INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

ESPORAS BACTERIANAS, CAPSULAS Y GRÁNULOS METACROMÁTICOS

SÁNCHEZ GUIZADO ESTEFANNY ESTHER

LOANA CAMILA CURIEL CAMARGO
TORRES NÁJERA MARÍA JOSÉ
CASTILLA CARO ELIS MARÍA
ALFONSO MORALES LIBARDO
CAICEDO CATAÑO LUIS ALEJANDRO

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
MICROBIOLOGÍA
VALLEDUPAR/CESAR
2019
 INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
ESPORAS BACTERIANAS, CAPSULAS Y GRÁNULOS METACROMÁTICOS

SÁNCHEZ GUIZADO ESTEFANNY ESTHER

LOANA CAMILA CURIEL CAMARGO
TORRES NÁJERA MARÍA JOSÉ
CASTILLA CARO ELIS MARÍA
ALFONSO MORALES LIBARDO
CAICEDO CATAÑO LUIS ALEJANDRO

DONCENTE
GLORIA INÉS MORALES

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
MICROBIOLOGÍA
VALLEDUPAR/CESAR
2019
INTRODUCCIÓN
 OBJETIVOS

General.
 Identificar la presencia de capsulas, esporas y gránulos metacromáticas en
los procesos de tinción desarrollados en el laboratorio.
Específicos.
 Ampliar los conocimientos básicos sobre el tema.
 Llevar a cabo de manera satisfactoria todos los pasos para realizar las
distintas tinciones requeridas en el laboratorio.
 Identificar las características microscópicas que diferencian a las capsulas,
las esporas y los gránulos metacromáticos uno de otros.
 MARCO TEÓRICO
Esporas: Las esporas son células en reposo, formadas dentro de una célula
vegetativa mediante un proceso especial de división. Después de su maduración la
espora es liberada por lisis de la célula madre que la rodea.

Se caracterizan por su extrema refringencia causada por la presencia de una gruesa

pared especializada y por el bajo contenido de agua de la célula de reposo
encerrada.

Está constituida por un córtex compuesto en gran parte por un único péptido glucano
que contiene tres subunidades repetitivas. Además, contiene por fuera del córtex
una cubierta externa compuesta en su mayor parte de proteínas con un alto
contenido de cisteína y aminoácidos hidrofóbicos. La célula que está esporulando
presenta una elevada cantidad de ión Ca++.

La pared de las esporas es relativamente impermeable, sin embargo, los colorantes

pueden penetrarla si se calienta la preparación y la misma impermeabilidad sirve
para prevenir la decoloración. Las esporas se tiñen con verde de malaquita o
carbofuxina.

Capsulas: Muchos procariotas sintetizan polímeros orgánicos que se depositan en

el exterior de la pared celular, como una capa blanda más o menos amorfa
denominada cápsula o capa mucosa, que se pone de manifiesto claramente por
tinción negativa.

Están constituídas por exopolímeros que varían en su composición. Generalmente

son homo o heteropolisacáridos como levanos, dextranos, glucanos. En el caso del
Bacillus sp. es un péptido formado por ácido glutámico.
Generalmente, las cápsulas se ponen de manifiesto mediante una tinción negativa.

Las capsulas, por sus características químicas, no se tiñen normalmente con

colorantes como el cristal violeta o la safranina. Pero pueden observarse con una
tinción negativa, solamente se tiñe el medio circundante.

Gránulos metacromáticos: Los corpúsculos metacromáticos son gránulos de

reserva, normalmente fosfatos, que se encuentran en determinadas bacterias.
Suelen ser de gran tamaño. Se tiñen de manera determinada, debido a su
composición química, en presencia de colorantes.
Es una coloración simple y de gran utilidad para el género Corynebacterium.
Muchos microorganismos, tanto procarióticos como eucarióticos, pueden acumular
gránulos de volutina, que se tiñen con colorantes básicos tales como azul de
metileno. Estos cuerpos de denominan también gránulos metacromáticos, porque
presentan un efecto metacromático, viéndose rojos cuando se tiñen con un
colorante azul. En las micrografías electrónicas aparecen como cuerpos
extraordinariamente densos a los electrones. Los gránulos deben su
comportamiento metacromático a la presencia de grandes cantidades de polifosfato
inorgánico que constituyen una fuente de reserva intracelular de fosfato.
Endosporas bacterianas: Una endospora es una sustancia inactiva, resistente, no
reproductiva producida por una pequeña cantidad de bacterias de la
familia de Firmicute. La función primaria de las endosporas es sobrevivir en tiempos
de tensión ambiental. Por lo tanto son resistentes a la radiación ultravioleta y
gamma, a la desecación, a lisozima, a la temperatura, al hambre y a los
desinfectantes químicos. Las endosporas se encuentran comúnmente en
el suelo y el agua donde sobreviven por periodos de tiempo largos.
La termorresistencia de las endosporas es una de sus principales características.
Mientras que las bacterias o las formas vegetativas de las bacterias esporuladoras
sometidas a 80 ºC durante diez minutos (pasteurización) mueren, las endósporas
sobreviven e incluso soportan un calentamiento superior. Para eliminarlas son
necesarias técnicas de esterilización. Esta característica permite un fácil método
de aislamiento de las bacterias esporuladas, calentando el material donde se
supone que existen esporas a 100 ºC durante 10 minutos mueren todas las
bacterias y, seguidamente, las esporas sobrevivientes se hacen germinar y crecer
en el medio de cultivo adecuado.

Son formadoras de esporas las bacterias bacilares Gram positivas, entre ellas, las
pertenecientes al género Bacillus son aeróbicas y las del
género Clostridium anaeróbicas. Un aspecto interesante es que el contenido de
GC de este tipo de bacterias es bajo, los clostridios contienen la menor proporción
de GC de los procariotas: 22 al 27 %.

Estructura: En contraste con las esporas eucariontes, que son producidos por
muchos eucariontes para propósitos reproductivos, las bacterias solo producen una
endospora internamente en ambientes desfavorables. La espora es a menudo
cubierta por una cubierta fina conocida como exosporium, que cubre la capa de
espora. La capa de la espora es impermeable a muchas moléculas tóxicas y puede
también contener las enzimas implicadas en la germinación. La corteza se
encuentra debajo de la capa de la espora y consiste en peptidoglucano. La pared
de la base se encuentra debajo de la corteza y rodea al protoplasto o base de la
endospora. La base tiene estructuras normales de la célula tales como: ADN y
ribosomas, pero tiene un metabolismo inactivo.
Hasta el 15% de la endospora consiste en calcio en la base, que se piensa se utiliza
para estabilizar el ADN. El ácido Dipicolínico podría ser responsable de
la resistencia térmica de la espora y el calcio puede ayudar a la resistencia al calor y
a los agentes que oxidan. Sin embargo, los agentes mutágenos se encuentran
aliados, sugiriendo que existen otros mecanismos que contribuyen a la resistencia
térmica.
Localización: La posición de la endospora diferencia entre especies bacterianas y
es útil en la identificación. Los tipos principales dentro de la célula son: terminales,
subterminales y endosporas centralmente puestos. Las endosporas terminales se
encuentran en los polos de la célula, las endosporas centralmente puestos están
normalmente en el centro. Las endosporas subterminales se encuentran en los
extremos, lo suficientemente lejos de los polos, pero no lo bastante cercanos al
centro para ser considerados central.
Las endosporas son difíciles de observar al microscopio debido a la
impermeabilidad de su pared que evita la entrada de las tinciones ordinarias.
Mientras el resto de la bacteria puede teñirse, la endospora permanece descolorida.
Formación y destrucción: Cuando una bacteria percibe condiciones ambientales
desfavorables, comienza el proceso de esporulación, el cual llega a durar cerca de
10 horas. Se repliega el ADN y una pared de la membrana conocida como tabique
se comienza a formar. La membrana de plasma de la célula rodea esta pared
formando una doble membrana alrededor del ADN y la estructura se convierte
ahora en lo que se conoce como forespora. El calcio se incorpora a la forespora.
La corteza se forma después entre las dos capas y la bacteria agrega una capa más
a la forespora. La esporulación es completa ahora, y la endospora es lanzada
cuando se degrada la célula vegetativa.
La endospora es resistente a la mayoría de agentes que matarían normalmente a
las células vegetativas. Los productos de limpieza de la casa generalmente no
producen ningún efecto, ni la mayoría de alcoholes, compuestos de amonio o de los
detergentes, sin embargo el óxido de etileno es eficaz contra las endosporas.

Esporulación
la esporulación comprende:

 una división asimétrica, durante la cual el futuro protoplasto de la espora

recibe el material nuclear correspondiente. A diferencia de una división
común, el estrangulamiento del protoplasto de la célula materna no es
seguido por el de la pared celular entre los dos protoplastos hijos.
 a posteriori el protoplasto de la futura espora es rodeado por la membrana
citoplasmática de la otra célula resultante de la división, siendo finalmente
englobada por la misma (ver esquema).
  el resultado de este englobamiento es que la futura espora está rodeada
por dos membranas citoplasmáticas que intervendrán en la fase final de la
espora sintetizando
 la membrana del protoplasto de la espora sintetiza hacia el exterior la pared
celular
 la membrana del protoplasto procedente de la otra célula sintetiza hacia el
interior el cortex de la espora, compuesto de un glucopéptido similar a la
mureína pero con mayor cantidad de enlaces transversales.
 esta otra célula forma en algunos casos el exosporio, que rodea a la espora
como una envoltura suelta.

 El material de las envolturas representa casi el 50% del peso seco de la

espora madura.
El proceso someramente descrito es uno de los fenómenos de diferenciación
más complejos de la célula bacteriana. Entre las transformaciones químicas
y físicas que acompañan a los cambios morfológicos destaquemos:
 concentración del material proteico en la zona de formación de la espora
 en razón de la concentración de material aumenta el índice de refracción de
la zona
 utilización del material de reserva (poli-beta-hidroxibutírico, en anaerobios y
polisacáridos en aerobios) para procesos de degradación y síntesis
 síntesis de ácido dipicolínico, especifico de las esporas, no se lo encuentra
en las células vegetativas. Este ácido se combina en forma de quelato con
iones Ca++. Se localiza en el protoplasto de las esporas termorresistentes.
 se liberan por autolisis de las células maternas

Propiedades

 no presentan actividad metabólica

 gran resistencia al efecto del calor
 gran resistencia al efecto de las radiaciones
 gran resistencia al efecto de los productos químicos

La resistencia a los efectos del calor se atribuye al bajo contenido de agua (aprox.
15%) y al contenido de ácido dipicolínico.
La resistencia al efecto de las radiaciones se atribuye a la presencia de puentes
disulfuro, resultante de la presencia de cisteína en las proteínas de la cubierta
externa.
La resistencia al efecto de los productos químicos debe atribuirse a
la impermeabilidad que presenta en esos casos la cubierta de la espora.
Germinación
El proceso por el cual las esporas pasan a formar células vegetativas se denomina
germinación. Ocurre cuando se las coloca en el medio adecuado y se requiere en
muchos casos la disponibilidad, entre otros, de glucosa, aminoácidos y nucleósidos.
Es posible elevar el porcentaje de esporas que germinan con un shock térmico.

Entre los fenómenos de la germinación destaquemos:

 perdida de la resistencia térmica

 aparición de la respiración
 aparición de actividad enzimática
 excreción de ácido dipicolínico, péptidos y aminoácidos
 ruptura de las cubiertas y aparición del "tubo germinativo"(origen de la célula
vegetativa)
 MATERIALES

 Microscopio
 Papel absorbente
 Fósforos
 Alcohol y algodón
 Porta objetos y cubreobjetos
 Aceite de inmersión
 Asa redonda
 Mechero
 Coloración de Wirtz (verde malaquita)
 Coloración de Albert (azul de metileno y Lugol)
 Tinta china
 Coloración de Gram
 Solución salina
 Cultivos: Bacillus, Klebsiella, Corynebacterium
 PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

Nota: antes de cada laboratorio que requiera el uso de microscopio se debe limpiar
cuidadosamente antes, durante y después de la práctica con alcohol y algodón.
También a la hora de realizar los extendidos debe estar encendido el mechero.

Procedimiento 1: coloración de esporas bacterianas

se realizaron dos extendidos con cultivos de Bacillus,
uno para colorear con tinción de Gram y el otro con
coloración de wirtz conklin (verde malaquita).

Tinción de Gram: una vez seco el extendido a

temperatura ambiente, se fijó con calor y se realizó la
coloración de la siguiente manera:
Cristal violeta: 1 minuto y se lavó
Lugol: 1 minuto y se lavó
Alcohol: 1 minuto y se lavó

Se dejo secar la muestra para luego ser observada

en el microscopio en el objetivo de inmersión(100x).

Resultado: Se observaron esporas incoloras y

bacilos de color rosado. Pero en la literatura nos dice
que los bacillus son de Gram positivos por lo que
pudo haber un error en la coloración de estos.
Coloración de Wirtz (verde malaquita): Con el otro
extendido ya seco, se fijó dos veces por medio del
color, se cubrió toda la lámina con verde malaquita y
con un mechero se flameo por debajo del extendido
hasta la emisión de vapor sin dejar hervir el colorante,
se repitió el procedimiento por 10 minutos, luego se
lavó.

Después se agregó safranina durante 2 minutos y se

lavó, se dejó secar la muestra a temperatura
ambiente para luego ser observado en el objetivo de
inmersión.
Resultados
Se observaron las esporas pequeñas ovaladas o
redondas de color verde y algunas endosporas; no se
lograron ver muchas por lo que apenas se estaban
esporulando los bacilos y estos eran de color rojo.

Procedimiento 2: coloración de Albert (gránulos

metacromáticos)

Una vez realizado el extendido con el cultivo de

corynebacterium y seco a temperatura ambiente se
cubrió la lámina con Albert (azul de metileno) por 5
minutos y luego se lavó. Se cubrió con Lugol por 2
minutos, se lavó con agua de la lleve y se dejó secar
temperatura ambiente para luego ser observado en el
objetivo de inmersión
Resultados

Se observaron los bacilos de color azul pálido y los

gránulos metacromáticos algunos en todo el cuerpo
del bacilo, pero en su mayoría se encontraban en los
extremos del cuerpo del bacilo de un color azul
oscuro.
Procedimiento 3: coloración de tinta china
(capsulas)

Se depositó en un extremo de la lámina una gota de

tinta china, se tomó una pequeña cantidad de la
bacteria klebsiella y se revolvió con la tinta, se realizó
el extendido con otro portaobjeto.

Una vez seco a temperatura ambiente, se fijó el

extendido por medio de calor y se cubrió el extendido
con cristal violeta por 2 minutos, se lavó
cuidadosamente para no arrastrar el extendido, se
dejó secar a temperatura ambiente para luego ser
observado en el objetivo de inmersión.
Resultados

Se observaron las capsulas incoloras (blancas) con

mayor claridad gracias a la tinta china y los bacilos de
color morado.
 CONCLUSIÓN

 Después de haber realizado los procedimientos expuestos previamente se

pudo apreciar todas las estructuras bacterianas que se buscaba determinar
capsulas, esporas bacterianas y gránulos metacromáticos, así mismo gracias
a las consultas realizadas, se pudo aprender más sobre las funcionalidades
de dichas estructuras.
 Durante esta práctica logramos identificar las diferentes coloraciones para
teñir y determinar esporas bacterianas, capsulas y gránulos metacromáticos
y sus diferentes coloraciones para identificar cada una de estas según la
tinción que se realizo
 Se logró visualizar esporas bacterianas, aplicando las tinciones como la de
wirtz contlin (en esta técnica la verde malaquita requiere calor para penetrar
la célula y teñir la espora). Igualmente se identificaron esporas de color verde
y bacterias de color rojo.
 Finalmente es importante hacer una buena toma y extendido de la muestra
para identificar bien los microorganismos presentes.
 CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la función de los cuerpos de inclusión (gránulos
metacromáticos)
Son acúmulos de sustancias orgánicas o inorgánicas, rodeadas o no de una
envuelta limitante de naturaleza proteínica, que se originan dentro del citoplasma
bajo determinadas condiciones de crecimiento. Constituyen reservas de fuentes
de C o N (inclusiones orgánicas) y de P o S (inclusiones inorgánicas). Su función
es la reserva.

2. ¿Por qué las capsulas no toman los colorantes? ¿Cuál es la principal

función de esta estructura?

No son una verdadera tinción. Se llaman así porque lo que realmente se tiñe es
el fondo sobre el que están los microorganismos apareciendo los
microorganismos sin teñir. Se emplea para ver la cápsula de S.
pneumoniae y Cryptococcus neoformans en LCR.

3. ¿Para qué se utiliza el calentamiento en la coloración de Wirtz Conklin?

4. ¿Por qué las esporas no se colorean con la coloración de Gram?

BIBLIOGRAFIA
 Díaz R Gamazo C y López Goñi I. 1999. Manual práctico de microbiología.
Edición Masson
 http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro7.htm
 https://prezi.com/foxuxue3gh9q/tincion-de-granulos-metacromaticos/
 https://es.slideshare.net/iltaitDes/tinciones-selectivas