso es el siguiente:
La muestra de aceituna una vez triturada se deseca en una estufa durante toda
una noche. Por diferencia entre la muestra seca (P’) y húmeda (P) se determina el % de
humedad.
La desecación de la muestra es necesaria puesto que si tenemos agua el aparato
no puede discernir entre los 1H del agua y los del aceite.
Una vez desecada la muestra se envuelve en una especie de cartucho de papel de
celofán y se introduce en un vaso de vidrio (150 ml).
A continuación se realizan 3 medidas en el espectrómetro el cual lleva un
orificio donde se coloca el vaso. Se hacen 3 medidas para tomar el valor medio.
Tenemos una señal L (lectura de la señal correspondiente a la muestra).
Después se prepara un patrón pesando en un vaso de igual características al
anterior alrededor de 50 g de dicho aceite patrón. Al vaso le colocamos encima una
pieza de teflón para que no entre en contacto con polvo.
Tenemos una señal l (lectura de la señal correspondiente al patrón).
Como el patrón contiene un 100% de aceite, entonces mediante proporcionalidad

obtengo el % de aceite de la muestra:
P' ' · L
% contenido graso (en materia húmeda) = · 100
l·P
P' ' · L
% contenido graso (en materia seca) = · 100
l· P
Cabe recordar que el método oficial es el de Soxhlet, pero éste tardaba muchas
horas, en cambio este método es más rápido, en solo 15 minutos hemos realizado la
medida.
Las medidas de RMN son dependientes de la temperatura.
Hay ocasiones en los que si queremos que el patrón se parezca más a la muestra
lo que se hace es introducirle unas bolitas de vidrio.
Hoy en día, además de analizadores de RMN existen analizadores de I.R. los
cuales trabajan en el I.R. cercano (NIR). En este caso no es necesario desecar la
muestra, pues en este método no se miden los 1H de la fase líquida sino la frecuencia de
vibración de los átomos de una estructura, con lo que es una ventaja frente a RMN.
Como inconveniente tenemos que se trabaja con muestras muy pequeñas, con lo
que las medidas son menos reproducibles al ser las muestras menos representativas.
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 10: Aplicaciones de la CCF al AG 159
TEMA 10: APLICACIONES DE LA CCF AL

ANÁLISIS DE GRASAS
1. Generalidades: formas de trabajo, revelado, desarrollo y cuantificación.
En cualquier separación cromatográfica las especies se separan según la forma

de distribución entre la fase móvil y la fase estacionaria.
En el caso de la CCF, la fase estacionaria se dispone como una película fina
sobre una placa de vidrio, es similar a la cromatografía en papel. La fase estacionaria
puede ser un sólido o un sólido recubierto con una capa de líquido.
Según se use una fase estacionaria u otra tenemos 2 tipos de CCF:
- Cuando la fase estacionaria es un sólido à CCF de adsorción.

- Cuando la fase estacionaria es un sólido recubierto de un líquido à
Cromatografía de reparto.
En CCF la fase móvil siempre es un líquido.
En la cromatografía de adsorción el analito sufriría fuerzas de adsorción y

desorción sobre la fase estacionaria. El paso de la fase móvil los irá separando.
En la cromatografía de reparto los analitos estarían en equilibrio entre el líquido
de la fase estacionaria y el líquido de la fase móvil, es parecido a la extracción líquido-
líquido.
Como soportes sólidos se suelen usar: sílice (SiO2), alúmina (Al2O3) que
generalmente están hidratados, y a veces se usa sílice recubierta con un líquido apolar
(undecano, tetradecano, etc...).
Si usamos SiO2-undecano, o SiO2-tetradecano tendríamos una cromatografía de
reparto.
Como fase móvil en análisis de grasas se usa una mezcla de 2 líquidos, y a veces
de 3 líquidos.
Ej: hexano, acetonitrilo, éter etílico, éter de petróleo, etc...
(Ver fotocopia nº 46, Tablas 11-1 y 11-2)

Formas de trabajo:
Además podemos trabajar de 2 formas:
a) Fase normal.
Tenemos:
- Fase estacionaria: polar à sílice.

- Fase móvil: apolar à hexano:benceno.
En fase normal cuanto mayor sea la polaridad de los analitos à más retenidos
quedarán, se desplazarán menos à menor Rf tendrán.
b) Fase inversa.
Tenemos:
- Fase estacionaria: apolar o menos polar que la fase móvil à sílice-undecano.

- Fase móvil: polar à acetonitrilo:ácido acético.
En fase inversa cuanto mayor sea la polaridad de los analitos à se desplazarán

más à mayor Rf tendrán.
Revelado y desarrollo:
Puede ser de 2 tipos:
a) Destructivo: pulverización con H2SO4 (50%), H3PO4 (30%), y calentamiento

a 300 ºC. Los ácidos empleados son minerales, oxidantes, carbonizan la
materia orgánica produciendo la aparición de manchas oscuras.
b) No destructivo: se emplean varios reveladores.
- Fluoresceína: es un líquido amarillo-anaranjado que absorbe en U.V. Se ven

manchas oscuras sobre un fondo verde.
- I2: en el recipiente de desarrollo se ponen cristales de I2. El I2 sublima y se
adsorbe sobre la placa. Se debe tapar el recipiente.
Si los compuestos son muy insaturados se puede adicionar el I2 a los dobles

enlaces, luego sería un método de revelado destructivo, por ello para emplear este
método hay que tener en cuenta la muestra de la que se trata.
I2
- Mezcla de Fe3+-dipiridilo: se emplea para el análisis de tocoferoles.
Los tocoferoles son antioxidantes, reducen el Fe3+ à Fe2+. El dipiridilo compleja

el Fe2+ dando un compuesto rojo.
Recordamos que en este caso se pulverizan únicamente los patrones, pues la
muestra la protegíamos mediante una contraplaca (ver página 73, Tema 4, Fracción
insaponificable).
Cuantificación:
- Se eluye la muestra con un disolvente apropiado. Tras separarlos se aplica

una Cromatografía de Gases o una Espectrofotometría U.V.-VIS para el
análisis.
- También podemos aplicar una densitometría. Para ello se hace pasar la placa
cromatográfica delante de una fuente de radiación potente.
Medimos la intensidad de luz transmitida a través de la placa, la fluorescencia

emitida por el compuesto o bien la reflectancia (o reflexión) difusa.
Medida de la intensidad de luz transmitida a través de la placa:
Fuente
I0
mancha
SiO2
Placa de vidrio
It
Detector
La fuente empleada varía según la forma de trabajo:
- Si trabajo en la región U.V.: la fuente es una lámpara de deuterio.

- Si trabajo en la región VIS: la fuente es una lámpara de wolframio.
Siendo:
I0: intensidad de la radiación incidente.
It: intensidad de la radiación transmitida.
La transmitancia es la relación entre estas intensidades:
It
T= à A = − lg T
I0
Cabe señalar que en este caso hay desviaciones de la Ley de Lambert-Beer,

debido a que parte de la radiación que llega a la placa es dispersada por el soporte
sólido, produciéndose un fenómenos de “scattering” con lo que el detector no podrá
medir toda la radiación que no absorbe la muestra.
Fuente
I0
It
Detector
Medida de la fluorescencia emitida por el compuesto:
La fluorescencia se mide a un ángulo de 45º respecto de la radiación incidente.

En este caso se emplean 2 monocromadores: uno antes de llegar el rayo
incidente a la muestra y otro antes del detector.
Fuente
Detector
I0
IF
45º
El monocromador situado antes del detector elige la λ a la que se produce la

fluorescencia. Se emplea solo para compuestos fluorescentes.
Medida de la reflectancia difusa:
Se emplea cuando el analito es sólido.

Consiste en medir la luz reflejada por las partículas sólidas de la fase
estacionaria. Se mide al igual que la fluorescencia a un ángulo de 45º respecto de la
radiación incidente.
Se puede emplear un espectrofotómetro de cualquier tipo.
Fuente
Detector
I0
IR
45º
Esta medida se emplea más pues la reflectancia difusa es la que está menos
afectada por las irregularidades de la capa de fase estacionaria.
Densitometría:
(Ver fotocopia nº 46, Figura XIII.15)
2. Orden general de elución.
2.1. Ácidos grasos: par crítico.
Conforme aumenta la longitud de la cadena, es decir, el nº de átomos de C à

disminuye la polaridad.
- Así, para una serie de ácidos grasos saturados como esta:
C12:0 / C14:0 / C16:0

polaridad
En el caso de haber insaturaciones, conforme aumenta el nº de insaturaciones à

aumenta la polaridad.
- Así, para una serie de ácidos grasos saturados e insaturados como esta:
C18:0 / C18:1 / C18:2

polaridad
Cuando tengamos una mezcla de ácidos grasos con distinta longitud y distinta
insaturación debemos hacer uso de un parámetro denominado par crítico (o nº de
átomos de C equivalentes) el cual relaciona el nº de insaturaciones con la polaridad.
par crítico = nº de átomos de C - 2 · nº de insaturaciones
Cuanto mayor sea el par crítico à menor es la polaridad.

Cuando 2 ácidos grasos tienen el mismo nº par crítico no se pueden separar.
(Ver fotocopia nº 46, Figura 6.6) à fase inversa
Aparece una cromatografía en fase inversa de varios ácidos grasos.

Luego a mayor Rf à mayor polaridad.
Compuesto Par crítico

12:0 à ácido laúrico 12
P salen juntos
18:3 à ácido linolénico 12
O
14:0 à ácido mirístico 14
L salen juntos
A 18:2 à ácido linoleico 14
R 16:0 à ácido palmítico 16

salen juntos
I 18:1 à ácido oleico 16
D 18:0 à ácido esteárico 18 sale solo
A
20:0 à ácido arcaico 20
D salen juntos
22:1 à ácido erúcico 20
2.2. Triglicéridos.
En el caso de los TG se calcular el par crítico de cada ácido graso y se suman.
Aquí podemos ver la separación de 3 TG sobre gel de sílice (fase estacionaria

polar) usando como fase móvil una mezcla hexano:éter etílico (apolar), en fase normal.
Los TG que aparecen son:
Triglicérido Ácido graso Par crítico

Tricaproína 6:0 3 · 6 = 18
Polaridad
Tributirina 4:0 3 · 4 = 12 Rf
Triacetina 2:0 3·2=6
2.3. Ácidos grasos, ésteres metílicos y glicéridos (MG, DG y TG).
De los glicéridos son los MG los de mayor polaridad al tener 2 grupos –OH
libres, le siguen los DG al tener 1 grupo –OH libre (siendo los 1,2-DG más polares que
los 1,3-DG). Le siguen los ácidos grasos que tienen un grupo COOH, después los TG y
por último los ésteres metílicos son los de menor polaridad al no tener ningún grupo
polar:
OH OH R1
OH R1 OH R–COOH TG Ésteres metílicos
R R2 R2
Cuando se cromatografían ácidos grasos, como parte de ellos están protonados y

otra parte están desprotonados, no dan manchas definidas, mal delimitadas, por ello se
añade un ácido para desplazar el equilibrio a la izquierda.
RCOOH RCOO- + H+
Aquí vemos una placa desarrollada de izquierda a derecha.

La monoleína es quien menos se desplaza y el ácido oleico el más desplazado.
Los TG que aparecen son:
Triglicérido Ácido graso Par crítico

Trioleína 18:1 3 · 16 = 48
Polaridad
Trilinoleína 18:2 3 · 14 = 42 Rf
Trilinolenina 18:3 3 · 12 = 36
Como la fase estacionaria es polar el Rf crece en sentido contrario a la polaridad.
2.4. Fraccionamiento completo.
Aquí vemos el orden de elución de una cromatografía en fase normal.

Para realizar la cromatografía se han usado 6 disolventes.
El orden de polaridad es el siguiente.
- Hidrocarburos: tienen un Rf ≈ 1, es decir, salen casi con el disolvente.

P
- Tocoferoles.
O
- Ceras.
L
- Ésteres metílicos.
A
- Triglicéridos.
R
- Ácidos grasos.
I
- Alcoholes.
D
- Esteroles.
A
- Diglicéridos.
D
- Monoglicéridos.
Los disolventes son:
a) Éter de petróleo:éter etílico (90:10)

b) Éter de petróleo:éter etílico (80:20)
El 2º disolvente es más polar que el 1º, pues el éter etílico es más polar que el
éter de petróleo.
Para los TG: - si empleo la mezcla a) à Rf = 0’35 (muy retenidos)

- si empleo la mezcla b) à Rf = 0’6
Para los hidrocarburos: apenas varía el Rf.
c) Hexano:éter etílico (80:20)
También habría que ver la solubilidad de los alcoholes en los disolventes. Con la
mezcla b) el Rf es 0’30 y con la mezcla c) el Rf es 0’17, es decir, la mezcla c) es menos
polar que la mezcla b) pues los alcoholes están más retenidos.
3. Aplicaciones.
3.1. Fraccionamiento del insaponificable.
Como fase estacionaria se emplea SiO2-KOH (polar)

Como fase móvil tenemos 2 posibilidades:
- hexano:éter etílico (65:35)

- benceno:acetona (95:5)
Como revelador se emplea fluoresceína.

Como la cromatografía es en fase normal los que más se desplazan (mayor Rf)
son los menos polares.
El orden de polaridad en la fracción del insaponificable es:
- Hidrocarburos.
- Tocoferoles.
Polaridad
- Alcoholes. Rf
- Esteroles (E+U).
- Xantofilas.
En el aceite de oliva este fraccionamiento se emplea para determinar los

esteroles en análisis de rutina.
(Ver fotocopia nº 49, Estructura del tocoferol)
Recordar que para determinar los tocoferoles se empleaba una contraplaca (ver
página 73).
3.2. Reconocimiento de ésteres no glicéridos en grasas comestibles.
Podemos encontrar en una grasa o aceite un éster que no sea derivado de la

glicerina, sino que sea un éster de un alcohol.
Tenemos: CH3OH, CH2OH-CH2OH (etilenglicol), CH2OH-CHOH-CH3 (1,2-
propilenglicol) y CH2OH-CH2-CH2OH (1,3-propilenglicol).
Estos ésteres no existen de forma natural en la grasa pues sólo hay ésteres de la
glicerina.
En el caso del aceite estos ésteres aparecen por procesos fermentativos o
enzimáticos.
En el caso de productos alimenticios que lleven una grasa como ingrediente,
algunos de estos ésteres no glicéridos se añaden como emulsionante (para favorecer la
emulsión entre la fase acuosa y la fase orgánica).
Aquí vemos una lista de emulsionantes empleados.

Para determinar la presencia de un éster no glicérido en una grasa o aceite se

realiza un fraccionamiento de la grasa completa por CCF. Para ello la muestra (aceite o
grasa) se disuelve en hexano y se realiza el fraccionamiento utilizando como fase
estacionaria SiO2, y como fase móvil una mezcla de hexano:éter etílico (92:8), fase que
es menos polar que para el fraccionamiento del insaponificable.
El revelador es H2SO4 (50%) y calentamos a 300 ºC.
La mancha de los TG aparece aproximadamente a 1/3 de la altura de la placa
cromatográfica medida desde la base, es una mancha muy identificable porque es muy
grande debido a que su % en la grasa es muy grande.
ésteres no glicéridos
ceras, tocoferoles e hidrocarburos
TG
1/3 Rf ≈ 0’33
Si aparece una mancha por encima, es decir, con un Rf mayor, serían los ésteres
no glicéridos.
Encima de los TG aparecen: ceras, tocoferoles e hidrocarburos, pero como
hemos usado una fase móvil muy apolar estos componentes aparecen muy desplazados
y salen casi en el frente del disolvente à Rf ≈ 1.
3.3. Tocoferoles.
La determinación de tocoferoles no se determina en CCF. La CCF es una etapa

previa que se emplea con fines separativos. Los tocoferoles por tanto se determinan por
Espectrofotometría VIS y por Cromatografía de Gases, que son los métodos oficiales.
Tras realizar el fraccionamiento del insaponificable por CCF, el análisis de
tocoferoles se realiza empleando luz con λ alta (para que la energía sea baja y así no se
oxiden). El revelado de la placa se lleva a cabo con Fe3+ y dipiridilo.
Se añade pirogalol para que al calentar a reflujo se evita la oxidación de los
tocoferoles en la saponificación.
3.4. Isómeros TRANS.
Sabemos que casi todos los dobles enlaces en los ácidos grasos tienen
configuración CIS.
Un contenido anormalmente alto de isómeros TRANS indicaría que la grasa ha
sido alterada. Estos isómeros aparecen cuando se trabaja a altas temperaturas. También
pueden aparecer durante la refinación o bien durante la hidrogenación parcial de una
grasa.
En el caso del aceite de oliva, el contenido de isómeros TRANS de ácidos grasos
está regulado. Se determina para los ácidos grasos mayoritarios à 18:1, 18:2 y 18:3.
Este análisis de isómeros TRANS se hace por C.G.
Otro método para separar los isómeros CIS de los TRANS es empleando CCF
sobre sílice recubierta con AgNO3.
Los enlaces etilénicos forman complejos con la Ag+, complejos que son tanto
más estables cuanto mayor sea el nº de insaturaciones.
Los CIS son más estables que los TRANS.
Ácido oleico à 18:19,c

Ácido elaídico à 18:19,t (el Rf es mayor que el Rf del 18:19,c)
Si tenemos una mezcla de ácidos grasos saturados, insaturados, etc... Ponemos

como fase estacionaria SiO2-Ag+.
La fracción más retenida serán los ácidos grasos poliinsaturados, le siguen los
ácidos grasos diinsaturados, después vienen los ácidos grasos monoinsaturados (18:19,c,
18:1 9,t) y finalmente salen los ácidos grasos saturados.
Vemos el desarrollo de una CCF empleando sílica gel recubierta de AgNO3 y

con una mezcla tolueno:cloroformo (1:1) como disolvente.
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 11: Aplicaciones de la CG al AG 173

CROMATOGRAFÍA DE GASES AL ANÁLISIS DE GRASAS
1. Generalidades: instrumentación, parámetros cromatográficos,

optimización, métodos de identificación y cuantificación.
La muestra se volatiliza y se introduce en el interior de una columna

cromatográfica en la cual los distintos componentes son arrastrados por la fase móvil y
quedan distribuidos de forma diferente entre dicha fase móvil y la fase estacionaria que
rellena la columna.
La fase móvil se llama gas portador o “carrier”.
Una diferencia muy importante entre C.G. y HPLC es que los analitos en C.G.
no interaccionan químicamente con la fase móvil, pues esta fase móvil es un gas inerte.
Solo sirve para arrastrar al analito a través de la columna, por ello el fundamento
es más fácil que el de la HPLC.
Como gas portador se emplea: Ar, He, N2, ...
La fase estacionaria puede ser un sólido o bien un sólido recubierto con una fina
película de líquido.
Cuando la fase estacionaria es un sólido recubierto con un líquido, el sólido
actúa como soporte para retener al líquido el cual sería la fase estacionaria propiamente
dicha.
Por tanto tenemos 2 tipos de cromatografías de gases:
- Si la fase estacionaria es un sólido à Cromatografía Gas-Sólido

(Cromatografía de adsorción).
- Si la fase estacionaria es un sólido recubierto con una fina película de líquido
à Cromatografía Sólido-Líquido (Cromatografía de reparto).
La cromatografía de adsorción apenas se utiliza puesto que los analitos que son
polares (alcoholes, fenoles, etc...) quedan muy retenidos en la columna (son muy
absorbidos por la fase estacionaria), lo cual da lugar a que los picos cromatográficos se
deformen y aparezcan colas.
Parámetros cromatográficos:
• Tiempo de retención (tR): es el tiempo transcurrido desde que se inyecta la

muestra hasta que llega al detector. La llegada al detector se traduce en la
aparición de un pico en el cromatograma. El tR para cualquier analito se mide
en el máximo del pico.
El tR será mayor cuanto más sea retenido sea el analito en la fase estacionaria.
El tR queda reflejado en las curvas gaussianas. Así una curva ancha significa
mucho tR.
• Tiempo muerto (tM): es el tiempo transcurrido desde que se inyecta la

muestra hasta que llega al detector una especie que no es retenida por la fase
estacionaria, es decir, es el tiempo que tarda en recorrer la fase móvil la
columna.
En una cromatografía el primer pico corresponde al disolvente.
Aquí podemos ver la medida del tR y del tM.
• Tiempo de retención corregido (tR’): es la diferencia entre el tR del analito y

el tM à tR’ = tR – tM.
• Tiempo de retención relativo: es el cociente entre el tR del analito y el tR de

otra especie de la muestra que se toma como referencia.
Cuando se hace la cromatografía de ácidos grasos, veremos que cada uno tendrá
un tR característico. A la hora de identificarlos debo de trabajar siempre en las mismas
condiciones, de esta forma el tR obtenido para cada ácido graso será el mismo que
refleja la literatura científica, aunque aún operando en las mismas condiciones estos
valores pueden variar por diversas razones:
- Envejecimiento de la columna.
- Variación de la velocidad de flujo del gas portador en algún momento.
Por este motivo en lugar de trabajar con los tR se trabaja con los tR relativos.
Cuando se trabaja con ácidos grasos se emplea como referente el ácido esteárico
à 18:0.
Los valores de los tR relativos están tabulados con lo que los analitos podrán ser
identificados fácilmente. Aquellos que salgan antes tendrán un tR relativo menor a la
unidad y los que salgan después tendrán un tR mayor a la unidad.
Así, aunque varían las condiciones de la experiencia serán las mismas para todas
las especies, es decir, el tR relativo permanecerá más constante que el tR del analito.
Hemos dicho que para los ácidos grasos se toma como referente el ácido
esteárico, para ello se han seguido unos criterios, uno es que el pico que da aparezca en
el centro del cromatograma.
• Factor de capacidad (K’): es el cociente entre la cantidad de analito en la

fase estacionaria y la cantidad de analito en la fase móvil.
nS
K' ( A ) =
nM
Sea:
nS: el nº de moles del analito A en la fase estacionaria.
nM : el nº de moles del analito A en la fase móvil.
Se demuestra que:
tR ' ( A )
K' ( A ) =
tM
A partir del cromatograma puedo calcular el valor de K’ para cada analito.

Si K’ < 1 à los picos del disolvente y del analito están muy cerca, es decir, el
analito eluye muy rápido, de esta forma el tR del analito se mide con un precisión baja o
incluso no se llega a medir al aparecer el pico del analito solapado con el del disolvente.
Por tanto no interesa que K’ sea muy pequeño, pero tampoco que sea muy alto,
porque un K’ alto indica que el tiempo de operación es muy largo. Además de alargarse
la experiencia también hay que señalar que conforme pasa el tiempo los picos
cromatográficos sufren un ensanchamiento de banda. El valor de K’ debe estar
comprendido entre 1 – 10.
Hay que decir además que K’ depende de efectos termodinámicos con lo que
varía fundamentalmente con la temperatura a la que se opera. Entonces una forma de
modificar el valor de K’ es variando la temperatura.
• Factor de selectividad (α): es un parámetro referido a 2 analitos (los

anteriores parámetros eran propios de cada analito). Es el cociente entre el
tR’ de la especie más retenida y el tR’ de la especie menos retenida.
Sea tR’(B) > tR’(A):
tR ' ( B )
αA , B =
tR ' ( A )
Interesa tener los picos perfectamente resueltos:
- Si α = 1 à los picos salen juntos.

- Si α ≈ 1 à los picos salen demasiado juntos.
- α debe ser mayor a 1, pero lo suficiente como para que los picos salgan bien
definidos.
Para lograr esto podemos variar las condiciones de operación, por ejemplo
variando el tR de alguno de los analitos, o bien variando el ancho de banda (W), etc...
• Eficacia de una columna:
Imaginemos que la columna cromatográfica tiene un nº de platos en donde se

produce un equilibrio (entre la fase móvil y la estacionaria). Surge el concepto de plato
teórico (N) y la altura de plato (H). Sea L la longitud de la columna.
N
La eficacia se define como .
L
Para una determinada columna columna (de longitud L) la eficacia dependerá

del número de platos. Entonces: a mayor N à mayor eficacia.
La altura de plato teórico (H) es la inversa de la eficacia:
L
H=
N
Luego, cuanto menor sea H à mayor será la eficacia.
• Resolución de una columna para 2 analitos A y B:
Nosotros queremos separar totalmente los componentes de una muestra en el

menor tiempo posible, para ello nosotros variamos las condiciones experimentales. Es
decir, queremos optimizar el proceso.
Dicha optimización tiene 2 objetivos:
- Reducir el ensanchamiento de banda.

- Modificar las velocidades de migración de los componentes, esto se
consigue modificando las variables K’ y α.
Para ello defino la resolución à es la distancia entre 2 picos dividida por la

anchura media:
tR (B ) - tR (A )
Rs =
wA + wB
2
tR
tR(A)
tR(B)
wA wB w
Para una alta resolución debe haber una distancia grande entre los picos
Podemos usar también w1/2 que es la anchura correspondiente a la altura media
de los picos.
Si los picos salen juntos, son adyacentes, entonces: wA = wB = w
tR (B ) - tR (A )
Rs =
w
Se demuestra que:
N (α − 1) K '
Rs = · ·
4 α (K '+1)
Siendo:
N: nº de platos teóricos.
α: factor de selectividad.
K’: media del factor de capacidad de A (KA’) y de B (KB’).
Tenemos 3 cromatogramas con distinta resolución, siendo el tercero el de mayor

resolución.
Si observamos la expresión de Rs anterior vemos que depende de 3 factores: uno

que depende de N, otro que depende de α y otro que depende de K’:
N
• à está relacionado con aspectos cinéticos.
4
Para que la resolución aumente el valor de N debe aumentar también.

Esto se consigue de 2 formas:
a) Aumentando la longitud de la columna (L).

b) Disminuyendo la altura del plato teórico (H):
H disminuye de varias formas:
- Disminuyendo el diámetro de la columna.

- Disminuyendo el diámetro de la partícula del soporte sólido.
- Disminuyendo el espesor de la fase estacionaria.
- Variando el flujo del gas portador à esto es lo más fácil de hacer, pues
nos basta con usar un manómetro y manipularlo a nuestro gusto.
La ecuación de Van Deemter representa la variación de H frente a la velocidad

de flujo (en cm/).
B
H=A+ + C·U
U
Para cada gas se obtiene una curva distinta. El mínimo es el valor óptimo de la
velocidad de flujo, pues H es mínimo también, algo que dijimos que necesitábamos para
aumentar la resolución.
α −1
• à está relacionado con factores termodinámicos, pues α relaciona las
α
constantes de reparto, las cuales a su vez se relacionan con factores
termodinámicos. Para variar α podemos variar la temperatura o la naturaleza de
la fase estacionaria. Lo que se hace es variar la temperatura pues si variamos la
naturaleza de la fase estacionaria habría que cambiar de columna.
K'
• à está relacionado con el factor de capacidad K’, también está relacionado
K '+1
con factores termodinámicos. K’ depende de las propiedades del analito y de la
columna. Se varía K’ variando la temperatura.
En todos los métodos oficiales se indica la resolución que se debe conseguir.
Partes del Cromatógrafo de gases: (Ver fotocopia nº 51, parte inferior)
Consta de:
Sistema de inyección:
Se emplea una microjeringa para inyectar la muestra o en algunos casos un

muestreador automático.
Inyectamos la muestra en una cámara de inyección que está a la entrada de la
columna. La cámara de inyección tiene un séptum que atravesamos con la aguja de la
microjeringa. La temperatura en esta cámara de estar como mínimo 50 ºC por encima de
la temperatura de ebullición del componente menos volátil pues la muestra debe estar en
fase vapor para entrar en la columna. aguja
séptum
CÁMARA
DE INYECCIÓN
Horno:
Permite el control de la temperatura de la columna.

Hay 2 formas de trabajo:
- En régimen isotermo: la temperatura permanece constante en todo el proceso.

- Con programación de temperatura: la temperatura varía durante el proceso.
Columna cromatográfica:
Se clasifica en 2 tipos:
• Columnas de relleno, empacadas o empaquetadas: el interior de la columna

está totalmente relleno por un soporte sólido cubierto por una capa de fase
estacionaria líquida.
corte longitudinal corte transversal
Son de mayor diámetro interno que las tubulares abiertas à 2 – 4 mm.

La longitud varía entre 5 – 6 m.
Son de vidrio, teflón o metal (acero inoxidable, aluminio, etc...).
El soporte sólido es de origen natural à tierras de diatomeas (plantas
unicelulares que se alimentaban por difusión molecular del agua con los nutrientes).
Estas columnas son menos eficaces que las tubulares abiertas.
• Columnas capilares o tubulares abiertas: la fase estacionaria no ocupa todo el

interior de la columna, solo una capa en la parte interna de la columna.

Se dividen en 2 tipos:
- WCOT (Wall Coated Open Tubular) à Columna Tubular Abierta de

Pared Recubierta.
Lleva la fase estacionaria líquida directamente situada sobre la pared interna de

la columna, es decir, no lleva soporte sólido.
- SCOT (Support Coated Open Tubular) à Columna Tubular Abierta con

Soporte Recubierto.
La fase estacionaria está en un soporte sólido que está en la pared interna de la

columna. Dicho soporte puede ser tierras de diatomeas.
Las primeras columnas eran de vidrio, ahora son de sílice fundida à FSOT
(Fused Silica Open Tubular) à Columna Tubular Abierta de Sílice Fundida. Estas
columnas no llevan óxidos metílicos lo cual indica que son más flexibles, más
resistentes físicamente y más inertes químicamente.
(Ver fotocopia nº 52, Tabla 25-1)
Aquí vemos las características de los distintos tipos de columnas.

Fase estacionaria (líquida):
La fase estacionaria debe reunir ciertas características como son:
- Baja volatilidad (que no se volatilice).

- Inercia química.
- Estabilidad térmica (no se descomponga con aumentos de temperatura).
- Características óptimas de disolvente à que tenga polaridad análoga a la
de los analitos.
Las fases estacionarias que más se emplean son las que tienen la estructura
siguiente:
R R R
R Si O Si O Si R
R R R
polidimetilsiloxanos
Los radicales metilos se pueden sustituir por otros que sean más polares y así
conseguir fases estacionarias con distinta polaridad:
P
R ≡ CH3 (metilo) O
L
R ≡ C6H5 (fenilo) A
R
R ≡ C3H6CN (cianopropilo) I
D
A
R ≡ C3H6CF3 (trifluoropropilo) D
La fase más polar de todas es el polietilenglicol (carbowax):
HO–CH2–CH2–(O–CH2–CH2)n–OH
Se emplea para separar alcoholes y fenoles de las grasas.
La fase menos polar es el escualeno que es apolar:
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

CH (CH2)3 CH (CH2)3 CH (CH2)4 CH (CH2)3 CH2
CH3
Gas portador:
El gas portador puede ser: He, H2, N2, Ar, ...

La elección se basa en función del detector a emplear pues hay detectores que
permiten el uso de unos gases pero no de otros.
Sus características son:
• Han de ser inertes respecto al soluto o fase estacionaria, pues su única

función es transportar al soluto.
• Deben ser baratos, seguros y fáciles de purificar.
• Deben dar una respuesta adecuada al detector.
• La elección del gas depende de:
- Naturaleza de la muestra.
- Naturaleza de la fase estacionaria.
- Tipo de detector empleado.
El N2 es barato, seguro y fácil de purificar, pero su conductividad térmica es

baja. El H2 es barato, de conductividad térmica alta, pero no es inerte, pues en
compuestos orgánicos produce una adición al doble enlace. El He es el más usado, pero
es muy caro.
Detector:
- FID (Flame Ionization Detector) à Detector de Ionización de Llama.
Se emplea casi para todos los compuestos orgánicos, pues calcula el nº de

átomos de C. Es casi universal, pues se guía de los átomos de C que le llegan.
Es muy sensible, pero no muy selectivo.
- ECD (Electronic Capture Detector) à Detector de Captura Electrónica.
Se emplea para analitos que contengan átomos electronegativos à halógenos.

Es muy selectivo y muy sensible.
Ej: disolventes halogenados en aceite de oliva.
Métodos de identificación de los analitos: (Análisis cualitativo)
Hay 3 formas de trabajo:
a) Emplear los parámetros cromatográficos y determinar la composición de los

analitos usando patrones.
En las mismas condiciones en las que se ha cromatografiado la muestra

(temperatura, velocidad de flujo, tipo de columna, etc...) se cromatografían patrones de
cada uno de los analitos y se comparan los tR, tR’ y K’.
señal
tRA tRB tR
señal
El valor de tR del analito A y el

valor de tR del patrón del analito
A deben coincidir.
tRPA tR
señal
El valor de tR del analito B y el
valor de tR del patrón del analito
B deben coincidir.
tRPB tR
Si la muestra es muy compleja puede ser que el tR de un compuesto coincida con

el tR del patrón de otro compuesto, aunque esto ocurre muy pocas veces. De todas
formas este método se emplea para muestras muy sencillas.
A veces ocurre el denominado efecto matriz, que es la influencia que tienen el
resto de componentes de la muestra sobre la señal del analito que estamos midiendo, es
decir, ocurre que los tR del analito y de su patrón no coinciden por este efecto. Para salir
de dudas se añade a la muestra una cierta cantidad de patrón del analito en cuestión, de
esta forma cuando volvamos a cromatografiar si realmente el analito corresponde con el
patrón la señal (su pico) habrá aumentado.
En la actualidad no hace falta emplear patrones, pues el valor de su tR está
perfectamente tabulado, aunque de vez en cuando se deben añadir para ver si estos
valores cambian por algún motivo.
b) Emplear la C.G. como técnica de separación, y una vez eluidos los

componentes de la muestra los analizamos mediante otras técnicas.
A la salida de la columna colocamos un sistema que separe cada uno de los

analitos.
Estas técnicas de análisis pueden ser: espectrofotometría U.V., I.R., RMN, etc...
c) Conectar “on-line” al cromatógrafo un espectrómetro de masas à C.G.-M.S.

Es una técnica muy potente, aunque en análisis de rutina no se emplea.
Métodos de cuantificación de los analitos: (Análisis cuantitativo)
Hay varios métodos:
a) Métodos del patrón externo: hay varias formas de trabajo.
- Calibración con un patrón.

- Calibración con varios patrones.
- Calibración con adición de patrón.
Calibración con un patrón:
Se inyecta en las mismas condiciones del cromatograma un patrón para cada

analito a determinar.
Como las áreas son proporcionales a las concentraciones:
Conocida la concentración y el área del patrón del analito a determinar, y

conocida el área del analito, podremos determinar su concentración:
CA à AA CPA · AA
CA =
CPA à APA PA
Este método como vemos es muy sencillo, pero en ocasiones no va bien según
sea la muestra.
Calibración con varios patrones:
Cromatografiamos distintas concentraciones de patrones del analito a estudiar y

obtenemos su recta de calibrado.
Tendríamos:
área
AA
CA conc.
Una vez tenemos la recta de calibrado a partir del área del pico del analito
obtenemos por interpolación su concentración.
Este método es mejor que el anterior, pero más complejo y de mayor duración.
Método de adición de patrón:
Se realiza cuando existe efecto matriz, es decir, cuando la señal del analito se ve
afectada por el resto de componentes de la muestra.
Cuando hay efecto matriz la proporcionalidad antes mencionada no se cumple,
pues el analito está en distintas condiciones a las del patrón.
Por ello se preparan distintas disoluciones que contienen una misma cantidad de
muestra y diferentes cantidades de patrón.
Sean 3 disoluciones:
1 à Muestra + 0 (patrón).
2 à Muestra + CPA (patrón).
3 à Muestra + CPA’ (patrón).
Seguidamente se hace una recta de calibrado en donde los patrones están en las
mismas condiciones de la muestra, pues también sufren el efecto matriz.
área
A3
A2
A1
CA concentración de
CA
patrón añadido
Para calcular CA tenemos 2 opciones:
- Extrapolar la recta hasta cortar el eje de abcisas.

- Trazar una recta de igual longitud a la de la recta que une el punto de
corte de la recta de calibrado y el eje de ordenadas, pero en sentido
ascendente (en naranja). Trazar una recta paralela al eje de abcisas. El
punto de corte con la recta de calibrado me dará el valor de CA.
b) Método del patrón interno:
Se le añade a la muestra antes de empezar a analizarla un compuesto que no

contiene la muestra en cantidad conocida.
Por ejemplo, añadimos una cantidad pi de patrón interno. Cuando analizo la
muestra con este patrón interno obtenemos un cromatograma con los picos de cada
componente de la muestra más el pico del patrón interno.
Para cada pico obtengo su área correspondiente.
señal
Pi
C
B
A
AA APi AB AC
tiempo
Del patrón interno conocemos su área y la cantidad en la que lo hemos añadido.

De los analitos conocemos sus áreas, y queremos conocer las cantidades en las
que aparecen presentes en la muestra.
Consiste en utilizar el patrón para cada uno de los analitos como si fuera el
patrón particular de cada uno de los analitos en el caso de emplear la calibración con un
patrón.
Así, para cada analito (i) tenemos:
Pi · Ai
Ci =
Api
Vemos que con un solo cromatograma puedo calcular la cantidad de todos los
analitos de la muestra.
Como el detector responde a la cantidad de analito: si 2 ppm de patrón interno da
un área de 40.000, entonces a un área de 60.000 del analito A le corresponde una
concentración de 3 ppm.
El problema está en que no siempre se cumple esto, pues el detector no responde
de igual manera para todos los analitos, habrá pues que hacer una corrección mediante
el factor de respuesta. Este método se emplea para esteroles, ceras, alcoholes alifáticos...
c) Método de normalización del área:
Se obtienen los picos cromatográficos de todos los componentes de una fracción

(ejemplo: fracción de ácidos grasos) y a continuación se realiza un reparto proporcional
del área total de los picos cromatográficos entre cada uno de los analitos.
señal
18:0
18:2
18:1
16:0
A1 A2 A3 A4 tiempo
Atotal = A1 + A2 + A3 + A4
Si se cumple que las áreas son proporcionales a las concentraciones, entonces:
A1
% 16 : 0 = · 100
Atotal
A2
% 18 : 0 = · 100
Atotal
A3
% 18 : 1 = · 100
Atotal
A4
% 18 : 2 = · 100
Atotal
En general:
Ai
%i = · 100
Atotal
Este % es de la fracción tomada, no del total de la muestra.

La ley marca el % de cada ácido graso, pero del total de la fracción de ácidos
grasos. Si quiero saber la cantidad que hay en el total de la muestra debo usar el método
del patrón interno.
Se emplea para la determinación de ácidos grasos y a veces se emplean el
método del patrón interno junto a éste.
2. Aplicaciones:
a) Determinación de ácidos grasos.
Los ácidos grasos no son lo suficientemente volátiles como para

cromatografiarlos directamente, por tanto hay que derivatizarlos en ésteres metílicos.
Para esto hace falta una serie procesos y de reactivos.
Ø Esterificación y transesterificación catalizada por ácidos:
En una grasa tenemos ácido grasos libres y ácidos grasos que forman parte de
los TG. Hay que determinar todos los ácidos grasos que hay.
La esterificación es la preparación de los ácidos grasos libres, y la
transesterificación es la preparación de los ácidos grasos que forman parte de los TG.
H+
Esterificación à RCOOH + CH3OH en exceso RCOOCH3 + H2O
ác. grasos libres
H+
Transesterificación à RCOOR’ + CH3OH en exceso RCOOCH3 + R’OH
triglicéridos
En presencia de metanol y con un catalizador ácido se esterifican los ácidos

grasos libres muy rápidamente y se transesterifican los TG más lentamente, pero
conseguimos preparar los ésteres metílicos de toda la muestra.
Generalmente el tratamiento se hace calentando a reflujo durante 2 horas, o bien
manteniendo la muestra en un tubo cerrado a 50 ºC durante una noche.
Los reactivos que se emplean son:
- HCl/CH3OH al 5% (P/V) à es el mejor reactivo.

L
O
S
Para prepararlo se hace burbujear HCl en CH3OH. Como inconveniente tenemos
M
E
que hay que trabajar con un gas, lo cual resulta tedioso.
J
O
R - H2SO4/CH3OH al 2% (V/V) à es más fácil de preparar.
E
S
Se emplea un baño de hielo porque el metanol se calienta mucho.
- F3B/CH3OH.
L
O
S
Como inconveniente tenemos que este reactivo es inestable, además da
P
E
reacciones secundarias.
O
R
E - Cl3B/CH3OH
S
Ø Transesterificación catalizada por bases:
Cuando se trata un grasa en presencia de un catalizador básico con exceso de

metanol se produce la transesterificación de los TG, pero no se esterifican los ácidos
grasos libres.
OH-
Transesterificación à RCOOR’ + CH3OH en exceso ROCH3 + R’OH
triglicéridos
La transesterificación es muy rápida, y se lleva a cabo a temperatura ambiente,

es decir, no hay que calentar como en el caso anterior.
Los reactivos que se emplean son:
- CH3ONa/CH3OH à se emplea en el método oficial español.
Para prepararlo se emplea Na en metanol, lo cual resulta peligroso.
- CH3OK/CH3OH
- KOH/CH3OH
Existe un reactivo que se emplea para esterificar los ácidos grasos libres, es el
diazometano à CH2N2.
OH-
Esterificación à RCOOH + CH3OH en exceso RCOOCH3 + H2O
ác. grasos libres
Este reactivo tiene muchos inconvenientes, pues es tóxico, cancerígeno y

explosivo.
En el caso particular de que queramos preparar ésteres metílicos de ácidos

grasos de cadena corta (Ej: mantequilla à C4, C6, C12, ...), se puede emplear un método
en el que no se calienta la muestra (para llevar a cabo la reacción o para eliminar el
disolvente que pudiera quedar de la extracción) y en el que no se realice ninguna
extracción en presencia de un medio acuoso porque las muestras de ácidos grasos de
cadena corta son volátiles y parcialmente solubles en agua.
Determinación de ácidos grasos (C12–C24): (Norma UNE)
v La preparación de ésteres metílicos se lleva a cabo en 2 etapas:
1) Reflujo de la muestra con CH3ONa/CH3OH durante 5 minutos. De esta

forma se preparan los ésteres metílicos de los ácidos grasos de los TG.
2) Reflujo con HCl/CH3OH durante 5 minutos. De esta forma se preparan los
ésteres metílicos de los ácidos grasos libres.
Se hacen los 2 tratamientos (catálisis ácida y básica) para tardar menos tiempo,
pues con la etapa 2) se pueden preparar todos los ácidos grasos, pero se tardan 2 horas.
v Seguidamente se añade hexano y se calienta ligeramente para extraer los

ésteres metílicos.
Como inconveniente tenemos que el hexano es muy volátil.
hexano
ésteres metílicos
Realmente no es una extracción propiamente dicha, pues una extracción se hace

en un embudo de decantación, además se hacen varias extracciones, pero así se hace una
determinación de ésteres metílicos de forma cualitativa que es lo que este método va
buscando, que nos aseguremos de la presencia de todos los ésteres metílicos.
v Por ultimo se añade al tubo de ensayo una disolución de NaCl saturada

con 2 finalidades:
• Favorecer la separación de las 2 capas: el NaCl quedaría en la fase

metanólica.
• Aumentar el volumen y así tener el hexano en la parte superior del tubo de
ensayo.
Con un gotero se extrae la capa de hexano e inyectamos en el cromatógrafo de

gases.
hexano hexano
disolución saturada de NaCl

fase metanólica
ésteres metílicos
Para una determinación cuantitativa se hace una extracción en un embudo de

decantación (se hacen 3 extracciones) y se elimina en un rotavapor parte del hexano. El
resto de la determinación es igual.
Determinación de ácidos grasos de cadena corta (< C12): (Norma UNE)
Se hace para muestras de: leche, mantequilla, aceite de coco, etc...
La muestra se disuelve en hexano y se le añade una disolución de KOH/CH3OH,

se agita durante 30 segundos en frío. Seguidamente podremos observar la separación de
la fase que corresponde a la glicerina la cual queda en el fondo.
De la fase sobrenadante se extrae un determinado volumen y se inyecta en el
C.G.
Este método sirve para muestras con una acidez baja (< 1%).
Se trata de una metanolisis en medio básico.
Al ser la muestra de una grasa con ácidos grasos de cadena corta no hace falta
calentar a reflujo durante 2 horas.
Aquí podemos ver los métodos comunitarios que se emplean para la

determinación de ácidos grasos.
Orden de elución de los ácidos grasos:
Los ácidos grasos se separan en base a su volatilidad, la cual está relacionada

con la longitud de la cadena (el nº de átomos de C).
Conforme aumenta el nº de átomos de C à aumenta su tR.
Por ejemplo, en una serie de ácidos grasos saturados el orden de elución sería:
C16/C18/C20/...
tR
Para una serie de ácidos grasos de igual longitud y distinta insaturación, se

separan en base a su polaridad.
Conforme aumenta el nº de insaturaciones à aumenta su tR (columna polar).
Por ejemplo, en una serie de ácidos grasos poliinsaturados con 18 átomos de C,
el orden de elución sería:
18:0/18:1/18:2/18:3/...
tR
Si la columna no es polar, entonces no es capaz de distinguir los ácidos grasos

de igual nº de carbonos pero distinta insaturación, es decir, toda la serie de ácidos grasos
C18 saldrían juntos, los de la serie C16 también, etc...
En el caso del aceite de oliva el orden de elución sería:
16:0/16:1/18:0/18:1/18:2/18:3/20:0
tR
El orden de elución de los ácidos grasos 18:3 y 20:0 puede invertirse según sea
la columna empleada.
En la columna que emplearemos en prácticas (columna que es muy polar) sale
antes el 20:0.
En los ácidos grasos existe una relación lineal entre el lgtR y el nº de átomos de
C para una determinada serie de ácidos grasos saturados, monoinsaturados,
diinsaturados, etc...
Esta dependencia lineal varía según sean las condiciones cromatográficas: tipo
de columna, temperatura de operación, velocidad de flujo del gas portador, etc..., lo cual
se traduce en un cambio de la pendiente de la recta.
Vemos que en una serie conforme ↑ el nº de átomos de C à ↑ el tR.

Si nos fijamos en una determinada longitud de cadena, conforme ↑ el nº de
insaturaciones à ↑ el tR.
(Ver fotocopia nº 55, Figura 16.I)
Aquí podemos ver la gráfica de las series de los ácidos grasos con nº par de
átomos de C desde la serie C16 hasta la serie C22 utilizando una columna muy polar y
otra de polaridad media para una muestra de aceite de bacalao.
Longitud de cadena equivalente (ECL):
El ECL de un ácido graso saturado es su longitud de cadena.

Para determinar el ECL de un ácido graso insaturado se traza en la gráfica una
línea paralela al eje de abcisas hasta que corte a la línea de los ácidos grasos saturados.
Así, mediante el ECL se puede prever el orden de elución de todos los ácidos
grasos, pues conforme ↑ el ECL à ↑ el tR.
Estas gráficas se obtienen empleando patrones de ácidos grasos.
Aquí vemos los disolventes y las condiciones de operación, así como los tR de
los ácidos grasos de la serie C18 y del ácido graso 20:0 (aráquico).
(Ver fotocopias nº 57 y 58, Tabla 4.2)
Aquí vemos el valor del tR y en algunos casos del ECL para los ésteres metílicos
de los distintos ácidos grasos desde el 12:0 hasta el 24:1 según sea el tipo de columna
empleada. Vemos que para la columna SP-2340 el orden de elución entre el 18:3 y el
20:0 se invierte.
Aquí podemos ver el cromatograma de un aceite de pescado.
Método cromatográfico:
Podemos trabajar de 2 formas:
- En régimen isotermo: así es como se trabaja con ácidos grasos, a 185 ºC.
- Con programación de temperatura.
Para la identificación de los distintos ácidos grasos se utilizan los tR relativos al

16:0 ó al 18:0.
Para la cuantificación se expresa como % de cada ácido graso (respecto de la
fracción de ácidos grasos). Se emplea el método de normalización del área (ver página
190).
Sea:
Ai: área del pico cromatográfico de cada ácido graso.
AT: área total à ΣAi.
Ai
%i = · 100
AT
La norma internacional marca el contenido de los ácidos grasos mayoritarios y

minoritarios.
Aquí vemos el % de cada ácido graso según el reglamento de la CEE.

Se hace referido a cada ácido graso pues cada tipo de aceituna tiene un % de
ácido graso diferente.
b) Determinación de esteroles.
Se emplea como criterio de pureza para determinar la presencia

fundamentalmente de aceite de semilla en aceite de oliva, pues todos los aceites de
semilla tienen un % en esteroles muy superior al de oliva.
La determinación tiene una serie de pasos:
1) Saponificación à adición de un patrón interno (α-colestanol)
El α-colestanol no debe contenerlo el aceite, aunque su estructura es muy similar

a la de los esteroles, luego sale en la fracción de esteroles, entre los picos de los
esteroles.
2) Extracción del insaponificable con éter etílico.
3) Fraccionamiento del insaponificable por CCF. Se obtiene la fracción de

esteroles junto al E + U.
4) Derivatización de los esteroles. Pues los esteroles no son volátiles.

La derivatización es la misma para esteroles, alcoholes y tocoferoles. Para ello
se lleva a cabo una silanización (o sililación) que consiste que a partir de una muestra de
esteroles se obtienen los trimetilsililéteres (esta reacción se emplea para aquellos
compuestos que contengan grupos –OH):
R–OH + Cl–Si(CH3)3 
→ R–O–Si(CH3)3 + HCl
esterol trimetilclorosilano
También se puede emplear hexametildisilazano:
(CH3)3–Si–N=N–Si–(CH3)3
5) Determinación por cromatografía de gases.
- Se lleva a cabo en régimen isotermo à 260 ºC.

- Para la identificación de los picos se usan los tR relativos al β-sitosterol.
- La cuantificación se puede dar de 2 formas:
• % de cada esterol (referido a la fracción de esteroles) à

método de normalización del área.
• Contenido total en esteroles (referido a la materia grasa) à
método del patrón interno (α-colestanol).
Sea:
Ai: área de cada esterol.
Ap: área del patrón interno.
AT: área total.
mi: masa de cada esterol.
mp: masa del patrón interno (en mg).
m: masa de la muestra (en g).
Para calcular el % de cada esterol:
Ai
% esterol i = · 100
AT
Para calcular el contenido total en esteroles:
Si a una masa mp de patrón le corresponde un área Ap, entonces a un área Ai del

esterol le corresponde una masa mi:
mp · Ai
mi = à masa de un esterol i.
Ap
El contenido total de esteroles (en mg/Kg) será
 mp · Ai  1  mp · Ai  1.000
contenido total en esteroles = ∑ mi = ∑  · = ∑ ·
i i  Ap  m i  Ap  m
1.000
para pasar a Kg
(Ver fotocopia nº 60, Tabla superior)
Aquí podemos ver el tR de cada uno de los esteroles. Vemos que el campesterol
da 3 picos, y que el β-sitosterol aparente son 6 esteroles que dan 6 picos.
Aquí podemos ver el cromatograma de la fracción de esteroles en el aceite de

oliva. Vemos que el pico mayoritario es el 2, el pico del patrón interno, el colestanol. En
el aceite de oliva el pico 7 (estigmasterol) debe ser menos intenso que el pico 5
(campesterol).
(Ver fotocopia de la normativa, apartado 3, página 3)
Para el contenido en esteroles totales la ley marca un mínimo a pesar de que en

aceites de semilla este contenido es muy alto, esto se hace para detectar adulteraciones
con aceites desesterolizados.

Aquí podemos ver los datos del cromatograma y el cromatograma de una

muestra de aceite de orujo contaminado con aceite de girasol. Calculando el % de
esteroles así como el de cada esterol podemos ver que en realidad está adulterado con
aceite de semilla. Para ello debemos emplear los valores que nos da la normativa (ver
apartado 3, página 3).
Vemos que:
- el % de colesterol debe ser menor a 0’5 à 0’41% (SE CUMPLE)

- el % de campesterol debe ser menor a 4’0 à 4’46% (NO SE CUMPLE)
- el % de estigmasterol debe ser menor al de campesterol à 2’03% (SE
CUMPLE)
- el % de β-sitosterol debe ser mayor a 93 à 90’89% (NO SE CUMPLE),
se trata por tanto de un aceite de semilla desesterolizado.
- el % de ∆7-estigmastenol debe ser menor a 0’5 à 2’22% (NO SE
CUMPLE)
En esta tabla podemos comparar los % que hemos obtenido con los de un aceite
de girasol alto oleico desesterolizado, vemos que prácticamente coinciden los
porcentajes.
c) Determinación de eritrodiol y uvaol.
Son dialcoholes triterpénicos que existen en mayor proporción en los aceites

obtenidos por extracción que en los aceites vírgenes o brutos.
Por tanto su determinación sirve para detectar la presencia de aceites de orujo en
aceites de oliva.
Esta determinación se hace paralelamente a la de los esteroles puesto que al
realizar el fraccionamiento del insaponificable por CCF estos alcoholes se encuentran
junto a la fracción de los esteroles.
La determinación es igual que la de esteroles.

Sobre la cuantificación decir que se da el contenido de E + U en % referido a la
fracción total de esteroles incluidos ellos 2 mismos.
Sea:
AE: área del pico cromatográfico del eritrodiol.
AU: área del pico cromatográfico del uvaol.
ΣAesteroles: área total de los picos cromatográficos de los esteroles.
AE + AU
%E + U = · 100
∑ Aesteroles + AE + AU
La ley marca un máximo en todas las calidades del aceite de oliva, este máximo
es del 4’5% (ver fotocopia de la normativa, apartado 3.6., página 5).
d) Determinación de alcoholes alifáticos (o grasos).
Se emplea para detectar la adulteración de aceites vírgenes y brutos con aceites

obtenidos por extracción (igual que la determinación de E + U), pues el % de estos
alcoholes alifáticos es muy superior en este tipo de aceites.
La ley marcaba un máximo de 300mg/Kg en todos los aceites de oliva, pero se
encontraron muestras genuinas con % superiores, por eso esta determinación se ha
sustituido por la determinación de ceras (aunque su cromatograma es muy confuso
como ya veremos).
Método de determinación:
La determinación consta de una serie de pasos:
1) Saponificación à adición de un patrón interno (eicosanol à C20), es un

alcohol alifático que no lo contiene el aceite de oliva.
3) Fraccionamiento del insaponificable por CCF. Se obtiene la fracción de
alcoholes tanto alifáticos como terpénicos. La mancha que queda justo por
encima de esta es la de los esteroles.
4) Derivatización de los alcoholes à Preparación de los trimetilsililéteres para

aumentar la volatilidad.
- Se lleva a cabo con programación de temperatura.

- La identificación se hace a través de los tR.
- Para la cuantificación se expresa el contenido total en alcoholes alifáticos
(en mg/Kg) y se emplea el método del patrón interno.
De todos los alcoholes que se obtienen en la determinación solo se consideran:
Ø dicosanol (C22).
Ø tetracosanol (C24).
Ø hexacosanol (C26).
Ø octacosanol (C28).
Se aplica la misma expresión que para el contenido total en esteroles:
 mp · Ai  1.000
contenido total en alcoholes alifáticos = ∑  ·
i  Ap  m
Aquí vemos el cromatograma de alcoholes alifáticos para el aceite de oliva

virgen. Vemos que aparecen otros picos debidos a los alcoholes terpénicos, pero estos
picos no se resuelven bien.
e) Determinación de ceras.
Esta determinación es muy diferente a la de alcoholes y esteroles, pues las ceras

son ésteres de ácidos grasos (RCOOR’), por tanto para su determinación no se puede
saponificar la muestra. Tampoco se pueden derivatizar pues el grupo –COOH (así como
el –OH) están formando un enlace éster (no hay un grupo funcional para derivatizar).
Al no ser entonces volátiles hay que aumentar la temperatura de operación hasta

los 340 ºC.
La determinación de ceras al igual que la determinación de E + U sirve para
detectar adulteraciones de aceites de oliva vírgenes o brutos con aceites obtenidos por
extracción (aceites de orujo).
Al principio de la determinación añadimos laurilaraquidato como patrón interno.
La determinación tiene una serie de pasos:
1) Fraccionamiento de la muestra por cromatografía en columna (SiO2).
El aceite se disuelve en hexano y se añade a una columna rellena con sílice

suspendida en hexano. Como eluyente utiliza una mezcla hexano:éter etílico (99:1), que
como vemos es casi todo hexano, lleva un poco de éter etílico para darle polaridad y
para que salgas los hidrocarburos (los menos polares), los tocoferoles y las ceras que
son la siguiente fracción en polaridad.
Los TG, esteroles y alcoholes al ser más polares que el eluyente se quedan en la
columna.
2) Análisis por cromatografía de gases.
- Se lleva a cabo con programación de temperatura.

- La identificación se hace a través de los tR.
- Para la cuantificación se expresa el contenido total en ceras (en mg/Kg) y
se emplea el método del patrón interno.
De todas las ceras se cuantifican:
(C40/C42/C44/C46)
Nota: una sencilla regla para recordar las ceras y alcoholes que se cuantifican es
la siguiente:
alcoholes + ácido oleico = ceras
Por ejemplo:
dicosanol (C22) + ácido oleico (C18) = C40
Aquí podemos ver el cromatograma de las ceras de un aceite de oliva virgen.

El pico donde pone I.S. (Internal Standard) es el patrón interno del éster C32.
Aparece un gran pico correspondiente al escualeno (hidrocarburo triterpénico à
C30), otros picos debidos a otros hidrocarburos y a los tocoferoles (que como dijimos
antes salen juntos a las ceras al ser de menor polaridad a estas).
La ley marca un máximo en el contenido en ceras en los aceites de oliva (ver
fotocopia de la normativa, apartado 3.6., página 5).
f) Determinación del contenido en solventes halogenados volátiles.
(Ver Tema 8, página 137)
Se determinan mediante cromatografía de gases con espacio de cabeza.
g) Determinación de estigmastadienos.
Los estigmastadienos son hidrocarburos que provienen de la deshidratación de

los esteroles:
Esteroles −→ Estigmastadienos

H 2O
En los aceites vírgenes no existen los estigmastadienos, sin embargo cuando un

aceite se somete a refinación, sobre todo si se hace a altas temperaturas, aparecen.
Esta determinación se utiliza para detectar la presencia de aceites refinados en

aceites vírgenes:
- Aceite de oliva en aceite de oliva virgen.

- Aceite de girasol en aceite de oliva virgen.
En el caso del aceite de oliva, el estigmastadieno que se determina es el

estigmasta-3,5-dieno que proviene de la deshidratación del β–sitosterol.
El–sitosterol es el esterol mayoritario, mínimo un 93%.
Se determinan al igual que el resto de hidrocarburos.
1) Saponificación à adición de un patrón interno (colesta-3,5-dieno), que es

similar a los estigmastadienos de la muestra, pero que no lo contiene.
2) Extracción del insaponificable con éter de petróleo.
3) Fraccionamiento del insaponificable por cromatografía en columna.
Se hace en una columna de vidrio rellena de sílice (fase estacionaria).
Añadimos el insaponificable disuelto en hexano o éter de petróleo.
insaponificable
sílice
Se emplea como fase móvil (eluyente) hexano o éter de petróleo.

Como el disolvente es muy poco polar, eluye solo a los hidrocarburos, quedando
el resto en la columna. Dentro de los hidrocarburos tenemos:
- Hidrocarburos saturados, que son los primeros en salir.

- Hidrocarburos insaturados, que al ser un poco más polares salen después.
Es en esta fracción donde se encuentran los estigmastadienos.
Por tanto una 1ª fracción de 30 ml la tiramos, nos quedamos con la 2ª.
4) Análisis por cromatografía de gases.
En este caso no hay derivatización.
- Para la cuantificación se expresa el contenido en estigmastadienos (en

mg/Kg) y se emplea el método del patrón interno.
Aquí podemos ver el cromatograma para los estigmastadienos.
Observamos que el máximo es de 0’15 ppm para aceites vírgenes, y de 0’5 ppm
para aceites lampantes. Para el resto de aceites el contenido no está regulado.
Para detectar aceite de girasol en aceite de oliva virgen se pueden hacer las
siguientes pruebas:
- Determinación del % total de esteroles y relativo de cada uno de ellos.

- Determinación de ácidos grasos.
- Determinación de estigmastadienos como apoyo de las pruebas
anteriores.
- Determinación de isómeros trans.
- Índice de yodo, aunque esta prueba tiene menor validez.
h) Determinación de isómeros trans.
Los isómeros trans aparecen cuando una muestra de aceite es sometida a altas
temperaturas, como por ejemplo durante el proceso de desesterolización de un aceite:
Girasol pérdida
 de
refinación
→ Girasol desesterolizado
esteroles (isómeros trans)
El girasol queda desesterolizado, aunque el perfil del cromatograma resultante es

diferente al del aceite de oliva, además aparecen los isómeros trans. Por tanto esta
determinación sirve para detectar aceites refinados en aceites vírgenes.
En general también sirve para saber si una muestra ha sido sometida a altas
temperaturas.
Esta determinación se hace junto a la de ácidos grasos. Para ello se utiliza una
columna con un alto poder de resolución, es decir, muy polar para que así se pueda
distinguir entre los 2 isómeros geométricos (cis y trans).
El isómero trans es siempre más retenido que el cis, es decir, tiene un tR mayor.
Los isómeros que se determinan en el aceite de oliva son:
- 18:1 (cis y trans).

- 18:2 y 18:3 (cis y trans) à salen juntos.
(Ver fotocopia del Diario Oficial de las Comunidades Europeas)
Aquí podemos ver que aparece la suma de los isómeros transoleicos, siendo el
valor máximo de 0’05% para el aceite de oliva virgen. 0’10% para el aceite de oliva
virgen lampante, etc... Además aparece la suma de los isómeros transolinoleicos y
transolinolénicos.
i) Determinación de tocoferoles.
Los tocoferoles son antioxidantes naturales de las grasas y aceites.

Ya hablamos de ellos en el Tema 1, página 10.
No es una determinación de rutina, no está regulado en la normativa europea, tan

solo es el COI quien indica que los aceites de oliva vírgenes no pueden contener
α–tocoferol añadido, y que únicamente los aceites de oliva que contienen refinado
(aceite de oliva, aceite de orujo de oliva y aceite de orujo de oliva refinado) pueden
contenerlo hasta un máximo de 200 mg/Kg.
1) Saponificación à adición de un patrón interno (escualano, es como el

escualeno pero saturado), además se añade pirogalol para evitar la oxidación
de los tocoferoles.
3) Fraccionamiento del insaponificable por CCF (bajo luz roja para que no se
oxiden los tocoferoles).
4) Derivatización de los alcoholes à Preparación de los trimetilsililéteres para
aumentar la volatilidad.
Se determinan el α, β, γ y δ–tocoferol.
- Para la cuantificación se expresa el % en α–tocoferol que es el

mayoritario (90% del total de tocoferoles).
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 12: Aplicaciones de la HPLC al AG 211

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
AL ANÁLISIS DE GRASAS
1. Generalidades: instrumentación, fase móvil, fase estacionaria,

detectores, formas de trabajo, métodos de identificación y
cuantificación.
Generalidades:
Es una cromatografía en columna.

En HPLC los componentes de la muestra se hacen pasar a través de una columna
arrastrados por una fase móvil que es siempre líquida. Estos componentes sufren
diferentes interacciones con la fase móvil y con la fase estacionaria que rellena el
interior de la columna. En cambio, en la CG el gas portador no interaccionaba con la
muestra.
Dentro de la HPLC hay distintos tipos:
- Cromatografía de reparto à se emplea en el análisis de lípidos.

- Cromatografía de adsorción.
- Cromatografía iónica.
- Cromatografía de exclusión.
Cuanto más pequeño es el tamaño de la partícula de la fase estacionaria, la

eficacia es mayor, pero los huecos que dejan son más pequeños, por tanto la velocidad
de migración de la fase móvil a su través se hace más lenta, luego para compensar esta
pérdida de velocidad se aplica una presión elevada.
Una diferencia con la CG es la naturaleza de los solutos a separar, pues como
ahora no se requiere estabilidad térmica y gran volatilidad, el rango de solutos a separar
es mayor. Es por tanto una técnica complementaria a la CG.
También se emplea para sustancias de alto peso molecular, sustancias iónicas,
etc... Aunque no se requiera trabajar a altas temperaturas se puede elevarla para facilitar
la extracción. Ahora sí podemos separar proteínas, ác. nucleicos, etc...
Frente a la CCF, en HPLC la identificación de la muestra es más sencilla, pues a

la salida de la columna se coloca un detector que determina cada uno de los
componentes de la muestra, en cambio en CCF había que recurrir a otra técnica
(espectrometría de masas, CG, etc...) para la identificación.
La HPLC se puede acoplar a otras técnicas dando técnicas híbridas:
- Espectrometría de masas.
- ICP.
- AAS.
- Etc...
Ej: HPLC–MS, GC–MS.
Instrumentación:
En un cromatógrafo de gases teníamos el siguiente esquema:
Sistema de inyección Columna Detector
horno
En HPLC añadimos un sistema de propulsión y recipientes para la fase móvil:
Sistema de Recipientes para la Sistema de

Columna Detector
propulsión fase móvil inyección
camisa termostatizada
Ø Sistema de propulsión:
Generalmente es una bomba peristáltica (de 3, 4, 5 ó 6 vías), en las cuales

podemos controlar la velocidad de flujo de la fase móvil.
Esta bomba va conectada a los diferentes recipientes de la fase móvil:
(Ver fotocopia nº 66, parte superior)
En HPLC se puede trabajar de 2 formas:
• Elución isocrática: la composición de la fase móvil es constante.

• Elución en gradiente: la composición de la fase móvil es variable.
Ej: acetonitrilo–H2O [50:50] à .............. à [80:20]
En casos difíciles la elución en gradiente resulta eficaz, aunque también hay

ciertos detectores que no permiten su uso.
En HPLC deben evitarse las burbujas de aire pues alterar completamente las
señales del detector, por eso se burbujea constantemente helio para desplazar así ese
aire.
Ø Sistema de inyección:
Se emplea una válvula de bucle:
Vemos la válvula en posición de llenado y vaciado.

El bucle es un tubo de volumen conocido para inyectar un volumen determinado
de muestra.
Ø Columna cromatográfica:
Es donde tiene lugar la separación.

En ellas se pueden dar fenómenos de partición, exclusión, adsorción,
intercambio iónico, etc... según sea la naturaleza del soluto.
Se construyen de vidrio o acero inoxidable, y van montadas en el interior de una
camisa termostatizada.
Generalmente tienen una longitud entre 10–30 cm, un diámetro interno entre
4–10 mm y una eficacia entre 40.000 – 60.000 platos/m.
Las de sílice fundido (las FSOT) empleadas en gases tenían una eficacia de
6.000–7.000 platos/m, vemos por tanto que las columnas en HPLC son mucho más
eficaces.
Recientemente se han desarrollado columnas de alta resolución cuyas
características son las siguientes:
Longitud: 3–7’5 cm.

Diámetro interno: 1–4’6 mm.
Eficacia: 100.000 platos/m.
El relleno (fase estacionaria) en la cromatografía de reparto es un soporte de

sílice hidrolizada y un líquido que es la propia fase estacionaria.
La sílice hidrolizada tiene la siguiente estructura:
OH OH OH
O O
Si Si Si
silanol
Para producir diferentes fases estacionarias a este soporte se le añaden distintos

líquidos polares o apolares.
Para ello se hacen reaccionar los grupos silanol de la sílice con un
organoclorosilano:
CH3 CH3
Si OH + Cl Si R Si O Si R + HC
l
CH3 CH3
silanol
siloxano
Según la naturaleza de R la fase estacionaria será más o menos polar.

R puede ser:
- C8 (octilo).
apolares
- C18 (octadecilo).
- CH2–CH2–CH2–CN (cianopropilo).
apolares
- CH2–CH2–CH2–NH2 (aminopropilo).
Al igual que en cromatografía de gases se puede trabajar en fase normal y en

fase inversa.
Ø Detector:
Los detectores pueden ser de 2 tipos:
A) Los que responden a una propiedad de la fase móvil. Ej: Índice de refracción,
densidad, ...
- Para el índice de refracción se puede emplear un refractómetro que mida

continuamente el índice de refracción. Así, podremos ver la variación de éste
con el tiempo.
La fase móvil será la que delimite la línea 0. Cuando llegue el primer analito el
valor del índice de refracción variará de esa línea inicial:
señal
tiempo
- Para la densidad se emplea un densitómetro.

B) Los que responden a una propiedad de los analitos. Ej: U.V., fluorescencia,
I.R., ...
- El detector U.V. es un fotómetro colocado detrás de la columna.
En el caso de querer detectar lípidos λ = 254 nm.

Cuando la fase móvil llega al detector éste no registra señal alguna, en cambio,
cuando llega el analito se produce una señal. El equipo contiene un monocromador para
ajustar la λ.
- Un fluorímetro se emplea cuando el analito muestra fluorescencia. Contiene 2

monocromadores, uno para seleccionar la λexcitación y otro para la λemisión.
- El detector I.R. se emplea por ejemplo para medir un carbonilo que absorbe ≈
1.750 cm-1.
En el caso de los lípidos hemos dicho que se emplea un detector U.V. que
detecta compuestos con dobles enlaces conjugados. Como resulta difícil encontrar estos
compuestos en grasas y aceites derivatizamos en una precolumna.
En el caso de los TG se utiliza como detector el de índice de refracción, pues no
se pueden derivatizar.
Cuando empleamos como detector el de índice de refracción no se puede
trabajar en gradiente de elución, pues este detector mide el índice de refracción, valor
que cambia si variamos la concentración del eluyente.
(Ver fotocopia nº 66, Tabla superior)
Aquí podemos ver una tabla con las características de los detectores en HPLC.
Como vemos el detector más sensible es el fluorescente que es capaz de medir
10-10 g/ml.
FID (Flame Ionization Detector) à Detector de Ionización de Llama:
Este detector responde a casi todos los compuestos orgánicos.

Entre la columna y el detector se coloca una interfase que evapora la fase móvil,
pues ésta al llegar al detector apagaría la llama de H2-aire del FID. De esta forma los
analitos llegan al detector en forma de aerosol.
Columna Interfase FID
Métodos de identificación y cuantificación:
Son los mismos que para la cromatografía de gases à (ver páginas 185–190).
- Para la identificación se emplean los tiempos de retención (tR).

- Para la cuantificación se emplean los métodos de normalización del área y del
patrón interno.
2. Derivatización de la muestra en HPLC.
Al igual que en CG, en ocasiones deben derivatizarse los analitos.
- En CG era por su baja volatilidad.

- Ahora en HPLC es por un doble motivo:
Ø Para aumentar la sensibilidad, con lo que aumenta la señal de los

distintos analitos.
Ø Para aumentar la eficacia de la separación, así mejoramos la
resolución de los picos cromatográficos.
La derivatización se puede emplear para el análisis de ácidos grasos, aunque la

cromatografía de gases es el método oficial.
Se emplea en el análisis de TG.
v Un tipo de derivado de los ácidos grasos son los ésteres de fenacilo y naftacilo.
Este derivado se prepara cuando el detector es un fotómetro (U.V.), pues los
ácidos grasos por sí mismos no absorben en el U.V. ya que rara vez contienen dobles
enlaces conjugados, por ello introducimos un grupo fenacilo o naftacilo.
(Ver fotocopia nº 68, Figura 9.1 y Tabla superior)
Aquí podemos ver la estructura de estos derivados. También tenemos una tabla
con los derivados de ésteres empleados para los ácidos grasos.
v Otro tipo de derivado son los ésteres de antracilo y la cumarina.

Se emplean cuando el detector es un fluorímetro, pues normalmente los ácidos
grasos no son fluorescentes, en cambio estos grupos que introducimos sí lo son.
(Ver fotocopia nº 68, Tabla inferior)

(Ver fotocopia nº 69, Figura superior)
La λemisión = 412 nm y la λexcitación = 365 nm.
Estos derivados también absorben en el U.V. (λ = 256 nm), por ello podemos
emplear para su detección un fotómetro, pero la sensibilidad es menor a la de un
fluorímetro.
3. Separaciones en Fase Normal y Fase Inversa.
• En fase normal, la fase estacionaria empleada es polar.
Por ejemplo podemos emplear cianopropilo à CH3CH2–CH2–CN.

La fase móvil es un líquido menos polar que la fase estacionaria.
La fase estacionaria interacciona con los grupos funcionales polares de los
analitos, por ejemplo con los grupos –OH (alcoholes, esteroles, etc...), C=O, etc...
Los analitos se unen a la fase estacionaria a través de enlaces de H o fuerzas de
Van der Waals.
En este tipo de cromatografía se consiguen separar los analitos en clases (por

grupos funcionales):
- Esteroles.
- Alcoholes.
- TG.
- Etc...
Raramente se consiguen separar entre sí los componentes de una clase.
• En fase inversa, la fase estacionaria es apolar (octilo, octadecilo, ...),

mientras que la fase móvil es un líquido más polar que la fase estacionaria.
La fase estacionaria interacciona con la parte lipofílica (apolar) de los analitos,

es decir, con la cadena hidrocarbonada.
Generalmente, en este caso se consiguen separar los analitos en función del
número de átomos de C de la cadena, aunque también va a incluir la insaturación.
Se consiguen separar generalmente entre sí los componentes de una clase.
Separación de tocoferoles:
(Ver fotocopia nº 69, Figura central à Estructura de los tocoferoles)
Aquí podemos ver la estructura de los tocoferoles, que en función de los grupos
situados en los carbonos 5, 7 y 8 se denominarán α, β, γ y δ-tocoferol.
(Ver fotocopia nº 69, Figura inferior à Cromatograma de los tocoferoles)
Aquí vemos un cromatograma de tocoferoles en fase normal e inversa.
- En fase normal, la fase estacionaria interaccionará con el grupo –OH. Como

los 4 tocoferoles contienen dicho grupo habrá que ver cual de ellos lo tiene
más o menos apantallado por el resto de grupos, lo cual indicará cuál es el más
o menos polar. El más apantallado à menos polar.
Por ejemplo, el α-tocoferol tiene 3 grupos metilo, con lo que el grupo –OH
estará más apantallado que en el resto que tienen menos grupos metilo, por tanto la fase
estacionaria interaccionará menos con el –OH quedando pues menos retenido (sale
antes). En el caso del β y γ-tocoferol, al tener 2 grupos metilo apantallan menos que el α
(que tiene 3 grupos), pero más que el δ (que tiene 1 solo grupo). Ambos tienen 2
metilos, pero sale antes el β pues los metilos en las posiciones 5 y 8 apantallan más (al
estar a los lados del –OH) que en las posiciones 7 y 8 (que están a un lado del –OH) del
γ. Por último sale el δ, que al tener solo 1 grupo metilo apantalla menos al –OH con lo
que queda retenido más tiempo (mayor tR).
- En fase inversa, la fase estacionaria interaccionará con la parte lipofílica

(apolar), habrá pues que ver cuál de los tocoferoles es el más pesado y así
saber cuál queda más retenido.
De todos el más pesado es el α-tocoferol, pues tiene 3 metilos. Le siguen el β y

γ, ambos con 2 metilos, por ello salen juntos en un solo pico, y por último el δ que solo
tiene 1 metilo.
Separación de esteroles:
(Ver fotocopia nº 70, Figura superior à Estructura de los esteroles)
Aquí podemos ver la estructura de los esteroles: estigmasterol, campesterol y

sitosterol.
(Ver fotocopia nº 70, Figura central à Cromatograma de los esteroles)
Aquí vemos un cromatograma de esteroles en fase normal e inversa.
- En fase normal, la fase estacionaria no es capaz de distinguir entre los distintos

tipos de esteroles, pues su polaridad es similar. Por ello debemos de recurrir a
la cromatografía en fase inversa.
- En fase inversa, la fase estacionaria interaccionará con la parte lipofílica

(apolar), habrá pues que ver cuál de los esteroles es el más pesado y así saber
cuál queda más retenido.
De todos los esteroles el más pesado, el de mayor longitud es el estigmasterol

pues contiene 1 átomo de C más que el campesterol y 1 átomo de C más 2 átomos de H
más que el sitosterol que es el menos pesado, el de menor longitud.
(Ver fotocopia nº 70, Figura inferior à Cromatograma en fase normal)
Aquí podemos ver el cromatograma en fase normal de los derivados de ácidos

grasos en diferentes clases.
4. Aplicaciones.
a) Determinación de trilinoleína.
La determinación de TG es norma UNE, CE y COI.

Para ello se disuelve la muestra en acetona y se inyecta en el cromatógrafo
utilizando como fase móvil una mezcla de acetona:acetonitrilo (1:1). Como fase
estacionaria se emplea un preparado comercial. Vemos por tanto que se trata de una
separación en fase inversa (pues la fase móvil es polar).
El detector empleado es el refractómetro, el cual mide la diferencia en el índice
de refracción entre la fase móvil y la fase móvil junto a la muestra.
La elución es isocrática (la fase móvil tiene que tener siempre la misma
composición), pues ya dijimos que cuando el detector es un refractómetro la
composición del eluyente no puede variar.
En este caso, los TG se separan en función del nº de C equivalentes (ECN):
ECN = nº de átomos de C – 2 · nº de insaturaciones.
Por tanto, conforme aumenta la longitud de la cadena y disminuye la

insaturación el valor del ECN aumenta.
A mayor ECN à menor polaridad à más retenidos quedan à mayor tR.
(Ver fotocopia nº 71, Cromatograma de una muestra de aceite de soja)
Ej: para calcular el ECN de la trilinoleína calculamos el ECN del ácido linoleico
y lo multiplicamos por 3:
ECN = 18 · 3 – 2 · 2 · 3 = (18 – 2 · 2) · 3 = 42.
Pero el grado de insaturación es diferente en cada ácido graso, por ello se recurre
a una expresión más aproximada:
ECN = nº de átomos de C – 2’65 · noleico – 2’35 · nlinoleico – 2’17 · nlinolénico.
donde:
noleico : nº de insaturaciones del oleico.
nlinoleico : nº de insaturaciones del oleico.
nlinolénico : nº de insaturaciones del oleico.
Por ejemplo, para la trilinoleína, su ECN sería:
ECN = 18 · 3 – 2’65 · 1 – 2’35 · 2 – 2’17 · 3 = 40’14
Así, de esta forma se obtiene una separación más aproximada.
Norma según la CE:
Para el aceite de oliva se determina la cuantificación mediante el método de

normalización del área. Lo que se determina es el % de trilinoleína (respecto de la
fracción de TG totales), pues en el aceite de oliva no hay gran cantidad de este TG, en
cambio en el aceite de girasol y demás aceites semisecantes sí la hay (pues contienen
ácido linoleico en gran cantidad).
En general se emplea para detectar adulteraciones de aceite de oliva con aceites
vegetales.
Otra determinación, en este caso cualitativa, es la de Vizern-Guillot, en la cual
se añadía a la muestra Br. Si aparecía un precipitado indicaba la presencia de aceites
semisecantes.
Aquí se nos indica que el % de trilinoleína que aparece en los aceites de calidad
virgen como máximo es del 0’5%, para el resto de calidades este % es algo mayor.
Norma según el COI:
(Ver fotocopia de la normativa, Apartado 3.7, página 5)
Se determinan los ácidos grasos con ECN = 42. Para ello se determina su
contenido real (experimental) y calculamos su contenido teórico empleando un
software. Dicho software calculará en el caso de que los ácidos de la muestra reaccionen
con la glicerina qué porcentaje de TG con ECN = 42 se obtendría.
Una vez sabemos el contenido real y el teórico se calcula su diferencia.
Por ejemplo, para aceites de oliva vírgenes comestibles esa diferencia es del
0’2%.
b) Determinación de anilina.
En los años 80 se produjo una intoxicación con aceite de colza desnaturalizado

con anilina. Dicho aceite estaba destinado para uso industrial, pues la anilina es tóxica.
A raíz de esto se decidió hacer la determinación de anilina mediante CG ó
HPLC.
Para su determinación, la anilina se extrae del aceite usando HCl (formándose el
cloruro de anilinio).
La estructura de la anilina es:
NH2

c) Determinación de anilida.
Esta determinación surge paralelamente a la de anilina por el síndrome tóxico.

En este caso, para la determinación de anilida, ésta se extrae empleando metanol.
La estructura de la anilida es:
O
NH C CH3

(Ver fotocopia nº 73, Figuras 1 y 2)
Aquí podemos ver un cromatograma de anilida obtenido mediante cromatografía

de gases y otro mediante HPLC.
Control de Calidad y Análisis de Grasas. Tema 13: Análisis sensorial 225
TEMA 13: ANÁLISIS SENSORIAL
1. Vocabulario general básico.
• Propiedad organoléptica:
Es toda característica de un producto que puede ser apreciada por los sentidos.
Se incluyen las propiedades olfato-gustativas, táctiles y cinestésicas.
• Atributo:
Es cada una de las propiedades organolépticas de un producto.
• Análisis sensorial:
Es una disciplina científica que está dedicada a la determinación, medida e

interpretación de las propiedades organolépticas de los productos alimenticios de forma
objetiva y sistemática.
• Cata:
Es la acción de percibir, medir e interpretar las propiedades organolépticas de un

producto.
• Catador:
Es una persona sensible, seleccionada y entrenada para realizar el análisis

sensorial de un determinado producto.
Dentro de los catadores existe el denominado catador experto, el cual es un
catador que además de conocer el análisis sensorial del producto de forma perfecta,
también tiene conocimientos sobre el proceso de elaboración del mismo y sobre las
preferencias del mercado, es decir, sabe qué tipos de aceites se consumen en su zona de
trabajo.
• Sabor:
Son aquellas sensaciones percibidas por el estímulo de las papilas gustativas

debido a sustancias solubles.
Hay sabores elementales:
ä Dulce: recuerda a la sacarosa.

ä Salado: recuerda al NaCl.
ä Amargo: recuerda a sustancias como la quinina o cafeína.
ä Ácido: recuerda al ácido cítrico, ácido tartárico, etc...
• Olor:
Se pueden percibir y discriminar cientos de miles de olores.

Son aquellas sensaciones percibidas por el estímulo de las células olfatorias que
existen en la nariz debido a la presencia de sustancias volátiles.
Estas sensaciones se pueden percibir:
- Por vía directa: a través de la nariz.

- Por vía indirecta o retronasal à aroma.
• Propiedades táctiles:
Tenemos el picor, aspereza, astringencia, etc...

Esta propiedad es percibida por terminaciones del nervio trigémino que se
encuentra en la boca.
• Propiedades cinestésicas:
Son aquellas sensaciones percibidas cuando se ejerce presión sobre un producto

mediante un movimiento bucal o presión de los dedos.
Al conjunto de las propiedades gustativas, olfativas, cinestésicas y táctiles se le

denomina flavor de un producto.
El flavor de un producto es lo que nos permite identificarlo.
Hay lagunas propiedades que son mezcla de otras.
Ej: agrio à es mezcla de un sabor y un olor.
2. Vocabulario específico para el aceite de oliva.
En el aceite de oliva hay 2 tipos de atributos:
• Positivos: le dan calidad al aceite de oliva virgen.

• Negativos o defectos: le restan calidad al aceite de oliva virgen.
Las propiedades de los atributos dependen de varios factores:
- Materia prima: variedad, fruto sano, recolección, transporte,

almacenamiento en la almazara, etc...
- Proceso de elaboración.
- Almacenamiento en bodega: material, temperatura, luz, etc...
- Tipo de envasado y envase.
- Vida posterior.
Los atributos positivos provienen de la materia prima. En el proceso que llega

después, lo máximo que se puede conseguir es mantener esos atributos positivos, por
tanto, por lo general se introducirán atributos negativos.
El atributo más importante es el frutado de aceituna, el cual se emplea para

clasificar la calidad del aceite.
Es un flavor que recuerda a la aceituna sana y recogida en un punto óptimo de
maduración.
Podemos tener:
- Frutado intenso à en aceitunas verdes.

- Frutado apagado o menos intenso à en aceitunas maduras.
Este frutado depende del estado de maduración del fruto.

Como vemos, el frutado disminuye desde que es recogida la aceituna.
Los aceites que provienen de aceitunas verdes, son de color verde, amargos,
picantes y ásperos.
Los aceites que provienen de aceitunas maduras, son de color amarillo, dulces
(en ellos no existe los atributos de amargo o picante).
El contenido en polifenoles es muy alto cuando la aceituna es verde, por ello los
aceites son de color verde, amargos, picantes, etc... En cambio, durante la maduración
los aceites pierden polifenoles pues se oxidan, de ahí el cambio de atributos.
Tenemos frutados a:
- Manzana.
- Plátano.
- Naranja.
- Almendra.
Entre los atributos positivos tenemos:
Ø Amargo, picante, ...

Ø Verde: hierba y hoja.
Entre los atributos negativos o defectos tenemos:
v Fermentación: aparecen los defectos como:
• Avinado/avinagrado: es un flavor que recuerda al ácido acético,

etanol y acetato de etilo. Proviene de la fermentación acética y
etanólica. Son fermentaciones aerobias (requieren la presencia de
aire).
• Atrojado: proviene de la fermentación láctica, se lleva en condiciones

anaerobias (no requiere de la presencia de aire). Se produce en los
trojales (montones de aceitunas).
v Rancio: proviene de la oxidación.

v Alpechín: es característico de aceites que han estado durante mucho
tiempo en contacto con las aguas de vegetación.
v Moho/humedad: es característico de aceitunas en las que se han
desarrollado hongos y levaduras.
v Metálico: proviene del contacto prolongado del aceite con partes
metálicas ya sea durante su elaboración o envasado.
v Gusano: proviene de aceitunas atacadas por la mosca del olivo.
v Borras: es característico de aceites que han estado mucho tiempo en
contacto por lodos.
v Cocido/quemado: aparece debido a un calentamiento prolongado o bien
a las temperaturas demasiado altas durante el proceso de batido.
En virtud a todos estos atributos es como se le asigna una puntuación al aceite.
3. Valoración organoléptica del aceite de oliva virgen.
3.1. Objeto.
El objeto de la norma es la de establecer criterios objetivos para la evaluación

del flavor del aceite de oliva virgen.
Esta norma se limita a clasificar los aceites de oliva virgen en distintas calidades
de acuerdo con el criterio de un grupo de catadores establecidos como panel analítico.
Un panel analítico funciona igual que un instrumento analítico, es decir, sus
resultados son objetivos y son obtenidos de forma sistemática en condiciones
controladas. Suelen haber entre 8–12 catadores.
También existe otro panel à el panel de consumidores integrado generalmente
por 500 personas.
En el panel analítico los integrantes son catadores, personas seleccionadas y
entrenadas. Se emplea para clasificar los aceites de oliva en calidades.
En el panel de consumidores los integrantes no son catadores, son personas

normales y corrientes, no especializadas. Se emplea para conocer las preferencias del
mercado, el gusto de los consumidores en una determinada zona, etc...
Tanto los organismos oficiales como los laboratorios tienen paneles analíticos y
paneles de consumidores.
Los paneles analíticos se emplean también para establecer diferencias entre
aceites, es decir, para decir si 2 muestras de aceite son iguales o no organolépticamente.
3.2. Copa para la degustación.
Es la copa que se utiliza para la valoración organoléptica.

Está perfectamente normalizada. Su aspecto es al de una copa de coñac.
(Ver fotocopia nº 75, Figura parte superior)
Tiene la boca estrecha para poder concentrar los componentes volátiles y así se
puedan apreciar.
No tiene una base añadida para darle mayor estabilidad.
Es de vidrio de color oscuro (azul, marrón o verde) para que el catador no pueda
apreciar el color del aceite emitiendo por tanto un juicio subjetivo.
El volumen de muestra que se le añade es de 15 ml.
La temperatura a la que se cata el aceite es de 28 ± 2 ºC.
Según la temperatura de la cata así será la cantidad de volátiles, por ello es de
gran importancia que la temperatura de la cata esté ajustada.
Cada alimento tiene una temperatura de cata.
Estas copas se presentan al catador introducidas dentro de un bloque de
calefacción para controlar su temperatura:
(Ver fotocopia nº 75, Figuras parte central)
Podemos ver que este bloque tiene 9 oquedades y un baño.

La copa va tapada con un vidrio de reloj para concentrar los componentes
volátiles en la boca de la misma.
3.3. Sala de cata.
Es un espacio que debe contener al menos 10 cabinas para 10 catadores y una

zona para la preparación de la muestra.
Todo panel analítico tiene un jefe de panel que es quien prepara la muestra y el
ensayo.
Cada copa va identificada por una clave compuesta de números y letras, clave
que solo conoce el jefe de panel.
Esta sala debe reunir una serie de requisitos:
- Debe estar aislada de olores extraños.

- La temperatura debe ser cercana a la de ambiente à 20 – 22 ºC.
- La humedad del ambiente debe estar controlada à 60–70% de humedad.
- La iluminación debe ser homogénea y difusa.
- Los colores de las paredes de la cabina deben ser neutros, que produzcan
relajación.
(Ver fotocopia nº 75, Figura parte inferior)
Las copas deben lavarse con un jabón neutro, secarse y guardarse en una estufa.
Los catadores deben estar aislados unos de otros, por ellos las cabinas están
separadas con una mampara.
Las cabinas tienen en su interior:
- Un bloque de calefacción.
- Una pila para lavarse la boca.
- Una puerta corredera o un torno para que el jefe de panel le pueda dar al
catador la muestra. No llegan a verse físicamente el jefe de panel y el
catador.
(Ver fotocopia nº 76, Figura parte superior)
El catador entre muestra y muestra se limpia la boca con un trozo de manzana y

se enjuaga la boca con agua.
En cada sesión de cata se catan un máximo de 2 muestras.
3.4. Metodología:
3.4.1. Actuación del jefe de panel.
El jefe de panel es quien prepara la muestra y le asigna una clave a cada copa. Al
final de la cata es quien recoge las hojas de perfil, las cuales son unas hojas en donde el
catador rellena los atributos que ha encontrado en el aceite.
3.4.2. Condiciones del ensayo.
- El volumen de la muestra a catar es de 15 ml.

- La temperatura del ensayo está entre 20–22 ºC.
- El horario del ensayo es a media mañana.
3.5. Catadores:
3.5.1. Factores que influyen sobre la agudeza sensorial.
- Factores genéticos, propios de cada individuos.

- Capacidad de concentración.
- Horario de la capa: no debe realizarse mucho tiempo antes de haber
comido ni recién comido à a media mañana.
- Fatiga sensorial: llega un momento que los sentidos se saturan, por ello
se hace un máximo de 2 muestras.
- Factor de contraste: entre 2 atributos de un aceite puede ser que debido a
los contrastes anteriores con otras muestras percibamos un atributo en
mayor o menor intensidad a la real. Por ejemplo, cuando tomamos algo
salado y después agua, ésta nos sabe a dulce, en cambio sabemos que es
insípida.
3.5.2. Catador experto.
(Ver página 225, apartado 1. Vocabulario general básico, catador)

3.5.3. Normas generales de comportamiento.
‚ El catador no debe usar cosméticos, perfumes ni jabones muy

persistentes.
z No debe haber fumado al menos durante la última media hora.
ä No debe de haber comido al menos en 1 hora.
† Si tiene algún día disminuidos sus sentidos debe comunicarlo al jefe de
panel. Igualmente si se encuentra mal físicamente.
Metodología del catador:
¦ Anota la clave del aceite (nada más recibir la copa) en la hoja de perfil.
å Coge la copa, la gira para untar las paredes, descorre el vidrio de reloj y
huele el aceite.
– Se echa una muestra en la boca y la mueve por toda ella, es decir,
comienza la degustación.
¦ Anota los atributos positivos o negativos que encuentre en la hoja de
perfil. Debe asignar una intensidad a los atributos encontrados.
Constitución del panel analítico:
Consta de varios apartados, desde el 3.5.4 hasta el 3.5.7.
3.5.4. Preselección de candidatos.
Se parte al menos de un nº de personas 3 veces superior al nº de catadores que

formarán el panel analítico.
Un catador puede ser cualquier persona medianamente sensible.
A los candidatos se les hace una encuesta establecida por la norma, en la cual se
valora:
- Interés por la cata.

- Disponibilidad de la persona para la cata.
(Ver fotocopia nº 76, parte central)

3.5.5. Determinación del “umbral medio” del grupo.
Según la normativa, para la selección de los catadores, éstos deben valorar los 4
atributos: amargo, avinado, atrojado y rancio.
El jefe de panel debe buscar 4 muestras de aceite que contenga esos atributos
con una intensidad alta.
A partir del aceite seleccionado prepara diluciones sucesivas empleando un
soporte. La dilución entre muestra y muestra es 1:2. Continúa haciendo diluciones 1:2
hasta que el jefe de panel no sea capaz de detectar ese atributo, es decir, hasta que llegue
a 2 concentraciones en las que no se distingue el aceite del soporte utilizado para la
mezcla.
De todas las diluciones preparadas se queda con la última y las 7 anteriores, de
esta forma tendrá en total 8 muestras.
A B C D J K
no se distingue
7 anteriores a del soporte
la dilución J
Esto lo realiza con las 4 muestras que contienen los 4 atributos.

Seguidamente prepara 8 parejas de copas: una de las copas del par llevará la
dilución preparada, la otra copa llevará al soporte. La copa 8 (que tendrá aquella
dilución que no distinguiremos del soporte) será igual a su par el cual lleva el soporte.
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
Estas 8 parejas se presentan al aspirante a catador, el cual debe decir si encuentra

diferencia entre las parejas.
Después representa en un eje de coordenadas el % de aciertos frente a la
concentración de las copas para cada uno de los atributos.
(Ver fotocopia nº 77, Gráfica parte superior)
Vemos la representación gráfica antes mencionada para el atributo rancio.

Se denomina umbral medio de grupo a la concentración de atributo que

corresponde a un 75% de aciertos, por debajo del umbral el % de aciertos es menor y
por encima es mayor. En el ejemplo de la fotocopia el umbral medio es de 0’32.
3.5.6. Selección de catadores por el método de “clasificación

de intensidad”.
El jefe de panel prepara una serie de 12 copas, de forma que la nº 10 es la que

corresponde al umbral medio del grupo para ese atributo, siendo la intensidad del
atributo mayor en la copa 1. En este caso entre copa y copa la dilución es de 1:1’5.
Cada uno de los aspirantes debe catar las 12 copas. Para ello se les da tiempo.
A continuación el jefe de panel saca una copa de la serie, y mueve al resto de
copas para ocultar el hueco dejado por la copa quitada. El aspirante debe asignar la
posición de la copa sacada.
Esto se hace 4 veces con copas diferentes y para cada atributo.
Si llamamos K a la posición correcta y K’ a la posición asignada por el

aspirante, la puntuación que se le da al aspirante es la diferencia entre K y K’.
Por ejemplo: si K = 7 y K’ = 2, la puntuación obtenida es de 7 – 2 = 5.
Si la puntuación es mayor a 3 el aspirante queda rechazado.
(Ver fotocopia nº 77, Ejemplo 1) à Aspirante rechazado.

(Ver fotocopia nº 78, Ejemplo 2) à Aspirante admitido.
La puntuación para cada uno de los 4 atributos es la suma de las puntuaciones

obtenidas en las 4 copas sacadas al cuadrado, por ejemplo:
Copa sacada en primer lugar à K1 – K1’ = 0

Copa sacada en segundo lugar à K2 – K2’ = 0
Atrojado
Copa sacada en tercer lugar à K3 – K3 ’ = 3
Copa sacada en cuarto lugar à K4 – K4’ = –1
Patrojado = ∑ (Ki − Ki ') = 0 2 + 0 2 + 3 2 + 12 = 9 + 1 = 10

2
Cuanto menor sea la puntuación à mejor es el candidato.
Para la puntuación total se suman las puntuaciones de cada atributo:
Ptotal = ∑ Patributo
Si la puntuación total de un candidato es ≥ 34 también queda rechazado.
(Ver fotocopia nº 78, parte superior, debajo del Ejemplo 2)
Este método de selección se denomina método de clasificación de intensidad.
3.5.7. Entrenamiento.
El jefe de panel organiza varias catas para que el catador aprenda la metodología
y aprenda a distinguir los distintos atributos, tanto los positivos como los negativos.
Este es un periodo que dura varios meses.
Comprobación:
El jefe de panel debe comprobar si el catador trabaja bien o no. Esto lo hace
presentándole muestras perfectamente caracterizadas. También se le puede presentar la
misma muestra en diferentes ocasiones para ver si los resultados son coherentes.
3.6. Procedimiento para la evaluación organoléptica de aceite de oliva

virgen.
3.6.1. Utilización de la hoja de perfil.

3.6.2. Puntuación final.
3.7. Legislación.
Los últimos apartados vienen juntos, pues dentro de la legislación viene indicada
la forma de puntuar, el procedimiento a emplear, tipo de vaso para la cata, etc... por ello
he incluido un único apartado que contiene el procedimiento para la evaluación
organoléptica de aceite de oliva, la utilización de la hoja de perfil, la puntuación final y
la legislación “mezclados”.
Existen 2 normativas para la utilización de la hoja de perfil:
- La de la CEE.
- La del COI.
Normativa según la CE:
(Ver fotocopia nº 78, parte izquierda)
En esta hoja aparecen:
- Frutado de la aceituna.
- Atributos positivos.
- Defectos.
El catador debe de asignarle una intensidad desde 0 hasta 5.

Una vez ha rellenado la hoja de perfil emplea la tabla de puntuación:
(Ver fotocopia nº 78, Tabla derecha)

La legislación de la CE indica que la puntuación va desde 1 hasta 9.
Ø Un aceite de oliva virgen extra es aquel que tiene una puntuación ≥ 6’5.
Ø Un aceite de oliva virgen es aquel que tiene una puntuación entre 5’5–6’5.
Estos 2 aceites se comercializan para su uso alimenticio como tal.
Ø Un aceite de oliva virgen corriente es aquel que tiene una puntuación entre
3’5–5’5.
Ø Un aceite de oliva virgen lampante es aquel que tiene una puntuación < 3’5.
Estos 2 aceites deben refinarse antes de su utilización.

El jefe de panel recoge la puntuación dada por los catadores, le hace la media
aritmética y calcula el intervalo de confianza.
La norma dicta que la determinación se haga por duplicado.
Normativa según la CE:
En esta hoja aparecen:
- Defectos más usuales y otros defectos.

- Atributos positivos.
Para cada uno de ellos aparece un segmento con una longitud de 10 cm.
El catador debe identificar cada uno de los atributos positivos o negativos y
asignarle una intensidad en función de la longitud del segmento que marque.
Aquí vemos un ejemplo para una muestra de aceite.

Esta muestra ha sido valorada por 8 catadores.
El jefe de panel indica los valores para cada atributo (atrojado, moho, ...)
indicando la intensidad media. A partir de estos valores calcula la mediana para cada
uno de los atributos.
(Ver fotocopia nº 80, Figura 8 (continuación))
Se calculan otros parámetros estadísticos y se le asigna la categoría al aceite.
(Ver fotocopia nº 80, Diagrama de barras)
Aquí podemos ver un diagrama de barras en el cual se ha representado la

mediana de los atributos.
- Para un aceite de oliva virgen extra debe de cumplirse que la mediana del
frutado sea > 0 y que la mediana de los defectos sea 0, es decir, que no
tenga defectos.
- Para un aceite de oliva virgen debe de cumplirse que la mediana del
frutado sea > 0 y que la mediana de los defectos esté entre 0–2’5. Como
vemos en este caso el defecto sí aparece.
- Para un aceite de oliva virgen corriente debe de cumplirse que la
mediana los defectos esté entre 2’5–6’0. En este caso la mediana del
frutado es independiente.
Otra posibilidad es que la mediana del frutado sea 0 y que la mediana de
los defectos sea ≤ 2’5.
- Para un aceite de oliva virgen lampante debe de cumplirse que la
mediana de los defectos sea > 6. La mediana del frutado también es
independiente.
La norma dicta que la determinación se haga por triplicado.
(Ver fotocopia de la normativa, Apartado 4, página 7)
Podemos ver los criterios de calidad para el aceite de oliva en función del valor
de la mediana del frutado y de los defectos (fila 3ª).
A parte de estos criterios de calidad se están intentando introducir otros criterios,

tales como el contenido de antioxidante en el aceite (pues lo estabiliza à polifenoles,
tocoferoles, etc...).
El COI ha propuesto lo que se denomina el Índice Global de Calidad à I. G. Q.
Este índice se calcula de los 4 criterios de calidad ya vistos: K270, índice de
peróxidos, acidez libre y valoración sensorial.
Aparecen 2 columnas:
- Límite.
- Coeficiente de ponderación: es el peso en importancia que tiene el
criterio de calidad. Por ejemplo, ½ de la calidad es debida a los atributos
que tenga, la acidez libre representa ¼ parte de la calidad, y el K270 y el
índice de peróxidos representan 18 cada uno.
I.G.Q. = 2'55 + 0'92 · P.O. - 0'28 · Ac - 7'35 · K270 - 0'066 · I.P.
donde:
P.O.: Valoración organoléptica.
Ac: acidez libre.
K270: absortividad molar (con la concentración expresada en g/100ml) a
270 nm.
I.P.: Índice de peróxidos.

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Control de Calidad y Análisis de Grasas.

Tema 1: Composición de una grasa 1

TEMA 1: COMPOSICIÓN DE UNA GRASA

La diferencia entre grasa y aceite desde el punto de vista químico es mínima.

1.1. Definición de grasa.

Una grasa no es un compuesto puro. Es una mezcla compleja constituida

R1 COOH o bien CH3 (CH2)n COOH

El ácido graso se compone de una cadena carbonada y un grupo carboxílico

Esta unión nos da un triglicérido:

Estos triglicéridos constituyen aproximadamente el 99% de la grasa.

Cuando se hidroliza un triglicérido volvemos a tener grupos –OH libres así

1.2. Clasificación de triglicéridos.

CH2 O ác. oleico

1.3. Características de una grasa.

Supongamos tenemos una mezcla de triglicéridos. Si hidratamos con una base

La saponificación es un proceso muy importante para separar los triglicéridos

2. Composición de una grasa.

Cualquier grasa o aceite se constituye por 2 grupos de compuestos:

- Triglicéridos (ácidos grasos) à 98-99% de la grasa.

Estos componentes menores son los responsables de comunicarle el flavor

2.1. Triglicéridos y ácidos grasos.

2.1.1. Ácidos grasos.

Son cadenas hidrocarbonadas muy largas, con un grupo carboxilo terminal, un

La cadena suele ser lineal y con un nº par de átomos de carbono, predominando

(Ver fotocopia nº 1, Tabla 3.1)

Aquí podemos ver el intervalo de % de ácidos grasos que aparecen en el aceite

Algunos autores dividen el tipo de aceite de oliva en 2 grupos:

ü España, Italia, Grecia à con alto contenido en ácido oleico, y bajo

2.1.2. Triglicéridos (TG).

En el aceite de olvida, el TG mayoritario es el triéster del ácido graso oleico, es

CH2 O ác. oleico

Los ácidos grasos insaturados en el aceite de oliva esterifican preferentemente la

α ác. graso saturado

β ác. graso insaturado

α' ác. graso saturado

En la biosíntesis intervienen enzimas que hacen que esta forma de esterificación

2.2.Constituyentes menores: materia insaponificable.

a) Derivados de ácidos grasos.

En los primeros podemos a su vez tener:

CH3 – (CH2)n – CH2OH ------ COOH – (CH2)n – CH3

- Ésteres de esteroles: pueden estar libres o esterificados.

El poder determinar la cantidad y composición de estos constituyentes menores

- El % de ellos es muy bajo.

Por tanto como mucho se determina el insaponificable, en el cual NO están

Seguidamente hacemos una extracción con un disolvente orgánico para disolver

Pertenecen a los esteroides. Son alcoholes esteroideos. Todos contienen al

El radical –R es lo que les hace ser diferentes. Además, algunos esteroles

(Ver fotocopias nº 2, parte superior, nº 3, Figura 3.4., y nº 4, Tabla 3.145)

Estigmasterol, β-sitosterol, colesterol y lanosterol como principales.

La estructura básica de un tocoferol es:

Como podemos ver contienen un grupo alcohol, luego son fenoles.

(Ver fotocopia nº 1, Figura 3.2.)

El mayoritario es el α-tocoferol (vitamina E à es un antioxidante).

- En el α-tocoferol à R1≡R2≡R3≡CH3. (Ver fotocopia nº 2, VIT E)

Distinguimos entre 2 grupos: (Ver fotocopia nº 2, parte inferior)

a) Alcoholes grasos o alifáticos.

Son cadenas hidrocarbonadas largas, con un grupo alcohol primario. Tienen

En el aceite de oliva tenemos:

C22 (dicosanol), C24 (tetracosanol), C26 (hexacosanol), C28 (octacosanol), ...