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    Vectores y Extracción de DNA Plasmídico

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    Axel Alarcon
    Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentran en bacterias y otras células. Los plásmidos son separados del cromosoma bacteriano y se replican independientemente de ella. Por lo general, tienen sólo un número pequeño de genes, algunos de ellos asociados con resistencia a los antibióticos.

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    Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentran en bacterias y otras células. Los plásmidos son separados del cromosoma bacteriano y se replican independientemente de ella. Por lo general, tienen sólo un número pequeño de genes, algunos de ellos asociados con resistencia a los antibióticos.

    Título original

    Vectores y extracción de DNA plasmídico

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    Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentran en bacterias y otras células. Los plásmidos son separados del cromosoma bacteriano y se replican independientemente de ella. Por lo general, tienen sólo un número pequeño de genes, algunos de ellos asociados con resistencia a los antibióticos.

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    Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentran en bacterias y otras células. Los plásmidos son separados del cromosoma bacteriano y se replican independientemente de ella. Por lo general, tienen sólo un número pequeño de genes, algunos de ellos asociados con resistencia a los antibióticos.

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    UVM México Ciencias de la Salud

    Práctica No.7: “​VECTORES Y EXTRACCIÓN DE DNA PLASMÍDICO​”


    Nombre: Alarcón Ramírez Brandon Axel
    Asignatura: Biología Celular
    Licenciatura QFBT
    Fecha de entrega: 28 Mayo 2019

    Introducción:
    Plásmidos
    Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentran en
    bacterias y otras células. Los plásmidos son separados del cromosoma bacteriano y se
    replican independientemente de ella. Por lo general, tienen
    sólo un número pequeño de genes, algunos de ellos
    asociados con resistencia a los antibióticos. Los plásmidos se
    pueden transmitir entre las distintas células bacterianas.
    Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas
    ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su
    tamaño varía desde 3 a 10 kb. El número de plásmidos puede
    variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta
    algunos cientos por célula. Los vectores plasmídicos permiten
    clonar ligandos de ADN exógeno de hasta 4 kb ya que un
    tamaño mayor a éste dificulta la clonación en estos vectores. El término plásmido fue
    presentado por primera vez por el biólogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en
    1952. Los plásmidos solo pueden coexistir como una o más copias en cada bacteria, debido
    a la división celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.
    Hay algunos plásmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el
    cromosoma bacteriano. Estos rompen momentáneamente el cromosoma y se sitúan en su
    interior, con lo cual, automáticamente la maquinaria celular también reproduce el plásmido.
    Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.
    Algunos usos
    Los plásmidos se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética por su
    capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal así como
    también porque es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias genéticas.
    Los plásmidos usados en Ingeniería Genética suelen contener uno o dos genes que les
    confieren resistencia a antibióticos y permiten seleccionar clones recombinantes.
    UVM México Ciencias de la Salud

    Objetivo:
    ● El alumno desarrollará la técnica de extracción de DNA plasmídico de una molécula
    recombinante (Escherichia coli DH5-alfa).
    Hipótesis:
    ● Mediante la metodología tradicional de miniPrep demostrar la extracción de DNA
    plasmídico de Escherichia coli DH5-alfa.
    Metodología ( Diagrama de flujo)
    **SE ANEXA HOJA**
    Resultados:

    Resultados Observaciones

    Después de Centrifugación a 13000 rpm se


    observaron dos fases (Acuosa y Orgánica)
    Debido a la mezcla previamente realizada
    de fenol-cloroformo junto con el
    sobrenadante anterior.
    El cual una fase se observa un poco más
    opaca(Orgánica)
    Figura 2: 1ra Centrifugación

    Después del centrifugado a 13000 rpm.

    El botón se observó en el fondo del tubo,


    posteriormente después del drenado de
    etanol y el resuspendido con PBS se
    observó con mayor claridad.

    Figura 3: Obtención del botón de plásmido.

    Discusión:
    El detergente fuertemente aniónico (SDS) estando presente junto con NaOH genera o
    induce a la lisis celular, al igual que también a la desnaturalización del DNA cromosómico y
    de las proteínas además de que durante este proceso se liberan los plásmidos.
    Estos plásmidos debido a su pequeño tamaño y su estructura súper enrollada, no se ven
    tan dañados o desnaturalizados como los demás componentes. Las altas concentraciones
    de sal fueron necesarias para realizar esta desnaturalización, y estas condiciones fueron
    proporcionadas por el acetato de potasio, lo cual generó la precipitación de las proteínas y
    la precipitación del DNA cromosómico.
    UVM México Ciencias de la Salud

    La mezcla de fenol-cloroformo se preparó para la extracción de proteínas de las


    preparaciones de DNA conservado en un pH 6-7, se necesitó un buffer o tampón alcalino
    que cumplió la función de elevar y mantener el pH a 8. Debido a que la densidad del DNA lo
    hace menos soluble en isopropanol, de necesito usar este solvente antes y además a una
    concentración menor para que se pueda disolver.
    El DNA al ser mal soluble en Etanol, el DNA deberá estar a una mayor concentración para
    pueda precipitarse, aunque se beneficia la precipitación debido a que aún existe presencia
    de algunas sales, por lo que el DNA precipita a una concentración de 75% Etanol y 0.5 M de
    sales.
    El EDTA solamente impide la acción de las nucleasas debido a su factor quelante.
    Cuestionario
    1) ¿Qué es un vector de clonación y cuáles son sus componentes?
    Los vectores de clonación o vector molecular son moléculas transportadoras que transfieren
    y replican fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de ADN
    recombinante. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto
    con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de
    reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.
    Todo vector de clonación debe contener los siguientes elementos:
    ● Origen de Replicación: Es la región que codifica para el inicio de la síntesis de DNA,
    el cual le da la cualidad de poder replicarse de manera independiente al DNA
    cromosómico, ya sea en un sistema bacteriano o en un sistema de expresión en
    levaduras.
    ● Agente de Selección: Son genes contenidos en la secuencia del vector, los cuales le
    confieren características adicionales al sistema de clonación (bacterias, levaduras,
    etc.), que permiten la identificación y selección de las clonas recombinantes, es
    decir, clonas que contienen el fragmento de DNA de interés. Ejemplos de esto son
    los genes que codifican para la resistencia a antibióticos, como lo son los de
    resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina, o por el contrario, pueden ser
    marcadores metabólicos como el gen Lac Z, que codifica para la síntesis de la
    enzima beta galactosidasa o marcadores auxotróficos, como lo es el gen que
    codifica para la síntesis de histidina (muy utilizado en los sistemas de expresión y
    clonación en levaduras).
    ● Polilinker o Sitio de Multiclonación: Región contenida dentro de las secuencias de los
    genes que codifican para los marcadores, que contienen múltiples sitios de
    restricción, es decir, múltiples sitios de reconocimiento para las enzimas de
    restricción, que permiten la inserción de los fragmentos de DNA que se desea clonar
    en un sistema.
    ***Observar Figura 4***
    2) ¿Qué es un vector de expresión y cuáles son sus componentes?
    Es una construcción genética que permite la introducción de un gen exógeno determinado en una
    célula diana que sea capaz de expresarlo eficientemente
    ​Estos vectores casi siempre transportan uno o más genes y con frecuencia estos genes son
    responsables por características muy útiles expresadas por la bacteria receptora.
    ***Observar Figura 4***
    3) ¿Qué es un cósmido?
    Los cósmidos son vectores de clonación, que han sido ampliamente usados en la
    elaboración de genotecas de DNA genómicos de gran tamaño, ya que permiten la
    UVM México Ciencias de la Salud

    introducción de insertos de DNA de hasta 45 kb, el doble que los vectores derivados de la
    eliminación de parte del genoma del fago λ, los fagémidos.
    Un cósmido contiene:
    ● Del plásmido, el ori C y un gen de resistencia a un antibiótico, esto depende del tipo
    de plásmido del cual derive y, por tanto puede contener más segmentos como por
    ejemplo el gen LacZ, que permite la selección blanco/azul de las colonias.
    ● Del fago λ, los extremos COS, extremos complementarios del genoma del fago y que
    se emplean para la recircularización del mismo.
    4) ¿Qué es un fagémido?
    Un fagémido, fagómido o fásmido es un tipo de vector de clonación empleado en
    biotecnología, compuesto por un plásmido al que se le ha incorporado el origen de
    replicación de un fago filamentoso (fagos de ácido desoxirribonucleico (ADN)
    monocatenario), de este modo mantiene todas las utilidades de los plásmidos pero además
    tiene la capacidad de producir ADN monocatenario.
    5) ¿Qué es un cromosoma artificial y el tamaño de inserto que se puede introducir?
    Son vectores de transferencia para grandes fragmentos de ADN. Los cromosomas
    artificiales de levadura YAC y, más recientemente, bacterianos BAC y P1 PAC. YAC y PAC
    se utilizan para clonar grandes loci genómicos incluidas las regiones reguladoras, y se han
    utilizado para generar mapas físicos del genoma, identificar genes de enfermedades por
    clonación posicional, y para generar ratones transgénicos para los estudios de expresión
    génica

    6) ¿Qué es una Genoteca?


    Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector al que
    se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la célula o
    tejido.
    7) Defina los términos: transformación, transfección y transducción.

    Transformación:
    Es la alteración genética de una célula resultante de la absorción directa, incorporación y
    expresión del material genético exógeno (ADN exógeno). El ADN exógeno se encuentra en
    el ambiente y se introduce a través de la membrana de la célula. La transformación ocurre
    de forma natural en algunas especies de bacterias, aunque también se puede efectuar por
    medios artificiales. Para que ocurra la transformación, la bacteria debe estar en un estado
    de competencia, lo que puede ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a las
    condiciones ambientales, tales como la falta de nutrientes y una densidad celular elevada.
    Transfección:
    Es el proceso de transferencia de material genético entre una célula procariota (bacteria o
    arquea) donadora y una receptora mediante el contacto directo o una conexión que las
    una.Descubierta por Joshua Lederberg y Edward Tatum en 1946, la conjugación es un
    mecanismo de transferencia horizontal de genes como la transformación y la transducción,
    con la diferencia de que estos últimos no involucran contacto intercelular.
    La información genética transferida a menudo beneficia al receptor. Las ventajas pueden
    incluir resistencia antibiótica, tolerancia xenobiótica o la capacidad de usar nuevos
    metabolitos
    Transducción:
    Es un proceso mediante el cual el ADN es transferido desde una bacteria a otra mediante la
    acción de un virus. También se utiliza para designar al proceso mediante el cual ADN
    exógeno es introducido en una célula mediante un vector viral. Esta es una herramienta que
    usualmente utilizan los biólogos moleculares para introducir en forma controlada un gen
    extraño en el genoma de una célula receptora.
    UVM México Ciencias de la Salud

    Figura 4: Vector de clonación y de expresión.


    Referencias:
    ● Segal, K. C. A., & Universidad Nacional Autónoma de México. (2005). Manual de
    prácticas biología molecular de la célula I. México: UNAM, Facultad de Ciencias.

    ● Armendáriz, B. J. S., Sandoval, R. A. S., & Armendáriz, B. J. S. (2013). Biología


    molecular [recurso electrónico]: Fundamentos y aplicaciones para las ciencias de la
    salud. México: Mcgraw-Hill Interamericana Editores, S.A. de C.V.

    ● Luque, J., y Herráez, Á. Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética.


    Ed. Harcourt, 2001.

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