Informe de Laboratorio N° 2

“ACTIVIDAD CATALÍTICA DE LA AMILASA SALIVAL”

Cuvi Dennys* (3692),Guachiculca Fridson * (3541), León Gabriela* (3302), Mañay Pamela*
(3102), Pantoja Luis* (3319), Sanchez Monserrath()* ,Vizueta Josselyne* (2925).
*Estudiantes de la Catedra de Bioquímica del metabolismo, Escuela de Bioquímica y Farmacia -
Facultad de Ciencias – Escuela Superior Politécnica de Chimborazo. Grupo
Fecha de realización: 15/11/2019 Fecha de entrega: 22/11/2019

RESUMEN

La amilasa salival es una enzima digestiva presente en la boca cuya función es el rompimiento
hidrolítico de los enlaces glicosídicos -1,4 de la amilosa y la amilopectina presentes en el
almidón. Ésta práctica pretende evaluar la actividad de la enzima sobre diferentes parámetros
como la acidez del medio, la temperatura y la concentración de la enzima. Al realizar los
diferentes análisis se obtuvo que a un pH de entre 6 y 7 la enzima presenta un funcionamiento
óptimo. Con respecto a la temperatura la enzima tenía un buen funcionamiento entre los 25 y
30ºC, es decir a temperatura ambiente y al aumentar la concentración de la enzima el porcentaje
de reacción se fue incrementando. La amilasa salival es una enzima muy eficaz al momento de
hidrolizar carbohidratos principalmente amilosa, pues funciona en un rango de pH amplio
además de soportar cambios de temperatura de hasta 40ºC. Por lo tanto, en el desarrollo de esta
práctica se puede concluir que no fuimos muy exactos a la hora de determinar el porcentaje de la
reacción debido a que es una práctica más cualitativa que cuantitativa y debido a esto puede
existir un margen de error relativamente elevado.

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INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos. Los enzimas son
catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente
su velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que sólamente aceleran las que
espontáneamente podrían producirse. Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan
lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o
pH.(1)
Alfa amilasa denominada también ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función
de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, se produce principalmente en
las glándulas salivares (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas,tiene la función de
digerir el glicógeno y el almidón para formar azúcares simples. La digestión del almidón
comienza con la acción de alfa-amilasa salivar, aunque su actividad es poco importante en
comparación con la realizada por la amilasa pancreática en el intestino delgado.(2)Las
propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser proteínas y de actuar como catalizadores.
Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las demás conformaciones
posibles. Así, cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la actividad
catalítica. Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de un enzima
son:pH.temperatura.concentracion(3)

El efecto del ph sobre la actividad enzimática menciona que las enzimas poseen grupos
químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas
laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica
positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus
cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad
catalítica. Este es el llamado pH óptimo.(3)

En cuanto al efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática se presenta en los aumentos

de temperatura que aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento, la velocidad
de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin
embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el
calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura
óptima.(2)El efecto de las concentraciones sobre la actividad enzimatica se menciona a la
velocidad de una reacción enzimática que depende de la concentración de sustrato. Además, la
presencia de los productos finales puede hacer que la reacción sea más lenta, o incluso invertir su
sentido.(1)

El objetivo general de la práctica fue evaluar la dependencia de la reacción enzimática con

respecto a la acidez del medio, la temperatura y concentración de la enzima. Los objetivos
específicos fueron: a) Preparar las distintas soluciones para la evaluación de las variables que
influyen en la actividad catalítica de la enzima en cuestión) Identificar de manera cualitativa los
distintos cambios que se presentan la enzima al ser sometida en diferente pH, temperatura y
concentración ;c)Tabular los resultados obtenidos de las distintas variables que influyen en la
actividad catalítica.

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METODOLOGÍA
Para la evaluación del cambio de pH sobre la actividad de la enzima se prepara 8ml de solución
de saliva al 25% tomando 2 mL de saliva sin espuma y completando hasta 8 mL con la solución
salina. A continuación se realiza un pre-tratamiento incubando en el baño maría 1 mL de la
solución de saliva al 25% en los buffers de diferentes pH (4, 7, 10),se dispone de 4 tubos de
ensayo y adicione el buffer respectivo a cada tubo y la solución de saliva (excepto al tubo # 4).
Colocar los tubos a 37 °C durante 5 minutos. Una vez pasados los 5 minutos, adicionar a cada
tubo 2 mL de la solución de almidón y 1 mL de solución de salina. Coloque nuevamente los
tubos a 37 °C durante 5 minutos. Posteriormente agregue 3 gotas de Lugol a cada tubo y mezcle
por inversión suavemente. Observar el grado de intensidad del color azul (complejo amilosa-I2)
en cada uno de los tubos y complete la siguiente tabla en la columna % Intensidad que indica el
% de intensidad de color azul (Si en el tubo aparece un color café marrón, el complejo formado
es amilopectina-I2 y debe registrarse como 0 para amilosa).La intensidad de color se mide en %,
siendo 0 el tubo de ensayo incoloro y 100 el tubo de coloración completamente oscura.
Finalmente se calcula el porcentaje de reacción (% Reacción) empleando la siguiente ecuación:
% Reacción = 100 - % Intensidad
En cuanto a la evaluación del cambio de concentración de la enzima sobre la reacción de
hidrólisis de la amilosa;Se prepara 7 soluciones acuosas con las siguientes concentraciones de
saliva: 50%, 25%, 12.5%, 6.2%, 3.1%, 1.6%, 0.8% aproximadamente, para lo cual proceda como
se explica a continuación: Solución 50%: tome 1 mL saliva sin diluir y adicione 1 mL de
solución salina. Solución 25%: tome 1 mL saliva 50% y adicione 1 mL de solución salina.
Solución 12.5%: tome 1 mL saliva 25% y adicione 1 mL de solución salina. Solución 6.2%:
tome 1 mL saliva 12.5% y adicione 1 mL de solución salina. Solución 3.1%: tome 1 mL saliva
6.2% y adicione 1 mL de solución salina. Solución 1.6%: tome 1 mL saliva 3.1% y adicione 1
mL de solución salina. Solución 0.8%: tome 1 mL saliva 1.6% y adicione 1 mL de solución
salina. Posteriormente disponer 7 tubos de ensayo y márquelos con su número respectivo.
Adicionar a cada uno 2mL de buffer 7.0 ;1 mL de solución salina 0.85% y 2 mL de almidón al
5%. Incube los tubos a 37 °C durante 5 minutos. A cada uno de los tubos agregue 1 mL de
solución de saliva en la concentración respectiva, coloque a 37 °C por 5 minutos más, agite por
inversión un par de veces. Una vez pasados los 5 minutos, adicione 3 gotas de Lugol a cada tubo.
Mezcle por inversión suavemente. Observar el grado de intensidad del color azul (complejo
amilosa-I2) en cada uno de los tubos y complete la tabla de resultados.
Por último la evaluación del cambio de temperatura sobre la actividad de la amilasa se determinó
al preparar 4 ambientes de temperaturas diferentes: - Un baño de hielo (4 °C) - Temperatura
ambiente (medir con termómetro) - Un baño termostatizado a 37 °C. - Un baño de agua
hirviendo (94°C).Se realiza un pretratamiento a la enzima incubando en 4 tubos de ensayo 1 mL
de la solución de saliva al 25% y 4 ml de Buffer pH 7.0. Llevar cada uno de los tubos a las
temperaturas previamente indicadas, durante 5 minutos. Posteriormente, deje cada uno de los
tubos a temperatura ambiente (colocar en baño de agua a temperatura ambiente). Luego agregue
a cada tubo 2 mL de la solución salina y 4 mL de solución de almidón. Temperar los tubos a 37
°C durante 5 minutos más y agite por inversión un par de veces. Finalmente, adicione 3 gotas de
lugol a cada tubo, agite suavemente y registre la intensidad del color azul (% Intensidad), en la
en la tabla de resultados.

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RESULTADOS
A: Resultados de la evaluación del cambio de pH sobre la actividad de la enzima

%𝑹𝑿𝑵 = 𝟏𝟎𝟎 − %𝑰𝑵𝑻

Tabla 1. Evalacion del cambio de ph sobre la actividad de la enzima

Tubo pH Buffer Solución NaCl Almidon Lugol %INT %RXN
(ml) de saliva 0,9% 1% (ml) (gotas)
(ml) (ml)
1 4.0 2 1 1 2 3 90 10
2 7.0 2 1 1 2 3 0 100
3 10.0 2 1 1 2 3 25 75
4 7.0 2 - 1 2 3 100 0

Tabla 2. Evidencia de resultados obtenidos

IMAGEN DESCRIPCION

Solución de Amilasa preparada con 2mL de

saliva y 6mL de solución salina, para
proceder a realizar la prueba

Solucion de amilasa a baño maría con la

adición de soluciones buffer de Ph 4, 7 10 y
un tubo de Ph 7 sin solución de amilasa

Resultado final de la solución de Amilasa,

para comparar sus tonalidades es necesaria
la adición de 3 gotas de lugol a cada tubo,
los resultados se miden en % e dependencia
de la intensidad de tonalidad azul que
presenten

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1) Realice una gráfica dé %reacción vs pH

% Reacción Vs. pH
120
100
% Reacción

80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12
pH

Grafica 1. gráfica dé %reacción vs pH

2) De una explicación de como el pH afecta la actividad catalítica de la enzima, ¿Cuál es el pH

óptimo obtenido en el experimento?
El pH no afecta a la actividad catalítica de la enzima directamente sino que modifica la
concentración de protones. Por lo tanto cualquier cambio brusco de pH, puede alterar el carácter
iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, sabiendo que las enzimas son
proteínas, afectando así las propiedades catalíticas de la enzima. A pH alto o bajo de producir la
desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación. El pH óptimo obtenido en el
experimento de la enzima se da en un pH entre 6 y 7 aproximadamente ya que se utilizó pocos
pH.

3) ¿Cuál será la funcionalidad del tubo nº4 durante la evaluación de la actividad catalítica de
la enzima, es un control positivo o negativo de la reacción de hidrolisis de amilosa?

La funcionalidad del tubo nº4 sirve como un control que se da negativamente de la reacción de
hidrolisis de amilosa, ya que indica la ausencia de la amilasa salival con la formación del
complejo colorado ya que al añadir el yodo con la amilosa se forma un color azul intenso.

4) ¿Cuál es la función del NaCl 0.9% en los experimentos realizados?

La función del NaCl 0.9% en los experiemntos se utiliza como cofactor para que se active y con
esto realizar la catálisis. Por esto se usó el ion metalico Na+ ya que hace posible que la enzima
pueda activarse y realizar su respectiva reacción en la hidrolisis de la amilosa.

5) ¿Explique a qué se debe la formación del color azul o marrón en algunos de los tubos,
consulte las estructuras de los complejos coloreados?

La formación del color azul o marron en algunos tubos se debe a la formación de complejos
coloreados que nos da la amilosa que no fue hidrolizada por la α-amilasa junto con el yodo.

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 Figura 1. Estructura de la amilosa

Figura 1. Estructura del complejo Yodo-amilosa

B: Resultados evaluación del cambio de concentración de la enzima sobre la reacción de
hidrolisis de la amilosa

Tabla 3. Evalacion del cambio de concentarcion de la enzima sobre la reacción de

hidrolisis de amilosa

Buffer Almidó NaCl Amilasa % Lugol %

%Reac
Tubo pH 7.0 n 1% 0.9% (mL) SALIV (gotas) Intenc
ción
(mL) (mL) (mL) A idad
1 2 1 1 1 50 3 0 100
2 2 1 1 1 125 3 17 83
3 2 1 1 1 112.5 3 34 66
4 2 1 1 1 16.2 3 51 49
5 2 1 1 1 13.1 3 68 32
6 2 1 1 1 11.6 3 85 15
7 2 1 1 1 10.8 3 100 0

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 Tabla 4. Evidencia de resultados obtenidos
IMAGEN DESCRIPCION

Preparación de diluciones de solución de

Amilasa en concentraciones de 50; 25;12.5;
6.2; 3.1; 1.6 y 0.8 % para llevarlos a baño
Maria

Soluciones de Amilasa luego de 3 minutos

en baño maria, podemos notar un cambio
ligero de tonalidad en las soluciones.

Resultados finales de la prueba luego de

añadir lugol, se debe analizar la intensidad
de color azul en cada uno de los tubos la
concentración del color es directamente
proporcional a la conentracion de la
solución de Amilasa

Realice la grafica de “% reacción vs concentración de enzima

% Reacción Vs. Concentración de la

enzima
120
100
% Reacción

80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentracion de la enzima

Grafica 2. Gráfica dé % Reacción Vs. Concentración de la enzima

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1) ¿Cómo se interpretan los resultados en términos de la reacción de hidrolisis de amilosa y de
la concentración de amilasa?¿cual concentración de la enzima fue la de mayor actividad?

En los resultados que se obtuvieron en la pracitca el porcentaje de reacción junto con la

concentración enzima se puede analizar que a medida que disminuye la concentración de la α-
amilasa salival mayor es el porcentaje de reacción de hidrolisis de la amilosa, es decir si presenta
un color café marron este seria 0 para amilosa por lo que el porcentaje de reacción de hidrolisis
de la α-amilasa salival aumenta proporcionalmente con la concentración de enzima.

C : Resultados evaluación del cambio de temperatura sobre la actividad de la amilasa

Tabla 4. Evaluación del cambio de temperatura sobre la actividad de la amilasa

Almido NaCl Saliva % saliva Lugol Temp %In
Tub Buffer %Rea
n 0.5% 0.9% (mL) (gotas eratur tensi
o pH 7.5 cción
(mL) (mL) a (ºC) dad
1 4 4 2 1 25 3 4 100 0
4 2 1 25 3 Ambie
2 4 40 60
nte 25

3 4 4 2 1 25 3 37 20 80

4 4 4 2 1 25 3 94 100 0

Tabla 5. Evidencia de resultados obtenidos

IMAGEN DESCRIPCION

Se somete la solución de amilasa

junto con las soluciones buffers a
diferentes temperaturas, en este
caso en Hielo a 94, 25 y 37 grados
centígrados

Resultados finales, la coloración

azul es directamente proporcional
a la temperatura es decir a mayor
temperatura mayor intensidad

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 1) Realice una grafica de “% reaccion vs temperatura”

Temperatura vs % Reacción
90
80
70
60
% Reacción

50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temperatura

Grafica 3. Gráfica dé % Reacción Vs. temperatura

2) ¿En cuál temperatura la actividad de la enzima fue máxima’ y ¿en cuál fue mínima’, ¿
cómo se puede explicar el comportamiento de la enzima con respecto a los cambios de
temperatura

Se puede observar que se presenta un máximo en el porcentaje de reacción a un rango de

temperatura 25 a 30°C; es decir a temperatura ambiente, esto significa que la enzima α-amilasa
salival tiene mayor porcentaje de reacción en la que su actividad enzimática es máxima, además
la antividad de reacción minima se presenta en condiciones de 0 a 4°C y también de 90 a 100°C.
ya que si la temperatura aumenta también se disminuye el porcentaje de reacción de la enzima
en trasformar el sustrato porque el calor empieza afectar el funcionamiento de la enzima hasta
desnaturalizarla por completo por lo que se pierde las interacciones del sustrato con la enzima.

CONCLUSIONES
 Se preparó las distintas soluciones que sirvieron de manera muy eficiente a la
hora de aplicar y evaluar la manera cómo influye la actividad catalítica de la
enzima sobre la amilosa para los distintos ensayos realizados.
 Se identificó cualitativamente dependiendo de la intensidad del color de las
distintas además de conocer cómo actúa la amilasa en diferente pH,
temperatura y concentración por lo que se concluye que el pH debe ser estar en

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 un rango neutro, la concentración de la amilasa en valores altos y a temperatura
cercana al ambiente con lo que se obtuvo mejores resultados de parte de la
actividad propia de la enzima.
 Se tabulo todos los resultados obtenidos de manera cualitativa siendo lo más
exactos posibles llegando así a distinguir las distintas variables que influyen en
la actividad catalítica de la enzima sobre la amilosa.

RECOMEDACIONES


BIBLIOGRAFÍA
1. Guerrero A. Enzimas [Internet]. Addi.ehu.es. 2019 [cited 20 November 2019]. Available
from: https://addi.ehu.es/bitstream/handle/10810/14292/4-
%20Cap%C3%ADtulo%20I.%20Las%20enzimas.pdf?sequence=4&isAllowed=y
2 Parada, R. (2019). Alfa amilasa: características, estructura, funciones - Lifeder. [online]
Lifeder. Available at: https://www.lifeder.com/alfa-amilasa/ [Accessed 20 Nov. 2019].
3. Gonzales J. Enzimas. Aspectos generales. [Internet]. Ehu.eus. 2019 [cited 20 November
2019]. Available from: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz1.htm

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