“AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCIÓN E IMPUNIDAD”

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE
ALIMENTOS Y PRODUCTOS AGROPECUARIOS
(I.A.P.A)
QUÍMICA DE ALIMENTOS
PRÁCTICA 4: “ACCIÓN ENZIMÁTICA, PARDEAMIENTO E
INACTIVACIÓN ENZIMÁTICA”

INTEGRANTES:
● Epiquien Zorrilla, Cristian Francisco (20160170)
● ​Gomez Coila, Jorge Antonio (20160398)
● Gomez Menacho, Alejandra Linda (20170223)
● Silva Espiritu, Leidy Clara (20161374)

PROFESOR:
● Ing. Mg. Gladys Tarazona

FECHA DE CLASE:
● 17 de abril del 2019

FECHA DE ENTREGA:
● 15 de mayo del 2019
 “AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCIÓN E IMPUNIDAD”

1. INTRODUCCIÓN:
Las enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica que aceleran la velocidad de reacción
hasta alcanzar un equilibrio. Constituyen el tipo de proteínas más numeroso y
especializado y, actúan como catalizadores de reacciones químicas específicas en los seres
vivos o sistemas biológicos. Muchas de las enzimas no trabajan solas, se organizan en
secuencias, también llamadas rutas metabólicas, y muchas de ellas tienen la capacidad de
regular su actividad enzimática (Lehninger, Nelson, & Cox, 2006).
Debido a que son capaces de acelerar la velocidad de reacciones químicas es que se les
considera catalizadores biológicos y son esenciales para que la célula esté
metabólicamente activa. Sin ellas, muchas de las reacciones químicas dentro de la célula
serían muy lentas, tanto, que no serían compatibles con la vida (Voet, Voet, & Pratta,
2013). En el área de alimentos, las enzimas juegan un papel destacado, dado que muchas
reacciones catalizadas por éstas se llevan a cabo en los alimentos o en procesos
alimentarios, tanto que el 30% de las enzimas que se producen industrialmente se utilizan
en el área de alimentos y bebidas (Voet, Voet, & Pratta, 2013).
Las enzimas pueden estar relacionadas directamente con las reacciones metabólicas de las
células que constituyen un alimento. Por ejemplo, el que un fruto madure depende
directamente de un grupo de enzimas que se expresan diferencialmente de acuerdo con la
etapa de maduración. Este es el caso de las pectinasas del jitomate, manzanas y peras,
entre otras, que son responsables del ablandamiento que sufren los frutos al madurar
(Quirasco & López-Munguía, 2013).
Las enzimas también son utilizadas en la preparación de alimentos. ¿Cuántos de nosotros
empleamos ablandadores de carne como práctica en la cocina? El ingrediente activo de esa
preparación culinaria son enzimas proteolíticas o proteasas, las cuales son de origen
vegetal y se llaman papaína y bromelina (García, Quinteros, & López-Munguía, 1999).
En la presente práctica observaremos la actividad enzimática de las enzimas presentes en
la levadura durante el proceso de fermentación en diferentes harinas de origen vegetal
mediante la prueba de la probeta, así mismo apreciar visualmente la inactivación por calor
de las enzimas presentes en la pera.
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2. MARCO TEÓRICO
2.1. ​PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO
Se conoce como pardeamiento enzimático a una alteración, aunque en su lugar principio
enzimático, que tiene como sustrato los compuestos fenólicos, que dan a lugar a
coloraciones, por lo general, pardas.
A penas puede ocurrir en alimentos de origen animal, sin embargo, puede traer
problemas en la conservación de la calidad de frutas y verduras. En estos casos, las
alteraciones aparecen cuando los productos han sufrido daños en su tejido a golpe o a
tratamientos tecnológicos como troceados, pelado, etc. Puede ocurrir como ya se
mencionó en alimentos de origen vegetal, como la papa, el plátano, la manzana, los
duraznos, los champiñones, las peras, entre otros. No siempre es un fenómeno químico
indeseable, existen casos en donde se busca la transformación de estos compuestos
fenólicos, compuestos fenólicos, como por ejemplo en la producción de té o café (Bello,
2000).
Según Fennema (2008), la actividad enzimática relacionada con el cambio de color se
debe a la acción de fenoloxidasas, peroxidasas y otras oxidoreductasas.

2.1.1. ​FENOLOXIDASA
El pardeamiento enzimático está causado por enzimas que se denominan
colectivamente fenolasa, fenoloxidasa, polifenoloxidasa, catecolasa, cresolasa y
tirosinasa. Estas enzimas están relacionadas por tener la misma arquitectura del centro
activo con un núcleo de dos cobres que puede catalizar las dos siguientes reacciones que
aparecen a continuación:

La primera es una reacción de hidroxilación y la segunda, una de oxidación. La acción

enzimática no forma directamente los pigmentos pardos. Son las o- quinonas que se
derivan de la acción enzimática que sufren reacciones de condensación química (que
puede implicar a aminas y proteínas) para dar lugar a diversos productos, poliméricos y
conjugados llamados melaninas, que en su conjunto son de color marrón rojizo.
En los alimentos, las fenoloxidasas son las causantes del pardeamiento enzimático que
puede ser deseable en algunos productos ciruelas deshidratas, el té, el café. Pero en la
mayoría de frutas y hortalizas, especialmente en productos mínimamente procesados, el
pardeamiento enzimático está asociado a la pérdida de la calidad del color. Las
fenoloxidasas en las frutas y vegetales tienen un pH óptimo en el rango de 4-7. Las
temperaturas óptimas de las fenoloxidasas están en el rango de 30 – 50°C, por lo que en
el proceso térmico se da una amplia oportunidad para que se activen las
polifenoloxidasas. (Fennema, 2008)
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2.1.2. ​PEROXIDASAS

La reacción peroxidática general que catalizan es:

Los fenoles (por ejemplo, el catecol), el ácido ascórbico, el NADH y las aminas
aromáticas son donadores comunes de electrones. El 2A* resultante del ciclo
peroxidático pueden tener distintos destinos. Si el AH es el ácido ascórbico, entonces
2A* sufrirá una adición de radicales libres (polimerización) para dar lugar a un
tetrámero y el color pardo concomitante desarrollados es la base del uso de guayacol en
el ensayo de peroxidasa que se usa ampliamente como indicador de la eficiencia del
escaldado.
Las peroxidasas se encuentran entre las enzimas más ubicuas y estables al calor de los
tejidos de las plantas, estas características permiten su uso como indicadores de
escaldado. La base racional de este uso es que, si la actividad de la peroxidasa endógena
se destruye, todas las otras enzimas que pueden deteriorar la calidad se tienen que
destruir también.
El papel de la peroxidasa en el pardeamiento enzimático y en otros procesos de
decoloración de los alimentos sigue siendo enigmático.
La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de
hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o- fenilendiamina)
por medio de peróxidos (). El substrato oxidable más usado es el guayacol, que es
oxidado a un completo coloreado a un complejo de tetraguayacol en presencia de
peroxidasa.

El método se basa en la oxidación del guayacol (incoloro) a tetraguayacol (rojo ladrillo).

El substrato es el guayacol – peróxido de hidrógeno y la reacción es catalizada por la
enzima ​peroxidasa.
La velocidad de formación del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la
actividad enzimática por lecturas espectrofotométricas de las absorbancias en relación
con el tiempo.
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Como la mayoría de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor siendo
una de las que precisa mayor temperatura y más tiempo para su inactivación. Posee
además, la propiedad peculiar de la regeneración enzimática. Este fenómeno consiste en
que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad después de un
cierto tiempo. Esto ha sido explicado, aduciendo que la fracción proteica de la enzima
sufre una desnaturalización solo parcial, con pérdida de su estructura terciaria, si el
calor se aplica un tiempo muy corto, produciéndose luego una reversión de la proteína a
su estado normal por recombinación de sus grupos hidrógenos o sulfhídricos.
Este efecto del calor sobre la actividad peroxidásica es muy, importante en la industria
de alimentos y la regeneración enzimática de la peroxidasa puede causar serios
problemas en los caracteres organolépticos. Se ha demostrado en el laboratorio que esta
actividad enzimática puede detenerse totalmente, si el calentamiento es
suficientemente largo, de manera que sobre 30” la regeneración es muy débil
generalmente. (Villanueva)

2.2. ​CONTROL DE PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO

La deshidratación, el procesado térmico son eficaces siempre y cuando el tiempo que se
necesite para ello no ocasione un pardeamiento intolerable o cambios texturales que
afecten la calidad. Otros medios físicos incluyen el envasado en atmósferas modificadas
para los alimentos mínimamente procesados, el recubrimiento de secciones de tejidos
con jarabes de azúcar o con películas comestibles que limiten la disponibilidad del .
También se puede hacer uso de tratamientos químicos basados en la inhibición o
inactivación de la enzima, en acomplejar los sustratos nativos o en reducir de nuevo las
quinonas hasta o-difenoles y/o quinonas conjugadas de forma que se impida la formación
de melanina (uso de agentes reductores, especialmente los tioles). En caso de la
inhibición enzimática se incluye a los acidulantes (ácido cítrico, málico o fosfórico), a los
inhibidores enzimáticos (similares a los sustratos nativos, compiten por ocupar el sitio de
unión de fenoles), a los agentes quelantes y a los inactivadores de la enzima (Fennema,
2008)

2.2.1 ​INACTIVACIÓN DE LAS ENZIMAS POR EL CALOR

Las enzimas pueden desnaturalizarse, al igual que el resto de proteínas. Son muy
termolábiles y si se les calienta a temperaturas de 70 a 80°C durante dos a 50 minutos,
la actividad de la mayoría de ellas queda destruida (Braverman, 1967)
La temperatura óptima para la mayoría de las reacciones enzimáticas está con pocas
excepciones entre 30-40°C en donde su actividad es máxima. Al aumentar la
temperatura la velocidad de reacción aumenta y, para casi todas las enzimas, un
incremento de 10°C duplica e incluso triplica la velocidad de reacción. Por otro lado,
este mismo aumento en la temperatura acelera también la inactivación de la enzima por
desnaturalización térmica. Para muchas enzimas la zona de inactivación térmica
extensiva está muy próxima de la temperatura óptima. (Schmidt-Hebbel,1982).
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En la industria se realiza frecuentemente la inactivación enzimática por calor, debido a
que en la mayoría de los casos la conservación de los alimentos precisa la supresión de
cualquier actividad enzimática. Si la actividad enzimática persiste puede, por ejemplo,
producirse un cambio en el color verde de la clorofila, o el pardeamiento de los
alimentos, puede alterar el sabor de los carbohidratos o enranciarse la grasa, se pueden
producir alteraciones en el aroma o el valor de las proteínas o de las vitaminas,
finalmente, la presencia de enzimas peptolíticas puede modificar totalmente la textura
de los alimentos (Braverman, 1967)
Las enzimas difieren ampliamente en su resistencia a la inactivación térmica. La
velocidad de la inactivación térmica depende también del Ph, fuerza iónica y el estado
físico de la enzima en el material alimentario (si la enzima está igualmente distribuida
por todo el producto o adsorbida sobre las partículas sólidas). (Schmidt-Hebbel, 1982).
El método más conveniente para inactivar las enzimas en la conservación de los
alimentos es el calentamiento, pasteurización o esterilización. Se puede dar el caso de la
regeneración de algunas enzimas que previamente han sido inactivadas, que recuperan
al cabo de algún tiempo su actividad. Se supone que cuanto más corto sea el periodo de
tratamiento, mayor son las probabilidades de regeneración de la actividad enzimática
(Braverman, 1967).
El tratamiento con calor es un método adecuado para la destrucción de
microorganismos que alteran los alimentos, un adecuado proceso térmico puede lograr
simultáneamente en la preservación microbiológica y la estabilización de los alimentos.
A veces la actividad residual de una enzima se utiliza como la prueba de la suficiencia de
un proceso térmico con calor. Por ejemplo, la actividad fosfatásica de la leche es un buen
indicador si la leche ha sido pasteurizada adecuadamente (Schmidt-Hebbel, 1982)

2.2.2. ​CONTROL NATURAL

El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce fundamentalmente
mediante la compartimentalización de los sustratos. La enzima se encuentra en los
plástidos y cloroplastos (en los vegetales superiores), también en el citoplasma celular,
mientras que los compuestos fenólicos que pueden servir de sustratos se acumulan en
vesículas. Cuando se rompe la compartimentalización por un daño mecánico, como el
triturado, corte o congelación y descongelación, la reacción de pardeamiento se puede
producir. También se produce la inhibición de la enzima por los productos de la
reacción. Además de manteniendo la compartimentalización, la reacción de
pardeamiento se puede frenar actuando sobre diferentes factores:

· Evitando el contacto del oxígeno con la superficie de corte.

· Bajando la temperatura.
· Reduciendo el pH.
· Desnaturalizando la enzima.
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Los reductores pueden actuar de varias formas, entre ellas revirtiendo la reacción de
quinonas a fenoles. También pueden actuar directamente sobre el centro activo del
enzima, transformando el cobre (II) en cobre (I), que se disocia más fácilmente. El
sulfito y la cisteína, además de reaccionar con las quinonas reduciéndose a difenoles,
inactivan la enzima. Los sulfitos presentan el problema de su toxicidad diferenciada
para algunas personas, un pequeño porcentaje de los asmáticos, que pueden sufrir crisis
severas con cantidades incluso inferiores a los límites legales. Consecuentemente, existe
una tendencia a reducir la utilización de sulfitos, aunque no siempre es posible. (Calvo,
2007)
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4. ​RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1. ​RESULTADOS PRUEBA DE LA PROBETA
Se realizaron dos pruebas de la acción de la levadura conteniendo diferente sustrato una
con harina de haba y harina de trigo (tratamiento) y otra solo con harina de trigo
(testigo); ambas con dos repeticiones, las cuales fueron sometidas a las mismas
condiciones (anteriormente explicadas), donde se obtuvieron los siguientes resultados:

Cuadro 1:​ Valores del volumen de la muestra respecto al tiempo en Baño María
Probeta 1 (Harina de trigo) Probeta 2 (Harina de trigo y haba)

Tiempo Volumen (ml) Tiempo Volumen (ml)

(minutos) (minutos)
R1 R2 R1 R2

0 37.5 37.5 0 36 24

1 49.5 39 1 47.5 36

2 59 43 2 57.5 41

5 72 57 5 69.5 54

10 87 72 10 85 69

15 60 74 15 91 79

20 48 76 20 59 82

Fuente Propia

Gráfica 1:​ Curva volumen (ml) vs tiempo (t) de la probeta 1​.

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Gráfica 2:​ Curva volumen (ml) vs tiempo (t) en la probeta 2.

4.1.2. ​DISCUSIONES
Como se puede observar en la gráfica 1, hubo un aumento de volumen de la harina de
trigo hasta los 10 minutos aproximadamente, mientras que en la gráfica 2, el aumento
de volumen de la harina de trigo mezclado con harina de haba fue solo hasta los 15
minutos aproximadamente; luego de este tiempo el volumen de las muestras empezó a
disminuir en una de las repeticiones.

Los estudios microbiológicos actuales indican que en el pie de masa coexisten bacterias
lácticas y levaduras. Las enzimas del cereal hidrolizan el almidón, formando azúcares
que son transformados en ácido láctico por las bacterias y en etanol por las levaduras.
La liberación de CO2 durante la fermentación alcohólica forma burbujas que confieren
porosidad y levedad a la masa (Aquarone et al. 2001).

Cuando se utiliza levadura comercial, el producto principal que se forma es el etanol, y

en menor proporción también pueden hallarse diferentes ácidos que contribuyen al
flavor del producto. Los microorganismos responsables de la fermentación, se nutren de
azúcares (glucosa y levulosa) presentes en la masa, los cuales sufren una
transformación enzimática dando como productos principales anhídrido carbónico y
alcohol (Calvel 1995, Bqca. 2008).

Los azúcares, que utilizan los microorganismos como nutrientes, son aportados por la
harina y por la actividad de las enzimas sobre el almidón. Las distintas enzimas
involucradas en la producción de azúcares simples son aportadas por la harina, por las
levaduras y en ocasiones son adicionadas con el fin de mejorar la calidad del producto.
(Sánchez 1987, Bqca. 2008)
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La actividad enzimática se ve favorecida con el incremento de la Aw ya que, al ser mayor

la cantidad de agua disponible, el grado de movilidad de los sustratos hacia las enzimas
es mayor. La actividad enzimática es prácticamente nula por debajo de una Aw de 0.3 y
es especialmente intensa por encima de 0.7. (Rodríguez 2008)

4.2.1. ​RESULTADOS INACTIVACIÓN ENZIMÁTICA POR CALOR

Fig 3: M
​ uestras de pera luego del tratamiento térmico e inactivación enzimática
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4.2.2. ​DISCUSIONES
En la figura 3, se puede observar el resultado de la exposición de las muestras de pera a
los tratamientos de temperatura en diferentes intervalos de tiempo; luego de la adición
de guayacol y peróxido de hidrógeno. Las muestras se encuentran en secuencia desde 1
hasta la 7 ordenadas de menor a mayor tiempo de exposición térmica.

Como podemos notar, las muestras con menor tiempo de tratamiento térmico muestran
mayor coloración que las muestras que estuvieron más tiempo en calor. El
oscurecimiento se debe probablemente a la actividad de las enzimas presentes en la
pulpa de la pera.
Se denomina pardeamiento enzimático a la transformación enzimática en sus primeras
etapas de compuestos fenólicos en polímeros coloreados, frecuentemente pardos o
negros (Cheftel, 1989).
Así también, el tiempo que duró la exposición juega un rol importante en el grado de
pardeamiento. La resistencia de las oxidasas al calor ha sido muy estudiada,
probablemente porque el calor sea el método más utilizado para la inactivación de estas
enzimas en procesos como blanqueamiento y pasteurización, pre tratamientos a los que
son sometidas las frutas y hortalizas antes de la apertización, congelamiento o
deshidratación, incluso en la obtención de jugos y purés (Eskin, 1990; Juárez, 2015).

El peróxido en el experimento sirve como sustrato a la enzimas peroxidasas propias de

la pera; mientras que el guayacol hace las veces de buffer y facilita la reacción. Tal como
lo describe Latorre et al. (2013), en el análisis de la inactivación enzimática aplicado a
muestras de jugo de fique:

“La actividad de la enzima POD (peroxidasa) muestra una reducción considerable con la
aplicación de tratamientos térmicos desde aproximadamente un 65% hasta un 98% de
su actividad inicial”.

En la misma investigación se afirma que:

“Inactivación térmica de polifenol oxidasa. La enzima PPO de jugo de fique entre 75 y

90ºC muestra una disminución significativa alrededor del 90% de su actividad inicial”.
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5. ​CONCLUSIONES
● Se observó la actividad enzimática de las enzimas presentes en la levadura durante el
proceso de fermentación en las harinas de habas y trigo, teniendo en cuenta el
tiempo y volumen.
● Se apreció visualmente las características de la pera, la cual al ser sometida a
tratamiento térmico, presentó niveles de pardeamiento que fueron decreciendo a
medida que se aumentaba el tiempo de exposición al calor.

6. ​BIBLIOGRAFÍA
● Aquarone, E., Borzani, W., Schmidell, W. & Lima, U. 2001. Biotecnología
industrial. Sao Paulo, Brasil: Editora Edgard Blücher Ltda.
● Bqca., B. 2008. Estudio del efecto de acciones químicas y biológicas sobre la
masa panaria. Tesis para obtención de título en ingeniería en industrias
alimentarias. Santa Fe, Argentina, Universidad Nacional del Litoral.
● Braverman, J. 1967. Introducción a la bioquímica de los alimentos. Ediciones
Omega, Barcelona- España.
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Disponible en:​ ​http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/enzimas/tirosinasa.html
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Editorial Acribia.
● Eskin, M. 1990. Bioquímica de alimentos. 2 Ed. USA: Academic Press.
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● Juárez, S. 2015. Influencia del blanqueado y secado de yacón (Smallanthus
sonchifolius Poepp. & Endl) en el contenido de azúcares y fructooligosacáridos”.
Tesis para obtención de título en ingeniería en industrias alimentarias. Lima, Perú.
Universidad nacional agraria la molina.
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 “AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCIÓN E IMPUNIDAD”
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https://www.academia.edu/8843707/DETERMINACI%C3%93N_DE_PEROXIDAS
_OBJETIVO
● VOET, D., VOET, J., & PRATTA, C. 2013. Fundamentals of Biochemistry. Life at
the Molecular Level. Editorial John Wiley & Sons. New Jersey (EE. UU.)