PRÁCTICA 06

ENZIMAS DIGESTIVAS. AMILASA Y LIPASA

PANCREÁTICA
INTRODUCCIÓN.

El proceso digestivo es necesario para que el cuerpo pueda utilizar los

nutrientes. Tiene lugar en el tracto buco-gastro-intestinal y es posible
gracias a la actuación de enzimas hidrolíticas que actúan sobre los
componentes de la dieta. La primera de ellas es la a -amilasa salival, que
degrada el almidón a una mezcla de hidratos de carbono más sencillos
(según el nivel de actividad y el tiempo de actuación, pueden llegar a
maltosa e incluso glucosa libre) y un resto, inatacable por ella, llamado
dextrina límite. El contenido en a -amilasa en saliva es variable, y puede ir
desde 0 a 3 mg/ml, puesto que algunas personas no poseen esta actividad,
sin que ello suponga ningún problema para ellos si disponen de niveles
adecuados de a -amilasa pancreática.

No obstante, el proceso digestivo propiamente dicho tiene lugar en el

intestino delgado. De la mezcla de enzimas que llegan a él, formando parte
del llamado jugo pancreático, nosotros estudiaremos en esta práctica la
lipasa pancreática, que consigue la hidrólisis de triacilgliceroles (TAG) a
ácidos grasos (AG).

Hidrólisis del almidón.

El almidón es un polisacárido compuesto por unidades de glucosa con

dos componentes; uno, mayoritario, llamado amilosa, de estructura lineal
(las unidades están unidas, exclusivamente, por enlaces a-1,4-glucosídicos),
y otro, minoritario, amilopectina, de estructura ramificada (cada cierto
número de eslabones lineales hay una ramificación, que encabeza una
glucosa unida mediante enlace a-1,6-glucosídico a una de las glucosas de la
estructura lineal). La práctica se aprovecha, para seguir la degradación del
almidón por a -amilasa salival, de que amilosa forma un complejo azul con
iodo, cosa que no pueden hacer los productos de su degradación.

Hidrólisis de TAG.

En este caso, emplearemos pancreatina bovina, una mezcla de

enzimas pancreáticos entre las que se encuentra lipasa y, como sustrato
suministrador de TAG, leche de vaca. Al hidrolizar los TAG, lipasa libera AG
que, al actuar como tales, bajan el pH de la disolución. Con un indicador
ácido-base como fenolftaleína, podremos visualizar la reacción y, por tanto,
seguir la hidrólisis de los TAG. Para ello, la leche de partida se basifica con
carbonato sódico, lo que hace que la disolución tenga color rosa, que es el
color de fenolftaleína en ese medio y, a medida que aparecen los protones
debidos a la actividad de los AG liberados, dicho pH desciende hasta
hacerse ácido, lo que decolora la disolución, al virar a blanco la fenolftaleína.

MATERIAL.

Gradilla Tubos de ensayo

Pipetas de 1, 5 y 10 ml Vaso de precipitado de 50 ml
Baño termostático (37ºC) Varilla de vidrio (agitador)
Pinzas de madera Micropipetas de 0,2 y 1 ml
Agitatubos Calefactor

REACTIVOS.

Almidón al 0,25%, hervido Fenolftaleína, 1% en etanol

Yodo 1 mM Pancreatina, 2%
Carbonato sódico, 0,2 M Bilis, 2% (o deoxicolato, 2%)
Suero fisiológico Reactivo de Benedict

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

a). Obtención de a -amilasa salival.

Se prepara un tubo de ensayo limpio sobre el que se coloca un

embudo con un papel de filtro plegado. Este filtro se humedece con suero
fisiológico (agua con NaCl al 0,9%) hasta adaptación al embudo y aparición
de filtrado. Se deposita, entonces, una pequeña cantidad de saliva (de, al
menos, dos personas) sobre el embudo y se añaden 12 ml de suero para
diluir la secreción y permitir la filtración de la a -amilasa. Se deja unos
minutos el tubo con el embudo en la gradilla hasta recoger el filtrado, que
será nuestra fuente de enzima. Antes de utilizarlo, se debe agitar el tubo con
el agitatubos para obtener una solución homogénea.

b). Obtención de la cantidad de a -amilasa adecuada.

En cinco tubos, marcados como A, B, C, D y E, pipetear las cantidades

de reactivos (en ml) que se especifican a continuación:

Reactivo A B C D E
Almidón, a 37ºC 5 5 5 5 5
Suero fisiológico 1 0,9 0,8 0,5 0
a -amilasa 0 0,1 0,2 0,5 1
 Añadir la a -amilasa lo más rápidamente posible. Agitar los tubos hasta
homogeneizar la mezcla de almidón y amilasa, e incubar cinco minutos a
37ºC, contados desde el momento en que se acaba la agitación tras la
adición de la enzima.

Pasados los cinco minutos, añadir rápidamente a cada tubo 1 ml de

disolución de iodo y observar la posible aparición de color. Seleccionar el
tubo en el que se haya producido la digestión total del almidón con la menor
cantidad de a -amilasa.

c). Seguimiento de la cinética de desaparición de almidón y la aparición de

azúcares reductores.

Preparar seis tubos con 1 ml de disolución de yodo en cada uno, y

otros dos tubos con 3 ml de Reactivo de Benedict. Pipetear, en un tubo
aparte, 10 ml de almidón, atemperarla a 37ºC durante cinco minutos y
añadirle, al final de ese tiempo, el doble de la cantidad elegida de a -amilasa,
de acuerdo con el resultado del apartado anterior. Mezclar lo más
rápidamente posible. Pipetear, inmediatamente, 1 ml de dicha mezcla a uno
de los tubos con iodo y al primero de los dos tubos con Benedict. A
intervalos de un minuto, ir pipeteando 1 ml de la mezcla sobre los restantes
tubos con iodo. Transcurridos los 5 minutos, añadir 1 ml de la mezcla
almidón/amilasa sobre el segundo de los tubos que contiene Benedict.
Acabada la serie, poner los dos tubos con Benedict en el calefactor, cuya
temperatura debe ser 100ºC, y dejarlos allí 10 minutos. Anotar las
variaciones de color producidas en cada tubo de yodo y en los dos tubos
con Benedict. Discutir los resultados obtenidos.

d). Acción de la lipasa pancreática.

Añadir unos 30 ml de leche de vaca al vaso de precipitado y adicionar

unas gotas de fenolftaleína. Agitar e irle añadiendo, gota a gota, disolución
de carbonato sódico 0,2 M, agitando continuamente con la varilla, hasta que
el líquido adquiera una coloración rosa persistente, de intensidad moderada.
Se numeran, a continuación, cuatro tubos de ensayo y se les añade las
siguientes cantidades (en ml) de los reactivos indicados:

Reactivo 1 2 3 4
Leche basificada 5 5 5 5
Agua destilada 1,5 1 0,5 0
Sales biliares 0 0,5 0 0,5
Pancreatina 0 0 1 1

Agitar todos los tubos hasta total homogeneización, y situarlos en el

baño termostático a 37 ºC, observando lo que sucede en ellos a lo largo del
 tiempo. Anotar las decoloraciones que tengan lugar, y el tiempo en que se
producen, contado desde el comienzo de la reacción. Interpretar resultados.

CUESTIONES.

1. ¿Cuál es el color original que aparece en los tubos en los que se mezcla
almidón con yodo? ¿por qué?

2. ¿Por qué la a -amilasa hace desaparecer el color de la mezcla

almidón/iodo?

3. Nombre dos productos que pueden estar presentes en el medio cuando el

yodo deje de producir su coloración típica con el almidón

4. ¿A que pH fisiológico actúa lipasa?

5. ¿Qué producto de la acción de lipasa es el responsable del viraje de color

de la fenolftaleína?

6. ¿Qué efecto tienen las sales biliares sobre la digestión?

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Amilasa
Definición: Enzima cuya mayor actividad se encuentra en las glandulas parotidas y en el pancreas. La amilasa pancreatica
sirve para evaluar la existencia de una pancreatitis aguda. El 80% de los pacientes con pancreatitis aguda
manifiestan valores aumentados de amilasa pancreatica en las primeras 24 horas, despues se van normalizando
hasta los 4 o 6 dias, a la vez que va aumentando la excrecion urinaria de amilasa, persistiendo esta durante unos
3 o 5 dias mas. Los valores normales son de 0,5 ml. en suero y de unos 10 ml. en orina de 24 horas. Estos
valores se ven aumentados en parotiditis, obstruccion intestinal, embarazo ectopico, peritonitis, quiste y
pseudoquiste pancreatico, ulcera gastrica, pancreatitis cronica, etc. Y disminuidos en las hepatopatias graves.

Departamento de Bioquímica, Biología Molecular (B) e

Inmunología

PRACTICAS DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA

MOLECULAR
1º CURSO DE LA LICENCIATURA DE
ODONTOLOGÍA
 DPTO. BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR B e
INMUNOLOGIA
CURSO 2002/2003

Enlace a otra práctica relacionada del Departamento

PRÁCTICA 4
ENZIMAS DIGESTIVOS. AMILASA SALIVAL Y
LIPASA PANCREATICA

INTRODUCCION

El proceso digestivo se realiza sobre los alimentos para su degradación en

moléculas más sencillas que puedan ser absorbidas y transportadas para su
utilización celular. Dicho proceso tiene lugar en diferentes partes del tubo
digestivo, y se lleva a cabo por diferentes clases de enzimas que actúan
sobre los componentes de la dieta. El primero en actuar es la a-amilasa
salival, que degrada almidones en una mezcla de dextrinas y carbohidratos
mas sencillos, pudiendo llegar según el nivel de actividad a maltosa o
glucosa. El contenido de a-amilasa en saliva varía entre 0 y 3 mg/ml,
existiendo individuos que no poseen tal actividad.

No obstante, el proceso digestivo más importante ocurre en el intestino

delgado. De la mezcla de enzimas digestivos intestinales, la lipasa
pancreática será también utilizada en la práctica, mediante seguimiento de la
hidrólisis de triacilglicéridos a ácidos grasos libres.

1. HIDROLISIS DEL ALMIDON

El almidón es un polisacárido compuesto por unidades de glucosa con dos

componentes: la a-amilosa, mayoritaria y de estructura lineal, y la
amilopectina, minoritaria y de estructura ramificada. La amilosa forma un
complejo azul con el iodo. Esta propiedad será aprovechada para observar
su hidrólisis por la a-amilasa.
2. HIDROLISIS DE TRIACILGLICERIDOS

En este caso se utiliza como fuente de enzima la pancreatina bovina, una

mezcla de enzimas que contiene lipasa. Como sustrato fuente de
triacilglicéridos se utilizará leche de vaca. Al hidrolizarse los triacilglicéridos
aparecen ácidos grasos libres que disminuyen el pH de la disolución.
Mediante fenolftaleína, un indicador ácido/base, es posible visualizar esa
disminución.

La leche se basifica con carbonato en presencia de unas gotas de

fenolftaleína hasta coloración rosa (pH>7) y se puede detectar la disminución
del pH por decoloración del indicador (pH<7).

MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS

2 Gradillas Almidón hervido al 1 y al 0.5 %

30 Tubos de ensayo Fenolftaleína 1% en etanol

Pipetas vidrio de 5 y 10 ml Iodo 1 mM

1 Vaso de 50 o 100 ml Pancreatina 2%

1 Varilla de agitación Carbonato sódico 0.2 M

1 Baño termostático a 37ºC Bilis 2% (o DOC sódico al 2%)

1 Embudo Reactivo de Benedict

Filtros precortados 1 Termobloque hasta 100ºC.

Agitatubos Vortex Suero fisiológico ClNa 0.9%

Leche entera Saliva (o a-amilasa 0.2 mg/ml)

Pipeta P1000 y cánulas

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. HIDROLISIS DEL ALMIDON

a) Obtención de la a-amilasa salival

Se prepara un tubo de ensayo limpio sobre el que se coloca un embudo con

un filtro de papel. Este filtro se humedece con suero fisiológico hasta
aparición de alguna gota de filtrado en el tubo de ensayo de recogida.
Activar en lo posible la secreción de saliva y depositar sobre el embudo un
poco de saliva escupiendo suavemente. Para facilitar la filtración y
fluidificación de dicha saliva, añadir 12 ml de suero fisiológico en el embudo
y esperar que el volumen de filtrado sea de unos 10 ml sobre el tubo de
ensayo.

b) Elección de la cantidad de a-amilasa adecuada.

En 5 tubos marcados como A, B, C, D y E se pipetean las cantidades que se

indican a continuación (expresadas en ml):

REACTIVO nº tubo A B C
D E

Almidón 0.5% 5 5 5
5 5

Agua destilada 0 0.9 0.8

0.7 0.4

Disolución de a-amilasa (saliva diluida) 0 0.1 0.2

0.3 0.6

AGITAR. Es INDISPENSABLE que se produzca una buena mezcla. Incubar 5

min a 37ºC e INMEDIATAMENTE añadir el iodo.

Iodo al 1% 3 3 3
3 3

Agitar y observar el color que aparece, azul o amarillento. Seleccionar el

tubo en el que se haya producido -amilasa.adigestión total del almidón con
la menor cantidad de

c) Seguimiento de la cinética de desaparición de almidón y la aparición de

azúcares reductores.

Preparar 6 tubos con 1 ml de disolución de iodo en cada uno y otros 2 tubos

con 3 ml de disolución de Benedict. Una vez preparados los tubos
anteriores, pipetear en un tubo provisto de tapón 10 ml de disolución de
almidón preatemperada a 37ºC y añadir el doble de la cantidad de a-amilasa
elegida en el apartado anterior. Agitar lo más rápidamente posible e
inmediatamente, pipetear 1 ml de dicha mezcla a uno de los tubos con iodo y
otro ml a uno de los tubos con reactivo de Benedict. Después, cada minuto,
pipetear 1 ml sobre los sucesivos tubos de iodo hasta el último tubo, donde
se pipeteará 1ml sobre iodo y otro ml sobre el segundo tubo que contiene
reactivo de Benedict. Acabada la serie del iodo, anotar resultados e
interpretarlos mientras se ponen los tubos con el Reactivo de Benedict al
baño maría durante 10min. Anotar las variaciones de color producidas en
cada tubo y discutir los resultados obtenidos.

NOTA: Caso de que la hidrólisis del almidón ocurra de forma muy rápida,
repetir la experiencia con intervalos de 30 s entre tubo y tubo, mientras que
si el proceso ocurre lentamente, puede esperarse 2 minutos entre cada
extracción de la mezcla de hidrólisis.

2. ACCION DE LA LIPASA PANCREATICA

Añadir unos 30 ml de leche al vaso de precipitados y adicionar unas gotas

de fenolftaleína. Agitar e ir adicionando disolución de carbonato sódico 0.2 M
gota a gota con agitación continua hasta adquirir un color rosa permanente y
claramente visible. Se marcan 4 tubos de ensayo y se les añade los
siguientes reactivos (cantidades expresadas en ml)

REACTIVO tubo A B C
D

Leche basificada 5 5
5 5

Agua destilada 2 1.5

0.5 0

Sales biliares 0 0.5 0

1.5

Pancreatina 0 0
1.5 1.5

Agitar todos los tubos hasta homogenización total y situarlos en el baño de

agua a 37ºC, observando lo que sucede con los tubos a lo largo del tiempo y
agitándolos ocasionalmente para homogenizar los cambios de color que
posiblemente se produzcan. Anotar las decoloraciones y a quÉ tiempo tienen
lugar desde el inicio de la reacción e interpretar resultados.

CUESTIONES

1) Cual es el color original que se obtiene en los tubos donde se mezcla

almidón con iodo? Porqué?

2) Porqué la a-amilasa hace desaparecer el color?

3) Nombre dos productos que pueden estar presentes cuando el iodo no

produzca la coloración típica con el almidón.

4) A que pH fisiológico actúan las lipasa?

5) Que producto de la acción de la lipasa es el responsable del cambio de

color de la fenolftaleína.

6) Cual es el efecto de las sales biliares sobre la digestión?

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