“USO Y CUIDADO DEL ESPECTROFOTÓMETRO DE

ABSORCIÓN UV-VISIBLE
OBTENCIÓN DEL ESPECTRO DE AZOSULFAMIDA
CURVA DE RINGBOWN 2019

1.- OBJETIVOS necesarios

 Operar correctamente el espectrofotómetro de absorción UV-Visible

MODELO GENESYS 10S UV-VIS MARCA THERMO SCIENTIFIC.
 Adquirir experiencia en la obtención de espectros de absorción.
 Demostrar la interacción de la energía radiante y la materia a través de
los espectros de absorción.
 Determinar la longitud de onda óptima de la sustancia y sus aplicaciones
analíticas.
 Determinar la zona de trabajo y la concentración óptima.

2. FUNDAMENTO

Las radiaciones ultravioleta y visible tienen en común el que la absorción en

ambas regiones provoca la excitación de electrones a niveles de energía
superiores. Para excitar a los electrones fuertemente unidos se requiere, en
general fotones energéticos (de longitud de onda corta), mientras que los
electrones unidos lábilmente (deslocalizados) pueden excitarse con radiación
de longitud de onda más larga.1

La mayor parte de los trabajos analíticos se realizan con soluciones de manera

que vamos a desarrollar la relación que existe entre la concentración de la
solución y su capacidad de absorber radiación. 2

Para poder comprender e interpretar los espectros electrónicos de absorción es

preciso tener en cuenta que tipo de transiciones electrónicas pueden tener
lugar cuando se absorbe radiación ultravioleta o visible. En esta región pueden
darse seis tipos de bandas de absorción (sin tener en cuenta los espectros de
resonancia de carga y resonancia electrónica de los iones y radicales orgánicos
inestables) que se deben a las transiciones electrónicas siguientes: π >> π*;
n >> π*; σ >> σ*; n >> σ*, de trasferencia de carga y transiciones de campo
ligando. Los distintos tipos de transiciones pueden identificarse claramente por
la zona del espectro donde aparecen, por sus intensidades relativas y, en
algunos casos por los desplazamientos observados al variar el disolvente. 3
Las intensidades de absorción suelen expresarse en términos de
absortividades molares.
 ϵ = A/bC
Siendo:
A= Absorbancia
b= camino óptico, en cm
C= concentración molar

El valor de la absortividad molar depende del tamaño de la especia absorbente

y de la probabilidad de la transición Para que haya interacción, el fotón debe
chocar con la molécula dentro de un espacio de dimensiones aproximadas al
tamaño de la molécula y la probabilidad de la transición es proporcional al
número de impactos que producen absorción. 3

Fundamento de la espectrofotometría de absorción UV-VISIBLE

3. PARTE EXPERIMENTAL

MATERIALES:

Equipos y reactivos:

 Espectrofotómetro UV – Visible: Modelo GENESYS 10S UV- Visible

 Cubeta de Cuarzo de 1cm
 Solución estándar de Azosulfamida 500µg/ml
 Pipetas de diferentes volúmenes
 Fiolas de diferentes volúmenes
 Agua destilada
 Propipeta
4 CÁLCULOS

Con ayuda del espectrofotómetro GENESYS 10S UV-VISIBLE se determinó el

%Transmitancia, mientras que para el cálculo de las Absorbancias se usó la
siguiente fórmula: 2-log (%T), esto para graficar la curva espectral. La curva
espectral nos determina la longitud de onda máxima para nuestra sustancia. Se
completó el siguiente recuadro para una solución de azosulfamida de diferentes
concentraciones:

Concentración 1 Concentración 2
λ(nm) %T A λ(nm) %T A
450 43.3 0.364 450 62.2 0.206
455 41.3 0.384 455 61.2 0.213
460 38.3 0.417 460 59.6 0.225
465 34.7 0.460 465 57.5 0.240
470 30.9 0.510 470 55 0.260
475 27.1 0.567 475 52.5 0.280
480 23.6 0.627 480 49.8 0.303
485 20.5 0.688 485 47.3 0.325
490 17.9 0.747 490 44.8 0.349
495 15.5 0.810 495 42.5 0.372
500 13.7 0.863 500 40.5 0.393
505 12.2 0.914 505 38.8 0.411
510 11 0.959 510 37.3 0.428
515 10.1 0.996 515 36.2 0.441
520 9.5 1.022 520 35.4 0.451
525 9.3 1.032 525 35 0.456
530 9.2 1.036 530 35 0.456
535 9.5 1.022 535 35.4 0.451
540 10.3 0.987 540 36.4 0.439
545 11.3 0.947 545 37.7 0.424
550 12.9 0.889 550 39.7 0.401
555 15.2 0.818 555 31.8 0.498
560 18.2 0.740 560 45.3 0.344
565 22.1 0.656 565 48.7 0.312
570 26.7 0.573 570 52.4 0.281
575 31.9 0.496 575 56 0.252
580 37.6 0.425 580 59.6 0.225
585 43.5 0.362 585 53.2 0.274
590 49.3 0.307 590 66.3 0.178
595 54.9 0.260 595 69.2 0.160
600 60 0.222 600 70.5 0.152
La curva de Ringbown nos determina la concentración óptima y la
concentración mínima y máxima, es decir la zona de trabajo. Para ello se
calculó las Absortancias de la azosulfamida de diferentes concentraciones,
usando la fórmula Absortancia = 100 - %T. Se completó el siguiente recuadro:

Diferentes concentraciones
[ ] µg/ml %T A
0.1 95.6 4.4
0.5 98.9 1.1
1 90.1 9.9
2 83.5 16.5
4 60 40.0
6 61.1 38.9
8 85.4 14.6
10 44.2 55.8
15 28.9 71.1
20 24.6 75.4
30 12.7 87.3
40 8 92.0
50 2.4 97.6
80 0.3 99.7
100 0.1 99.9

5. RESULTADOS

Con los datos obtenidos se obtienen las siguientes gráficas:

%T vs Longitud de onda

Curva Espectral De Azosulfamida

Absorbancia vs Longitud de onda

En esta gráfica se observa que en la solución de concentración 2 existen 2
picos, mientras que en la solución de concentración 1 no observamos ningún
pico.

La aparición de estos picos puede deberse a posibles causas:

 interacción del operador y el aparato de medición

 condiciones experimentales fluctuantes
 variabilidad inherente en los instrumentos de medición
 una calibración incorrecta del instrumento de medición
 un error consistente en el uso del instrumento
 condiciones experimentales inadecuadas

También podemos observar que en la soluciónes de concentración 1 y 2 la

longitud de onda óptima es de 530nm.

Curva de Ringbown

Según el gráfico se determina una concentración óptima de 9.5µg/ml y una

zona de trabajo que va desde 1.6 a 50µg/ml.

6. DISCUSION
El registro de la variación del coeficiente de absortividad molar є, o de la
absorbancia A, o de la transmitancia T, en función de la longitud de onda
da origen a lo que se denomina " espectro " o curva espectral de una
sustancia química e indica las características de absorción de dicha
sustancia con relación a la longitud de onda. En muchas ocasiones la curva
espectral se presenta como Absorbancia vs longitud de onda y el espectro se
denomina espectro de absorción, o en función de la transmitancia,
denominándose el espectro, espectro de transmisión. 4

En esta práctica se realizó tanto el espectro de absorción como el espectro de

transmisión de la azosulfamida, obteniendo a partir de ella la longitud de onda
óptima, la cual fue de 530nm; esto nos servirá para el trazo de la curva de
Ringbown.

Para obtener el intervalo óptimo y adecuado de concentraciones con el menor

error por lectura primero se construye la curva de Ringbown que consiste en
construir una gráfica de absortancia (100%-T) vs la concentración. 5

Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva

en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de
concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre
absorbancia y concentración.5

En el caso de la curva de Ringbown se obtuvo como concentración óptima

9.5µg/ml aproximadamente, la concentración mínima fue de 1.6µg/ml y la
concentración máxima fue de 50µg/ml.

7. CONCLUSIONES

 El buen manejo y cuidado del espectrofotómetro determina la efectividad

de nuestros resultados al momento de analizar las muestras. Es
indispensable antes de analizar una sustancia calibrar el instrumento,
usando el blanco (solvente) al 100% T.

 Las diferentes sustancias tienen diferentes comportamientos frente las

radiaciones electromagnéticas por lo cual al llevarlas al
espectrofotómetro este nos brinda las absorbancias de cada
concentración de las sustancias.

 La longitud de onda máxima obtenida en las dos concentraciones de

azosulfamida fue de 530nm.

 Determinando la curva de Ringbown podemos demostrar mediante

trazos y rectas en la gráfica, que no todas las concentraciones cumplen
con la ley de Lambert- Beer; es decir, se halla la concentración óptima y
la zona de trabajo óptima (concentraciones mínima y máxima).

8. CUESTIONARIO
1.- Describa cada uno de los sistemas que componen el
espectrofotómetro UV-V. 6

Los cinco componentes esenciales de la radiación UV-VIS instrumentos son los

siguientes.

 Una fuente de radiación estable.

 Selector de longitud de onda.
 Portamuestras.
 Detector o transductor de la radiación.
 Procesamiento de señales y dispositivo de salida.

Fuentes de radiación

Una fuente de radiación

espectrofotométrica debe proporcionar
una salida estable de alta energía en un
amplio intervalo de longitudes de onda.
No hay una fuente barata disponible que
puede proporcionar una salida estable
durante toda la gama de UV-visible (190
nm a 780 nm). Se utilizan normalmente
fuentes continuas para las mediciones
de absorción molecular. Algunos
ejemplos de fuentes continuas
comúnmente utilizados están:
(a) Lámpara de deuterio para el
rango UV. (b) Lámpara de tungsteno
 Las lámparas halógenas de para el rango visible.
tungsteno, que tienen una
temperatura radiante T de 3000 K y por lo tanto tienen un espectro
radiante máximo a una longitud de onda de aproximadamente 1,2 µm;
son ampliamente utilizados en el visible y por encima de los 330 nm.
 Las lámparas de deuterio (lámparas de descarga de gas) que emiten
fuertemente en la región UV por debajo de los 330 nm, el espectro
continuo de deuterio tiene líneas de emisión atómica en superposición.
 Las lámparas de arco de xenón que le dan un continuo que va desde
menos de 190 nm y por encima de 1000 nm.

Selectores de longitud de onda

En las mediciones espectrofotométricas tenemos que usar una banda estrecha

de longitudes de onda de la luz. Esto mejora la selectividad y la sensibilidad del
instrumento. Instrumentos menos costosos usan un filtro para aislar la energía
radiante y proporcionar una amplia banda de longitudes de onda.

En muchas aplicaciones es necesario variar continuamente la longitud de onda

en un rango definido. Esto puede lograrse mediante el uso de
monocromadores.

Compartimientos de muestras
Muestras líquidas
Las muestras líquidas están usualmente contenidas en
celdas fotométricas y estas se ubican en
compartimientos o contenedores especiales. Los
contenedores pueden ser calentados o enfriados con
el fin de controlar la temperatura del líquido en la celda
de muestra.

Muestras gaseosas
Los gases y vapores se miden en celdas para gases
similares a los utilizados para líquidos. Generalmente,
el paso de luz a través de la celda es mucho mayor.
Los gases a cualquier presión se encuentran en celdas
cerradas para su medición. Cubetas o celdas
comúnmente
Muestras sólidas empleadas en
Las muestras sólidas se mantienen en espectrofotometría
compartimientos especiales. Cuando se miden sus UV-VIS.
absorbancias, se experimentan dificultades, por
ejemplo en la adecuación de la muestra y la longitud de los caminos de
referencia.

Detectores

Los detectores se utilizan para convertir una señal luminosa a una señal
eléctrica que puede ser adecuadamente medida y transformada en una salida.
Los detectores usados en la mayoría de los instrumentos generan una señal,
que es lineal en la transmitancia, es decir, que responden linealmente a la
potencia radiante que incide sobre ellos. Los valores de transmitancia se
pueden cambiar logarítmicamente en unidades de absorbancia por una
disposición eléctrica o mecánica en la señal de lectura del dispositivo.

Adquisición y procesamiento de datos

La señal eléctrica procedente del transductor está convenientemente

amplificada o procesada antes de ser enviada a la grabadora para dar una
salida. La resta del espectro del disolvente del espectro de la solución se hace
electrónicamente.

La gráfica de salida entre la longitud de onda y la intensidad de absorción es la

resultante del proceso de sustracción y es característico de la especie
absorbente.
7
2. ¿En qué consiste el calibrado del instrumento?

La calibración de espectrofotómetros consiste en realizar un conjunto de

operaciones que tienen como finalidad determinar la magnitud de los errores
que comete el instrumento al realizar las mediciones, dichos errores son
obtenidos al comparar los resultados de cada medición con los valores
certificados de un material de referencia, tomando en cuenta que las
mediciones son realizadas bajo las mismas o similares condiciones y
empleando la misma metodología. De la calibración se obtiene la
incertidumbre, de esta y de la tolerancia se derivan los factores de corrección
que el instrumento requiere, lo que resulta ser un indicativo de sí el instrumento
demanda o no un ajuste.

Calibración de la longitud de onda: Es la determinación de la exactitud en la

escala de longitud de onda.

Calibración de la escala fotométrica: Similarmente a la calibración de la

escala de longitud de onda, es posible utilizar un patrón para la calibración de
la escala fotométrica, es decir la escala de transmitancia o de absorbancia del
instrumento.

Linealidad de la escala fotométrica: Esta prueba determina la exactitud de

los instrumentos para medir absorbancias con el incremento de la
concentración, evidentemente, los problemas de linealidad en los
espectrofotómetros producen resultados incorrectos.

Ruido fotométrico: El ruido fotométrico es una medición de la relación

Señal/Ruido de un instrumento. Esta prueba es monitoreada como una función
del tiempo, determina la variación entre la absorbancia a través de un periodo
corto tiempo en una longitud de onda establecida.

Estabilidad fotométrica: Este parámetro provee una indicación de cuán

estable es el espectrofotómetro en un amplio tiempo de medición. Es la
diferencia entre el pico mínimo y el pico máximo en un periodo no menor de 1
hora.

Línea base plana: Esta prueba determina las variaciones del valor fotométrico
a lo largo de toda la distribución espectral o en el intervalo deseado con el
compartimiento de muestras vacío.

Ancho de banda espectral: Se compara el ancho de banda espectral

seleccionado por el instrumento y el ancho de banda determinado por cálculo,
cuyo valor corresponde a la diferencia de longitudes de onda del punto medio
de la banda.

Luz extraviada: La luz extraviada es cualquier radiación que llega al detector y

que no posee una longitud de onda similar a la seleccionada. El detector no
puede diferenciar entre la luz extraviada y la luz proveniente de la muestra y
por tanto une ambas señales, dando indicaciones incorrectas.
8
3. ¿Qué es la precisión fotométrica?

Se denomina precisión fotométrica a la medida de la dispersión de una serie de

mediciones de transmitancia o absorbancia alrededor de la media y se expresa
como coeficiente de variación porcentual.

4. ¿A qué se debe la diferencia de los espectros de la sustancia

estudiada?
Uno de los principales factores que determinan la diferencia de un espectro y
otro es la concentración, ya que en nuestro caso se analizó la misma sustancia
pero a dos concentraciones diferentes. Existe una relación directa entre la
concentración de la sustancia y la absorbancia, efectivamente esto se observa
en nuestra gráfica en la cual podemos deducir que aquel espectro que tiene
una absorbancia mayor es la que se encontraba a una concentración mayor.

5. Si se traza la curva espectral de tres soluciones de concentraciones

distintas de una misma sustancia ¿variará la longitud de onda de máxima
absorción? Explique con un ejemplo.

No varía la longitud de onda de máxima absorción, un ejemplo claro está en los

espectros obtenidos en nuestra práctica con azosulfamida, en ella se ve
claramente que la longitud de onda máxima se mantiene; mientras que solo se
evidencia una diferencia en la absorbancias, esto ya se explicó anteriormente
por la relación directa que existe entre la concentración de la sustancia y la
absorbancia.

6. Ubique la zona de trabajo y la concentración óptima de lectura.

La concentración óptima obtenida en nuestra gráfica de azosulfamida fue de

9.5µg/ml aproximadamente.

La zona de trabajo varía de 1.6 a 50µg/ml.

7. De acuerdo a la curva de Ringbown, explique y fundamente ¿a qué se

debe la formación de mesetas, inferior y superior? 9

Para obtener el intervalo óptimo de concentraciones primero se construye la

curva de Ringbom, que consiste en construir una gráfica de absorbancia (100-
%T) vs. Log Concentración. Para la mayoría de los sistemas la curva de
Ringbom corresponde a una curva en forma de S con una meseta superior y
una meseta inferior. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo
de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal
entre absorbancia y concentración. En esta gráfica, se trazan líneas paralelas
en las mesetas superior e inferior, permitiendo realizar los cruces de la parte
recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, los cuales pueden
servir para determinar un valor para los límites de detección mínimo y máximo,
respectivamente.

8. Investigue sobre los principales errores en la lectura de absorbancia

relacionados con la concentración. (Error relativo ΔC/C) y error absoluto
ΔT y la curva de Crackford.

Los errores indeterminados que se producen en la lectura de las escalas de

transmitancia o absorbancia son errores instrumentales siempre presentes y
deben ser tomados en cuenta por todos los usuarios de espectrofotómetros
cuando realizan mediciones cuantitativas. Pequeños errores en la lectura de la
transmitancia o de la absorbancia pueden ocasionar errores grandes en la
concentración cuando se opera en los extremos de la escala.

El error absoluto cometido en la determinación de la concentración, para una

cierto error de lectura de transmitancia, es pequeño, pero al ser pequeña la
concentración, el error relativo puede ser grande. Esto es, el error absoluto en
una concentración es pequeño, ahora bien el error relativo (el error absoluto
dividido por la concentración a determinar) será elevado, dando lugar de nuevo
a poca precisión en la medida de la concentración, intuitivamente se puede
concluir que parece razonable aceptar que los valores intermedios de la
transmitancia son los que darán una precisión óptima, esto explica la
importancia de la gráfica de la curva de Ringbown.

Curva de Crackford:

Si:

(ΔC/C) / ΔT = 0.4343 / T. logT.

A partir de esta última relación se construye la curva del error o curva de

Crawford graficando el valor absoluto de (D C/C) / D T vs. T, tomando
transmitancia entre cero y uno.

Esta gráfica indica que el error depende en forma compleja de la medida de la

transmitancia y para valores muy bajos o muy altos de transmitancia, el error
en la concentración crece exponencialmente, mientras que para valores
intermedios el error permanece aproximadamente constante, presentándose un
mínimo error en la concentración para la transmitancia correspondiente a 0.368
o 36.8 %T.

9. BIBLIOGRAFIA

1. Olsen E. Métodos ópticos de análisis. Espectrofotometría ultravioleta y

visible. Reverte. Barcelona, 1990. Pág. 87-88.

2. Brunatti C, Martín A. Introducción a la Espectroscopía de Absorción

Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano. Medición de
Transmitancia y Absorbancia. Pág 2.

3. Olsen E. Métodos ópticos de análisis. Espectrofotometría ultravioleta y

visible. Reverte. Barcelona, 1990. Pág. 91.

4. Universidad Nacional de Colombia. Establecimiento de un método

espectrofotométrico.URL:
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2001184/lecciones/Cap10/
01_01_01.htm

5. Skoog Douglas, Principios de análisis instrumental. 6ta edición.

CENGAGE, 2007.
6. Datateca.unad. [internet]. Instrumentación de la espectrofotometría UV-
VIS. [Citado 28 de enero de 2016]. Disponible en:
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/401539/exe-2%20de
%20agosto/leccin_5_instrumentacin_de_la_espectrofotometra_uvvis.htm
l
7. Chacón S. Caracterización de un espectrofotómetro Ultravioleta Visible
para ser utilizado en la certificación de materiales de referencia.
[Internet], 2002. Costa Rica. Disponible en:
http://www.lacomet.go.cr/documentosweb/quimica/2011/Publicaciones/sa
ndra.pdf

8. Claudio Duymovich, Rosana Acheme, Sandra Sesini, Daniel Mazziotta.

Espectrofotómetros y Fotocolorímetros Guía práctica de actualización.
[Internet], 2005. Disponible en: http://www.scielo.org.ar/scielo.php?
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9. Blogspot.pe. Gráficas de Ringbown [internet], 2010. [Actualizado 10 de

junio de 2010; Citado 28 de enero de 2016]. Disponible en:
http://rocioeevelyn.blogspot.pe/