GUIAS DE LABORATORIO DE BIOLOGIA

LABORATORIO # 7
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS Y BACTERIAS

Objetivos
1. Conocer procesos de preparación en fresco y en cinta adhesiva de distintas
especies de hongos
2. Observar la morfología de los hongos y distinguir las diferentes estructuras
que presenta.
3. Implementar algunas técnicas de tinción para observar las diferentes
morfologías bacterianas.
4. Comprender y explicar la vitalidad de los colorantes en la identificación de
estructuras celulares
INTRODUCCION
Para realizar el estudio microbiológico, ya sea humana o animal, vegetal, hongo,
industrial o del medio ambiente, se debe someter a una serie de procesos
estandarizados de laboratorio, que permitan reconocer los microorganismos. Las
coloraciones permiten diferenciar formas, agrupaciones, características tintoriales y
estructuras de los diferentes microorganismos en las muestras.
La célula es un microcosmos con limites definidos por una membrana celular, dentro
de la cual se desarrolla continuamente una gran actividad bioquímica; constituye un
sistema organizado complejo, dinámico y autoregulado de moléculas y agregados
moleculares, que toma y emplea energía del medio que la rodea para utilizarla en
fenómenos de biosíntesis, crecimiento y reproducción celular.
La citología trata de definir la diversidad de células, para comprender su
organización y estructura, en relación con su función; y ver a la célula no solo como
una entidad individual independiente, sino como parte integrante de tejidos, órganos
y sistemas complejos de los seres vivos. La actividad de un organismo es el
resultado de la sumatoria de las actividades de las células que lo componen y de
sus interacciones.
El perfeccionamiento del microscopio y desarrollo de nuevas técnicas han permitido
a los bioquímicos conocer la composición química, estructura y reacciones químicas
que se producen en las células, y relacionados con su estructura.
Muchos principios biológico fundamentales se han descubierto a través de la
observación de células aisladas y de experimentación sobre ellas. Para estudiar en
detalle la estructura y morfología celular, es necesario el uso de tejidos previamente
preparados.
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Los hongos que son los organismos del reino Fungi, incluyen mohos y levaduras.
El ambiente está cargado de esporas de diversos hongos y, por lo general, estas
flotan en el aire. Entre la amplia variedad de esporas que caen sobre la piel o son
inhaladas hacia los pulmones solo algunos producen infecciones menores, y solo
rara vez se extienden hacia otras partes del organismo. Algunos pocos tipos de
hongos, como las variedades de Candida, pueden vivir normalmente sobre la
superficie del cuerpo o dentro del intestino. Estos habitantes habituales del
organismo solo ocasionalmente pueden causar infecciones locales de la piel, la
vagina o la boca, pero muy rara vez producen más daño. En ciertos casos, no
obstante, determinadas variedades de hongos pueden producir infecciones graves
de los pulmones, el hígado y el resto del cuerpo.
Los hongos obtienen los nutrientes por absorción y tienen un metabolismo
quimioheterótrofo, ya que obtienen la energía y el carbono de compuestos orgánicos
sintetizados por otros organismos. Este hecho condiciona su modo de vida, ya que
en la naturaleza se encuentran asociados a la materia orgánica en descomposición,
participando en los ciclos naturales de reciclado del carbono y otros elementos
naturales o Bial - Arístegui 3 4 Rev Iberoam Micol 2002 como patógenos
oportunistas de los animales y plantas. Los hongos pueden degradar una gran
cantidad de componentes, para lo que disponen de potentes exoenzimas que en
algunos casos pueden servirles como factores de virulencia en el hospedador. En
el laboratorio, los hongos crecen fácilmente en la mayoría de los medios de cultivo,
necesitando una fuente de carbono orgánica e iones amonio o nitrato como fuentes
de nitrógeno. Esta facilidad para crecer en cualquier medio de cultivo y la presencia
de conidios en el aire hace que sean contaminantes habituales en el laboratorio.
Los hongos filamentosos son aerobios y los levaduriformes anaerobios facultativos.
Sus requerimientos de temperatura y de pH son poco exigentes y la mayoría crecen
en un rango de pH de 2 a 9 y a temperaturas entre 10 y 40 °C. La mayoría de los
hongos presentan reproducción sexual y asexual. El estado sexual se denomina
teleomorfo o meiospórico y el asexual anamorfo o mitospórico. Es relativamente
común que un mismo hongo tenga dos nombres, el del estado anamorfo y el del
estado teleomorfo, ya que suelen haberse descubierto y nombrado de forma
independiente. En un grupo importante de hongos solamente se conoce la
reproducción asexual, bien porque no se conocen las condiciones adecuadas para
que se desarrolle la forma sexual o porque ésta se ha perdido a lo largo de la
evolución. Aunque la reproducción asexual puede lograrse por fragmentación de las
hifas, ya que cada fragmento puede producir una nueva colonia, normalmente los
hongos se reproducen, tanto sexual como asexualmente, por medio de esporas.
Los hongos producen millones de esporas, cada una con la capacidad para
desarrollar una nueva colonia. Las esporas sexuales se producen tras la fusión de
los núcleos de dos hifas sexualmente compatibles o de dos levaduras y posterior
meiosis. La morfología de las esporas sexuales es muy variada y tiene gran interés
para la identificación fúngica, ya que presentan diferencias características.
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COLORACIONES
Los colorantes biológicos tienen varias aplicaciones en microbiología, se usan para
clasificar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, también para observar
las diferentes estructuras microbianas como pared, capsula, espora, flagelo, núcleo
y gránulos, tienen utilidad para la observación de levaduras y estructuras, en medios
de cultivo se emplean como indicadores o inhibidores selectivos. La morfología
bacteriana se puede observar claramente por medio de coloración de las células.
En las técnicas de coloración, las bacterias están muertas por el hecho de fijar con
calor la muestra a la lámina y por el mismo proceso de coloración. Al aplicar un
colorante a la preparación microbiana, las bacterias se tiñen haciéndolas resaltar
con claridad, debido a la composición química tan diferente con respecto al medio
que las rodea, además permite estudiar las características morfológicas y emplear
mayores amplificaciones microscópicas. Al poner en contacto una célula bacteriana
con un colorante, ocurre un intercambio de iones entre el colorante y los sitios
activos de la superficie o del interior de la célula. Los iones tenidos del colorante
reemplazan a los iones de los componentes celulares, por ejemplo, el catión azul
de metileno, reemplaza el catión de sodio, dándoles el color. Según la estructura
que el colorante tiñe en la bacteria, las coloraciones se han clasificado en:
-Coloraciones simples: En las que se emplea un solo colorante para el proceso,
por ejemplo: azul de metileno, cristal violeta, fucsina básica y safranina.
-Coloraciones compuestas y diferenciales: En estas se usa más de un colorante,
y con la misma coloración las células se tiñen de manera diferente. Ejemplo: Tinción
de Gram, Ziehl Neelsen.
-Coloraciones especiales o selectiva: permiten la observación de estructuras
especiales de la bacteria como esporas, glicocálix, cápsulas, flagelos, etc. Ejemplo:
Wayson (esporo), Leifson (flagelo), rojo congo (coloración ácida) (glicocalix,
cápsula), Van Stoltemberg (gránulos metacromáticos).
-Coloración de Gram: La coloración de Gram fue descrita en 1884, por el citólogo
Christian Gram, para teñir bacterias presentes en los tejidos. Actualmente continúa
siendo la más empleada en microbiología, está clasificada como una coloración
compuesta y diferencial, debido a que en el proceso se utilizan dos colorantes: el
cristal violeta y la fuscina básica, y dependiendo del colorante que toma la pared
bacteriana y dos grandes categorías denominadas: Gram positivas (se tiñen de
cristal violeta) y las Gram negativas (toman el color de la fuscina básica). Esta
diferenciación es fundamental para establecer específicamente el tratamiento con
antibióticos. La reacción tintorial que presentan las bacterias al ser coloreadas con
Gram demuestra una composición química y estructural de la pared, pues se
evidencia también el comportamiento bacteriano específico frente a agentes físicos
y químicos. Reacción de las células frente a los componentes de la coloración de
Gram.
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La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la

tinción de Gram (1884). Las propiedades de teñirse o no de violeta oscuro (Gram
positivas o Gram negativas) por esta coloración es un criterio de clasificación
importante correlacionable con otras propiedades bacterianas. Unos pocos
organismos son Gram variables. Tanto las Gram positivas como las Gram negativas
captan la misma cantidad de cristal violeta e yodo. El complejo CV-I sin embargo es
atrapado dentro de la célula Gram positiva por la deshidratación y la reducción del
tamaño de los poros de la pared resultante del proceso de lavado con solvente. En
contraste en las Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de
peptidoglicano no impide la extracción por el solvente del complejo. Avala lo
antedicho el hecho que, si después de su tinción se tratan con lisosoma bacterias
Gram positivas, se ve que los protoplastos siguen teñidos, pero pierden el colorante
si se los trata con alcohol. Esto indica que el colorante es fijado a nivel del
protoplasto, y que la pared celular de las bacterias Gram positivas es la que impide
la extracción del colorante. Corroborando esta suposición se observa que cuando
B. subtilis emerge de su espora su pared celular está inmadura y se comporta como
Gram negativas. Cuando la pared celular adquiere su estructura final pasa a ser
Gram positiva. La pared bacteriana está compuesta por elementos comunes para
la mayoría de especies como son peptidoglucano, ácido diaminopimélico, y
componentes especiales que están presentes solo en algunas especies como ácido
teicoico – teicurónico en Gram positivas, lipopolisacaridos en Gram negativas, ácido
micólico – arabinogalactano en mycobacterias, formas meso – levo de ácido
diaminopimélico o carencia de ellas como sucede en Actinomices, Streptomyces y
Nocardias, ausencia de peptidoglucano en Micoplasma y Ureaplasma.
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MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR

 Microscopio
 Caja de petri
 Asa bacteriológica
 Beaker
 Mechero de alcohol
 Pipeta pasteur
 Estilete
 Puente de coloración

REACTIVOS A UTILIZAR

 Azul de metileno
 Azul de lactofenol
 Cristal violeta
 Lugol
 Safranina o fucsina básica
 Alcohol cetona
 Aceite de inmersión

MATERIALES QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

 Portaobjetos
 Laminillas cubreobjetos
 Pan con Moho
 Fruta cítrica con moho
 Yogurt con probióticos (Preferiblemente Regeneris)
 Vinagre de plátano
 Levadura
 Guantes descartables
 Cinta transparente de grosor 2 cm
 Palillo
 Sarro dental
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PROCEDIMIENTO

Una semana antes de realizar el laboratorio se deberán cultivar hongos, los cuales
serán observados en el laboratorio. En diferentes frascos de vidrio de plástico o
vidrio de boca ancha, colocar los siguientes materiales: a) un trozo de pan de marca
o de panadería, b), un trozo de naranja o limón en descomposición. Dejar la caja a
la intemperie un día en un lugar sombreado y después taparla. Colocar los frascos
de preferencia en un lugar fresco por cinco días y llevarla posteriormente al
laboratorio.

-Técnica cinta adhesiva: colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de

lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la
preparación quede demasiado gruesa. Cortar un trozo de cinta adhesiva
transparente de aproximadamente 2cm. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la
superficie de la fruta o el pan enmohecidos. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota
del portaobjetos como se observa en la figura 1. Eliminar el colorante sobrante con
un papel de filtro. Llevar al microscopio y observar en 10x y 40x. realizar los
respectivos dibujos.

Observación de levaduras

Coloque una gota de solución de levaduras con azul de lactofenol sobre un

portaobjetos, cúbrala con una laminilla cubreobjetos y examine cuidadosamente al
microscopio con el objetivo de menor aumento de mayor aumento. Esquematice a
través de un dibujo las estructuras observadas, le serán de gran como modelo de
comparación.

Figura 1 Moho del pan

Hongo fruta cítrica Levadura

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Una vez observado los hongos resuelve las siguientes preguntas

1. ¿En qué consisten las diferencias que presentan los hongos encontrados o
desarrollados en los distintos materiales?
2. ¿Qué origen tienen olores que despiden los diferentes alimentos? Señalar si
éstos pueden indicar cuál sustancia o compuesto degradan los hongos
3. Tras realizar las observaciones con el microscopio compuesto, qué estructuras
se pueden identificar en los organismos observados.
4. Con base en las características observadas en los diferentes organismos, ¿Cómo
se clasifican los organismos observados?
5. Realizar un esquema con las divisiones del reino hongo o fungi.

Bacterias del Yogur.

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra.
2. Tomar una muestra (gota) de yogur y expandirla en el portaobjeto, mezclarla bien
con el agua.
3. Dejar secar y fijar al calor.
4. Teñir 2 o 3 minutos con azul de metileno, lavar el exceso de colorante y dejar
secar.
5. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el
portaobjeto a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución
de no calentar demasiado el portaobjeto pues las células pueden deformarse o
romperse.
6. Observar en microscopio con los objetivos de 40x y 100 x. Para el objetivo de
100x aplicar aceite de inmersión y observar.
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Bacterias del Vinagre

1. Tomar una muestra (gota) de vinagre y expandirla en el portaobjeto.
2. Dejar secar y fijar al calor
3. Teñir con azul de metileno por 2 o 3 minutos, lavar el exceso de colorante y dejar
secar.
4. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el
portaobjeto a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución
de no calentar demasiado el portaobjeto pues las células pueden deformarse o
romperse.
5. Observar en microscopio con los objetivos de 40x y 100 x. Para el objetivo de
100x aplicar aceite de inmersión y observar

Bacterias del Sarro Dental

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra.
2. Tomar con un palillo una porción del sarro dental y expandirla en el portaobjeto.
3. Dejar secar y fijar al calor
4. Teñir con azul de metileno 2 o 3 minutos, lavar el exceso de colorante y dejar
secar.
5. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el
portaobjeto a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución
de no calentar demasiado el portaobjeto pues las células pueden deformarse o
romperse.
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6. Observar en microscopio con los objetivos de 40x y 100 x. Para el objetivo de

100x aplicar aceite de inmersión y observar.

TINCION DE GRAM
1. Preparar los frotis bacterianos (Yogurt, vinagre y sarro dental) descrito
anteriormente
2. Teñir con cristal violeta 1min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la
preparación deje de perder color (30seg)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
8. Teñir con safranina o fucsina básica 1min.
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparación.
11. Observar en microscopio con los objetivos de 40x y 100 x. Para el objetivo de
100x aplicar aceite de inmersión y observar.
12. Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de cada preparación.
Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se
prepara la batería de colorantes para realizar la tinción Gram presentan algunas
diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser
necesario ajustar los tiempos
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Morfología y agrupaciones bacterianas

Para investigar
1. Describa las características más importantes de las bacterias, realizar esquemas
de las formas que presentan y los tipos de agrupaciones que presentan.
2. Realizar una revisión de las aplicaciones de células bacterianas más importantes
a nivel ambiental e industrial.
3. Busque en esquemas (dibujos) las formas y agrupaciones bacterianas y dibújelas
4. De 3 razones por las que a una muestra se le debe realizar la coloración de Gram
5. Mencione 5 bacterias Gram positivas y 5 Gram negativas.
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6. Explique porque las bacterias gram negativas se tiñen de rosado a diferencia de

las gram positivas (morado) siendo el procedimiento de tinción el mismo
7. Cuál es el propósito de flamear la muestra.
8. Cómo argumenta usted la presencia de bacterias en el yogurt

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Qué diferencias existe entre un desinfectante y un antiséptico
2. En qué consiste el proceso de esterilización y la importancia de este.
3. Explique la importancia de la pasteurización de la leche

BIBLIOGRAFIA.

1. Audesirk T. Audesirk T. Biología. 4ta. Edic. México, Prentice Hall. 1996.

2. Gerald Karp. Biología Celular. 3era. . Edic., México, MACGRAWHILL. 1998.
3. Bretsher, M.S. “The Molecules of the Cell Membrane”. Scientific American,
Octubre, 1985.

DIAGRAMA DE FLUJO
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