Práctica 5 Método de tinción para hongos.

1. Describa la técnica de cuatro preparaciones microscópicas para hongos, que se usan en

muestras clínicas o en aislamientos de colonias.

Exámenes en fresco o exámenes directos. Solución acuosa de KOH al 10 y 20%: Las muestras de
tejidos queratinizados, como escamas de piel, polvo de uñas, pelos y raspado de córnea, deben ser
procesadas con la adición de una o dos gotas de solución de KOH al 10% entre portaobjetos y
cubreobjetos; la concentración al 10% es la que se prefiere, aunque se puede aumentar a 20 e
incluso 30%. Una vez realizado el examen en fresco, o directo, la preparación se debe calentar
suavemente en una fuente directa de calor (mechero, estufa); el objetivo de esto es acelerar la
degradación de la queratina y saponificación de las grasas.

Tinciones. Giemsa: Los extendidos o frotis de médula ósea, sangre y pus pueden ser teñidos con
este colorante; por lo general para la búsqueda de estructuras intracelulares (histoplasmosis,
peniciliosismarneffei), las cuales son fagocitadas por los macrófagos y polimorfonucleares. Esta
tinción, entre otras, permite el reconocimiento de las estructuras micóticas.

Cultivos. Agar dextrosa de Sabouraud (ADS) y agar extracto de levadura (AEL): Los medios sólidos
de ADS y AEL son los óptimos para el aislamiento rutinario de cepas de hongos; se deben incubar a
25-28°C. Ambos medios se consideran más útiles para el aislamiento de hongos de micosis de tipo
oportunista.

Pruebas de susceptibilidad. Tiras LE: Son tiras de acetato de celulosa impregnadas con antimicóticos
a concentraciones decrecientes; permiten observar la formación de halos de inhibición al colocarlas
sobre placas de agar sembradas masivamente; el halo adquiere forma de ojiva y el punto en el cual
se puede apreciar la CMI es aquel en donde la base de la ojiva toca la cinta. Es un método muy
sencillo y fácil de realizar en cualquier laboratorio; sin embargo, en algunas ocasiones los dos lados
donde el desarrollo toca la cinta pueden no mostrar una lectura definida.

2. Explique cuatro tipos de tinciones para hongos utilizadas en muestras clínicas o en

colonias aisladas.

Hidróxido de potasio (KOH): Es el medio de montaje de las muestras clínicas más universalmente
aceptado. Permite clarificar todo tipo de muestras clínicas con abundantes células y restos celulares
y observar la morfología y la pigmentación fúngica. El KOH disuelve más rápidamente los elementos
celulares que los hongos (protegidos por la pared celular). El efecto clarificador del KOH puede
demorar desde 10 min hasta horas, en el caso de las muestras de uñas, y puede reducirse calentando
ligeramente la preparación. Se suelen utilizar dos concentraciones, una más fuerte del 20-30% para
uñas, y del 10% para el resto de muestras. Si no se utiliza con colorantes, las preparaciones deben
estudiarse con un microscopio de contraste de fases o, en su defecto, con uno convencional
diafragmando el condensador para aumentar el contraste.

Naranjada de Acridina: Se trata de un fluorocromo que se liga a macromoléculas polianiónicas,

como los mucopolisacáridos y los ácidos nucleicos. Se descubrió por accidente, en 1958, que al teñir
mucina en tejidos se podía demostrar la presencia de hongos. Pronto se describe su utilidad, tanto
en cortes de tejidos como en muestras clínicas directas.
Tras la confección habitual del frotis y secado al aire, se fija con metanol o calor. Teñir el frotis con
solución de trabajo durante 2 min, lavar con agua y dejar secar. Se puede hacer un montaje con
agua y observar inmediatamente con microscopio de fluorescencia con los filtros habituales de
Inmunofluorescencia y Auramina (Exc. 450- 490/510/520). Las bacterias y los hongos se tiñen de
color naranja y los núcleos de los leucocitos se tiñen de color verde.

Tinciones Romanowsky: Aunque de uso cotidiano en los Laboratorios de Hematología para teñir los
frotis de sangre periférica y médula ósea, tiene un uso y utilidad limitado en Micología Clínica. Se
pueden emplear multitud de modificaciones (Giemsa, MayGrünwald-Giemsa, Leishman, Wright,
Riu, etc.) pero se han ido imponiendo las más sencillas y rápidas, como el Diff-Quik (Medion
Diagnostics). Se ha demostrado su eficacia en la detección de H. capsulatum dentro de las células
mononucleares, como levaduras pequeñas con fino halo hialino. También son útiles en el
diagnóstico de C. neoformans en muestras respiratorias y en líquido cefalorraquídeo y se usan de
forma más habitual en el diagnóstico de P. jiroveci.

Tinción negativa. Para la detección de la cápsula polisacarídica extracelular de algunos hongos se

utilizan suspensiones coloidales de partículas de carbón. Las más utilizadas son la Tinta China y la
Nigrosina. Es la técnica de tinción negativa más ampliamente recogida en la literatura para poner
de manifiesto la cápsula de C. neoformans. La cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno
a una levadura redonda contra un fondo negro

3. Escriba el fundamento de las tinciones PAS, metenamina de plata y hematoxilina-eosina.

Ácido peryódico de Schiff (PAS): Es una de las tinciones clásicas para la mayoría de los hongos. Las
características basófilas o eosinófilas de muchas estructuras fúngicas, permiten que al procesar las
muestras con esta tinción sean visibles de manera más clara y nítida; es importante resaltar que
estructuras intracelulares, como el caso de las histoplasmosis, o bien estructuras fúngicas
intracelulares (endosporas de esférulas de coccidioidomicosis o rinosporidiosis), pueden verse con
esta tinción; otro de los usos principales que tiene es en los casos de micetoma, principalmente.

Metenamina de plata (Gromori-Grocott): Al igual que la tinción de PAS, se considera una tinción de
rutina para la identifi cación de la mayoría de las micosis. Las estructuras micóticas tienden a tomar
una tonalidad negra por la oxidación de la plata, permitiendo una visión más clara y su fácil
localización en los materiales biológicos teñidos de esta manera; sin embargo, puede tener
limitaciones sobre estructuras intracelulares. Esta tinción se considera la de elección para el
diagnóstico de la neumocistosis; se hace a partir de LBA y también es muy útil en los casos de
paracoccidioidomicosis y mucormicosis.

Hematoxilina-eosina: La capacidad de determinados hongos en muestras clínicas para emitir

radiación en el visible tras ser irradiados con luz UV (autofluorescencia) es conocida desde hace
años, pero la debilidad de esta fluorescencia natural la hacen inútil desde el punto de vista del
diagnóstico práctico. Sin embargo, se ha podido demostrar una autofluorescencia importante en
algunos hongos incluidos en parafina y teñidos con hematoxilina-eosina.

En la H&E, los hongos tiene el citoplasma rosa, el núcleo azul y la pared incolora.
 4. Investigue los aspectos coloniales y microscópicos de los siguientes hongos:
a) Microsporum audouinii

Características macroscópicas:

Colonias de crecimiento moderado, 6 a 10 días, grises, aterciopeladas, planas, el reverso presenta

pigmento color café-marrón a rojizo.

Características microscópicas:

Es un micelio septado, hialino, microsifonado, ramificado, con hifas peptinadas y presencia de

clamidoconidios terminales, que a veces son puntiagudos en el extremo terminal; Presenta
microconidios de la misma forma que las otras especies de Microsporum, pero los macroconidios
son de forma diferente, son ahusados, con extremos puntiagudos (como M. canis) pero algunos
tienen un estrechamiento en el centro (figuran una cintura).

b) Microsporum cookei

Características macroscópicas:

La tasa de crecimiento de Microsporum cookei es moderadamente rápida. El diámetro de la colonia

alcanza 1 a 3 cm después de la incubación a 25 ° C durante 7 días en agar de dextrosa Sabouraud.
La textura es suave a polvorienta. El color del frente es inicialmente blanco a amarillo y puede
cambiar a rojo uva o marrón oscuro en el tiempo. El reverso es de color rojo oscuro a marrón oscuro.

Características microscópicas:

Microsporum cookei produce hifas de ramificación septada, macroconidia y microconidia. Los

macroconidios son numerosos, de forma ovalada, de paredes gruesas, rugosas y de 6 a 10 celdas.
Los microconidios también son abundantes. Son de forma unicelular y ovoide a piriforme.

c) Trichophyton schoenleinii
Características macroscópicas:

Macroscópicamente las colonias son algodonosas, con el tiempo toman un aspecto aterciopelado y
pulverulento, de color blanquecino a amarillento o rojo violeta, El reverso de la colonia suele tener
un color rosado-rojo, pero, en ocasiones, puede ser amarillo-marrón, rojo-vino o violeta e, incluso,
pueden carecer de pigmento.

Características microscópicas:

Microscópicamente tiene hifas largas y delgadas, los microconidios son abundantes con forma
piriforme a redondeada, raramente hay macroconidios con pared delgada, multiseptados, de
tamaño variable y con forma de puro o cigarrillo.

d) Pyrenochaeta romeroi

Características macroscópicas:

Las colonias de Pyrenochaeta crecen moderadamente rápido. Son planos y lanudos a algodonoso.
Desde el frente, el color es inicialmente blanco y se vuelve verde oliváceo a gris oliváceo. El reverso
es oscuro.

Características microscópicas:

Se observan sepatas, hifas hialinas a subhialinas, picnidios y conidios. Pycnidia (sing. Pycnidium;
cuerpo fructífero redondo o en forma de matraz que contiene conidios) son globosos a en forma de
matraz y ostiolados. Son de color marrón a negro y tienen pelos (cabello rígido ubicado en la
picnidia) que surgen de su parte superior. Los fialidos surgen del revestimiento interno de los
picnidios. Los conidios (2-4 x 1-2 µm) son unicelulares, ovalados a cilíndricos, hialinos y rectos o
ligeramente curvados.

e) Phialophora richardsiae
Características macroscópicas:

Colonias de crecimiento rápido, son polvorientas a lanosas o con mechones, de color marrón
grisáceo con un reverso de color marrón grisáceo a negro oliváceo.

Características microscópicas:

Producen dos tipos de conidios: (1) conidios hialinos que son alantoides o cilíndricos, con un tamaño
de 3-6 x 1.5-2.5 μm, formados en fialidos discretos, similares a clavijas en hifas de pared delgada; y
(2) conidios marrones de paredes gruesas que son esféricos a subféricos, 2.5-3.5 x 2-3 μm, formados
en fialides de color marrón oscuro, delgados y afilados con collarines de quema.

f) Conidiobolus cooronatus

Características macroscópicas:

Se desarrolla en medios de cultivo habituales, es inhibido por la cicloheximida; en Sabouraud

dextrosa agar y extracto de levadura agar crece con rapidez en un tiempo promedio de 72 horas a
temperatura de 25-28°C; presenta colonias limitadas, de color blanco-beige, de aspecto
membranoso-rugoso, plegadas y con escaso micelio corto, aéreo-húmedo.

Características microscópicas:

Al microscopio se observan dos tipos de reproducción: sexuada (teleomórfica) a base de zigosporas,

y asexuada (anamórfi ca), esta última constituida por un esporangióforo corto (5-10 μm), que
sostiene un esporangiolo único (10-40 μm de diámetro) con una esporangiospora primaria (2-3 μm);
la estructura completa presenta una papila o prominencia, y al envejecer la membrana se hace
vellosa, como una forma de “corona”, de aquí el nombre de la especie; la espora es expulsada o
disparada con gran fuerza y una vez libre puede generar una espora secundaria, que se forma por
elongación de la primera, como un tubo germinal.

Referencias:
 Bonifaz, A. (2012) Micología Médica Básica, Capitulo 7: Dermatofitosis, 4 edición,
McGrawHill: México. pag 93 – 130, 600p.
 Arenas, R. (2008) MICOLOGÍA MÉDICA ILUSTRADA, capitulo 6 Dermatofitosis, McGrawHill:
México, DF. Pag 61 – 87, 403 p.
 Llovo José., Pontón José. (2007). Diagnóstico microscópico de las micosis. Asociación
Española de Micología.