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Estudio de la Degradación Enzimática del
Glucósido Amargo Oleuropeína Durante el

Procesamiento de Aceitunas de Mesa
Eva Ma Ramírez Castro
Sevilla, 2015
Índice
Índice 1. INTRODUCCIÓN
.................................................................................................. 1
1.1. Aceituna de mesa: importancia social y económica

................................... 3
1.2. Procesos de elaboración de aceitunas de mesa

........................................... 7
1.2.1. Aceituna verde estilo español

..................................................... 8
1.2.2. Aceituna negra oxidada o estilo californiano

.............................. 11
1.2.3. Aceituna natural en salmuera: verde de color cambiante o
negras naturales al estilo griego

............................................................ 13
1.2.4. Aceitunas deshidratadas

.............................................................. 14
1.3. Compuestos fenólicos en aceitunas

........................................................... 15
1.3.1. Composición fenólica del fruto fresco

........................................ 16
1.3.2. Composición fenólica del fruto procesado

................................. 21
1.3.3. Influencia de los factores agronómicos sobre la

composición
fenólica de las aceitunas

........................................................................ 23
1.4. Enzimas en alimentos

................................................................................ 26
1.4.1. Enzimas oxidoreductasas: polifenoloxidasa (PPO) y
peroxidasa (POD)
.................................................................................. 28
1.4.1.1. Enzimas oxidoreductasas (PPO y POD)
relacionadas con compuestos polifenólicos en aceitunas

.......... 31
1.4.2. Enzimas hidrolasas: β-glucosidasa y esterasa

............................. 33
1.4.1.2. Enzimas hidrolasas (β-glucosidasa y esterasa)
relacionadas con compuestos polifenólicos en aceitunas

.......... 36
1.5. Influencia de los procesos tecnológicos sobre la composición

fenólica
en aceitunas de mesa
......................................................................................... 38
1.5.1. Transformaciones químicas

........................................................ 38
1.5.1.1. Aceitunas verdes estilo español

................................... 39
1.5.1.2. Aceitunas negras oxidadas

........................................... 40
1.5.1.3. Aceitunas naturales en salmuera

.................................. 41
1.5.1.4. Aceitunas deshidratadas

............................................... 42
1.5.2. Transformaciones con intervención enzimática

.......................... 43

................................... 43
1.5.2.2. Aceitunas negras oxidadas y aceitunas naturales

en
salmuera
.................................................................................... 44
1.5.2.3. Aceitunas deshidratadas

............................................... 46
I
Índice 2. OBJETIVOS
........................................................................................................... 49
3. MATERIALES Y MÉTODOS ..............................................................................

53
3.1. Determinación de la concentración de cloruro sódico

............................... 55
3.2. Determinación de la acidez libre, acidez combinada y pH

........................ 55
3.3. Análisis de ácidos orgánicos en salmueras y jugo de aceitunas

................ 56
3.4. Análisis del color superficial de las aceitunas

........................................... 57
3.5. Análisis del color de los jugos de aceitunas

.............................................. 57
3.6. Determinación del contenido de humedad de las aceitunas

...................... 58
3.7. Determinación de la actividad de agua (aw) de las aceitunas
.................... 58 3.8.
Determinación de la textura de las aceitunas
............................................. 58
3.9. Análisis microbiológico

............................................................................. 58
3.10. Análisis de compuestos polifenólicos

...................................................... 59
3.10.1. Preparación de la muestra

......................................................... 59
3.10.1.1. Pulpa de aceitunas

...................................................... 59
3.10.1.2. Salmuera de aceitunas

................................................ 60
3.10.2. Determinación mediante cromatografía líquida de alta
eficacia (CLAE)
.................................................................................... 60
3.11. Análisis de compuestos cloroplásticos

.................................................... 62
3.11.1. Preparación de la muestra
......................................................... 62
3.11.2. Determinación de compuestos cloroplásticos

........................... 63
3.12. Determinación de la actividad enzimática en aceitunas

.......................... 64
3.12.1. Obtención del material enzimático o polvo cetónico

................ 64
3.12.2. Determinación de la actividad de las enzimas
oxidoreductasas: PPO y POD

............................................................... 65
3.12.2.1. Obtención del extracto enzimático

............................. 65
3.12.2.2. Condiciones de reacción para la PPO

........................ 65
3.12.2.3. Condiciones de reacción para la POD

........................ 66
3.12.2.4. Cuantificación de la actividad enzimática

mediante
espectrofotometría
..................................................................... 66
3.12.3. Determinación de la actividad de las enzimas hidrolasas:
β-glucosidasa y esterasa
........................................................................ 67
3.12.3.1. Determinación de la actividad β-glucosidasa

............. 67
II
Índice 3.12.3.1.1. Obtención del extracto enzimático
.............. 67
3.12.3.1.2. Condiciones de reacción para la β-
glucosidasa
.................................................................... 67
3.12.3.1.3. Cuantificación de la actividad

enzimática
mediante espectrofotometría
......................................... 68
3.12.3.2. Determinación de la actividad esterasa

...................... 68
3.12.3.2.1. Obtención del extracto enzimático ..............

68
3.12.3.2.2. Condiciones de reacción para la esterasa

.... 69
3.12.3.2.3. Cuantificación de la actividad

enzimática
mediante espectrofotometría
......................................... 69
3.13. Evaluación subjetiva de la calidad de las aceitunas

................................. 70
3.14. Evaluación de la composición fenólica y actividad enzimática en
fruto fresco
........................................................................................................ 70
3.14.1. Materia prima

............................................................................ 70
3.14.2. Identificación de compuestos fenólicos y actividad
enzimática en fruto fresco

..................................................................... 71
3.14.3. Influencia de la temperatura y pH sobre la actividad de

las
diferentes enzimas estudiadas

............................................................... 71
3.15. Influencia de las enzimas oxidativas en los procesos de

elaboración
de las aceitunas de mesa

................................................................................... 72
3.15.1. Postrecolección
......................................................................... 72
3.15.1.1. Efecto del “golpeado” en aceitunas sobre el
contenido de compuestos fenólicos

........................................... 72
3.15.1.2. Experiencias para la reducción de la formación

de
manchas oscuras debido al “golpeado” durante la
recolección mecanizada en aceitunas verdes estilo españo

....... 74
3.15.1.2.1. Efecto de la recolección mecánica

sobre
la calidad de aceitunas
................................................... 74
3.15.1.2.2. Aplicación de películas protectoras
previas al almacenamiento bajo atmósfera de
nitrógeno. Estudio sobre la calidad de la aceituna
procesada como verde estilo español

............................ 76
III
Índice 3.15.2. Aceitunas verdes estilo español y aceitunas verdes
naturales
en salmuera
........................................................................................... 79
3.15.2.1. Influencia del proceso de elaboración en el

color
de los frutos procesados

............................................................ 79
3.15.2.2. Aceitunas verdes preparadas en condiciones
asépticas
.................................................................................... 80
3.15.3. Aceitunas deshidratadas

............................................................ 81
3.15.4. Nuevo proceso de eliminación del amargor basado en la
eliminación enzimática de la oleuropeína

............................................. 83
3.16. Transformaciones de los compuestos fenólicos durante la

elaboración
de aceitunas verdes naturales

............................................................................ 85
3.16.1. Hidrólisis de la oleuropeína en aceitunas de mesa

.................... 85
3.16.1.1. Hidrólisis química de la oleuropeína

.......................... 85
3.16.1.2. Hidrólisis enzimática de la oleuropeína

..................... 87
3.16.1.2.1. Experiencias para demostrar la
participación de enzimas endógenas en la

hidrólisis
de la oleuropeína durante el almacenamiento de

los
frutos en salmuera
......................................................... 87
3.17.1.2.2. Factores que intervienen en la hidrólisis
enzimática de las aceitunas no tratadas con NaOH

....... 89
3.16.2. Estudios para el diseño de un nuevo proceso de

elaboración

................................................................ 93
3.16.2.1. Inactivación de enzimas hidrolíticas

.......................... 93
3.16.2.2. Estudio de la capacidad hidrolítica de las BAL
sobre la molécula de oleuropeína

.............................................. 94
3.16.2.2.1. Aislamiento de cepas y mantenimiento

....... 94
3.16.2.2.2. Efecto de las cepas de BAL sobre la
concentración de oleuropeína en soluciones modelos

... 95
3.16.2.2.3. Evolución de la oleuropeína durante la
fermentación de aceitunas verdes naturales en
salmuera
......................................................................... 96
3.17. Análisis estadístico

.................................................................................. 98
IV
Índice 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
............................................................................ 99
4.1. Evaluación de la composición fenólica y actividad enzimática en
fruto
fresco
................................................................................................................. 101
4.1.1. Identificación de compuestos fenólicos en pulpa de

aceitunas
frescas
................................................................................................... 101
4.1.2. Enzimas endógenas relacionadas con las

transformaciones de
la oleuropeína
....................................................................................... 113
4.1.2.1. Evaluación de la actividad de las enzimas oxidasas ...

113
4.1.2.2. Evaluación de la actividad de las enzimas hidrolasas .

119
4.1.3. Influencia de la temperatura y el pH sobre la
actividad de las diferentes enzimas estudiadas .............

124
4.2. Influencia de las enzimas oxidativas en los procesos de

elaboración de
las aceitunas de mesa

....................................................................................... 130
4.2.1. Postrecolección
.......................................................................... 130
4.2.1.1. Efecto del “golpeado” en aceitunas sobre el
contenido de compuestos fenólicos

.......................................... 130
4.2.1.2. Experiencias para la reducción de la formación

de
manchas oscuras debido al golpeado durante la

recolección
mecanizada en aceitunas verdes estilo español

........................ 139
4.2.1.2.1. Efecto de la recolección mecánica sobre

la
calidad de aceitunas ......................................................

139
4.2.1.2.2. Aplicación de películas protectoras

previas
al almacenamiento bajo atmósfera de nitrógeno ..........

146
4.2.2. Aceitunas verdes estilo español y aceitunas verdes

naturales
en salmuera: importancia de las transformaciones enzimáticas

de
los compuestos fenólicos en el color de los frutos procesados

............ 156
4.2.2.1. Evaluación de los compuestos clorofílicos de

las aceitunas .............................................................
159
4.2.2.2. Evaluación del contenido fenólico y actividad

PPO ............................................................... 167
V
Índice 4.2.3. Aceitunas deshidratadas: evolución de los
compuestos
fenólicos durante el procesado
............................................................. 174
4.2.4. Nuevo proceso de eliminación del amargor basado en la
oxidación enzimática de la oleuropeína

............................................... 181
4.3. Transformación de los compuestos fenólicos durante la

elaboración de
aceitunas verdes naturales

................................................................................ 191
4.3.1. Hidrólisis de la oleuropeína en aceitunas de mesa

..................... 191
4.3.1.1. Hidrólisis química de la oleuropeína ...........................

191
4.3.1.2. Hidrólisis enzimática de la oleuropeína ......................

195
4.3.1.2.1. Experiencia para demostrar la
participación de enzimas endógenas en la

hidrólisis
de oleuropeína durante el almacenamiento de los
frutos en salmuera ........................................................

196
4.3.1.2.2. Factores que intervienen en la hidrólisis
enzimática de las aceitunas no tratadas con NaOH ......

202
4.3.2. Estudios para el diseño de un nuevo proceso de

elaboración

............................................................... 221
4.3.2.1. Inactivación de enzimas hidrolíticas ............................

221
4.3.2.2. Estudio de la capacidad hidrolítica de las BAL
sobre la molécula de oleuropeína

.............................................. 228
concentración de oleuropeína en soluciones modelo ....

228
concentración de oleuropeína en aceitunas verdes
naturales en salmuera a escala piloto ............................

232
5. CONCLUSIONES
.................................................................................................. 239
6. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................
244
VI
1. Introducción
Introducción 1. INTRODUCCIÓN
1.1. Aceituna de mesa: importancia social y

económica
Los orígenes del olivo (Olea europea L.) se remontan muy atrás en la
historia, la
primera referencia escrita sobre esta planta se encuentra recogida en el libro del
Génesis. Su origen se sitúa posiblemente en la antigua Mesopotamia, siendo los

griegos
y fenicios los responsables de su expansión por todos los países de la cuenca
mediterránea, abarcando Europa, África, Asia Menor e incluso la India. Para los
pueblos
primitivos, el olivo y su fruto han sido siempre símbolo de paz, sabiduría y

progreso, y
el aceite ha sido muy apreciado por sus valores nutritivos y

medicinales.
En España, fueron los romanos quienes dieron continuidad al olivo y lo
extendieron considerablemente a partir del siglo II a. C. Posteriormente, los árabes
intensificaron y perfeccionaron su cultivo, que perduró a lo largo de los siglos. Con

el
descubrimiento de América en el siglo XV, el cultivo del olivo pasó al Nuevo

Mundo, y
actualmente se encuentra extendido en todos los

continentes.
El olivo es uno de los cultivos que más ha influido en la alimentación de los
pueblos del mediterráneo, no sólo porque a partir de su fruto se elabora el

apreciado
aceite de oliva, considerado como alimento básico de la dieta mediterránea, sino

porque
de él se obtiene un excelente aperitivo, la aceituna de mesa, que al igual que el

aceite
tiene gran importancia en nuestra

dieta.
En el siglo I ya existen referencias en España sobre el consumo de

aceitunas de
mesa. Es el caso de los famosos escritos de Columela, donde el gaditano recogía
los
diferentes métodos de preparación: en salmuera, aliñadas con hinojo, con hojas

de
lentisco y vinagre, etc (Columela, 42). La preparación a escala industrial de las

primeras
aceitunas de mesa en España “verdes al estilo español o sevillano” comenzó a

finales
del siglo XIX en la provincia de Sevilla. Desde entonces y hasta ahora, España ha
liderado los mercados mundiales, tanto en volumen de producción como de
comercialización. Actualmente, la aceituna de mesa es muy apreciada en

numerosos
países, en particular como aperitivo, aunque también es consumida en algunos

países
3
Introducción formando parte del desayuno, acompañando a bebidas, como el
Martini, o como
ingrediente y adorno de muchas preparaciones

culinarias.
Según datos del Consejo Oleícola Internacional (COI, 2014), el olivar

mundial
está constituido por unos 850 millones de árboles que ocupan una superficie
superior a
10 millones de hectáreas, de las cuales, más de un millón se dedica a la

producción de
aceitunas de mesa. Se recolectan más de 18 millones de toneladas anuales de

aceitunas,
de las cuales el 90 % es destinado a la producción de aceite y el 10 % restante a
la
elaboración de aceitunas de
mesa.
Atendiendo a la Reglamentación Técnico-Sanitaria Española (BOE, 2001,

2013)
se denomina “aceituna de mesa al fruto de variedades determinadas del olivo

cultivado
(Olea europaea sativa Hoffg, Link), sano, cogido en el estado de madurez

adecuado y,
de calidad tal, que sometido a las preparaciones adecuadas, dé un producto de

consumo
y de buena conservación”.
España es el primer país productor de aceitunas de mesa (Figura 1). En las
últimas cinco campañas la producción media mundial ascendió a 2.472.700

toneladas,
de las cuales, un 21 % se produjo en nuestro país, seguido por otros países como
Turquía, Egipto, Argentina, Siria, Argelia y Grecia, entre otros. Asimismo, España
también es el primer país exportador de este producto, representando el 39 % del

total
de las exportaciones (Figura 1). Estas aceitunas se destinan a más de 150 países,
destacando las exportaciones realizadas a la Unión Europea y Estados Unidos.

Respecto al
consumo de aceitunas de mesa a nivel mundial, los tres mayores consumidores

son
Turquía, Egipto y Estados Unidos, ocupando España el cuarto lugar

(Figura 1).
En España, la producción y exportación de aceitunas se han mantenido
constantes durante las campañas 2007-2013 (Figura 2). La producción media en

los
últimos años (2004-2013) se ha incrementado en un 57 % respecto a la media de

la
década anterior (1994-2003), pasando de 330.057 a 516.919 toneladas. El 68 %

de la
producción española en los últimos seis años se ha exportado al exterior, mientras

que
las importaciones han sido poco importantes y proceden fundamentalmente de

países de
la Unión Europea.
4
Figura 1. Producción, exportación y consumo medio mundial de aceitunas de mesa
durante las últimas campañas (2009-2014 para producción y consumo, 2008-2013 para
exportación). Fuente: Consejo Oleícola Internacional (COI, 2014).
Figura 2. Producción y exportación (millones de kg) de aceitunas de mesa en España
durante el periodo 2007-2013. Fuente: Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio
Ambiente (MAGRAMA, 2014).
Introducción 5
Asimismo Andalucía es la comunidad autónoma con mayor producción de
aceitunas de mesa en España, de hecho durante la campaña 2012-13 representaba un
75,4 % de la producción nacional, seguida en menor medida por Castilla-La Mancha
(6,5 %), Cataluña (4,3 %), Comunidad Valenciana (4,2 %) y Extremadura (4,1 %). En
Andalucía, Sevilla es la provincia con mayor producción, representando más de la
mitad
regional (74,1 %), seguida a mucha distancia de Córdoba y Málaga. (Figura 3).
Figura 3. Producción nacional de aceitunas de mesa por comunidades autónomas (CC
AA) y en Andalucía durante la campaña 2012-2013. Fuentes: MAGRAMA y Agencia
de Información y Control Alimentarios (AICA, 2014).
Las principales variedades utilizadas para la elaboración de aceitunas de mesa
son Hojiblanca, Manzanilla, Gordal, Cacereña, Carrasqueña y Aloreña, entre otras,
siendo las dos primeras variedades las más empleadas, seguidas de la variedad
Gordal
(Figura 4).
De otra parte, el olivar es uno de los cultivos que más empleo genera en España.
En Andalucía, el sector de la aceituna, puede originar en una campaña 19 millones de
jornales, siendo el sector que más puestos de trabajo produce en esta Comunidad
Autónoma, de los cuales, el 15,3 % corresponden a la aceituna de mesa. Según datos
de
MAGRAMA durante la campaña 2013-2014, 412 empresas se dedicaron al entamado
de aceitunas y 270 al envasado, localizándose en Andalucía el 52 % de las
entamadoras,
Introducción 6
de las cuales 131 se localizaron en la provincia de Sevilla (62,4 %), 34 en Córdoba
(16,2 %), 31 en Málaga (14,8 %), 7 en Jaén (3,3 %), 2 en Almería (1 %), etc.
Igualmente, el 43 % de las envasadoras se localizan en la Comunidad Andaluza, de las
cuales 50 se localizaron en la provincia de Sevilla (44,6 %), 22 en Málaga (19,6 %), 15
en Córdoba (13,4 %), 10 en Jaén (8,9 %), 7 en Granada (6,3 %), 3 en Almería (2,7 %),
etc.
Figura 4. Producción media nacional de las variedades más empleadas para la
elaboración de aceitunas de mesa durante la campaña 2013-2014. Fuente: AICA
(2015).
La aceituna de mesa es un producto que necesita un alto grado de manipulación,
que se vende en pequeños formatos y que, por tanto, genera más de 8000 puestos de
trabajo directo y aporta más de 1200 millones de euros al PIB nacional.
1.2. Procesos de elaboración de aceitunas de mesa
La aceituna es un fruto que, a diferencia de otros empleados para encurtidos,
tiene el inconveniente del intenso sabor amargo debido a la presencia del glucósido
oleuropeína. Por ello, uno de los principales objetivos de los procesos de elaboración
consiste en la aplicación de diferentes tratamientos que eliminen total o parcialmente
Introducción 7
Introducción dicho compuesto antes de su consumo, con lo que se obtiene un
producto con unas
características organolépticas
particulares.
La aceituna está compuesta por endocarpo o hueso (20-30 %), en cuyo
interior
se encuentra la semilla, mesocarpo o pulpa (68-86 %) y exocarpo o piel (1-2 %).

Posee
un gran valor nutritivo y su parte comestible está compuesta mayoritariamente por

agua
(56-88 %) y grasa (10-24 %), siendo esta última rica en ácidos grasos de interés
nutricional (ácido oléico, ácido linoleico y ácido linolénico), esteroles, tocoferoles y

β-
caroteno. En su composición, también destacan azúcares, aminoácidos esenciales

y
proteínas, minerales, principalmente calcio, magnesio y sodio, además de otros
componentes menores como son pigmentos, ácidos orgánicos, vitaminas y

compuestos
fenólicos. Entre las formas de elaboración más importantes de la aceituna de
mesa destacan
principalmente cuatro: aceitunas verdes estilo español, negras oxidadas o al estilo
californiano, naturales en salmuera y aceitunas deshidratadas

(Figura 5).
1.2.1. Aceituna verde estilo

español
Las aceitunas elaboradas como verdes estilo español es el tipo de

preparación
más popular, siendo España el primer productor y la variedad Manzanilla la más
empleada (Garrido Fernández y colbs., 1997). El proceso de elaboración de estas

aceitunas se encuentra esquematizado en la Figura
5A.
La recolección de las aceitunas se efectúa generalmente durante los meses

de
septiembre y octubre, antes del envero, cuando se alcanza una coloración verde-
amarillenta en la superficie del fruto. Esta etapa se realiza de forma manual, sobre
todo
para las variedades Manzanilla y Gordal, mediante el sistema denominado

“ordeño”, lo
cual supone un elevado coste de mano de obra. Por ello, ya desde los años 60-70
se
viene estudiando la recolección mecánica de las frutos mediante el uso de

vibradores de
troncos o de ramas (Ferguson y colbs.,

2010).
Figura 5. Procesos de elaboración de aceitunas de mesa.

Introducción
9
Introducción El principal problema de la recolección mecanizada es el
oscurecimiento de los
frutos como consecuencia de los golpes que soportan los mismos al ser
recolectados,
siendo la variedad Manzanilla la más propensa a la aparición de estas manchas
(Ferguson, 2006). Se han descrito numerosos métodos para evitar la aparición de

las
mismas: reducción de la fuerza mecánica aplicada con el vibrador (Ferguson,
2006;
Burns y colbs., 2008; Castro-García y colbs., 2015), inmersión de los frutos en
soluciones de hidróxido sódico diluidas del orden del 0,3 % (Ben-Shalom y colbs.,
1978), transporte de los frutos hasta la industria en éstas soluciones, tanto a

temperatura
ambiente como en refrigeración (Kailis y Harris, 2007; Rejano y colbs., 2008),
inmersión de los frutos recolectados en soluciones ácidas (Segovia-Bravo y colbs.,
2011), almacenamiento de los frutos bajo atmósfera controlada de anhídrido

carbónico
(Nanos y colbs., 2002), o bajo atmósfera de nitrógeno (Segovia-Bravo y colbs.,

2012).
Sin embargo, los métodos propuestos hasta ahora no se han implementado a

escala
industrial debido a las dificultades tecnológicas planteadas y falta de eficacia para

evitar
la aparición de estas manchas oscuras que disminuyen la calidad del

producto final.
Tras la recolección, los frutos se colocan en una solución del 1,7-3,5 % de
hidróxido sódico (p/v) conocida como “lejía”, fase denominada “cocido”. En

algunas
variedades como la Manzanilla existe un período de reposo superior a 24 horas

para
evitar el despellejado del fruto. La duración del cocido varía dependiendo de la

dureza
del agua, la concentración de la lejía, la temperatura externa y la variedad del

fruto. Esta
etapa oscila entre 6-7 horas para las variedades Manzanilla y Hojiblanca, y unas
10
horas para la variedad Gordal. Se considera que el cocido finaliza cuando la

solución de
hidróxido sódico ha penetrado en el fruto hasta 2/3 ó 3/4 partes de la pulpa,

midiendo la
distancia desde la piel al

hueso.
A continuación, los frutos se sumergen en agua durante 5-12 horas para

eliminar
el exceso de lejía (lavado). Es recomendable hacer un tratamiento corto de 2-3

horas
seguido de uno largo de 7-10 horas, aunque para evitar la generación de grandes
vertidos se suele reducir el tratamiento a sólo un

lavado.
Finalmente, las aceitunas se colocan en una solución salina del 10-12 % de
cloruro sódico (p/v), donde crecen espontáneamente los microorganismos

responsables
10
Introducción de la fermentación. Durante los primeros días, cuando el pH es
elevado, aumenta la
población de bacilos Gram negativos pertenecientes a la familia de

Enterobacteriaceae.
A medida que el pH disminuye alrededor de 7 unidades, comienza el crecimiento

de
bacterias del ácido láctico o bacterias lácticas (BAL), en especial Lactobacillus
pentosus, y también distintas levaduras cuya presencia se mantiene hasta el final

de la
fermentación (Rodríguez-Borbolla y Rejano, 1979; Lucena-Padrós y colbs.,
2014).
Una adecuada fermentación es fundamental para la obtención de un

producto
con buenas características organolépticas. El crecimiento de bacterias lácticas

puede
verse limitado por diversos factores, tales como una elevada concentración de sal
(Tassou y colbs., 2007), baja temperatura (Rodríguez-Borbolla y Rejano, 1979),

falta de
nutrientes (Montaño y colbs., 2000) o deficientes tratamientos alcalinos. Medina y
colbs. (2008) demostraron que un tratamiento de hidróxido sódico incompleto

posibilita
la formación de compuestos antimicrobianos de origen fenólico que inhiben el
crecimiento de las bacterias lácticas, deteniéndose la fermentación láctica y, por

tanto,
obteniéndose un producto final no

seguro.
Finalizada la fermentación, los frutos son envasados, bien enteros,

deshuesados
o rellenos, siendo habitual su

pasterización.
1.2.2. Aceituna negra oxidada o estilo

californiano
Las variedades de aceituna más utilizadas en España para este tipo de
elaboración son Hojiblanca, Cacereña y en menor proporción Manzanilla. En la

Figura
5B se puede observar el proceso de elaboración de este tipo de
producto.
Los frutos son recolectados durante los meses de octubre y noviembre,

cuando
alcanzan una coloración verde-amarillenta o con ligeras coloraciones moradas. La
recolección se realiza de forma mecánica mediante vibradores para la Hojiblanca,

ya
que no presenta el problema de “golpeado” que aparece en la variedad

Manzanilla, la
cual se recolecta para esta forma de preparación de forma manual aunque con
poco
esmero o, incluso, mecánicamente. El producto comercial, tras este proceso de
11
Introducción elaboración, es una aceituna de color negro y, por tanto, el
golpeado de los frutos tiene
menor importancia desde el punto de vista del color

final.
Los frutos recolectados son recepcionados en las cooperativas o centros de
compra donde se les eliminan las hojas, trozos de ramas, piedras, etc, se lavan,
pesan y
colocan en fermentadores. Las aceitunas se pueden ennegrecer directamente,

algo
inusual, o se conservan durante varios meses para procesarlas a lo largo

del año.
Existen varias opciones para conservar estos frutos, bien empleando un
medio
ácido sin sal bajo condiciones anaeróbicas (2-4 % ácido acético), una salmuera
acidificada con aireación (7-9 % cloruro sódico y 0,4-1,0 % ácido acético) o un

medio
ácido con aireación (1,2-1,6 % ácido acético). Las condiciones aeróbicas evitan el
alambrado y arrugado superficial de las aceitunas que se produce debido a la
acumulación de CO2 en el interior de los frutos como consecuencia de su
desarrollo de levaduras fermentativas (Romero y colbs., 1996). Los

respiración y el
principales
microorganismos que crecen durante el periodo de conservación de las aceitunas
destinadas a negras oxidadas son levaduras, también bacterias acetogénicas en

ausencia
de sal (De Castro y colbs., 2007) y si se alcanzan temperaturas superiores a los

20 oC es
posible la aparición de bacterias lácticas, siempre que la concentración de cloruro
sódico no supere el 7 % (Sánchez y colbs.,

2006).
La etapa principal en este tipo de aceituna de mesa es la denominada de
ennegrecimiento, la cual consiste en la aplicación de sucesivos tratamientos con
hidróxido sódico que se alternan con lavados de agua donde se inyecta aire,
transcurriendo aproximadamente unas 20 horas entre cada tratamiento alcalino

(García
y colbs., 1991). Finalmente, la última solución alcalina habrá penetrado hasta el

hueso
dejando la pulpa a un valor de pH muy elevado, superior a 11 unidades, siendo

conveniente neutralizarla hasta valores de pH inferiores a 8 unidades, bien
mediante
lavados con agua o añadiendo agentes acidulantes (HCl, CO2, etc) (Brenes y
colbs., 1993b).
Las aceitunas van desarrollando a lo largo de estas etapas el color
negro que las

caracteriza, el cual requiere, para quedar fijado en las mismas, un último lavado
con una
12
Introducción sal ferrosa (Brenes y colbs., 1995b; García y colbs., 2001a).
Actualmente, las únicas
sales de hierro permitidas por ley son el gluconato y lactato ferroso, que se
adicionan en
una concentración de 0,10 ó 0,06 % (p/v)

respectivamente.
Las aceitunas después de esta etapa de fijación del color se envasan, bien
enteras, deshuesadas o en rodajas con una salmuera de baja concentración (2 %

cloruro
sódico en el equilibrio) y una pequeña cantidad de sal ferrosa (0,01-0,02 %

gluconato
ferroso). Este es un producto de baja acidez (pH >4,6 unidades) lo que requiere
que se
realice un tratamiento de esterilización antes de ser comercializado para que sea
un
producto microbiológicamente
seguro.
1.2.3. Aceituna natural en salmuera: verde de color cambiante o negras
naturales
al estilo griego
Este tipo de elaboración de aceitunas tiene gran interés internacional

aunque en
España su producción es baja. Se les denomina naturales porque no son

sometidas a
ningún tratamiento con hidróxido sódico (BOE, 2001, 2013) como se observa en la
Figura 5C.
En general, los frutos recolectados se colocan en una solución de cloruro

sódico
de alta graduación (8-16 %), y en algunos casos acidificada con ácido acético.
Durante
su permanencia en la salmuera, los frutos van perdiendo el amargor por difusión

de la
oleuropeína desde el fruto hacia la salmuera. El periodo de conservación varía

entre 7-8
meses durante la cual tiene lugar una fermentación como consecuencia del
crecimiento
de levaduras que le confiere un sabor característico al producto, desaparecen
prácticamente los azúcares, disminuye la textura de los frutos y se produce una

pérdida
del color. Las bacterias lácticas no suelen crecer debido a la elevada

concentración
salina (Tassou y colbs., 2002).

En España, como ejemplo de aceituna verde en salmuera podemos
destacar las
Aceitunas Aloreñas de Málaga, primera aceituna de mesa española con

Denominación
13
Introducción de Origen. Concretamente, las Aceitunas Aloreñas Verdes Frescas
se caracterizan por
una primera etapa de “machacado o partido” de los frutos que permite una difusión
muy
rápida de los nutrientes a la salmuera y el endulzamiento ocurre en apenas unos

días,
trascurrido este tiempo, los frutos se envasan con el aliño típico de la comarca
(tomillo,
hinojo, pimiento, ajo, etc).
Las aceitunas negras naturales al estilo griego tienen una producción baja
en
España debido a la dificultad que presenta la recolección del fruto. Las aceitunas
se
recogen a partir del mes de noviembre, ya maduras, con una tonalidad negra en
toda la
superficie. La Aceituna Negra del Bajo Aragón, variedad Empeltre, es la más

conocida
a nivel nacional. Este tipo de producto, por su carácter natural y sabor aromático,
cada
vez es más demandado. También se elabora este producto en Extremadura con la
variedad Cacereña y en Mallorca con la variedad

Empeltre.
En general, estas aceitunas naturales se envasan enteras, bien en
salmueras
acidificadas, al natural (pH de 4,2 y 7,5 % NaCl) o al estilo Kalamata (acidez 0,75
%
añadida como vinagre y 6,0 % NaCl), o al vacío sin líquido de gobierno. La

seguridad
del producto durante su vida media de mercado se controla mediante

pasterización o por
adición de sorbato potásico al 0,05 %

(p/v).
1.2.4. Aceitunas
deshidratadas
Esta es una forma de preparación muy tradicional aunque focalizada en
mercados locales y mediterráneos aunque el producto es demandado hoy día en

países
del este europeo, junto con Australia y Perú. En España, su producción está
limitada a
zonas de la campiña sevillana donde se suelen aliñar y denominar aceitunas

prietas.
El proceso de elaboración de este producto está descrito en la Figura 5D.

Las
aceitunas se recolectan totalmente maduras con una coloración morada

intensa-negra en
toda la superficie, después de un lavado y escogido por tamaño se colocan capas
alternas de frutos y cloruro sódico.Transcurridos unos 40-60 días, las aceitunas

están
deshidratadas. Posteriormente se lavan y secan a temperatura ambiente,
quedando aptas
para su consumo (Panagou y colbs., 2006; Değirmencioğlu,

2011).
14
urante el proceso de deshidratación las aceitunas pierden
Introducción D
su amargor,
disminuyen su peso, la pulpa se enriquece en sal y al mismo tiempo alcanza una

baja
actividad de agua (0,75-0,85), lo cual asegura su conservación

posterior.
Este tipo de preparación tiene una vida de mercado muy corta y es fácil su
contaminación por microorganismos, fundamentalmente hongos (Panagou y

colbs.,
2002; Değirmencioğlu, 2011). La actual normativa internacional sólo exige para su
consumo seguro que la concentración de cloruro sódico en el producto final sea

superior
a 10 %, expresado como gramos de NaCl por 100 ml de jugo de aceituna (COI,

2004).
Existe otro proceso de deshidratación de aceitunas que no es el tradicional

y
consiste en secar las aceitunas en un tunel de aire caliente (40-50 oC, 17-24 h)
hasta
alcanzar una actividad de agua <0,9 (Marsilio y colbs., 2000; Mantzouridou y
Tsimidou, 2011). A continuación, se envasan generalmente en bolsas de

plástico.
1.3. Compuestos fenólicos en
aceitunas
Los compuestos polifenólicos constituyen un amplio grupo de sustancias

(ácidos
hidroxibenzoicos, ácidos hidroxicinámicos, estilbenos, lignanos, flavonoides, etc),
consideradas metabolitos secundarios de las plantas, con diferentes estructuras

químicas
y actividad, habiéndose estimado en los años 80 en más de 8000 compuestos

distintos
(Harborne, 1989). Son moléculas que poseen al menos un anillo aromático unido a
uno
o más grupos hidroxilo y se pueden encontrar en sus formas simples de bajo peso
molecular o formando agregados poliméricos que contienen varios anillos

aromáticos,
como los taninos condensados (Shahidi y Naczk, 1995). Al ser metabolitos
secundarios,
no son esenciales para el crecimiento, desarrollo o reproducción de la planta

aunque sí
son importantes en la relación que establece la planta con su entorno

(Winkel-Shirley,
2002).
La aceituna es un fruto con un contenido elevado en sustancias de

naturaleza
fenólica. Se estima su concentración en un 2-5 % del total de la pulpa. El

compuesto
mayoritario es la oleuropeína que le imparte amargor a los frutos aunque estas

15
Introducción s ustancias polifenólicas tienen también una gran importancia en el
color, sabor y
propiedades nutricionales de las aceitunas de

mesa.
1.3.1. Composición fenólica del fruto

fresco
Al igual que muchas frutas y verduras, la aceituna contiene una cantidad
importante de polifenoles distribuidos en la piel, pulpa y hueso, los cuales tienen

un
importante papel en la calidad final de los alimentos derivados del fruto, aceite y
aceituna de mesa. La Figura 6 muestra la estructura química de los principales
compuestos fenólicos presentes en las aceitunas

frescas.
De todos los compuestos presentes en la aceituna, la oleuropeína suele

ser el
mayoritario, el más estudiado y el que presenta mayor interés para los diferentes
procesos de fabricación.
Los tratamientos aplicados durante la elaboración de las aceitunas de mesa

se
fundamentan en la eliminación de este glucósido fenólico, ya que es el compuesto
responsable del amargor y el más abundante en la pulpa de las aceitunas frescas,

cuyo
contenido puede alcanzar hasta un 14 % de la materia seca en aceitunas verdes
de
algunas variedades (Amiot y colbs.,

1986).
La oleuropeína se descubrió en aceitunas y hojas de olivo debido a sus
propiedades similares a la de los taninos (Bourquelot y Vintilesco, 1908), aunque

no fue
hasta mediados del siglo XX cuando se caracterizó su estructura completa. La

molécula
de oleuropeína está compuesta por ácido elenólico unido mediante un enlace

éster al
ortodifenol hidroxitirosol y mediante un enlace glucosídico a una molécula de

glucosa
(Panizzi y colbs., 1960).
16
Figura 6. Estructura química de los principales compuestos fenólicos presentes en
aceitunas.
Introducción 17
Figura 6. Continuación.
En la década de los setenta, Inouye y colbs. (1971, 1974) propusieron que la
biosíntesis de los glucósidos secoiridoides como la oleuropeína ocurría a través de la
formación de una molécula llamada secologanina, aunque estos mismos autores
indicaron que esta ruta biosintética debería ser estudiada en mayor profundidad.
Introducción 18
Posteriormente, Damtoft y colbs. (1993, 1995) mostraron su desacuerdo con dichos
investigadores y propusieron que estos glucósidos secoiridoides tienen su origen en el
ácido mevalónico y su formación tiene lugar a través de una ruta metabólica compleja
(Figura 7).
Figura 7. Ruta de biosíntesis de la oleuropeína propuesta por Damtoft y colbs. (1993,
1995).
Estos investigadores demostraron que el ácido deoxi-logánico, el ácido
7-epi-logánico, el ácido 7-cetologánico y la 7-cetologanina son compuestos
intermedios
que se forman en la ruta de biosíntesis del oleósido-11-metil éster, compuesto a partir
del cual se formarían la oleuropeína y otros compuestos similares en la familia de las
oleáceas.
Introducción 19
Introducción Los resultados indicaron que el compuesto 7-cetologanina
es el precursor
inmediato del oleósido 11-metil éster y esto indica que la transformación se ajusta
a una
reacción de una sola etapa siguiendo una oxidación tipo Baeyer-Villiger. La

biosíntesis
del oleósido incluiría la ruptura del anillo ciclopentano. El grupo cetona se oxidaría
obteniéndose un éster y, posteriormente, ocurriría una ruptura en el enlace entre

los
carbonos C7 y C8, formándose un doble enlace entre los carbonos C8 y C9 con la
consecuente eliminación de un átomo de hidrógeno en el C9, lo que daría lugar al
oleósido 11-metil éster. Después tendría lugar una glicosilación, formándose el
compuesto 7-β-1-D-glucopiranosil-11-metil oleósido, el cual se esterificaría con

tirosol
formándose el ligustrósido, que, por hidroxilación, se transformaría en la molécula

de
oleuropeína, lo que indica que la biosíntesis de este glucósido secoiridoide

necesita de
tirosol y no de hidroxitirosol.
Recientemente, Gutiérrez-Rosales y colbs. (2010, 2012) corroboraron la

ruta
biosintética propuesta por Damtoft y colbs. (1993, 1995), aunque dichos autores
especificaron que dicha ruta se mantiene en ausencia de la enzima β-glucosidasa

e
indicaron que la presencia de dicha enzima induce una competencia entre la ruta
catabólica y la ruta metabólica de la oleuropeína en el propio fruto

fresco.
Además de la oleuropeína, en la pulpa fresca de las aceitunas han sido
identificados otros glucósidos tales como demetiloleuropeína (Ragazzi y Veronese,
1973), ligustrósido (Kubo y Matsumoto, 1984), verbascósido (Amiot y colbs.,

1986),
oleurósido (Kuwajima y colbs., 1988), salidrósido (Maestro y colbs., 1994),
hidroxitirosol 4-β-glucósido (Romero y colbs., 2002a), éster del ácido cafeico unido
a
secologanósido (Innocenti y colbs., 2006), así como glucósidos y dímeros de
oleuropeína (Cardoso y colbs.,

2006).
Asimismo, la presencia de otros compuestos fenólicos ha sido descrita en la
pulpa fresca de las aceitunas, como es tirosol, comselogósido (Karioti y colbs.,

2006) y
los ácidos cafeico, p-cumárico y vaníllico (Brenes y colbs., 1992). Son numerosos
también los flavonoides como luteolina 7-glucósido, apigenina 7-glucósido y rutina
(Vázquez y colbs., 1974), así como diferentes tipos de antocianinas, tales como
cianidina 3-rutinósido y cianidina 3-glucósido (Vázquez y Maestro, 1970; Romero y
20
Introducción colbs., 2002b), que son los compuestos responsables del cambio
de color de amarillo a
violeta y negro. Nuzenida y salidrósido son los compuestos mayoritarios presentes

en
semilla de aceitunas (Maestro y colbs., 1994; Silva y colbs.,

2010).
1.3.2. Composición fenólica del fruto

procesado
Los compuestos polifenólicos participan directa o indirectamente en las
características organolépticas del producto final (color, sabor, textura) y

contribuyen a
las propiedades beneficiosas que el consumo de aceitunas de mesa puede

aportar a la
dieta.
El procesado de las aceitunas induce una pérdida importante de la

composición
fenólica, difiriendo ésta enormemente de la existente en el fruto fresco, tanto

cualitativa
como cuantitativamente. En general, después de todas las trasformaciones

ocurridas
según sea el procesado, se comprueba que el perfil fenólico de las aceitunas

elaboradas
mediante tratamiento alcalino (verdes estilo español y negras estilo californiano),

está
constituido principalmente por los fenoles simples, hidroxitirosol y tirosol (Romero
y
colbs., 2004b).
Por otra parte, el perfil fenólico de aquellas aceitunas elaboradas como

naturales
en salmuera, bien verdes o negras, se caracteriza por una mayor riqueza

cualitativa.
Estos frutos contienen fundamentalmente hidroxitirosol y en mucha menor medida
tirosol, salidrósido y verbascósido (Romero y colbs., 2004a; Arroyo-López y colbs.,
2005; Othman y colbs., 2009).
Asimismo, las aceitunas comerciales deshidratadas son ricas en

hidroxitirosol
fundamentalmente y contienen una pequeña cantidad de verbascósido y ácido

cafeico,
dependiendo de la variedad seleccionada (Zoidou y colbs., 2010; Soufi y colbs.,

2014).
En general, la composición en fenoles totales de las aceitunas de mesa
comerciales puede oscilar entre 200-1200 mg/kg de producto (Tabla 1). Además,
en
todas ellas, más de un 90 % de la concentración se debe a la presencia de

hidroxitirosol.
Si se comparan estos valores con los encontrados para el aceite de oliva, se

puede decir
21
Introducción q ue las aceitunas de mesa poseen una concentración similar o incluso
superior,
dependiendo de la forma de preparación, que el contenido polifenólico del aceite de
oliva virgen.
Tabla 1. Composición fenólica de productos comerciales derivados de la oliva (García
y colbs., 2003; Romero y colbs., 2004b).
Fenoles Totales
mg fenoles/20 g de (mg/kg de producto)
producto consumido
Aceite de oliva virgen 400 8
Aceite de oliva 95 1,9
Aceitunas verdes al estilo español 400 8
Aceitunas negras oxidadas 200 4
Aceitunas moradas en salmuera 1200 24
Aceitunas negras naturales en salmuera 600 12
Los compuestos polifenólicos de las aceitunas se han asociado con numerosas
propiedades beneficiosas para la salud, ya que pueden contribuir a la prevención de
algunos cánceres, la diabetes, etc (Loru y colbs., 2009; Kountouri y colbs., 2009; Hao y
colbs., 2010). Además, ejercen un efecto protector contra la degeneración neuronal y
los
daños cardiovasculares (Frankel, 2011; Martín-Peláez y colbs., 2013). Ciertos
investigadores han encontrado una correlación entre el consumo de aceitunas de mesa
y
la prevención de la osteoporosis, atribuyendo este efecto a la presencia de
hidroxitirosol
y tirosol (Coxam y colbs., 2010). Asimismo, está bastante estudiada la capacidad
antioxidante del fenol hidroxitirosol (Malheiro y colbs., 2011).
Precisamente, la Unión Europea ha aprobado recientemente el Reglamento no
432/2012, donde se establece una lista autorizada de propiedades saludables en los
alimentos. Según este Reglamento, se permite indicar en las etiquetas de los aceites
de
oliva la siguiente frase: “Polifenoles del aceite de oliva contribuyen a la protección del
estrés oxidativo de los lípidos de la sangre”. No obstante, esta declaración sólo puede
22
Introducción ser utilizada para aquellos aceites de oliva que contienen al menos
5 mg de
hidroxitirosol y sus derivados (por ejemplo, derivados de oleuropeína y tirosol) por

cada
20 g de aceite de oliva
consumido.
Si observamos los datos obtenidos por Romero y colbs. (2004b), en

referencia al
valor total de compuestos fenólicos en aceitunas de mesa, podemos comprobar

que al
consumir 20 g del producto en la mayoría de las aceitunas de mesa se supera

claramente
el consumo de 5 mg de hidroxitirosol y sus derivados (Tabla

1).
1.3.3. Influencia de los factores agronómicos sobre la composición

fenólica de las
aceitunas La variedad, el índice de madurez del fruto y las prácticas agrícolas
tales como
la irrigación, son los principales factores agronómicos que influyen en la
composición
química de las aceitunas en general y en su perfil fenólico, en particular, con la
consecuente influencia en las características nutricionales y organolépticas de los
productos obtenidos a partir de las mismas: aceite de oliva y aceituna de

mesa.
El principal factor que determina el perfil de compuestos fenólicos de las
aceitunas es la variedad, que está relacionado según algunos autores con la

actividad
enzimática (Gutiérrez-Rosales y colbs., 2010). En las últimas décadas ha tenido

un
elevado interés el conocer el perfil fenólico en los frutos frescos por su repercusión
en el
perfil fenólico del producto final que se obtenga, bien aceite de oliva o aceituna de
mesa. Esta caracterización en el fruto fresco se ha realizado en variedades

italianas
(Esti y colbs., 1998; Briante colbs., 2002), españolas (Romero y colbs., 2002b),
portuguesas (Vinha y colbs., 2005), turcas (Arslan, 2012), griegas (Petridis y

colbs.,
2012), etc.
Sin embargo, la mayoría de los investigadores han centrado sus estudios

sobre
las diferencias varietales en el producto comercial final, bien sea aceite de oliva
(Cimato
y colbs., 1990; Uceda y Hermoso, 2001; García y colbs., 2003; Ramos-Escudero y
colbs., 2015) o aceituna de mesa (Amiot y colbs., 1990; Romero y colbs., 2004b,
Zoidou y colbs., 2010; Medina y colbs., 2012; Malheiro y colbs., 2014). No

obstante,
23
Introducción existen pocos estudios que comparen la composición fenólica de
distintas variedades, en
especial analizando un número elevado de

muestras.
s otro aspecto que influye enormemente en el perfil

El grado de madurez e
fenólico de los frutos. Amiot y colbs. (1986) indicaron que la concentración de
oleuropeína disminuía a lo largo de la maduración de los frutos y aumentaba la de
demetiloleuropeína y glucósidos derivados de la

misma.
Este comportamiento ha sido estudiado posteriormente por numerosos
investigadores, en variedades italianas (Ranalli y colbs., 2009; Cecchi y colbs.,

2013),
tunecinas (Jemai y colbs., 2009), portuguesas (Machado y colbs., 2013) y

españolas
(Gutiérrez-Rosales y colbs., 2010; Romero-Segura y colbs., 2012). Todos estos

autores
coinciden en sus resultados, un aumento del índice de madurez en el fruto está
correlacionado linealmente con una disminución en el contenido total de fenoles

en el
mismo. Asimismo, esta disminución drástica en la concentración de oleuropeína
coincide con un aumento paralelo de la concentración de hidroxitirosol, lo cual

puede
considerarse un indicador de la maduración del fruto (Esti y colbs., 1998; Sousa y
colbs., 2014).
De otra parte, también se produce un aumento con el estado de maduración

de la
concentración total de fenoles como consecuencia de la aparición de las

antocianinas,
cianidina 3-glucósido y cianidina 3-rutinósido (Vázquez y Maestro, 1970; Yorulmaz

y
colbs., 2013), hidroxitirosol 4-β-glucósido (Romero y colbs., 2002a),
demetiloleuropeína y verbascósido en la variedad Arbequina (Gómez-Rico y

colbs.,
2008), además de ciertos flavonoides como la rutina y la luteolina 7-glucósido

(Bouaziz
y colbs., 2004 y 2010), quercetina 7-rutinósido, apigenina 7-glucósido y quercetina

7-
ramnósido (Vlahov, 1992; Yorulmaz y colbs.,

2013).
El estado de maduración de la aceituna también ejerce una gran influencia

sobre
el contenido fenólico del aceite de oliva. Brenes y colbs. (1999) indicaron que en
aceites
monovarietales españoles se observaba una tendencia del hidroxitirosol, tirosol y
luteolina a aumentar su concentración con la maduración de los frutos, mientras

que las
agluconas secoiridoideas disminuían, siendo esta disminución más acentuada en

los
24
Introducción derivados de hidroxitirosol que en los de tirosol (Gómez-Rico y
colbs., 2006). En
general, la concentración de fenoles totales aumenta al principio de la maduración

hasta
llegar a un máximo y luego, en aceites obtenidos de frutos más maduros

disminuye
(Morello y colbs., 2004; Benito y colbs., 2013; Cevik y colbs.,

2014).
Por otro lado, la irrigación es un factor agronómico muy importante en el
desarrollo del fruto que influye también en la composición fenólica de las

aceitunas. Se
ha demostrado en pulpa de aceitunas y en los alimentos que de ellas se obtienen

(aceite
de oliva y aceitunas de mesa) que existe una correlación lineal entre la

disminución en
el contenido fenólico y el aumento en la intensidad del riego (Tovar y colbs., 2002;
Martinelli y colbs., 2012; García y colbs., 2014; Stefanoudaki y colbs.,

2009).
Por otra parte, no todos los compuestos fenólicos se ven afectados de igual
forma por la disponibilidad de agua, encontrándose que mientras los fenoles

simples
aumentan en el aceite con la irrigación (Martinelli y colbs., 2012), otros autores

indican
que los derivados secoiridoides (agluconas de oleuropeína y ligustrósido)

disminuyen
con la misma, y los lignanos (1-acetoxipinoresinol y pinoresinol) no están

influenciados
por el sistema de riego del campo (Romero y colbs., 2002c; Servili y colbs., 2007;
Caruso y colbs., 2014). Asimismo, un aumento de cloruro sódico en el agua de

riego
está relacionado con un aumento en los compuestos fenólicos totales de los

aceites
obtenidos, tanto de fenoles simples como de derivados secoiridoides (Ben Ahmed

y
colbs., 2009; Stefanoudaki y colbs.,

2009).
El área geográfica también es un factor que influye en el perfil fenólico de

las
aceitunas, aunque su interés en investigación se ha centrado fundamentalmente

en la
composición fenólica de los aceites obtenidos de variedades procedentes de

diferentes
zonas, tanto italianas (Ranalli y colbs., 1999), turcas (Alkan y colbs., 2012; Arslan
y
colbs., 2013; Kesen y colbs., 2014) como españolas (Brenes y colbs., 1999;
Criado y
colbs., 2004; Bakhouche y colbs., 2013). Hay pocos estudios sobre la influencia
del área
geográfica sobre en el perfil fenólico de frutos frescos (Gutiérrez-Rosales y colbs.,
2012) y no se conocen trabajos en relación a frutos elaborados como aceituna

de mesa.
25
Introducción Son muchos los factores que inciden en la variable “área
geográfica”: tipo de
suelo, climatología, prácticas agronómicas, etc. Por tanto, es lógico pensar que
existe
una diferenciación fenólica en las aceitunas para la misma variedad dependiendo

de su
localización (Arslan y colbs., 2013). No obstante, los resultados obtenidos hasta

ahora,
en especial con aceite de oliva, no son muy

concluyentes.
Estudios realizados con aceites de la variedad Arbequina indican que su
composición fenólica depende enormemente del área geográfica (Bakhouche y

colbs.,
2013), siendo muy destacable que el contenido en fenoles simples, hidroxitirosol y
tirosol, es muy superior en aceites obtenidos en la zona de Jaén, mientras que los
de
Tarragona son mucho más ricos en derivados secoiridoides (Criado y colbs.,
2004). Sin
embargo, otros investigadores consideran que el área geográfica no es un factor

muy
influyente en el perfil fenólico de los aceites (Brenes y colbs., 1999; Yorulmaz y

colbs.,
2012; Kesen y colbs., 2014).
el olivo es otro factor importante y controlable que afecta a

La fertilización d
la
composición química de los frutos y consecuentemente al producto de él obtenido.

Son
escasos los estudios encontrados en la literatura sobre el efecto de la fertilización

de los
olivos sobre la composición fenólica de los frutos. En general, los investigadores

han
concluido que un aumento en la concentración de nitrógeno en las hojas y los

frutos del
olivo está linealmente correlacionado con una disminución en la concentración de
fenoles totales presente en los aceites obtenidos de dichos frutos (Erel y colbs.,
2013;
Tekaya y colbs., 2013 y 2014).
1.4. Enzimas en
alimentos
Las enzimas son biocatalizadores complejos de gran especificidad y

eficiencia,
producidos por organismos vivos, que aumentan la velocidad de las reacciones

biológicas a través de vías bien definidas. Se encuentran localizadas en el
citoplasma, en
las mitocondrias, en tejidos y fluidos corporales, etc. (Schmidt y Pennacchiotti,

2001).
Algunas de las características de las enzimas incluyen la alta especificidad

de
sustrato y el estrecho rango de temperaturas y pH necesarios para llevar a cabo

su
26
Introducción actividad. La mayoría de las enzimas se desnaturalizan a
temperaturas superiores a 50
oC y son pocas las que muestran desnaturalización a temperaturas inferiores a 5

oC.
Respecto al pH óptimo de actividad, algunas enzimas muestran una amplia

tolerancia a
los cambios de pH, aunque suelen trabajar en un rango estrecho, debido a que
valores
extremos de pH, producen la desnaturalización de la misma. Por tanto, cualquier

cambio
que ocurra en estos factores externos, pueden provocar inestabilidad en la

integridad
estructural de estas proteínas y, consecuentemente, la pérdida de la actividad

enzimática
(Pandey y colbs., 2008).
Son numerosos los estudios científicos que evidencian la importancia de los
procesos enzimáticos en la elaboración y conservación de los alimentos.

Fenómenos tan
importantes como las reacciones de pardeamiento (frutas y vegetales), de
rancidez
(grasas y aceites), de textura (salsa de tomate) son ejemplos muy conocidos de la
intervención enzimática en la definición de las características organolépticas de los
productos alimenticios. Generalmente, la acción enzimática en alimentos se

asocia a un
efecto negativo desde el punto de vista organoléptico del producto. Sin embargo,
del
mismo modo que hay enzimas perjudiciales que deben ser inactivadas, hay otras
que la
tecnología de los alimentos potencia su actividad para una mejora en el acabado

del
alimento, como son enzimas de filtración o de clarificación, enzimas de acción
aromatizante, enzimas proteolíticas, enzimas glucosa-oxidasa, etc (Schmidt y
Pennacchiotti, 2001).
La mayoría de las enzimas se clasifican según el sustrato específico sobre

el cual
actúan aunque también por las reacciones que catalizan, e incluso en base a su
origen
histórico. La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica

introdujo
en 1964 una nomenclatura basada en los denominados números EC. De este

modo, cada
enzima se identifica con cuatro números precedidos por las letras “EC”, el primer
número clasifica según el mecanismo de acción. Actualmente se consideran seis

grupos
principales de enzimas de acuerdo al tipo de reacción catalizada: oxidoreductasas
(EC1), transferasas (EC2), hidrolasas (EC3), liasas (EC4), isomerasas (EC5) y

ligasas
(EC6).
27
1.4.1. Enzimas oxidoreductasas: polifenoloxidasa (PPO) y peroxidasa (POD)
Las oxidasas, son enzimas que catalizan reacciones de oxido-reducción
empleando oxígeno molecular (O2) como aceptor de electrones. En estas reacciones el
oxígeno se reduce a agua (H2O) o a peróxido de hidrógeno (H2O2 ). Son de gran interés
en la industria alimentaria, ya que están relacionadas con fenómenos tan importantes
como el pardeamiento enzimático de los alimentos. Dentro de las oxidasas,
encontramos
las oxidasas cúpricas, como la PPO, y oxidasas férricas, como la POD.
La PPO es una enzima bifuncional que contiene dos átomos de cobre en su
estructura, ampliamente distribuida en la escala filogenética, la cual, en presencia de
oxígeno molecular, cataliza la o-hidroxilación de monofenoles para dar o-difenoles
(actividad cresolasa, EC 1.14.18.1) y además la oxidación de los o-difenoles a o-
quinonas (actividad catecolasa, EC 1.10.3.1) (Martínez y Whitaker., 1995). La doble
reacción de o-hidroxilación y o- oxidación de la PPO se muestra en la Figura 8. La
actividad cresolasa puede variar e incluso ser inexistente dependiendo de la
procedencia
de la enzima, en cambio todas tienen actividad catecolasa.
Figura 8. Reacción de hidroxilación (a) y oxidación (b) catalizada por la PPO (Queiroz
y colbs., 2008).
Las o-quinonas que se generan son muy inestables y rápidamente reaccionan
entre ellas o con aminoácidos y proteínas, polimerizando y dando lugar a pigmentos
marrones o negros responsables de la melanización en animales y del pardeamiento
en
vegetales. La PPO ha sido ampliamente estudiada en muchas especies de plantas,
Introducción 28
Introducción hongos y bacterias, y existe una gran variedad de propiedades
cinéticas y moleculares e
isoformas descritas en diferentes

especies.
Con respecto a su función biológica, la PPO ha sido relacionada con la
maduración de los frutos así como con el estrés biótico y abiótico. Esta enzima ha
sido
localizada en los cloroplastos, concretamente en las membranas inertes de los

tilacoides,
en el citoplasma y en vesículas situadas entre la membrana y la pared celular

(Sommer y
colbs., 1994; Murata y colbs., 1997). En condiciones normales, cuando la célula se
encuentra sana e intacta, la PPO y sus sustratos, los fenoles, se encuentran en
compartimentos separados. Sin embargo, cuando la célula se desorganiza al

envejecer, o
como resultado del daño físico originado durante la etapa de postcosecha o el

procesado
de los frutos o vegetales, las enzimas y sustratos entran en contacto y suceden las
reacciones de pardeamiento descritas

anteriormente.
Éste fenómeno de pardeamiento ha sido ampliamente estudiado en

numerosos
frutos y vegetales, tales como patatas (Langdon, 1987), manzanas (Janovitz-Klapp

y
colbs., 1990) y bananas (Wuyts y colbs., 2006), que poseen altos niveles de
PPOs.
También, esta actividad enzimática ha sido determinada en mora (Arslan y colbs.,
2004), níspero (Ayaz y colbs., 2008), uva (Castellari y colbs., 1997), berenjena
(Concellon y colbs., 2004), tomillo (Doğan y colbs., 2006), alcachofa (Espin y

colbs.,
1997), pera (Franck y colbs., 2007), cereza (Kumar y colbs., 2008), aguacate
(Soliva-
Fortuny y colbs., 2002), etc.
La POD (EC 1.11.1.7) está ampliamente distribuida en la naturaleza y se
encuentra en plantas, microorganismos y animales, donde catalizan la oxidación

de una
gran variedad de sustratos orgánicos e inorgánicos (Pandey y colbs., 2008). En

plantas,
esta enzima está implicada en el desarrollo, diferenciación y protección de los

tejidos
vegetales frente al daño e infección provocada por los microorganismos

patógenos
(Welinder, 1992; O‟Brien, 2000). La POD utiliza como cofactor el grupo hemo y
cataliza reacciones bisustrato de carácter redox, utilizando un peróxido como

sustrato,
generalmente H2O2 , que actua como electrón aceptor, reduciéndose a H2O, y, este
a su vez,
oxida al segundo sustrato, que puede ser un fenol y se forma la quinona
correspondiente (Figura 9).
29
Figura 9. Reacción de oxidación catalizada por la POD (Da Cruz-Vieira y Fatibello-
Filho, 1998).
Las peroxidasas son proteínas que se encuentran en forma glicosilada y
asociadas a la membrana de las células (Civello y colbs., 1995), muestran varias
isoformas y alta resistencia térmica. Debido a esta propiedad y su fácil cuantificación, la
actividad POD residual se utiliza con frecuencia para determinar si el tratamiento
térmico de los vegetales ha sido adecuado (Saravia y colbs., 2007).
La contribución de la POD a la oxidación de los fenoles está limitada por la
disponibilidad de H2O2 . PPO y POD pueden actuar sinérgicamente, mientras la PPO
puede generar H2O2 c omo producto final en la oxidación de ciertos fenoles, la POD
puede utilizar dicho H2O2 como sustrato y oxidar otros fenoles, formándose las
correspondientes quinonas (Espinal, 2010).
En alimentos crudos y procesados la actividad POD se ha asociado con cambios
en el sabor, color, textura y valor nutricional (Civello y colbs., 1995; Saravia, 2010). La
actividad de ésta enzima se ha determinado en frambuesa y fresa (García-Palazón y
colbs., 2004), pimentón (Goodwin y Hertwig, 2003), calabacín (Lebeda y colbs., 1999),
tomate (Lurie y colbs., 1997), higo chumbo (Padiglia y colbs., 1995), uva (Rivera y
colbs., 2004), manzana (Torres y colbs., 2003), etc. Estudios realizados en fresas
muestran que la actividad POD es máxima en frutos verdes disminuyendo con la
Introducción 30
Introducción maduración del fruto (Civello y colbs., 1995). Por el contrario, en
nísperos la actividad
aumenta en frutos maduros (Aydin y Kadioglu,

2001).
En general, el oscurecimiento producido por la acción de estas enzimas es
indeseable en tecnología de alimentos porque causa una apariencia desagradable

y un
flavor inadecuado en los alimentos y, como consecuencia, un rechazo del

consumidor,
lo cual provoca un impacto económico negativo tanto para los productores como
para
las industrias encargadas del procesado (Doğan y colbs., 2008; Kumar y colbs.,
2008).
1.4.1.1. Enzimas oxidoreductasas (PPO y POD) relacionadas con

compuestos
polifenólicos en
aceitunas
Investigadores israelitas fueron los primeros que estudiaron la presencia de
estas
enzimas en aceitunas, en particular en frutos de la variedad Manzanilla

(Ben-Shalom y
colbs., 1977a). Aislaron catecol oxidasa en aceitunas recogidas con coloración

verde y
encontraron actividad oxidativa hacia ortodifenoles aunque no actividad cresolasa.

Esta
enzima tenía un peso molecular aproximado de 42.000 daltons y su actividad se

inhibía
por la presencia de tropolona y, en menor medida, por la sal. También encontraron

que
su actividad disminuía con el avance en la maduración de los frutos (Ben-Shalom

y
colbs., 1977b), lo cual ha sido confirmado posteriormente por otros autores (Goupy
y
colbs., 1991; Hornero-Méndez y colbs., 2002). No obstante, otros investigadores

han
encontrado la tendencia opuesta, un aumento de la actividad oxidasa al aumentar

el
índice de madurez de los frutos (Ebrahimzadeh y colbs., 2003; Ortega-García y

colbs.,
2008).
Estudios realizados en aceitunas de la variedad Picual indicaron la

presencia de
actividad enzimática PPO en los tilacoides del cloroplasto y en las mitocondrias
(Shomer y colbs., 1979). Se ha observado que la actividad PPO es más alta en el
mesocarpio de los frutos en variedades de aceitunas Arbequina y Picual, mientras

que la
mayor actividad POD se encuentra en la semilla (García-Rodríguez y colbs.,

2011),
representando más del 98 % de la actividad POD total de las aceitunas (Luaces y

colbs.,
2007). Por el contrario, hay autores que afirman que la enzima PPO se localiza en
mayor cantidad en la epidermis de los frutos (Ortega-García y colbs.,

2008).
31
Introducción Desde el punto de vista de las aceitunas de mesa, los
investigadores han
mostrado interés en su implicación en el oscurecimiento de los frutos durante la
recolección, en concreto la aparición de manchas oscuras como consecuencia de

los
golpes que sufren los frutos cuando son recolectados (Ben-Shalom y colbs.,
1978).
Sciancalepore y Longone (1984) estudiaron el oscurecimiento de la pulpa

de 5
variedades de aceitunas y lo relacionaron con su contenido en PPO.

Posteriormente,
estos mismos investigadores encontraron que existía una correlación entre el
oscurecimiento de los frutos y el contenido en ortodifenoles en los mismos, así

como
con la actividad de la enzima PPO, aunque no con la actividad de la enzima POD
(Sciancalepore, 1985).
Estudios realizados sobre frutos de la variedad Picual, Verdial, Arbequina y

Frantoio correlacionaron el aumento de la actividad PPO con la disminución en la
concentración de fenoles totales durante la maduración del fruto (Ortega-García y
colbs., 2008; Ortega-García y Peragón, 2009). Sin embargo, estudios más

recientes
indican que la disminución de la concentración de oleuropeína durante la

maduración
del fruto no se corresponde con un incremento en la actividad PPO (Ortega-García

y
colbs., 2010; García-Rodríguez y colbs.,

2011).
Por otra parte, Goupy y colbs. (1991) no encontraron relación entre el
oscurecimiento de la pulpa de 7 variedades de aceitunas y su contenido en PPO,

aunque
sí existía una correlación positiva entre el oscurecimiento y la disminución en la
concentración en oleuropeína. Además, Tzika y colbs. (2009) han indicado que la

POD
endógena de aceitunas no es capaz de oxidar a la

oleuropeína.
Asimismo, estás enzimas oxidoreductasas tiene un gran interés por su
participación en las características organolépticas y nutricionales del aceite de

oliva, uno
de los principales alimentos derivados de la

aceituna.
Estudios sobre la composición fenólica de aceites de oliva vírgenes de las
variedades Manzanilla, Hojiblanca y Picual han demostrado que su concentración
aumentaba al eliminar el hueso de los frutos durante la etapa de molienda, como

32
Introducción c onsecuencia de la disminución de la presencia de POD endógena,
muy rica en la
semilla de los frutos (Luaces y colbs.,

2007).
Un factor determinante para la actuación de estas enzimas es la presencia

de
oxígeno y así se ha confirmado en estudios sobre la etapa de molienda y batido

de la
pasta para la obtención de aceite de oliva. La reducción o eliminación de oxígeno
durante el batido de la pasta evita la oxidación de estas sustancias y, por tanto, da

lugar
a aceites con un mayor contenido polifenólico (García y colbs., 2001b; Servili y

colbs.,
2008).
Recientemente, se ha confirmado en soluciones modelos el papel

fundamental de
la acción de la POD y PPO obtenida de frutos de la variedad Arbequina y Picual

en el
perfil polifenólico final de los aceites de oliva (García-Rodríguez y colbs., 2011).
Además, estos mismos autores han demostrado a escala de laboratorio que la

PPO es
una enzima más implicada en la oxidación de los fenoles durante la etapa de

molienda,
mientras que la POD tiene una mayor influencia durante la etapa de batido de la
masa
de aceitunas (García-Rodríguez y colbs.,
2015).
1.4.2. Enzimas hidrolasas: β-glucosidasa y

esterasa
Los hidratos de carbono son los compuestos orgánicos más abundantes en

el
reino vegetal que intervienen en diversas funciones fisiológicas de la célula, tanto
estructurales como de reserva. Esta diversidad, junto al hecho de que

prácticamente
cualquier tipo de molécula (proteína, lípidos, ácidos nucleicos) pueda ser

glicosilada,
implica la existencia de un amplio espectro de enzimas vinculadas al metabolismo

de
carbohidratos y de moléculas glicosiladas, tanto en su síntesis, modificación e

hidrólisis.
Las glucósido hidrolasas son el grupo de enzimas responsables de la

hidrólisis
de carbohidratos, dentro del cual se encuentran las β-glucosidasas (β-D-
glucósido glucohidrolasas) (EC 3.2.1.21), que constituyen un grupo de enzimas
importantes biológica e industrialmente, ya que catalizan la rotura selectiva de los
enlaces β-glucosídicos entre dos o más residuos glicona o entre la glucosa y un
33
grupo/radical aril o alquil aglicona. La reacción catalizada por la β-glucosidasa se
describe en la Figura 10.
Figura 10. Reacción de hidrólisis catalizada por la β-glucosidasa (Divakar, 2013).
Las β-glucosidasas representan el mayor grupo de glucósido hidrolasas
presentes en todos los organismos vivos desde bacterias a humanos. Estas enzimas
desempeñan una función crucial tanto fisiológica como biotecnológica dependiendo de
la naturaleza y diversidad de la molécula glicona o aglicona de sus sustratos (Hatibe
Ertürk y colbs., 2011). Las β-glucosidasas en plantas desempeñan un papel importante
en el crecimiento, desarrollo, detoxificación, maduración y defensa (Li y colbs., 2005;
Mazzuca y colbs., 2006).
Las β-glucosidasas están implicadas en numerosas funciones biológicas, tales
como la degradación de estructuras y almacenamiento de polisacáridos, actúan como
marcadores celulares e intervienen en procesos de oncogénesis.
La activación de compuestos químicos procedentes del metabolismo secundario
que intervienen en el mecanismo de defensa de la planta es la función de estas
enzimas
más estudiada en el ámbito de la alimentación, dado que algunos metabolitos
secundarios como los compuestos fenólicos, tienen una gran repercusión en las
sensaciones olfato-gustativas en alimentos de origen vegetal.
Desde el punto de vista tecnológico, estas enzimas se utilizan en múltiples
aplicaciones. Generalmente, las agliconas formadas por la acción de las
β-glucosidasas
son los compuestos responsables del flavor de los alimentos y mejoran las propiedades
organolépticas del producto final (Esem, 2003). Particularmente, han sido muy
Introducción 34
estudiados los aromas producidos por la acción de las β-glucosidasas en las hojas de
té,
en zumos de frutas y vinos (Shoseyov y colbs., 1990; Guegen y colbs., 1996; Riou y
colbs., 1998; Li y colbs., 2005).
Las esterasas o α/β-hidrolasas (EC 3.1.1.X) son enzimas que catalizan la
hidrólisis y formación de enlaces ésteres (Figura 11). La rotura enzimática de un enlace
éster ocurre en presencia de una molécula de agua, obteniéndose como productos de
la
hidrólisis un ácido y un alcohol. Existe una amplia gama de enzimas esterasas, que se
diferencian por su especificidad por el sustrato, por su estructura proteica y por su
función biológica. Son enzimas termoestables, sobre todo a altas temperaturas, y en
medios orgánicos catalizan la esterificación, interesterificación, así como reacciones
alcohólicas y ácidas (Kawamoto y colbs., 1987).
Figura 11. Reacción de hidrólisis catalizada por la esterasa (Panda y Gowrishankar,
2005).
Las esterasas tienen muchas aplicaciones industriales, en concreto son utilizadas
en la producción de alimentos, bebidas, cosméticos, papel, detergentes, en la síntesis
de
derivados de carbohidratos y aditivos alimentarios (Ranjitha, 2009).
Las esterasas participan en el desarrollo del flavor de muchos alimentos, como
por ejemplo en la elaboración del queso (Fenster y colbs., 2003), en la producción de
los compuestos aromáticos del vino (Du Toit y colbs., 2011) y durante la producción de
carne fermentada (Brod y colbs., 2010). Asimismo, las esterasas procedentes de
microorganismos tienen un gran interés por su aplicación en biotecnología. Por
ejemplo,
Rojas y colbs. (2001) han estudiado la producción de ésteres acetatos a partir de
levaduras vínicas. También se ha demostrado que esterasas procedentes de levaduras
juegan un papel significativo en el flavor final de cervezas (Dufour y colbs., 2003).
Introducción 35
Introducción 1.4.2.1. Enzimas hidrolasas (β-glucosidasa y esterasa)
relacionadas con compuestos
polifenólicos en
aceitunas
Las enzimas β-glucosidasas junto con las esterasas están naturalmente

presentes
en las aceitunas (Briante y colbs., 2002). Existen muy pocos estudios sobre la
localización de las β-glucosidasas y ninguno sobre las esterasas relacionadas con

los
compuestos fenólicos de las

aceitunas.
Mazzuca y colbs. (2006) localizaron actividad de β-glucosidasa en el

mesocarpio
durante la maduración del fruto e indicaron que cuando los tejidos de los frutos
son
dañados mecánicamente o por la acción de insectos patógenos los

compartimentos
celulares se desorganizan y la β-glucosidasa es capaz de hidrolizar la

oleuropeína.
Asimismo, Spadafora y colbs. (2008) han comprobado que la respuesta de
defensa de los frutos a un ataque por insectos induce a la acción de la

β-glucosidasa, la
cual actúa rápidamente hidrolizando la molécula de oleuropeína y formando

moléculas
aldehídicas altamente reactivas contra estos daños ocurridos en el tejido del fruto.
En
este estudio se observó máxima actividad β-glucosidasa durante los 20 minutos
posteriores al daño, existiendo después una progresiva inactivación de la enzima

en los
tejidos circundantes a la zona dañada e inactivándose definitivamente a las 3

horas de
haberse producido el daño.
Estudios realizados en sistemas modelos han demostrado que extracto de
oleuropeína obtenido de frutos verdes y de hojas de olivos se hidroliza por la

acción de
la enzima β-glucosidasa, obteniéndose glucosa y la aglicona correspondiente

(Walter y
colbs., 1973; Capasso y colbs., 1997; De Leonardis y colbs., 2015). Algunos
investigadores han indicado que, durante la maduración de las aceitunas, la β-
glucosidasa degrada progresivamente la oleuropeína, liberándose glucosa de la

molécula
y endulzándose los frutos (Konno y colbs., 1999; Briante y colbs., 2002). Sin
embargo,
otros estudios indican que la aglicona procedente de la hidrólisis de la oleuropeína

tiene
el mismo grado de amargor que ésta (Walter y colbs.,
1973).
36
Introducción La afinidad de la enzima β-glucosidasa por la oleuropeína ha
sido observada en
variedades de aceitunas italianas Ascolana Tenera y Frantoio (Briante y colbs.,

2002) y
en la variedad tunecina Dhokar (Jemai y colbs., 2009). Estos investigadores han
afirmado que la actividad glucosidasa aumenta durante la maduración de los frutos

y, a
su vez, la concentración de oleuropeína disminuye. Asimismo, más recientemente,

en
variedades españolas como Arbequina y Hojiblanca se ha demostrado el papel

crucial
de la β-glucosidasa en la síntesis y degradación de la molécula de oleuropeína

durante la
maduración de los frutos en el árbol (Gutiérrez-Rosales y colbs., 2010,

2012).
Estudios de laboratorio han demostrado la especificidad de la β-glucosidasa
aislada de aceitunas de la variedad Picual hacia la oleuropeína y, en menor

medida, por
las moléculas demetiloleuropeína y ligustrósido (Romero-Segura y colbs.,

2009).
Por otra parte, investigadores italianos han demostrado que durante la

molturación y batido de las aceitunas, al elaborar aceite de oliva, se producen
transformaciones enzimáticas de los fenoles presentes en el fruto fresco por la

acción de
las hidrolasas endógenas, principalmente de la oleuropeína y el ligustrósido.

Ambos
glucósidos son hidrolizados por la acción de la β-glucosidasa endógena de los

frutos y
se transforman en sus respectivas agliconas, la forma dialdehídica

decarboximetilada de
la aglicona de oleuropeína (HyEDA) y de ligustrósido (TyEDA) (Ranalli y colbs.,
2003).
Previamente, Montedoro y colbs. (1993) habían identificado la presencia de
estas agliconas en el aceite de oliva e indicaron que no aparecería en los frutos

frescos,
aunque, posteriormente, Briante y colbs. (2002) postularon que en frutos maduros,

las
enzimas y sustratos sí entran en contacto y sí se forma una pequeña

concentración de
HyEDA en los mismos. Una prueba más de que estas transformaciones eran
enzimáticas
fue un ensayo realizado por Montedoro y colbs. (2002), donde encontraron que la
concentración de HyEDA en la masa de aceituna era mínima si los frutos previos a

la
molturación se calentaban, lo cual indicaba que dicho calentamiento inactivaba la
enzima β-glucosidasa y, por tanto, no podía formarse las agliconas fenólicas.
Recientemente, se ha postulado que la formación de HyEDA en la obtención de

aceite
de oliva no se debe únicamente a la acción de la β-glucosidasa, sino que además

es
37
Introducción necesario la acción de una segunda enzima metilesterasa
endógena (Romero-Segura y
colbs., 2012).
Las esterasas en aceitunas actúan hidrolizando el enlace éster de la

oleuropeína,
formándose hidroxitirosol y un derivado glucosilado. Amiot y colbs. (1989)

observaron
que los derivados glucosilados de la oleuropeína, glucósido del ácido elenólico y
demetiloleuropeína, aumentaban en los frutos durante su maduración. Además, la
aparición de estos compuestos coincidía con la disminución en la concentración

de
oleuropeína y un aumento en la actividad esterasa endógena de los

frutos.
Asimismo, se ha sugerido la posibilidad de sinergismo entre la esterasa y la

β-
glucosidasa, facilitando ésta última la acción de la primera. En primer lugar la β-
glucosidasa rompe la unión de la glucosa con el aglicón, y posteriormente la

esterasa
hidroliza este último compuesto dando lugar a hidroxitirosol y ácido elenólico

(Jemai y
colbs., 2009).
1.5. Influencia de los procesos tecnológicos sobre la composición fenólica

en
aceitunas de mesa
La presencia de compuestos fenólicos en el fruto fresco, concretamente el
glucósido amargo oleuropeína, hace necesario el procesamiento del mismo con el
objetivo de transformar dicho compuesto en otros no amargos. Estas

trasformaciones
que implican la hidrólisis de la oleuropeína pueden ser catalizadas de forma

química o
enzimática. La intensidad de estas reacciones va a depender del proceso

tecnológico
aplicado e influirán en las características del producto final obtenido (Montedoro y
colbs., 1991).
1.5.1. Transformaciones
químicas
Los procesos de elaboración de aceituna de mesa comprenden numerosas

etapas,
siendo el valor de pH del medio uno de los parámetros más determinantes en las
transformaciones químicas que suceden sobre los compuestos fenólicos

presentes en las
38
aceitunas de mesa. En la figura 12 se muestran las principales transformaciones
químicas ocurridas en la molécula de oleuropeína.
Figura 12. Transformaciones químicas de la oleuropeína durante la elaboración de
aceitunas de mesa (Brenes y colbs., 1993a y 1995a).
Si observamos el esquema de elaboración de este producto (Figura 5A), se puede
afirmar que la etapa crucial de transformación química de los compuestos fenólicos es
el tratamiento con hidróxido sódico. En medio alcalino, se produce la rotura del enlace
éster de la oleuropeína con la consiguiente formación de hidroxitirosol y glucósido de
ácido elenólico (Figura 12), compuestos no amargos (Brenes y de Castro, 1998).
Asimismo, otros compuestos fenólicos presentes en la pulpa del fruto fresco se
hidrolizan, liberándose un parafenol, tirosol, a partir del ligustrósido, y dos
ortodifenoles, hidroxitirosol y ácido cafeico, a partir del verbascósido (Brenes y colbs.,
1995a).
Introducción 39
Introducción En la siguiente etapa del proceso, el lavado, lo que se
produce es una difusión de
estas sustancias desde la pulpa al medio acuoso, con la consiguiente reducción

en el
contenido en pulpa dependiendo de la duración del lavado. A continuación, los

frutos se
sumergen en salmuera en la cual se produce el crecimiento de bacterias lácticas y
levaduras. Pues bien, las sustancias polifenólicas presentes en la pulpa lavada se
difunden al medio salino y se alcanza un equilibrio en los primeros 15-20 días sin
que
se detecte posteriormente ningún tipo de transformación de los polifenoles por el

hecho
de la acidificación del medio (Brenes y colbs.,

1995a).
La concentración fenólica en el producto final envasado variará

dependiendo de
la forma de presentación, así los frutos enteros tendrán mayor contenido, seguidos
de
los deshuesados, siendo las aceitunas rellenas las que presentan menor
concentración de
fenoles al haber sido tratados con un mayor número de etapas de lavado durante
su
elaboración (Romero y colbs.,
2004b).
1.5.1.2. Aceitunas negras

oxidadas
La elaboración de este producto implica una primera etapa de conservación

de
las aceitunas en un medio ácido durante la cual se produce la difusión de los
compuestos polifenólicos desde la pulpa hasta el medio acuoso y la hidrólisis

ácida de
la oleuropeína, formándose ácido elenólico, glucosa e hidroxitirosol como

productos de
la reacción (Brenes y colbs., 1993a), tal como se refleja en la

Figura 12.
Por otra parte, en la etapa de ennegrecimiento (Figura 5B), los tratamientos

con
hidróxido sódico transforman químicamente los restos de oleuropeína y otros
compuestos fenólicos presentes en los frutos como verbascósido, liberándose en
condiciones alcalinas compuestos como hidroxitirosol y ácido cafeico. Ambos
ortodifenoles en presencia de oxígeno se oxidan y polimerizan (Figura 12) dando

lugar
a la formación del color negro característico de esta forma de elaboración (Brenes

y
colbs., 1992).
La siguiente etapa es la adición de una sal ferrosa (gluconato o lactato

ferroso)
para fijar el color negro formado. El hierro ferroso penetra en la pulpa de las
aceitunas,
40
se oxida a férrico y se une a los polímeros fenólicos formados durante la fase de
ennegrecimiento (Brenes y colbs., 1995b). El pH del medio, la temperatura y el tipo de
sal ferrosa son algunos de los factores que influyen en la eficacia de esta etapa y en la
estabilidad de los complejos Fe-polímeros fenólicos (García y colbs., 2001a).
1.5.1.3. Aceitunas naturales en salmuera
La eliminación del amargor en estas aceitunas se produce sin la intervención del
hidróxido sódico. De un lado, se parte de aceitunas negras ya maduras con menor
contenido en oleuropeína y, por otra parte, la difusión paulatina de esta sustancia al
medio salino y su hidrólisis ácida son los factores determinantes en el endulzamiento
de
los frutos. Además de oleuropeína, es importante la presencia en los frutos maduros de

hidroxitirosol 4-glucósido y antocianinas (Romero y colbs., 2002b). El glucósido de
hidroxitirosol se hidroliza por las condiciones ácidas del medio en glucosa e
hidroxititosol (Figura 13) (Arroyo-López y colbs., 2005) y las antocianinas libres
tienden a polimerizarse formando complejos antociánicos coloreados (Figura 13).
Figura 13. Transformaciones químicas de fenoles durante la elaboración de aceitunas
naturales en salmuera (Romero y colbs., 2004a).
Introducción 41
Introducción Este tipo de aceitunas se suelen conservar en condiciones
anaeróbicas, aunque
en ocasiones la conservación puede ser aeróbica con el objetivo de eliminar el

anhídrido
carbónico generado por la propia respiración de los frutos y/o producido por los
microorganismos del medio. En estas condiciones de aerobiosis, el hidroxitirosol
liberado se oxida lentamente debido al pH ácido del medio dando lugar al
oscurecimiento de los frutos con lo que adquieren tonalidades pardas. Si las

aceitunas
son muy maduras, recolectadas con color negro, se produce además la oxidación
y
polimerización de los compuestos antociánicos (Figura 13), desapareciendo por
completo las antocianinas simples del medio (Romero y colbs.,

2004a).
1.5.1.4. Aceitunas
deshidratadas
Este tipo de aceitunas de mesa se elabora a partir de frutos muy maduros,

los
cuales tienen una concentración de compuestos fenólicos no muy elevada y el

grado de
amargor no suele ser muy

intenso.
Es un producto local que también se comercializa en numerosos países

aunque
en pequeñas cantidades debido a los problemas de estabilidad que presenta y a

los
problemas de elaboración que conlleva. Por ello, son también escasas las
publicaciones
científicas sobre esta forma de preparación comercial y, en particular, sobre las
transformaciones de los compuestos polifenólicos. La mayoría de los estudios, por
tanto, se han centrado sobre la estabilidad química y microbiológica del producto

ya
envasado (Panagou y colbs., 2002; Panagou,

2006).
Las investigaciones relacionadas con la composición fenólica de este

producto
elaborado son casi inexistentes, apenas se conoce el perfil fenólico de algunas
variedades italianas, griegas o argelinas, deshidratadas con sal (Zoidou y colbs.,

2010;
Soufi y colbs., 2014) o deshidratadas con calor (Marsilio y colbs., 2000;

Mantzouridou
y Tsimidou, 2011). Se asume que durante el proceso de deshidratación el

endulzamiento
del fruto ocurre por difusión de los compuestos fenólicos del fruto fresco hacia el
líquido que resuma durante la elaboración del producto, es decir, se elimina en el

jugo
de las aceitunas que se filtra durante la deshidratación aunque ello no ha sido
demostrado.
42
1.5.2. Transformaciones con intervención enzimática
Las investigaciones realizadas hasta ahora sobre las transformaciones de los
compuestos fenólicos catalizadas enzimáticamente durante el procesado de aceitunas
de
mesa son muy escasas y centradas en la etapa de postrecolección. En la Figura 14 se
muestran las transformaciones de la molécula de oleuropeína mediante la intervención
enzimática de β-glucosidasas, esterasas y oxidasas (PPO y POD).
Figura 14. Estructura de la oleuropeína y productos generados a partir de las
transformaciones enzimáticas (García y colbs., 2008).
De todas las etapas del proceso de elaboración de este tipo de aceitunas (Figura
5A) es en la recolección donde se han centrado los escasos estudios que existen sobre
la
acción enzimática en la transformación de los compuestos polifenólicos, en particular
oleuropeína. Es bien conocido que la recolección mecanizada, sobre todo con
variedades tales como Manzanilla y Gordal, origina una serie de manchas oscuras en
las
aceitunas debido a los golpes que sufren los frutos. Por tanto, los investigadores han
centrado sus estudios en cómo inhibir la acción de las oxidasas (PPO y POD) durante
la
Introducción 43
Introducción etapa de postrecolección de los frutos. Por ejemplo, conservar los
frutos recolectados en
soluciones de ácido ascórbico, soluciones acidificadas a pH 2,0, refrigeración, etc
(Segovia-Bravo y colbs., 2007).
Por otra parte, la siguiente etapa de la elaboración de estas aceitunas

consiste en
el tratamiento con hidróxido sódico, lo que implica unas condiciones de pH muy
elevadas, en torno a 11 unidades. La gran mayoría de las enzimas tienen un pH

óptimo
de actividad entre 4 y 8 unidades, y se degradan o se inactivan en ese grado de
alcalinidad (Pandey y colbs., 2008), por ello ningún investigador hasta ahora ha
estudiado este tipo de transformaciones en este producto. Únicamente, Medina y

colbs.
(2009) han indicado que el tratamiento con hidróxido sódico podría inactivar las
enzimas presentes en las aceitunas, tales como la β-glucosidasa, ya que en estas
aceitunas no aparecen compuestos antimicrobianos, los cuales sí están presentes

en
aceitunas no tratadas
alcalinamente.
1.5.2.2. Aceitunas negras oxidadas y aceitunas naturales en

salmuera
Si observamos el esquema de elaboración de las aceitunas negras

oxidadas y las
aceitunas naturales en salmuera (Figura 5B y 5C), existe en ambas elaboraciones

una
etapa común que es la conservación de los frutos en una salmuera durante la cual
podría
existir actividad enzimática relacionada con la transformación de los compuestos
polifenólicos. Mazzuca y colbs. (2006) indicaron que las agliconas fenólicas no
aparecen en el
fruto fresco ya que las enzimas y los sustratos no están en contacto en los frutos
en el
árbol. Sin embargo, en el caso de las aceitunas de mesa, el hecho de colocar las
aceitunas en salmuera provoca la rotura de los tejidos del fruto y ello podría dar
lugar al
contacto entre los glucósidos fenólicos y las enzimas endógenas de los

frutos.
Medina y colbs. (2007) han demostrado la formación de elevadas
concentraciones de HyEDA en la salmuera de 17 variedades de aceitunas

conservadas
en condiciones asépticas durante dos meses, a la vez que disminuye

considerablemente
la concentración de oleuropeína en el medio (Medina y colbs., 2009). Este

compuesto es
44
Introducción el producto de la acción de la enzima β-glucosidasa endógena del
fruto y no se forma si
las aceitunas son tratadas térmicamente en un paso previo a la colocación en

salmuera,
dado que dicho tratamiento térmico provocaría la inactivación de la

enzima.
Asimismo, García y colbs. (2008) han propuesto la obtención de un nuevo
producto por acción de una sobrepresión de oxígeno o aire durante 1-3 días. Esta
forma
de procesado consigue endulzar los frutos, que presentan un color oscuro, tanto
externa
como internamente, como consecuencia de la oxidación enzimática de los

ortodifenoles
como la oleuropeína por acción de la enzima PPO

endógena.
Por otra parte, la pérdida de amargor en las aceitunas naturales en

salmuera suele
ser un proceso lento que tarda meses o años. Levaduras y bacterias lácticas son
los
microorganismos que se suelen desarrollar en las salmueras de éstas aceitunas y,

como
es bien conocido, muchos de estos microorganismos presentan actividad

β-glucosidasa
y esterasa, lo cual podría aprovecharse para actuar sobre la molécula de

oleuropeína.
Por ello, han sido numerosos los autores que han investigado la posibilidad de
buscar un
microorganismo que degrade enzimáticamente la oleuropeína, y así de este modo
acelerar el periodo de endulzamiento de los

frutos.
Ciafardini y colbs. (1994) inocularon soluciones modelos ricas en

oleuropeína
con tres cepas diferentes de Lactobacillus plantarum (B17, B20, B21), aisladas de
salmueras de aceitunas negras naturales no tratadas con NaOH, y demostraron
que
dichas cepas se caracterizaban por tener actividad β-glucosidasa e hidrolizaban el
glucósido fenólico. Ensayos similares han sido realizados por otros investigadores
y han
demostrado que cepas de Lactobacillus plantarum eran capaces de hidrolizar la
oleuropeína a través la acción de β-glucosidasa formándose su aglicona, que
posteriormente por acción de esterasas daba lugar a los productos finales de la
hidrólisis, hidroxitirosol y ácido elenólico (Marsilio y colbs., 1996; Ghabbour y

colbs.,
2011; Zago y colbs., 2013; Tofalo y colbs., 2014). Algunas de estas cepas
llegaban a
hidrolizar el 90 % de la oleuropeína presente en la solución modelo, obteniéndose
hidroxitirosol como producto final de hidrólisis, mientras otras sólo alcanzan a la
formación de un metabolito intermedio, la aglicona de la oleuropeína (Santos y

colbs.,
2012).
45
Introducción T ambién, este aspecto de las transformaciones enzimáticas
de los fenoles,
concretamente oleuropeína, por acción de enzimas exógenas procedentes de
microorganismos ha sido abordado desde el punto de vista de cepas de levaduras
procedentes de las salmueras de aceitunas elaboradas como verdes en salmuera
(Bautista-Gallego y colbs., 2011; Restuccia y colbs., 2011; Tofalo y colbs., 2013) o
negras naturales en salmuera (Bonatsou y colbs., 2015), destacándose

Wicheramomyces
anomalus como la especie más

efectiva.
Por otra parte, son escasos los estudios a escala piloto. Únicamente Servili
y
colbs. (2006) seleccionaron 5 cepas aisladas de salmueras de aceitunas negras

naturales
italianas y encontraron que el Lactobacillus pentosus ( 1MO) era capaz de endulzar

las
aceitunas en apenas 8 días, haciéndolas comestibles. Asimismo, Kaltsa y colbs.

(2015)
aislaron cinco cepas de Lactobacillus plantarum procedentes de la elaboración de
p15
aceitunas verdes y negras naturales y comprobaron que el Lactobacillus L
tenía una
elevada actividad β-glucosidasa, mientras que el Lactobacillus Lp20 tiene una

elevada
actividad esterasa.
1.5.2.3. Aceitunas
deshidratadas
La humedad de los alimentos es de gran importancia en la velocidad de la
reacción enzimática, a niveles muy bajos de humedad la actividad enzimática

puede
verse afectada cualitativamente aunque su velocidad enzimática pueda ser

medible. En
estas condiciones de humedad la rigidez del medio impide la difusión de las

enzimas o
del sustrato limitándose así la acción enzimática por no estar en contacto con el
sustrato.
En ocasiones, en productos con tan poca humedad son generalmente las enzimas
de los
mohos que se desarrollan en superficie las únicas actividades enzimáticas

medibles en
estos productos.
Asimismo, la concentración de cloruro sódico puede ser un factor inhibitorio

de
las enzimas endógenas de los frutos. Lu y colbs. (2006) demostraron que la

actividad de
la enzima PPO de manzana se inhibe casi totalmente al 0,058 % de NaCl por lo

que la
inhibición de la PPO es dependiente de la concentración de cloruro sódico

presente en el
medio.
46
Introducción Los estudios relacionados con este tipo de aceitunas son
escasos, todos ellos
centrados en obtener un producto seguro y organolépticamente aceptable

(Panagou y
colbs., 2002). Tampoco existe ninguna investigación que haya abordado las
transformaciones enzimáticas de los compuestos fenólicos presentes en este tipo

de
aceituna de mesa.
En general, en las aceitunas de mesa, al contrario de lo que sucede con

otros
vegetales, existen muy pocos estudios sobre la actividad enzimática

relacionada con
las transformaciones de los compuestos fenólicos y los cambios que se

producen
durante los diferentes procesos de

elaboración.
47
2. Objetivos
Objetivos En los últimos años los estudios sobre la importancia de los
compuestos
fenólicos en los diferentes procesos de elaboración de aceitunas de mesa han

sido muy
relevantes. Sin embargo, no existen precedentes de investigaciones sobre la

actividad
enzimática catalizadora de las reacciones de transformación de estas sustancias
fenólicas. El objetivo general de esta tesis doctoral es conocer los mecanismos de
actuación de las enzimas oxidasas e hidrolasas sobre los compuestos fenólicos,
en
particular oleuropeína, presentes en las aceitunas, para mejorar su calidad,

abaratar los
costes de recolección y permitir el desarrollo de nuevos productos y

preparaciones.
Para conseguir este objetivo general, se plantean los siguientes objetivos
específicos:
1. Identificación de la composición fenólica en los frutos no procesados de las
variedades más empleadas para la elaboración como aceitunas de mesa: Gordal,
Manzanilla y Hojiblanca.
2. Caracterizar la actividad de las enzimas oxidativas (polifenoloxidasa y

peroxidasa) e
hidrolasas (β-glucosidasa y esterasa) relacionadas con los compuestos fenólicos

de las
aceitunas, en particular
oleuropeína.
3. Estudiar la influencia de las enzimas catalizadoras de las reacciones de
transformación de los compuestos fenólicos, sobre todo la oleuropeína, sobre los
diferentes procesos de elaboración de

aceitunas.
4. Desarrollar nuevos procesos de elaboración mediante la modulación de las

reacciones
enzimática y química de la oleuropeína que se desarrollan durante las diferentes

formas
de procesado de las aceitunas de

mesa.
51
3. Materiales y
métodos
Materiales y métodos 3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Determinación de la concentración de cloruro

sódico
Se determina valorando la concentración del ión cloruro con una solución

de
nitrato de plata (0,086 N) (Panreac, Barcelona, España) exactamente valorada,

siendo
necesario utilizar material de color topacio y una solución indicadora de cromato
potásico al 5 % (p/v) en agua

destilada.
Salmuera de
aceitunas
Se valoran 0,5 mL de salmuera, a los que se añaden 100 mL de agua

destilada,
con la solución de nitrato de plata, usando como indicador la solución de cromato
potásico (Panreac). La concentración de cloruro sódico (NaCl) es igual al valor del
volumen gastado de la solución de nitrato de plata en la valoración y se expresa

en
porcentaje (p/v, gramos de NaCl por 100 mL de

solución).
Pulpa de aceitunas
Se pesan 20 g de fruto y se mezclan con 20 mL de agua destilada,

empleando un
homogeneizador Ultra-turrax (IKA-T25, S25N-18G) la mezcla se centrifuga a 7052

xg
durante 5 minutos. 0,5 mL del sobrenadante diluidos con 100 mL de agua

destilada se
valoran de la misma forma indicada anteriormente. El contenido en sal de las

aceitunas
se expresa en porcentaje (p/v, gramos de NaCl/100 mL de jugo de aceituna)

teniendo en
consideración la humedad de la
muestra.
3.2. Determinación de la acidez libre, acidez combinada y

pH
La medida de la acidez libre, pH y acidez combinada de las salmueras se

realiza
con un titulador Metrohm 670 Titroprocessor (Herisau, Switzerland). La acidez

libre se
determina titulando 25 mL de salmuera con NaOH 0,2 N hasta un pH de 8,3 y se
expresa como porcentaje (p/v) de ácido láctico. La acidez combinada se determina

con
55
Materiales y métodos HCl 2 N hasta alcanzar un valor de 2,6 y se expresa
como equivalentes de hidróxido
sódico por litro.
El pH de la pulpa de las aceitunas se mide directamente usando un

pHmetro
portátil pH Tester WP Spear (Singapore). Las medidas se realizan insertando el
electrodo en la pulpa de las aceitunas. Los datos de pH de la pulpa es el promedio

de 3
medidas.
3.3. Análisis de ácidos orgánicos en salmueras y jugo de

aceitunas
Las salmueras se filtran a través de filtros de nylon de 0,20 μm de tamaño

de
poro antes de ser analizadas en el sistema cromatográfico. Los jugos de aceitunas

se
obtienen triturando las pulpas de aceitunas empleando un triturador (Braun turbo
Multiquick/Minipimer 500 Watt Type 4191) y posteriormente filtrando el triturado a
través de un filtro de tela. Posteriormente, se centrifuga a 10577 x g durante 5

minutos
(Sánchez y colbs., 2000) y el sobrenadante se filtra a través de un filtro de nylon

de 0,20
μm de tamaño de poro antes de inyectarse en el sistema

cromatográfico.
El sistema cromatográfico está constituido por un equipo Waters 2695

Alliance
que incluye una bomba cuaternaria, inyector automático y horno en el mismo

equipo.
La detección de los ácidos se lleva a cabo mediante un detector de índice de

refracción.
Todo el proceso está controlado por el programa Millenium 32 (Waters Inc.,

Milford,
Ma). La columna utilizada para la separación de los compuestos es una
Spherisorb
analítica ODS-2 (C18) de 5 μm de tamaño de partícula, 25 cm de largo y 4,6 mm

de
diámetro interno (Waters Inc.). La temperatura de la columna es 30 oC y la

temperatura
interna del detector 40 oC. Se inyectan 20 μL de

muestra.
La separación se realiza bajo un gradiente de elución donde las fases

móviles
son agua acidificada con ácido fosfórico (1,5 mL/L) (A) y metanol (B). El gradiente
de
elución y el flujo empleado es:
56
Materiales y métodos Tiempo (min) Flujo (mL/min) A (%) B
(%)
0 1,2 100 0
15 1,2 100 0
17 0,9 100 0
19 0,9 20 80
26 0,9 20 80
28 0,9 100 0
32 1 100 0
36 1 100 0
38 1,2 100 0
83 1,2 100 0
La cuantificación se realiza mediante rectas de calibrado con ácido acético

y
ácido láctico al 0,5 % (p/v). Los resultados se expresan en porcentaje

(p/v).
3.4. Análisis del color superficial de las

aceitunas
El análisis del color de las aceitunas se lleva a cabo usando un

espectrofotómetro Color-viewTM modelo 9000 (BYK-Gardner, USA), equipado con
un Sofware (QC
Manager) que calcula los parámetros CIE L* ( luminosidad), a* ( rojo/verde), b*
(amarillo/azul), C (croma) y h (tono), considerando el iluminante D65 y el

observador
de 10o. Para evitar distorsiones en la medida, el receptáculo donde se coloca la

muestra
se cubre con una cápsula que tiene el interior de color negro. Los datos de cada
medida
son la media de 20 frutos que previamente habrán sido

secados.
3.5. Análisis del color de los jugos de

aceitunas
El análisis del color de los jugos de aceitunas se lleva a cabo usando un
espectrofotómetro Shimadzu UV-1800 (Kioto, Japón), con control de temperatura.

Los
jugos de aceitunas se obtienen según el apartado 3.3. Se mide la absorbancia
entre 400 y
700 nm.
57
Materiales y métodos 3 .6. Determinación del contenido de humedad de
las aceitunas
El contenido de humedad se determina mediante el secado de las

aceitunas en
una estufa a 105 oC (Fernández y colbs., 1985). Se pesan 5 g de pulpa de

aceitunas
trituradas empleando un triturador (Braun turbo Multiquick/Minipimer 500 Watt

Type
4191) y se secan a la temperatura indicada anteriormente hasta obtener un peso
constante. La humedad de las aceitunas se calcula por la pérdida de porcentaje de

agua
en peso debida a su eliminación por calentamiento. Las medidas se hacen por

triplicado.
Los resultados se expresan como porcentaje de humedad (p/p, gramos de
H2O/100 g de pulpa
de aceitunas).
3.7. Determinación de la actividad de agua (aw) de las
aceitunas
La actividad de agua se determina mediante el equipo Aqua Lab (Decagon

Devices, Inc., Pullman, Washington, USA). El análisis se realiza midiendo el punto
de
rocío de una aceituna partida por la mitad. El resultado es la media de 8

medidas.
3.8. Determinación de la textura de las

aceitunas
La textura de las aceitunas se mide usando una célula de compresión-
cizallamiento tipo Kramer acoplada a un texturómetro modelo TA.TX plus (Stable
Microsystems, Godalming, UK). La velocidad de bajada del pistón es de 200

mm/min y
la escala de fuerza de 0 a 500 N. La textura de las aceitunas es el resultado de la

media
de 10 medidas realizadas con 3 aceitunas deshuesadas cada una. Los resultados

se
expresan en kN/100 g de fruto

deshuesado.
3.9. Análisis
microbiológico
Salmueras
Las muestras de salmuera y las correspondientes diluciones decimales (en

agua
de peptona 0,1 % estéril) se siembran utilizando un sembrador en espiral Spiral

Plater
(Don Whitley Sci. Ltd., Model Wasp 2, Shirpley, UK). El recuento de bacterias
lácticas
58
Materiales y métodos se realiza en MRS (de Man, Rogosa y Sharpe, 1960)
(Oxoid Ltd., Basingstoke, U. K.),
en algunas ocasiones suplementado con azida sódica al 0,02 % e incubando las

placas
en anaerobiosis. El recuento de mohos y levaduras se realiza en OGYE agar

(Oxoid), a
veces suplementado con antibiótico oxitetraciclina (Oxoid). Ambos medios se

incuban a
32 oC y las colonias se enumeran a las 24, 48 o 72 horas usando un Countermat

V.3.1.
(IUL Instrument, Barcelona, España). Los resultados se expresan como unidades
formadoras de colonias (UFC)/mL de

salmuera.
Frutos
Para realizar el análisis microbiológico de los frutos se toman

asépticamente 100
g de aceitunas, se mezclan y agitan con 400 mL de una solución salina estéril al

0,85 %
de NaCl. Esta solución y sus diluciones decimales se siembran utilizando un

sembrador
en espiral en diferentes medios de cultivo. Para el recuento de microorganismos
aerobios mesófilos se usa PCA (Plate Count Agar) (Oxoid), para enterobacterias
se usa
violeta rojo bilis glucosa agar (VRBG) (Biokar), las levaduras y mohos en OGYE
agar
(Oxoid), a veces suplementado con antibiótico oxitetraciclina (Oxoid) y las
bacterias
ácido lácticas en MRS agar (Man Rogosa Sharpe) (Biokar). Las placas se incuban
a 37
oC para VRBG y a 32 oC para el resto de medios. Las colonias se enumeran a las

24, 48
o 72 horas de incubación usando un contador de colonias

automático.
3.10. Análisis de compuestos

polifenólicos
3.10.1. Preparación de la
muestra
3.10.1.1. Pulpa de
aceitunas
La extracción de los compuestos fenólicos presentes en la pulpa de las

aceitunas
se realiza mediante la metodología propuesta por Kumral y colbs. (2013) con

algunas
modificaciones, la cual se basa en la extracción de estas sustancias con

dimetilsulfóxido
(DMSO).
59
Materiales y métodos Se pesan 10 g de pulpa de una muestra
representativa de 20 frutos a los que se
añaden 30 mL de DMSO. Se tritura con ayuda de un homogeneizador-triturador
Ultra-
turrax (IKA-T25, S25N-18G) hasta conseguir una mezcla totalmente homogénea.
Después de 30 minutos de contacto, se centrifuga a 10577 x g durante 5 minutos

a una
temperatura de 22 oC, se recoge el sobrenadante y se pasa a través de un filtro

de 0,20
μm de diámetro de poro. En un vial de cromatografía se mezclan 250 μL del

filtrado,
250 μL de patrón interno (ácido siríngico 0,2 mM en DMSO) y 500 μL de DMSO y

se
inyectan en el sistema cromatográfico. Todas las muestras se analizan por

duplicado.
La extracción de los compuestos fenólicos de la piel de las aceitunas se

realiza
separándola de la pulpa con la ayuda de un cúter. Se pesan 0,1 g de piel y 0,5 mL

de
DMSO y se procede a la extracción de los compuestos fenólicos como se ha

descrito
anteriormente. Todas las muestras se analizan por

cuadruplicado.
La extracción de los compuestos fenólicos de pulpa de aceitunas

porraceadas se
realiza mezclando 0,1 g de pulpa de las áreas dañadas y no dañadas con 0,5 mL
de
DMSO. Se agita en el vórtex durante un minuto y se sonica durante 5 minutos en

un
baño de ultrasonidos. Este procedimiento se repite durante 5 veces.

Posteriormente la
mezcla se centrifuga a 10577 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se
recupera el sobrenadante, se filtra y se inyecta en el sistema cromatográfico. Los
análisis se realizan por triplicado.
3.10.1.2. Salmuera de
aceitunas
Se mezclan 250 μL de salmuera, 250 μL de patrón interno (ácido siríngico 2

mM
en agua desionizada) y 500 μL de agua desionizada. Se hace pasar a través de

un filtro
de 0,20 μm de diámetro de poro y se inyectan en el sistema cromatográfico.

Todas las
muestras se analizan por

duplicado.
3.10.2. Determinación mediante cromatografía líquida de alta eficacia

(CLAE)
El análisis cuantitativo se lleva a cabo mediante cromatografía líquida de

alta
eficacia, con detección por absorbancia en el ultravioleta (Medina y colbs.,

2007).
60
Materiales y métodos El sistema cromatográfico se compone de una
bomba Waters 600E, inyector
automático Waters 717 plus, detector de fotodiodos Waters 996 y horno externo
(Waters Inc. Milford, MA). El sistema está controlado por el programa Empower 2
(Waters Inc.).
La columna utilizada para la separación de compuestos es una Spherisorb
analítica ODS-2 (C18) de 5 μm de tamaño de partícula, 25 cm de longitud y 4,6

mm de
diámetro interno (Waters Inc.). El flujo de elución es de 1 mL/min, la temperatura

del
horno 35 oC y el volumen de inyección de la muestra 20 μL. La absorbancia en el
ultravioleta de los compuestos polifenólicos se mide a una longitud de onda de

280 nm.
La separación se lleva a cabo usando un gradiente de elución en el cual las

fases
móviles son agua acidificada con ácido fosfórico (1,5 mL/L) (A) y metanol (B). El
gradiente empleado es el
siguiente:
Tiempo (min) 0 10 20 30 35 40 45 50 55 60 65 75 A (%) 90 70 70 60 60 50 50

40 30 0 90 90 B (%) 10 30 30 40 40 50 50 60 70 100 10 10
La cuantificación se realiza utilizando rectas de calibrado obtenidas a partir

de
los correspondientes patrones. Hidroxitirosol, oleuropeína, verbascósido, luteolina

7-
glucósido, luteolina, rutina y apigenina adquiridos de Extrasynthese S.A. (Lyon

Nord,
Genay, France); tirosol, ácido cafeico y p- cumárico de Sigma Chemical Co. (St.
Louis,
MO). Hidroxitirosol 1-glucósido, éster de ácido cafeico unido a secologanósido y

comselogósido se cuantifican usando los factores de respuesta de hidroxitirosol,
ácido
cafeico y p-cumárico respectivamente. Salidrósido y ligustrósido se cuantifican

usando
los factores de respuesta de tirosol. Los compuestos hidroxitirosol 4-glucósido y
HyEDA se obtienen mediante un sistema de CLAE preparativo. Se emplea como

patrón
interno ácido siríngico 0,2 mM en el caso de la pulpa de las aceitunas y ácido

siríngico
2 mM para las salmueras. Los resultados se expresan en

concentración mM.
61
Materiales y métodos 3.11. Análisis de compuestos cloroplásticos
3.11.1. Preparación de la
muestra
La extracción de compuestos cloroplásticos presentes en la pulpa de las
aceitunas se realiza mediante la metodología propuesta por Mínguez-Mosquera y
Garrido-Fernández (1989), ligeramente modificada por Gandul-Rojas y colbs.

(2012).
Se pesan 10 g de pulpa de una muestra representativa de 15-20 aceitunas

a los
que se le añaden 50 mL de N, N-dimetilformamida (N, N-DMF) saturada con

MgCO3. La
mezcla se tritura y homogeneiza con ayuda de un
homogeneizador-triturador (IKA-
T25, S25N-18G) durante 1 minuto, y se filtra a vacío. El residuo sólido se recoge y

la
operación se repite hasta que el filtrado es incoloro. Los filtrados se depositan en

un
embudo de decantación y se tratan con 70 mL de hexano. Se agita durante un

minuto y
se deja en reposo para conseguir la separación de las fases. En la fase de

hexano, capa
superior quedan los lípidos y carotenos, mientras que en la fase de N, N-DMF se
retienen las clorofilas y xantofilas. Esta operación se repite 3

veces.
La fase de N, N-DMF se transfiere a un embudo de decantación que

contiene
400 mL de una solución de NaCl al 10 % a una temperatura de 0 oC. Se añaden

70 mL
de hexano y 70 mL de éter etílico, se agita y se deja reposar hasta la separación

de las
fases. La fase inferior, fase acuosa, se desprecia, y la fase superior, fase orgánica,
se
lava varias veces con una solución acuosa de Na2SO4 al 2 % y finalmente se filtra
a través
de un lecho de Na2SO4 anhidro. La solución libre de agua, se concentra
en un rotavapor
hasta sequedad a una temperatura de 30 oC y el residuo seco se
disuelve en
1,5 mL de acetona. Posteriormente, se centrifuga a 13000 x g durante 10 minutos,

para
su análisis mediante cromatografía líquida de alta eficacia

(CLAE).
Las fases de hexano se lavan con 50 mL de N, N-DMF y se transfieren a

100 mL
de éter etílico en un embudo de decantación y se saponifican con 100 mL de una
solución de KOH al 20 % (p/v) en metanol. Se agita y después de una hora se

añade
agua destilada para romper las fases. La fase de éter se lava hasta la neutralidad,
se seca
con la solución acuosa de Na2SO4 al 2 %, se filtra a través de un lecho de Na2SO4
62
Materiales y métodos anhidro, se concentra en un rotavapor hasta sequedad a
una temperatura de 30 oC y el
residuo seco se disuelve en

acetona.
Todo el procedimiento se realiza bajo la misma intensidad de luz verde para
evitar la fotooxidación de clorofilas y

carotenoides.
3.11.2. Determinación de compuestos

cloroplásticos
El β- caroteno se cuantifica directamente en la fase de hexano por la

medida de la
absorbancia a 450 nm usando un espectrofotómetro UV/Vis Hewlett Packard

8452.
El sistema cromatográfico está compuesto por un equipo HP 1100 (Hewlett-

Packard, Palo Alto, CA) que consta de una bomba cuaternaria e inyector
automático y
un detector de fotodiodos. La separación de pigmentos se realiza a través de una

columna de acero inoxidable (20 x 4,6 mm de diámetro interno) C18
MediterraneaTM
Sea, con un tamaño de partícula de 18,3 μm (Teknokroma, Barcelona, España). El

flujo
es de 1,25 mL/min y el volumen de inyección 20 μL. La detección

espectrofotométrica
de los pigmentos se realiza a 410, 430, 450 y 666 nm. El sistema está controlado
por el
programa LC HP ChemStation (Rev. A. 05.

04).
La separación se realiza usando un gradiente de elución donde las fases

móviles
son agua/reactivo de par de iones/metanol (1/1/8, v/v/v) (A) y metanol/acetona

(1/1,
v/v) (B). El reactivo de par de iones está compuesto por tetrabutilamonio 50 mM y

de
acetato de amonio 100 mM en agua. El esquema de gradiente usado es una
modificación del de Mínguez-Mosquera y colbs. (1991) como se muestra a
continuación:
63
Materiales y métodos 64
Tiempo (min) A (%) B (%)
0 75 25 8 25 75 10 25 75 11 19 81 13 14 86 15 11 89 18 10 90 21 10 90 22 8 92
22,5 6 94
23 0 100 35 0 100 40 75 25
Los pigmentos se cuantifican utilizando rectas de calibrado obtenidas a partir de
patrones externos purificados de cada pigmento. Para los compuestos clorofílicos con
Mg en su estructura (a y b) : clorofila, derivados alomerizados de clorofila (DA), éster
Mg-152-Me-fitol-clorina e6, Mg-152-Me-fitol-rodina g7. Los derivados clorofílicos libres

de
Mg (a y b): feofitina, DA, éster 152-Me-fitol-clorina e6, 152-Me-fitol-rodina g7,

pirofeofitina, feoforbida, pirofeoforbida. Los compuestos carotenoides: luteína, β-
caroteno, violaxantina, neoxantina, anteraxantina, luteoxantina, auroxantina, neocromo
y mutatoxantina. Los análisis del fruto fresco se realizan por triplicado, y en aceitunas
procesadas por cuadruplicado. Los resultados se expresan en concentración μM.
3.12. Determinación de la actividad enzimática en aceitunas
3.12.1. Obtención del material enzimático o polvo cetónico
Se utiliza el método propuesto por Sciancalapore y Longone (1984), el cual se
basa en la obtención del material enzimático triturando en frío 50 g de pulpa fresca,
procedente de distintas aceitunas de una misma partida, en 100 mL de acetona con
polietilenglicol al 2,5 % (p/v), a baja temperatura. La trituración se realiza con un
homogeneizador-triturador Ultra-turrax (IKA-T25, S25N-18G), hasta obtener una pasta
totalmente homogénea que se filtra a vacío a través de un filtro Whatman 40 de 110
mm
Materiales y métodos de diámetro acoplado a un kitasato. El precipitado se
lava tres veces con 100 mL de
acetona a -30 oC. Finalmente, el residuo de color blanco y pulverulento se deja
secar a
temperatura ambiente durante 24 horas y conserva a -40 oC hasta

su uso.
3.12.2. Determinación de la actividad de las enzimas oxidoreductasas: PPO

y POD
3.12.2.1. Obtención del extracto

enzimático
La obtención del extracto enzimático se realiza en base a la metodología
propuesta por Hornero-Méndez y colbs.

(2002).
Se pesan 0,5 g de polvos cetónicos y se suspenden en 20 mL de una

solución
tampón de fosfato sódico 100 mM, con NaCl al 5,84 %, ajustando el pH a 6,2
unidades
con hidróxido sódico. La suspensión se agita durante 30 minutos a 4 oC en una

cámara
termostática y luego se centrifuga a 15500 x g durante 20 minutos a la misma
temperatura. Se separa el sobrenadante del pellet y se divide en dos alícuotas,

una se
utiliza como extracto enzimático crudo y la otra como extracto enzimático
desnaturalizado, después de su calentamiento en un baño a 90 oC durante 30

minutos.
3.12.2.2. Condiciones de reacción para la

PPO
La evaluación de la actividad enzimática PPO se basa en el método
desarrollado
por Hornero-Méndez y colbs. (2002). La solución tampón utilizada es citrato sódico

100
mM, ajustada a pH 5 con hidróxido sódico y almacenada a temperatura

ambiente.
La mezcla de reacción está formada por 2,5 mL del sustrato 4-metilcatecol

20
mM en la solución tampón y 0,5 mL del extracto enzimático. El volumen total es de

3
mL. La reacción se inicia en el momento que se añade el extracto enzimático. El

blanco
contiene 2,5 mL de sustrato 4-metilcatecol 20 mM en la solución tampón y 0,5 mL

de
extracto enzimático
desnaturalizado.
65
Materiales y métodos 3.12.2.3. Condiciones de reacción para la POD
La evaluación de la actividad enzimática de la POD se desarrolla de

acuerdo al
método de Civello y colbs. (1995). La solución tampón utilizada para la medición

de la
POD está formada por fosfato ácido de sodio (Na2HPO4) 20 mM y fosfato

monobásico de
sodio (NaH2PO4) 80 mM, ajustada a pH 6 con hidróxido sódico y
almacenada a temperatura
ambiente.
La mezcla de reacción contiene 2,7 mL de sustrato guaiacol 40 mM y

peróxido
de hidrógeno 26 mM en la solución tampón. Esta mezcla se incuba a una

temperatura de
30 oC durante 15 minutos y, transcurrido este tiempo, se inicia la reacción por

adición
de 0,3 mL del extracto enzimático. El volumen total es 3 mL. El blanco contiene

2,7 mL
de sustrato guaiacol 40 mM y peróxido de hidrógeno 26 mM en la solución tampón

y
0,3 mL de extracto enzimático

desnaturalizado.
3.12.2.4. Cuantificación de la actividad enzimática mediante

espectrofotometría
La reacción enzimática para ambas oxidasas, PPO y POD, se lleva a cabo

en una
cubeta espectrofotométrica a 25 oC en un espectrofotómetro Shimadzu UV-1800

(Kioto,
Japón), con control de temperatura. La actividad enzimática se evalúa mediante la
medición del incremento de la absorbancia durante el tiempo de reacción a una

longitud
de onda de 410 nm y 470 nm para la PPO y POD respectivamente. Las

mediciones se
realizan a intervalos de 5 segundos durante 10 minutos para la PPO, y a intervalos

de un
minuto durante 10 minutos para la POD. Todos los análisis se realizan por
duplicado.
La representación de los datos obtenidos, incremento de absorbancia frente

al
tiempo, nos permite evaluar la actividad enzimática de ambas enzimas calculando

el valor de la pendiente correspondiente a la zona inicial lineal con un valor de R2≥
0,97.
Se define una unidad de actividad PPO como la cantidad de enzima

necesaria
para que se produzca un cambio de 0,05 unidades de Abs (410 nm)/min. Por otra
parte,
una unidad de actividad POD corresponde a la cantidad de enzima necesaria para

que se
66
Materiales y métodos produzca un cambio de 0,001 unidades de Abs (470
nm)/min. Los resultados se
expresan en unidad de actividad enzimática/mL de extracto enzimático (U/mL

e.e.).
3.12.3. Determinación de la actividad de las enzimas hidrolasas:

β-glucosidasa y
esterasa
3.12.3.1. Determinación de la actividad

β-glucosidasa
3.12.3.1.1. Obtención del extracto

enzimático
Para la obtención del extracto enzimático se suspenden 0,14 g de polvos
cetónicos obtenidos según el apartado 3.12.1. en 10 mL de una solución tampón

de
carbonato sódico 10 mM, compuesta por bicarbonato de sodio 100 mM y

carbonato de
sodio 100 mM, que contiene 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1

mM
de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 1 % de 2-mercaptoetanol ajustado a un

pH
de 9,0 unidades con una solución de hidróxido sódico. La mezcla se agita durante
1 hora
a 4 oC en una cámara termostática y se centrifuga a 15500 x g durante 20 minutos

a la
misma temperatura. Se separa el sobrenadante del pellet, se llevan hasta un pH

de 5,4
unidades mediante la adición de ácido acético y se divide en dos alícuotas, una se

utiliza
como extracto enzimático crudo y la otra como extracto enzimático

desnaturalizado,
después de su calentamiento en un baño a 90 oC durante 30

minutos.
3.12.3.1.2. Condiciones de reacción para la

β-glucosidasa
La evaluación de la actividad β-glucosidasa se realiza según la metodología
desarrollada por Romero-Segura y colbs. (2009) con algunas

modificaciones.
La mezcla de reacción está formada por 100 μL de una solución tampón de
acetato sódico 50 mM ajustada a pH 5,4 y almacenada a temperatura ambiente,

que
contiene 15 mM de p- nitrofenil β- D-glucopiranósido (Sigma Chemical Co., St.

Louis,
MO) (p-NPG) como sustrato y 100 μL de extracto enzimático. Esta mezcla se

incuba
durante 30 minutos a 45 oC y seguidamente la reacción se paraliza con 1 mL de

una
solución de carbonato sódico 500 mM. El volumen total de reacción es de 1,2 mL.
El
67
Materiales y métodos blanco contiene 100 μL del sustrato p-NPG 15 mM en la
solución tampón de acetato
sódico y 100 μL de extracto enzimático desnaturalizado. Tanto la mezcla de

reacción
que contiene el extracto enzimático como el blanco se miden con respecto a una
cubeta
espectrofotométrica que contiene 1,2 mL de agua

destilada.
3.12.3.1.3. Cuantificación de la actividad enzimática mediante

espectrofotometría
La reacción enzimática tiene lugar en una cubeta espectrofotométrica a 45

oC en
un espectrofotómetro Shimadzu UV-1800 (Kioto, Japón), con control de

temperatura.
La actividad enzimática se evalúa mediante la medición de la absorbancia a una
longitud de onda de 405 nm en intervalos de 5 minutos durante 30 minutos. Todos

los
análisis se llevan a cabo por

duplicado.
La diferencia entre la absorbancia obtenida al emplear el extracto

enzimático
desnaturalizado y la obtenida al usar el extracto enzimático crudo nos permite

calcular
la absorbancia real de nuestra

muestra.
La actividad β-glucosidasa se calcula frente a una curva estándar usando

p-
nitrofenol (p-NP) en una concentración de 0-0,3 mM. Se define una unidad de

actividad
β-glucosidasa como la cantidad de enzima necesaria para formar un μmol de p- NP

por
minuto. Los resultados se expresan en unidad de actividad enzimática/mL de

extracto
enzimático (U/mL e.e.).
3.12.3.2. Determinación de la actividad

esterasa
3.12.3.2.1. Obtención del extracto

enzimático
El extracto enzimático se obtiene en base a las metodologías propuestas

por
Briante y colbs. (2002) y Jemai y colbs. (2009), con algunas modificaciones. Se

pesan
0,25 g de polvos cetónicos obtenidos según el apartado 3.12.1. y se suspenden en

10 mL
de una solución tampón de borato 10 mM que contiene 5 mM de EDTA y 1 mM de
PMSF ajustada a pH 9,0 con hidróxido sódico a temperatura ambiente. La

suspensión se
agita durante 1 hora a 4 oC en una cámara termostática y luego se centrifuga a

15500 x g
68
Materiales y métodos durante 20 minutos a la misma temperatura. Se separa
el sobrenadante del pellet y se
divide en dos alícuotas, una se utiliza como extracto enzimático crudo y la otra
como
extracto enzimático desnaturalizado, después de su calentamiento en un baño a

90 oC
durante 30 minutos.
3.12.3.2.2. Condiciones de reacción para la

esterasa
La actividad esterasa se evalúa según la metodología propuesta por Koufi y
colbs. (2011). La solución tampón utilizada es Tris-HCl 9,2 mM ajustada a pH 7,5

con
una solución de HCl al 37 %, y mantenida a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción está formada por 2,9 mL de tampón Tris-HCl a pH 7,5 y 50 μL de una

solución
150 mM de sustrato p-nitrofenil acetato (Sigma Aldrich) (p-NPA) en etanol. La

reacción se inicia por la adición de 50 μL del extracto enzimático. El volumen total
es
de 3 mL. El blanco contiene 2,9 mL de la solución tampón de Tris-HCl, 50 μL de
sustrato
p-NPA en etanol y 50 μL del extracto enzimático desnaturalizado. Tanto la mezcla
de
reacción que contiene el extracto enzimático como el blanco se midieron con

respecto a
una cubeta que contenía 3 mL agua

destilada.
3.12.3.2.3. Cuantificación de la actividad enzimática mediante

espectrofotometría
La reacción enzimática se lleva a cabo en una cubeta espectrofotométrica a

40
oC en un espectrofotómetro Shimadzu UV-1800 (Kioto, Japón), con control de
temperatura. La actividad enzimática de la esterasa es evaluada mediante la

medición de
la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm, realizando las mediciones en
intervalos de 5 segundos durante 10 minutos. Todos los análisis se realizaron por
triplicado.
La diferencia entre la absorbancia obtenida al emplear el blanco y la

obtenida al
usar el extracto enzimático crudo nos permite calcular la absorbancia real de

nuestra
muestra.
69
Materiales y métodos La actividad esterasa se calcula frente a una
curva estándar usando p-NP en una
concentración de 0-0,03 mM. Se define una unidad de actividad esterasa como la
cantidad de enzima necesaria para producir un μmol de p-NP por minuto. Los
resultados se expresan en unidad de actividad enzimática/mL de extracto

enzimático
(U/mL e.e.).
3.13. Evaluación subjetiva de la calidad de las

aceitunas
El análisis lo realiza un panel de 4 expertos en aceitunas. El tamaño de

muestra
evaluada es de 500 g y la escala utilizada se basa en lo establecido por el COI

(2004).
Los frutos se clasifican en función del tamaño (mm) de la superficie dañada. Se
consideran 3 grados de intensidad de

daño:
- Grado A, aceitunas con manchas oscuras cuyo tamaño es inferior a 3

mm2. - Grado B, aceitunas con manchas oscuras cuyo tamaño oscila entre
3 y 9 mm2. - Grado C, aceitunas con manchas oscuras cuyo tamaño es
superior a 9 mm2.
Los resultados se expresan como porcentaje de aceitunas correspondiente

a cada
categoría.
3.14. Evaluación de la composición fenólica y actividad enzimática en fruto

fresco
3.14.1. Materia prima
Las muestras de aceitunas utilizadas pertenecen a las variedades Gordal,
Manzanilla y Hojiblanca, recolectadas durante los meses de septiembre y octubre

en la
provincia de Sevilla en dos campañas consecutivas 2010-2011 y 2011-2012.

Todas
fueron partidas comerciales de diversas cooperativas y centros de recepción

destinadas a
su elaboración como verdes estilo español o negras estilo californiano, con un

índice de
madurez de 1 (color verde) de acuerdo con el método utilizado por Hermoso y

colbs.
(2001), basado en la pigmentación extendida en el epicarpio y mesocarpio en 100

frutos
procedentes de una
muestra.
70

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Estudio de la Degradación Enzimática del

Glucósido Amargo Oleuropeína Durante el

1.1. Aceituna de mesa: importancia social y económica

1.2. Procesos de elaboración de aceitunas de mesa

1.2.1. Aceituna verde estilo español

1.2.2. Aceituna negra oxidada o estilo californiano

negras naturales al estilo griego

1.2.4. Aceitunas deshidratadas

1.3​. Compuestos fenólicos en aceitunas

1.3.1. Composición fenólica del fruto fresco

1.3.2. Composición fenólica del fruto procesado

1.3.3. Influencia de los factores agronómicos sobre la

fenólica de las aceitunas

1.4. Enzimas en alimentos

1.4.1. Enzimas oxidoreductasas: polifenoloxidasa (PPO) y

1.4.1.1. Enzimas oxidoreductasas (PPO y POD)

relacionadas con compuestos polifenólicos en aceitunas

1.4.2. Enzimas hidrolasas: β-glucosidasa y esterasa

1.4.1.2. Enzimas hidrolasas (β-glucosidasa y esterasa)

relacionadas con compuestos polifenólicos en aceitunas

1.5. Influencia de los procesos tecnológicos sobre la composición

1.5.1. ​Transformaciones químicas

1.5.1.1. Aceitunas verdes estilo español

1.5.1.2. Aceitunas negras oxidadas

1.5.1.3. Aceitunas naturales en salmuera

1.5.1.4. Aceitunas deshidratadas

1.5.2. ​Transformaciones con intervención enzimática

1.5.2.1. Aceitunas verdes estilo español

1.5.2.2. Aceitunas negras oxidadas y aceitunas naturales

1.5.2.3. Aceitunas deshidratadas

3. MATERIALES Y MÉTODOS ..............................................................................

3.1. Determinación de la concentración de cloruro sódico

3.2. Determinación de la acidez libre, acidez combinada y pH

3.3. Análisis de ácidos orgánicos en salmueras y jugo de aceitunas

3.4. Análisis del color superficial de las aceitunas

3.5. Análisis del color de los jugos de aceitunas

3.6. Determinación del contenido de humedad de las aceitunas

3.7. Determinación de la actividad de agua (a​w​) de las aceitunas

3.9. Análisis microbiológico

3.10. Análisis de compuestos polifenólicos

3.10.1. Preparación de la muestra

3.10.1.1. Pulpa de aceitunas

3.10.1.2. Salmuera de aceitunas

3.10.2. Determinación mediante cromatografía líquida de alta

3.11. Análisis de compuestos cloroplásticos

3.11.2. Determinación de compuestos cloroplásticos

3.12. Determinación de la actividad enzimática en aceitunas

3.12.1. Obtención del material enzimático o polvo cetónico

3.12.2. Determinación de la actividad de las enzimas

oxidoreductasas: PPO y POD

3.12.2.1. Obtención del extracto enzimático

3.12.2.2. Condiciones de reacción para la PPO

3.12.2.3. Condiciones de reacción para la POD

3.12.2.4. Cuantificación de la actividad enzimática

3.12.3. Determinación de la actividad de las enzimas hidrolasas:

3.12.3.1. Determinación de la actividad β-glucosidasa

3.12.3.1.3. Cuantificación de la actividad

3.12.3.2. Determinación de la actividad esterasa

3.12.3.2.1. Obtención del extracto enzimático ..............

1.3. Compuestos fenólicos en aceitunas

1.5.1. Transformaciones químicas

1.5.2. Transformaciones con intervención enzimática

3.7. Determinación de la actividad de agua (aw) de las aceitunas