Vaca Repetidora

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
Trabajo de Tesis para optar por el título de Doctor en Ciencias Veterinarias
DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE VACAS REPETIDORAS

EN TAMBOS DE LA CUENCA ABASTO SUR
Autor: MV, María Jaureguiberry
Director: MV, MSc, PhD, DECAR, Rodolfo Luzbel de la Sota
Codirector: MV, PhD, Marcelo Pecoraro
Lugar de Trabajo: Laboratorio de Reproducción Animal,

Laboratorio de Virología,
Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Nacional de La Plata
Miembros del Jurado:

MV, MSc, PhD, DACT, Julián Bartolomé
MV, DrCsVet, Santiago Callejas
MV, DrCsVet, Luis Fazzio
La Plata, 3 de julio de 2017

II
“Hay una fuerza motriz más poderoso que el vapor, la electricidad y la energía
atómica: la voluntad”
Albert Einstein
III
DEDICATORIA
A mi esposo Juan Martín y a mi hija Rosario,
A mis padres Catalina y Alejandro.

IV
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, quiero agradecer a mi director de tesis, el Dr. R. Luzbel de
la Sota, por brindarme con generosidad sus conocimientos y experiencias en el área
científica, por confiar en mí y darme la posibilidad de conocer otros grupos de
trabajo y sobre todo por su gran corazón.
Agradezco también a mi codirector, el Dr. Marcelo Pecoraro, y
especialmente al Dr. Marco Tizziano, por haberme guiado en el estudio de
expresión génica y haberme brindado su laboratorio para realizar todas las pruebas
necesarias.
A la Dra. Vanina Madoz y al Dr. Mauricio Giuliodori, quienes a través de
sus conocimientos y experiencias me han ayudado, aconsejado y apoyado en la
realización de este trabajo.
Al Dr. Tomás B. Díaz Pernía, quien, con gran calidez y total desinterés, me
brindó todo lo que tenía a su disposición para que pueda llevar a cabo este trabajo.
Además, le agradezco por haberme transmitido sus conocimientos sobre esta
hermosa profesión y sobre los valores importantes de la vida.
A las Dras. Silvina Quintana, Maia Marín y Mercedes Burucua por
brindarme su valiosa ayuda en el procesamiento de las muestras correspondientes
al estudio de expresión génica. Realmente fue un placer trabajar con ellas.
A los colegas veterinarios Tomás Díaz Pernía, Edgardo Alvarez, Roberto
Chiavonne, Ignacio, Conrado, Juan Francisco y Norberto Céspedes, Santiago
Uranga, Sebastián Rollie, Javier Roldán, Germán Domínguez y Horacion
Lagomarcino por haber colaborado con los muestreos y con la recolección de datos.
V
A los productores y personal de trabajo, por haberme permitido, con total
generosidad, utilizar sus animales para los trabajos experimentales y colaborar
durante los muestreos.
A todos los integrantes de la Cátedra de Reproducción Animal,
especialmente a Lore, Walter, Joaquín, Facundo y Ramiro por brindarme su ayuda
cada vez que la necesité y por todos los gratos momentos que hemos pasado juntos.
A los Drs. Marc Drillich y Monika Ehling-Schulz por haberme dirigido en
el experimento correspondiente al capítulo IV, y a todo su equipo de trabajo por su
colaboración en la realización del mismo.
A la Dra. Afra Mang, por haber colaborado en la primera etapa de este largo
trabajo.
A la Universidad Nacional de La Plata, por haberme permitido realizar mis
estudios de grado, y por haberme becado para iniciar mis estudios de posgrado.
Al CONICET, por haberme becado para finalizar mis estudios de posgrado.
A los jurados por sus sugerencias y correcciones que permitieron enriquecer
el trabajo.
A mi familia, mis padres, hermanas, tías, cuñados y sobrinos; por el cariño
y apoyo incondicional de siempre.
A Juan Martín, mi esposo, por ayudarme con los muestreos cuando yo no
podía realizarlos y porque junto a Rosario, nuestra hija, llenan mis días de felicidad.
VI
INDICE
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................... IX
LISTA DE TABLAS .............................................................................................X
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................... XI
PUBLICACIONES REALIZADAS DE LA TESIS ....................................... XII
TITULO: DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE VACAS

REPETIDORAS EN TAMBOS DE LA CUENCA ABASTO SUR ............ XIV
RESUMEN ........................................................................................................ XIV
SUMMARY ...................................................................................................... XVI
CAPÍTULO I ......................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN GENERAL ............................................................................ 1
CAUSAS ................................................................................................................. 3
1. Factores externos ........................................................................................... 3

1.2. Desbalance nutricional ............................................................................. 3
1.2. Problemas de manejo ................................................................................ 6
2. Factores internos ............................................................................................ 7

2.1. Infecciones ................................................................................................ 7
2.2. Desbalances hormonales .......................................................................... 9
2.3. Factores genéticos .................................................................................. 10
TRATAMIENTOS .............................................................................................. 11
ÚLTIMOS AVANCES EN VACAS REPETIDORAS .................................... 15
OBJETIVO GENERAL ..................................................................................... 16
OBJETIVOS PARTICULARES ....................................................................... 16
HIPÓTESIS RELEVANTES ............................................................................. 17

VII
CAPÍTULO II ..................................................................................................... 19
DIAGNÓSTICO, PREVALENCIA Y TRATAMIENTO DE VACAS

REPETIDORAS CON Y SIN ENDOMETRITIS SUBCLÍNICA .................. 19
INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 19
MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................... 22
Diseño experimental .......................................................................................... 22
Análisis estadístico ............................................................................................ 26
RESULTADOS.................................................................................................... 27
DISCUSIÓN ........................................................................................................ 30
CONCLUSIONES ............................................................................................... 33
CAPÍTULO III .................................................................................................... 34
COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA ENDOMETRIAL EN

VACAS REPETIDORAS Y VACAS FÉRTILES DURANTE EL DIESTRO
............................................................................................................................... 34
INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 34
RESULTADOS.................................................................................................... 46
DISCUSIÓN ........................................................................................................ 48
CONCLUSIONES ............................................................................................... 52
VIII
CAPÍTULO IV .................................................................................................... 54
IDENTIFICACIÓN DE ESCHERICHIA COLI Y TRUEPERLLA

PYOGENES POR MARCHA BACTERIOLÓGICA CONVENCIONAL Y
ESPECTROSCOPIA INFRARROJA TRANSFORMADA DE FOURIER EN
VACAS LECHERAS .......................................................................................... 54
INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 54
RESULTADOS.................................................................................................... 60
DISCUSIÓN ........................................................................................................ 61
CONCLUSINES .................................................................................................. 65
CONCLUSIONES GENERALES ..................................................................... 66
BIOGRAFÍA PERSONAL ................................................................................. 68
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 70
APÉNDICE I ....................................................................................................... 87
IX
LISTA DE ABREVIATURAS
ATB Antibióticos
BE Benzoato de estradiol
CB Cytobrush
CC Condición corporal
DIV Dispositivo intravaginal
dpp Días postparto
E2 Estrógenos
EC Endometritis clínica
EGF Factor de crecimiento epidérmico
ES Endometritis subclínica
IA Inseminación artificial
IATF Inseminación artificial a tiempo fijo
im Intramuscular
IPC Intervalo parto concepción
P4 Progesterona
PMN Polimorfo nucleares neutrófilos
RT-qPCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa
inversa en tiempo real
SVR Síndrome de Vaca repetidora
US Ultrasonografía
VR Vacas Repetidoras
X
LISTA DE TABLAS
Tabla Página
1.1. Desempeño reproductivo de vacas en lactancia sin problemas reproductivos
y desempeño reproductivo de vacas repetidoras (adaptado de Yusuf y col.,
2010).............................................................................................................2
2.1. Análisis descriptivo de las vacas repetidoras incluidas en el estudio.........29
2.2. Efecto del líquido en la luz uterina sobre el porcentaje de preñez a la primera
inseminación artificial post muestreo en vacas repetidoras .......................29
2.3. Aislamientos bacterianos de vacas repetidoras con y sin endometritis
subclínica ....................................................................................................29
2.4. Efecto de la endometritis subclínica en el porcentaje de preñez a la primera
inseminación de vacas repetidoras diagnosticadas por cytobrush o por
ultrasonografía ............................................................................................30
2.5. Efecto del tratamiento realizado a vacas repetidoras con o sin endometritis
subclínica sobre el riesgo de quedar preñadas a la primera inseminación
artificial ......................................................................................................30
3.1. Secuencia de las cebadores forward (F) y reverse (R), tamaño del producto
de PCR y su referencia ...............................................................................45
4.1. Efecto del grado de descarga vaginal en el riesgo de aislar Escherichia coli
y Trueperella pyogenes en vacas lecheras .................................................62

XI
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1.1. Efecto del balance energético negativo (BEN) profundo sobre la
reproducción .................................................................................................5
1.2. Efecto de la disminución de la pulsatilidad de LH y/o anormal concentración
de metabolitos en sangre (glucosa, ácidos grasos no esterificados, β-
hidroxibutirato) sobre la reproducción en vacas lecheras .............................. 6
2.1. Diseño experimental y asignación de tratamientos correspondientes a cada
grupo ...........................................................................................................26
3.1. Comparación de la expresión relativa de ARNm del receptor del factor de
crecimiento epidérmico (EGFR), factor Nodal (FNod) y de la enzima
prostaglandina-endoperóxido sintasa (PTGS2) en vacas repetidoras (VR) y
vacas fértiles (CF) ......................................................................................48
3.2. Comparación de la expresión relativa de ARNm del receptor de estradiol
(ER) y del receptor de progesterona (RP) en vacas repetidoras (VR) y vacas
fértiles (CF) ................................................................................................49

XII
PUBLICACIONES REALIZADAS DE LA TESIS
Congresos
1. Jaureguiberry M, Mang AV, Drillich M, de la sota RL. 2013. Diagnosis
and treatment of repeat breeder cows in dairy herds from Argentina.
International Meeting of the Society for Biology of Reproduction & 46th
Annual Conference of Physiology and Pathology of Reproduction. Gdansk,
Poland. February 27-March 1. Poster.
2. Jaureguiberry M, Mang AV, Madoz LV, Álvarez E, Chiabone R, Díaz
Pernía T, Díaz Pernía T, Pecoraro M, Drillich M, de la Sota RL. Diagnóstico
y tratamiento de vacas repetidoras con y sin endometritis subclínica en
tambos de la cuenca Abasto Sur. IX Simposio Internacional de
Reproducción Animal. IRAC. Córdoba 04, 05 y 06 de Julio de 2013.
Presentación oral y poster.
3. Jaureguiberry M, Madoz LV, Giuliodori MJ, Wagener K, Prunner I,
Grunert T, Ehling-Schulz M, Drillich M, de la Sota RL. 2015. Identificación
de bacterias uterinas por espectrofotometría infrarroja en vacas de tambo
entre 5 y 60 días postparto. XI Simposio Internacional de Reproducción
Animal. IRAC. Córdoba 14, 15 y 16 de agosto de 2015. Presentación de
poster Nº414.
4. Jaureguiberry M, Giuliodori MJ, Madoz LV, de la Sota RL. Diagnóstico
de endometritis subclínica por ultrasonografía. VI Jornadas Jóvenes

XIII
investigadores. CABA, 10 de junio de 2016. Facultad de Ciencias
Veterinarias, UBA. Presentación oral.
5. Jaureguiberry M, Giuliodori MJ, Madoz LV, Mang AV, Pothmann H,
Drillich M, de la Sota. 2016. Diagnosis and treatments of repeat breeder
cows in Argentina. 18th International Congress on Animal Reproduction.
ICAR. Tour, Francia, 26-30 de Junio. Poster presentation: PW1018.
Revistas
1. Jaureguiberry M, Madoz LV, de la Sota RL. 2015. Actualización en el
síndrome de vaca repetidora. Taurus. 65:14-19.
2. Jaureguiberry M, Madoz LV, Giuliodori MJ, Drillich M, de la Sota RL.
2016. Espectroscopia infrarroja transformada de Fourier para identificar
bacterias uterinas patógenas en vacas lecheras. Revista Veterinaria. ISSN
(papel): 1668-4834. ISSN (on line): 1669-6840.
3. Jaureguiberry M, Madoz LV, Giuliodori MJ, Wagener K, Prunner I,
Ehling-Schulz M, Drillich M, de la Sota RL. 2016. Identification of
Escherichia coli and Trueperella pyogenes isolated from the uterus of dairy
cows using routine bacteriological testing and Fourier transform infrared
spectroscopy. 58:81. Acta Vet Scand. Factor de impacto: 1.230. DOI:
10.1186/s13028-016-0262-z.
4. Jaureguiberry M, Giuliodori MJ, Mang AV, Madoz LV, Pothmann H,
Drillich M, and R. L. de la Sota. 2016. Repeat breeder cows with fluid in
their uterine lumens had poorer fertility. 100:1-3. Factor de impacto:
2.854. J Dairy Sci. DOI:10.3168/jds.2016-11406.

XIV
TITULO: Diagnóstico y tratamiento de vacas repetidoras en tambos de la
cuenca abasto sur
PALABRAS CLAVES: Vacas repetidoras, subfertilidad, endometritis subclínica,
ultrasonografía, expresión génica endometrial, RT-qPCR, FT-IR.
RESUMEN: Las vacas repetidoras (VR) se caracterizan por ser clínicamente sanas,
pero fallan en quedar preñadas luego de 3 o más inseminaciones. Este es un
problema frecuente en nuestros rodeos lecheros que genera grandes pérdidas
económicas. Numerosos trabajos afirman que las causas son múltiples (desórdenes
nutricionales, infecciones, desbalances hormonales, factores genéticos, manejo).
Dentro de éstas, parecen ser importantes las que modifican el ambiente uterino. La
endometritis subclínica (ES) y la alteración de la expresión del factor de crecimiento
epidérmico (EGF) a nivel endometrial podrían ser responsables del síndrome de
vaca repetidora. Se determinó la prevalencia de ES en VR por cytobrush (n= 432)
y por ultrasonografía (N= 358). Se evaluó la eficacia de cefapirina benzatínica
intrauterina (grupo tratado, n=38; grupo control, n= 46) en VR con ES, y un
protocolo de sincronización a celo detectado (grupo tratado, n= 135; grupo control;
n= 136) en VR sin ES. Los resultados obtenidos determinaron que la ES no es la
causa principal de infertilidad en las VR. La detección de ≥ 2 mm de luz uterina
está relacionada con un menor riesgo de preñez en VR. Por último, el tratamiento
con cefapirina benzatínica en VR con ES y el protocolo de sincronización en VR
sin ES no tuvieron efecto beneficioso en los porcentajes de preñez. Posteriormente,
se estudiaron mecanismos moleculares relacionados con subfertilidad en VR. Para
esto, se evaluó la expresión endometrial de los receptores de progesterona,
estrógeno y EGF, al factor nodal (FNod) y la enzima prostaglandina endoperóxido

XV
sintasa (PTGS2), por RT-qPCR en tiempo real en VR (n= 16) y vacas fértiles (n=
9). Los resultados obtenidos demuestran que hubo diferencias significativas en la
expresión del EGFR, FNod, y PTGS2. Por último, teniendo en cuenta la aparición,
cada vez más frecuente, de cepas bacterianas resistentes; se realizó un estudio en el
que se comparó la marcha bacteriológica convencional (n = 64) y la espectroscopia
infrarroja transformada de Fourier (FT-IR, n = 27) como métodos diagnósticos
(simple, relativamente rápido y de bajo costo) para la identificación de bacterias
patógenas uterinas. Los resultados obtenidos determinaron que, mediante la técnica
de FT-IR es posible identificar E. coli y T. pyogenes.

XVI
TITLE: Diagnosis and treatments of repeat breeder cows in Argentina
KEY WORDS: Repeat breeder cows, subfertility, subclinical endometritis,
ultrasonography, endometrial gene expression, RT-qPCR, FT-IR.
SUMMARY: The repeat breeder cows (RBC) are defined as clinically normal
cows that fail to conceive after at least three consecutive insemination. This is a
frequent problem in dairy farms that cause important economic losses. Numerous
researches agree that there are multiple causes (nutritional disorders, infections,
hormonal imbalance, genetic factors, management). Among them, the alteration of
the uterine environment seems to be an important one. It is possible that subclinical
endometritis (SE) and the alteration of the endometrial expression of epidermal
growth factor are responsible for RBC. The prevalence of SE in RBC was diagnosed
by cytobrush (n= 432) and by ultrasonography (N= 358). The efficacy of an
intrauterine treatment of benzathine cephapirin (treatment group, n=38; control
group, n= 46) in RBC with SE, and a synchronization protocol (treatment group,
n= 135; control group; n= 136) in RBC without SE were tested. The results showed
that SE is not the main cause of RBC. The detection of ≥ 2 mm of fluid in uterine
lumen was associated with lower odds for pregnancy in RBC. Finally, neither the
antimicrobial treatment with cephapirin benzathine in RBC with SCE nor the
synchronization protocol in RBC without SE improved pregnancy rate. Then, the
molecular mechanisms associated with subfertility in RBC were studied. The
expression of progesterone and estradiol receptors, epidermal growth factor
receptor, nodal (NodF) and prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) were
studied by real time RT-qPCR in RBC (n= 16) and fertile cows (n= 9). The results
demonstrated a significance difference in endometrial EGFR, NodF, and PTGS2

XVII
expression. Finally, considering the increasingly development of bacterial resistant;
a study about comparing routine methods of bacteriological testing (n= 64) and the
Fourier Transformed infrared spectroscopy (FTIR, n= 27) method (a simple,
relatively fast and inexpensive method) to uterine pathogenic bacteria
identification, was done. The results determined that it is possible identify E. coli
and T. pyogenes by FT-IR.

CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN GENERAL
En los últimos 30 años se ha registrado en nuestro país, así como en otras
partes del mundo (Estados Unidos, Canadá, Inglaterra, Holanda, Australia y Nueva
Zelanda) una disminución en la fertilidad de las vacas lecheras (Silvestrini y col.,
2011a, b; Walsh y col., 2011). Si bien se han realizado importantes avances en
cuanto a los conocimientos sobre la salud y el manejo de las vacas lecheras, todavía
queda mucho por aprender (LeBlanc y col., 2006). El SVR es uno de los problemas
que se relaciona con una disminución en la fertilidad (Garcia-Ispierto y col., 2007),
y que se da frecuentemente en los rodeos lecheros de todo el mundo. Se caracteriza
por ser un grupo heterogéneo de vacas subfértiles que al examen clínico no poseen
anormalidades anatómicas macroscópicas o evidencia de infecciones del tracto
reproductivo (Casida, 1961). Esta definición no ha cambiado mucho durante los
últimos 60 años y actualmente se ha limitado a las vacas que exhiben una variedad
de problemas reproductivos sobre un período de 3 o más ciclos consecutivos de
duración normal (17-25 días) (Perez-Marin y Espana, 2007).
La importancia de este síndrome se debe a las pérdidas económicas que
produce. Por un lado afecta la eficiencia reproductiva, lo cual fue descripto por
Yusuf y col. (2010) al comparar el desempeño reproductivo de las VR con vacas
normales en lactancia (vacas que se preñaron dentro de los tres primeras IA; Tabla
1.1), debido a que incrementa los días de vaca vacía y aumentar el número de
pajuelas utilizadas por preñez, disminuye la disponibilidad de hembras de
reposición y de machos para su comercialización, e incrementa los rechazos por

2
causas reproductivas. Por otro lado, afecta la eficiencia productiva ya que
disminuye la eficiencia de conversión de alimentos en leche (Martino y Capitaine
Funes, 2011). Sumado a esto, hay un aumento en la demanda de servicios
veterinarios y de utilización de medicamentos.
Tabla 1.1. Desempeño reproductivo de vacas en lactancia sin problemas

reproductivos y desempeño reproductivo de vacas repetidoras
(adaptado de Yusuf y col., 2010).
Vacas en lactancia Vacas repetidoras

Vacas inseminadas (n) 479 86
Días en leche a la 1º IA 81 ± 2 74 ± 4
Tasa de concepción a la 1º IA (%) 49.1 -
Porcentaje de preñez ≤100 dpp (%) 50.1 1.2
Porcentaje de preñez ≤300 dpp (%) 99.8 50
Vacas preñadas a los 435 dpp (%) 100 58.1
Intervalo parto concepción (días) 114 ± 3 211 ± 10
Servicios por concepción (n) 1.7 ± 0.1 4.7 ± 0.2
1ºIA: primera inseminación artificial
dpp: días postparto
La incidencia de VR en un rodeo puede variar de un 9 % hasta un 24%
dependiendo de la región, el ambiente y el manejo del tambo (Yusuf y col., 2010;
Janowski y col., 2013). El manejo del tambo es uno de los principales factores de
riesgo al cual se le suman la incidencia de distocia, las enfermedades del postparto,
el reinicio de la actividad ovárica dentro de los 80 días postparto y los días en leche
a la 1º IA (Moss y col., 2002; Yusuf y col., 2010), lo cual se describirá con mayor
detalle a continuación.
3
CAUSAS
El SVR pude darse por fallas en la fertilización o muertes embrionarias muy
tempranas (0 a 7 días post concepción) o tempranas (8 a 24 días post concepción)
(Ayalon, 1978). En vaquillonas repetidoras, las fallas en la fertilización son más
frecuentes que las muertes embrionarias, mientras que en VR ambas son igualmente
importantes (Ayalon, 1978). Que estas ocurran depende de la calidad del ovocito,
el ambiente oviductal y el ambiente uterino (Bridges y col., 2013), los cuales pueden
ser afectados por una variedad de factores (Bage y col., 2002; Yusuf y col., 2010).
Estos factores podemos dividirlos en: factores externos al animal (desbalances
nutricionales, problemas de manejo) y factores internos (infecciones, desbalances
hormonales y factores genéticos).
1. Factores externos
1.2. Desbalance nutricional
Numerosos estudios demuestran que los desbalances nutricionales que se
producen durante el parto y postparto afectan la fertilidad (Giuliodori y col., 2011;
Giuliodori y col., 2013b). Esto se debe a que dichos desbalances provocan la
alteración de los niveles sanguíneos de ciertos metabolitos y hormonas que
participan en mecanismos relacionados con la actividad ovárica, calidad del
ambiente uterino y el sistema inmune del animal (Lucy y col., 2014). Uno de los
desbalances nutricionales que ocurre con mayor frecuencia se da durante el
postparto temprano. Durante esta etapa, la energía requerida por el animal es mayor
que la que puede ingerir y por lo tanto se produce un balance energético negativo
(BEN). El grado de BEN se relaciona con el reinicio de la actividad ovárica, un

4
parámetro muy importante de fertilidad (Leroy y col., 2008; Grummer y col., 2010).
Dentro de los metabolitos y hormonas que participan en dichos mecanismos se
encuentran la glucosa, los ácidos grasos no esterificados (NEFA), beta
hidroxibutirato (BHB), factor de crecimiento similar a insulina-1 (IGF-1) e insulina.
La glucosa juega un rol importante tanto en la producción de leche como en
la reproducción. Un estudio reciente describe que bajos niveles de glucosa en sangre
provocan una disminución en la pulsatilidad de LH lo que afecta negativamente el
crecimiento y desarrollo folicular y por ende la calidad del ovocito (Butler, 2014).
A su vez, la glucosa regula la liberación de insulina, quien estimula la síntesis y
liberación de IGF-1 en el hígado. Estas hormonas son de suma importancia en lo
que respecta a la reproducción ya que actúan sinérgicamente con las gonadotrofinas
ováricas, estimulando también el crecimiento y desarrollo folicular (Lucy, 2001).
Además, tanto la insulina como el IGF-1 actúan sobre el ovario estimulando la
producción de 17β-estradiol (Castro y col., 2012). Este, junto con la P4, regulan la
expresión de receptores y proteínas en el útero, fundamentales para llevar a cabo la
gestación (Bridges y col., 2013). En vacas con BEN, los niveles en sangre de ambas
hormonas disminuyen, afectando la actividad ovárica (Lucy, 2001) y el ambiente
uterino entre otras cosas. Además, en vacas con BEN los niveles en sangre de NEFA
y BHB se encuentran elevados, lo cual afecta negativamente la fertilidad y el
sistema inmune del animal. Un estudio reciente describe que las concentraciones
altas de NEFA en sangre y en líquido folicular, se relacionan negativamente con la
síntesis de E2, mientras que, junto con las concentraciones altas de BHB en sangre
durante las primeras semanas postparto, se relacionan con un desempeño
reproductivo menos eficiente (ej., incremento del IPC, menor porcentaje de preñez
5
a la 1ºIA) (Ribeiro y col., 2013; Butler, 2014). Otro parámetro que se relaciona con
una menor fertilidad son los niveles de calcio en sangre (Souza y col., 2014). La
disminución de éste se asocia con una menor capacidad inmunitaria y con un
ambiente uterino sub-óptimo. (Figura 1.1 y 1.2)
Por otro lado, aquellos animales que se encuentran en balance energético
positivo (CC ≥ 3.5) tienen predisposición a padecer enfermedades metabólicas
(acidosis, hígado graso, cetosis, desplazamiento de abomaso) que incrementan la
incidencia de mastitis, laminitis y endometritis, las cuales contribuyen a disminuir
la eficiencia reproductiva (Walsh y col., 2011; Ribeiro y col., 2013).
Figura 1.1. Efecto del balance energético negativo (BEN) profundo sobre la
reproducción.
6
Figura 1.2. Efecto de la disminución de la pulsatilidad de LH y/o anormal

concentración de metabolitos en sangre (glucosa, ácidos grasos no
esterificados, β- hidroxibutirato) sobre la reproducción en vacas
lecheras (adaptado de Lucy y col., 2014).
1.2. Problemas de manejo
El manejo de las vacas lecheras de alta producción es un gran desafío,
especialmente en los sistemas de producción con base pastoril (Diskin y col., 2006).
Para lograr que una vaca de alta producción se preñe, hay que brindarle las
condiciones necesarias para que así sea. Un ambiente confortable debe evitarles el
estrés térmico, físico, por enfermedad y social (Webster, 1983). El manejo
nutricional es clave. La dieta que se les provee durante el preparto y postparto es
esencial para evitar que se desarrollen desordenes metabólicas que afecten
posteriormente el establecimiento de la gestación (Walsh y col., 2011). Como se
mencionó en el apartado anterior, los desórdenes metabólicos están relacionados
con la actividad ovárica, ambiente uterino y sistema inmune del animal. Además,
7
las vacas de alta producción tienen una menor intensidad y duración del celo.
Wiltbank y col. (2006) reportó que las vacas que producen alrededor de 25 l
expresan el celo durante 14 h, mientras que las que producen alrededor de 40 l lo
expresan durante solo 5 h. Esto lleva a que se cometan errores en la detección de
celo y en el momento en que se realiza la inseminación. Otros puntos importantes
son, la técnica de inseminación en sí y la calidad del semen que se utiliza.
2. Factores internos
2.1. Infecciones
Dentro de los procesos infecciosos o inflamatorios, aquellos que involucran
al útero tienen un impacto directo sobre el desempeño reproductivo del animal
(LeBlanc y col., 2002; Sheldon y col., 2009; Giuliodori y col., 2013b, a). En
relación al SVR podemos destacar la ES. Este es un proceso inflamatorio que afecta
la capa más superficial del útero (Madoz y col., 2014). Los animales que la padecen
no presentan signos clínicos pero si una disminución en la fertilidad (Madoz y col.,
2012). Hill y Gilbert (2008) postularon que la ES podría alterar la calidad del
embrión y favorecer de esta forma las muertes embrionarias tempranas. La
participación de las bacterias patógenas uterinas (Trueperella pyogenes,
Escherichia coli, Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium nucleatum,
Prevotella spp) en el desarrollo de la ES fue propuesta por Kasimanickam y col.
(2005). No obstante, otros trabajos realizados en vacas con ES no obtuvieron
aislamiento de dichas bacterias (Madoz y col., 2014; Pothmann y col., 2015). Es
posible que la desregulación de la respuesta inmune local tenga un rol
preponderante en este tipo de afección (LeBlanc, 2012). Los trabajos publicados

8
hasta el momento sobre la ES en VR describen una prevalencia del 12%, 40% y
53% (Salasel y col., 2010; Janowski y col., 2013; Pothmann y col., 2015). Los
mismos fueron realizados en Austria, Polonia e Irán, respectivamente, y utilizaron
diferentes puntos de corte para el diagnóstico de ES (≥5% en Austria, ≥10% en
Polonia y ≥3% en Irán). Otra de las enfermedades que debería considerarse es la
cervicitis (˃5% PMN, 21-35 dpp). Deguillaume y col. (2012) describieron que la
cervicitis, diagnosticada entre el día 21 y 35 postparto, reduce el riesgo de preñez y
alarga el IPC. Además, cuando se da junto con una endometritis los perjuicios sobre
la fertilidad son aún mayores. El resto de las enfermedades uterinas (metritis,
endometritis), podrían actuar como factores de riesgo para el desencadenamiento
del SVR ya que, como explica Sheldon y col. (2009), tienen un efecto sobre la
actividad ovárica y ambiente uterino que puede mantenerse una vez resulta la
enfermedad.
Dentro de los microorganismos que se han estudiado en relación a procesos
infecciosos del útero, el Herpes virus bovino-4 (BoHV-4) es el único virus
fuertemente asociado a infecciones uterinas (Sheldon y col., 2009). En los últimos
años se han realizado estudios sobre la implicancia del BoHV-4 en el desarrollo de
metritis y endometritis, éstos no lograron demostrar una participación del BoHV-4
como agente primario (Fabian y col., 2008) pero si una asociación entre infección
por BoHV-4 y desarrollo de metritis (Monge y col., 2006). En VR se han realizado
estudios serológicos sobre dicho microorganismo. Los resultados obtenidos hasta
el momento demuestran una mayor proporción de animales seropositivos en el
grupo de VR (69%) con respecto al grupo de vacas no repetidoras (44%) (Gur y
Dogan, 2010).
9
2.2. Desbalances hormonales
La detección de celo es fundamental para realizar la IA en el momento
adecuado. En un trabajo realizado en VR se observó que un 50% de VR presentaban
celo silente (Perez-Marin y Espana, 2007). Por lo tanto, una disminución de la
duración o del grado de expresión del celo, puede llevar a errores en su detección y
por lo tanto aumento del número de IA por preñez.
Ahora bien, suponiendo que la IA se realice en el momento adecuado y con
semen de óptima calidad, el siguiente punto importante es la calidad del ovocito.
De esta depende que se forme un embrión y que este sea capaz de desarrollarse y
sobrevivir. Dicha calidad, puede verse afectada por desbalances hormonales, los
cuales parecen ser una de las causas más estudiadas en VR. Los niveles adecuados
de P4 antes, durante y después de la IA son fundamentales para que la fertilización
sea exitosa. Algunos autores encontraron niveles supra basales de P4 al momento
de la IA tanto en VR como en vaquillonas repetidoras (Bage y col., 2002; Ghanem
y col., 2006). Estos niveles de P4 por encima de lo normal, se relaciona con folículos
preovulatorios de mayor tamaño y edad. Los ovocitos producto de estos folículos
(folículos persistentes) son de baja calidad y si bien es posible que sean fertilizados,
el embrión que se produce es igualmente de baja calidad y por lo tanto tienen una
menor sobrevida (Wiltbank y col., 2013). Por otro lado, ciertos estudios registraron
un retraso en el incremento de los niveles de P4 sanguínea así como también una
baja concentración total de la misma post IA en VR, lo cual incrementaría las
muertes embrionarias (Shelton y col., 1990; Bage y col., 2002). Una baja
concentración de P4 post IA, disminuye el crecimiento embrionario, y por lo tanto

10
este tienen menor capacidad de producir interferón-tau, lo que afecta el
reconocimiento materno de gestación (Walsh y col., 2011).
Es importante remarcar que los desbalances hormonales y endócrinos no
sólo afectan la calidad del ovocito y/o del embrión, sino que también modifican el
ambiente uterino, el cual es fundamental para que se lleve a cabo la gestación. El
E2 en particular, estimula la producción del EGF en el útero que a su vez actúa como
un importante regulador de la función uterina y del desarrollo embrionario (Kliem
y col., 1998). Trabajos recientes han demostrado una disminución de la
concentración de EGF en VR al compararlas con vacas fértiles, y que la
normalización de la expresión endometrial del mismo permitiría restablecer la
fertilidad de dichos animales (Katagiri y Takahashi, 2004, 2006).
2.3. Factores genéticos
Se han descripto algunas alteraciones cromosómica en VR (Bage y col.,
2002; Perez-Marin y Espana, 2007). Una de ellas es la translocación Robertsoniana
1/29, que trae como consecuencia la formación de cigotos trisómicos y
monosómicos y, por lo tanto, la muerte embrionaria (Lozano Carbajal y col., 1993).
No obstante, se cree que este tipo de alteraciones tiene una baja incidencia (Bage y
col., 2002). Algunos trabajos reportan que el porcentaje de endogamia se ha
incrementado de 1 a 5% en la raza Holando en los últimos años. Este es otro de los
puntos importantes ya que la endogamia afecta el desarrollo embrionario y por lo
tanto el establecimiento de la gestación (Lazzari y col., 2011).
Durante muchos años, la selección de los animales de razas lecheras se basó,
principalmente, en la producción de leche y posteriormente se incluyó a la fertilidad

11
(Miglior y col., 2005). Algunos autores reportaron una correlación negativa entre
la selección por producción de leche y fertilidad (Veerkamp y col., 2001; Berry y
col., 2003). No obstante, otros factores, como el manejo, la nutrición y el ambiente,
parecerían tener un impacto mayor en el desempeño reproductivo de las vacas
lecheras de alta producción (Leblanc, 2010; citado por Walsh y Col., 2011)
TRATAMIENTOS
La mayoría de los trabajos realizados sobre tratamientos en VR apuntan a
restaurar los desbalances hormonales mencionados anteriormente.
El uso de un protocolo de sincronización clásico, combinando BE (2 mg,
día 0; 1mg, día 8), DIV de P4 (1.38 gr, día 0 a 7 días, CIDR) y PG (25 mg, día 7)
como tratamiento, pretende evitar la ovulación de ovocitos provenientes de
folículos persistentes y brindar un aporte de P4 previo a la IA. No obstante, las
pruebas realizadas por Alnimer y Husein (2007) no mostraron diferencias
significativas entre VR tratadas con dicho protocolo y sus controles. Katagiri y
Takahashi (2008) utilizaron en su trabajo un protocolo de sincronización similar,
pero con un objetivo muy diferente. El mismo fue normalizar las concentraciones
del EGF en VR, cuya síntesis por las células endometriales es estimulada por E2 en
presencia de P4. Para ello compararon tres tratamientos cuya base es un protocolo
de sincronización que combina, BE, DIV P4, PG e IA a celo detectado (IACD), la
diferencia entre ellos fue la dosis de BE al comienzo del protocolo (grupo 1: 5 mg
totales, grupo 2: 1 mg total y grupo 3: control, sin tratamiento). El porcentaje de
vacas que lograron concentraciones normales de EGF después del tratamiento fue
mayor en las vacas tratadas con 5 mg de BE (66.7%) que aquellas tratadas con 1
12
mg de BE (30%) o las controles (13.3%) (P <0.01). A su vez, las vacas que
alcanzaron niveles normales de EGF post tratamiento tuvieron porcentajes de
preñez mayores (88.9%, 1 mg de BE y 85%, 5 mg de BE) que las que continuaron
con niveles anormales de EGF (19%, 1 mg de BE y 30%, 5 mg de BE) sin importar
el tratamiento previamente administrado (P <0.05).
El tiempo que transcurre entre el comienzo del celo y el pico de LH es mayor
en vaquillonas repetidoras comparándolas con vaquillonas fértiles (4.6 ± 6 h vs 4.0
± 1 h, respectivamente) lo que sugiere un retraso en la ovulación (Bage y col., 2002).
El uso de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH) es uno de los
tratamientos más utilizados en VR (Amiridis y col., 2009). Kharche y Srivastava
(2007) probaron utilizar distintas dosis de GnRH (Receptal, Alemania) al momento
de la IA (20 µg de GnRH, 10 µg de GnRH y solución salina). Los resultados que
obtuvieron indican que la administración de 20 µg de GnRH al momento de la IA
incrementa el porcentaje de preñez total de VR en un 29% con respecto al grupo
tratado con 10 µg y en un 39% con respecto al grupo control (P <0.05). Amiridis y
col. (2009) realizaron una prueba similar con la diferencia de que la aplicación de
GnRH (12 µg) la realizaron 4-6 h antes de la IA sin encontrar diferencias
significativas entre el grupo tratado y el control. No obstante, cuando compararon
el uso de una combinación de P4 (100 mg en forma de cápsulas intravaginales, los
días 4, 5, 6 después del celo, cada 12 h), GnRH (12 µg im, 4-6 h antes de la IA) y
meloxicam (0.5 mg/kg subcutáneo, los días 16, 17 y 18 post IA) con el grupo
control, si encontraron diferencias significativas entre grupos (37,76% vs 21.74%,
respectivamente, P <0.05). El uso del meloxicam tiene como objeto inhibir la PG,
que es un factor luteolítico natural. La contribución de cada uno de los componentes

13
del tratamiento es difícil de definir, ya que cuando fueron utilizados
individualmente y como única droga del tratamiento, no se encontraron diferencias
significativas con el grupo no tratado.
La hormona gonadotrofina coriónica humana (hCG) administrada durante
la fase luteal temprana post IA, induce la ovulación del folículo de la 1º onda
folicular y forma un cuerpo lúteo (CL) accesorio. Este incrementa los niveles de P4
durante el período de reconocimiento materno de gestación. La GnRH y la hCG son
igualmente efectivas induciendo un CL accesorio, pero el incremento de P4 es
mayor cuando se emplea hCG en vaquillonas (Khoramian y col., 2011). Khoramian
y col. (2011), en su trabajo compararon el uso de hCG (1500 IU), vs DIV P4 (CIDR)
vs GnRH (20 µg) en VR el día 5 post IA. Los mayores porcentajes de preñez a los
45 días los obtuvo utilizando el tratamiento con hCG y con el tratamiento con DIV
P4 (P <0.05). Del mismo modo, Kendall y col. (2009) propusieron la administración
de hCG (1500UI) al día 5 post IA, los resultados que obtuvieron fueron alentadores
pero solo en VR multíparas y no en primíparas (P <0.05). También probaron utilizar
DIV P4 (1.9 g) a partir del día 5 y 6 post IA durante 7 días, pero no encontraron
diferencias significativas en cuanto a porcentaje de preñez entre VR tratadas y
controles (P >0.05).
Una alternativa interesante es la utilización de VR como receptoras en los
protocolos de transferencia embrionaria. Con ésta herramienta se puede
incrementar la probabilidad de mantener la gestación en aquellos casos donde la
calidad del ovocito y el desarrollo embrionario se vean afectados (Son y col., 2007).
Son y col. (2007) compararon el porcentaje de preñez obtenido por IATF (BE 2 mg,
DIV P4 por 7 días, PG 25 mg y BE 1mg), transferencia embrionaria a tiempo fijo

14
(utilizando el mismo protocolo que el anterior) e IACD en VR. La transferencia
embrionaria logró un porcentaje de preñez de 53.8%, el cual fue significativamente
superior a los obtenidos por IACD (18.5%) e IATF (7.7%) (P <0.05). Por otro lado
(Rodrigues y col., 2010) en su trabajo compararon un protocolo de sincronización
para transferencia embrionaria a tiempo fijo (TETF) y otro donde empleó una única
dosis de PG, detección de celo y transferencia embrionaria 6-8 días después de
detectado el celo (TECD). Las VR para ser transferida tenían que tener un CL al
momento de la transferencia. El porcentaje de VR transferidas fue mayor en el
grupo TETF (75%) comparado con el grupo TECD (34.5%) (P <0.0001). Así
mismo, el porcentaje de preñez fue mayor en el primer grupo (29% vs 16%) aunque
el resultado no fue tan alentador como el obtenido por Son y col. (2007) (P= 0.001).
Varios trabajos demuestran la importancia de ciertos mediadores
moleculares, como factores de crecimiento y citoquinas, en el establecimiento de la
gestación (Katagiri y Takahashi, 2004; Bridges y col., 2013). Lange-Consiglio y
col. (2015) propusieron en su trabajo, la administración de un concentrado
plaquetario intrauterino post IA en VR, con el objeto de brindar los mediadores
moleculares que se encuentran en las plaquetas. De esta forma, propone mejorar el
ambiente uterino y el establecimiento de la gestación. Si bien el número de animales
por grupo fue bajo (grupo tratado: n= 30, grupo control: n= 30), hubo diferencia
significativa en el porcentaje de preñez entre los animales del grupo tratado y
control (70% vs. 33%, respectivamente), lo cual brinda información alentadora para
nuevas alternativas de tratamientos.

15
ÚLTIMOS AVANCES EN VACAS REPETIDORAS
El endometrio es un tejido en el que ocurren muchos cambios a lo largo del
ciclo estral y durante la gestación. En los últimos años, muchos investigadores
comenzaron a estudiar en el endometrio mecanismos moleculares que podrían
participar en el desencadenamiento del SVR. Ciertas interleuquinas, citoquinas,
factores de crecimiento, proteínas de fase aguda, entre otras; fueron algunas de las
moléculas estudiadas.
Hayashi y col. (2017), describieron diferencias en la expresión génica
endometrial entre VR y vacas controles. Una de ellas, es la inhibición de la
expresión de genes relacionados con la adhesión celular en VR comparándolas con
las vacas controles lo cual podría asociarse a fallas en la implantación. Siguiendo
la misma línea, estudios realizados en VR describen un incremento en la expresión
endometrial de mucina en comparación con vacas control (Kasimanickam y col.,
2014; Wagener y col., 2017). La mucina, es una proteína secretada por células
epiteliales que actúa como barrera para evitar la adhesión de patógenos a las
superficies epiteliales y en los últimos años se la asoció a fallas en la implantación
por impedir la adhesión del embrión al endometrio (Kasimanickam y col., 2014;
Wagener y col., 2017). A su vez, también se comenzó a estudiar la expresión de
ciertas interleuquinas y citoquinas relacionadas con procesos inflamatorios en el
útero. Estas alteraciones podrían modificar la expresión de genes relacionados con
la estabilidad de membrana, ciclo celular y apoptosis del embrión (Kasimanickam
y col., 2014). Janowski y col. (2013) reportaron un incremento en la expresión de
factor de necrosis tumoral α y de la enzima óxido nítrico sintasa en VR con ES

16
comparándolas con VR sin ES, por lo que sugiere la participación de éstos en los
casos de VR con ES.
El SVR es una entidad compleja que involucra múltiples factores para su
desencadenamiento, por ende, no es posible actualmente recomendar un único
tratamiento efectivo. De los numerosos tratamientos que se han probado, los
tratamientos hormonales parecerían ayudar a restablecer la fertilidad en algunos
casos de VR. No obstante, es necesario continuar investigando los mecanismos que
participan en el desencadenamiento del SVR para poder dar soluciones concretas.
A nuestro conocimiento, a pesar de que en Argentina el SVR es un problema
que se da en la mayoría de los establecimientos, existe escasa información sobre el
tema. La falta de información sobre causas, formas de diagnóstico y posibles
tratamientos para las VR sumado a las pérdidas económicas que genera, hizo que
eligiéramos este tema para la realización de la presente tesis. A continuación, se
detallarán los objetivos e hipótesis de la misma.
OBJETIVO GENERAL
1. Realizar un estudio sobre el diagnóstico y tratamiento de las VR en tambos
de la cuenca Abasto Sur.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Determinar mediante CB la prevalencia de ES en VR.
2. Evaluar mediante US el efecto de la presencia de líquido en la luz uterina
sobre la fertilidad de VR.
3. Determinar el grado de acuerdo entre el diagnóstico de ES por US y CB.

17
4. Determinar si la ES en VR es producida por agentes bacterianos.
5. Evaluar la eficacia de la administración de 500 mg de cefapirina benzatínica
intrauterina en VR con ES.
6. Evaluar la eficacia de un protocolo de sincronización que combina
progesterona y altas dosis de BE en VR sin ES.
7. Comparar la expresión endometrial de ARNm de transcriptos involucrados
en el establecimiento y mantenimiento de la gestación entre VR sin ES y
vacas fértiles.
8. Determinar el grado de acuerdo entre marcha bacteriológica convencional
y la TF-IR.
9. Determinar si la base de datos generada a partir de bacterias uterinas de
vacas lecheras europeas podría ser utilizada para la identificación de
bacterias uterinas de vacas lecheras de nuestro país.
HIPÓTESIS RELEVANTES
1. La ES es un factor de riesgo importante para el desencadenamiento del SVR.
2. La presencia de líquido en la luz uterina disminuye la fertilidad en VR.
3. Es posible realizar el diagnóstico de ES por US.
4. La ES en VR es producida por agentes bacterianos.
5. La administración de 500 mg de cefapirina benzatínica intrauterina es
efectiva para el tratamiento de VR con ES.
6. La realización de un protocolo de sincronización combinando progesterona
con altas dosis BE es efectivo para el tratamiento de VR sin ES.

18
7. La expresión endometrial de ARNm de transcriptos involucrados en el
establecimiento y mantenimiento de la gestación difiere entre VR sin ES y
vacas fértiles.
8. La TF-IR puede ser utilizada para la identificación de bacterias uterinas de
vacas lecheras.
9. La base de datos producida a partir de bacterias obtenidas de vacas lecheras
europeas puede ser utilizada para la identificación de bacterias uterinas de
vacas lecheras de nuestro país.

19
CAPÍTULO II
DIAGNÓSTICO, PREVALENCIA Y TRATAMIENTO DE VACAS
REPETIDORAS CON Y SIN ENDOMETRITIS SUBCLÍNICA
INTRODUCCIÓN
Las VR se definen como vacas clínicamente sanas, pero que fallan en quedar
preñadas luego de tres o más IA. Como se mencionó en el capítulo anterior, la causa
es multifactorial (Bage y col., 2002; Katagiri y Takahashi, 2004; Kharche y
Srivastava, 2007; Salasel y col., 2010; Yusuf y col., 2010). Dentro de estas causas,
parecen ser importantes los procesos inflamatorios y los desbalances hormonales y
endócrinos que modifican el ambiente uterino.
Para que el desarrollo embrionario sea normal, es necesario que el útero se
encuentre en óptimas condiciones (Walsh y col., 2011), y es por ello que los
procesos infecciosos/inflamatorios del endometrio podrían afectar negativamente
dicho desarrollo (Hill y Gilbert, 2008). En los últimos 10 años, aproximadamente,
se ha estudiado la ES en vacas lecheras post parto. Estos estudios han permitido
obtener las primeras estimaciones de su prevalencia y su efecto sobre la eficiencia
reproductiva (Gilbert y col., 2005; Kasimanickam y col., 2005; Cheong y col.,
2011; Madoz y col., 2013). Un estudio realizado en nuestro país demostró que la
prevalencia de ES en vacas lecheras postparto es del 17%, y que la misma produce
efectos negativos sobre la eficiencia reproductiva (Madoz y col., 2013). No
obstante, se han realizado pocos trabajos en los que estudien la ES como una posible
causa del SVR (Salasel y col., 2010; Pothmann y col., 2015). El diagnóstico de ES
20
se realiza por citología endometrial, utilizando la técnica de lavaje uterino, CB o,
según estudios realizados recientemente, cytotape (Pascottini y col., 2015). Si bien
dichas técnicas son simples en cuanto a su realización y equipamiento, todas
requieren tiempo para arribar a un diagnóstico, lo cual no las hace prácticas para ser
realizadas a campo. En los últimos años se comenzó a estudiar el uso de la US para
el diagnóstico de ES (Kasimanickam y col., 2004; Lenz y col., 2007). Según estos
trabajos, la presencia de líquido en la luz uterina es uno de los criterios que pueden
utilizarse para su diagnóstico (Kasimanickam y col., 2004; Barlund y col., 2008).
La principal ventaja que posee la US es su practicidad, permitiendo obtener el
diagnóstico en el mismo momento en que se realiza el examen clínico. Por lo tanto,
la validación de la US sería un gran adelanto en el diagnóstico de la ES. El otro
punto importante es determinar la causa de la ES para poder realizar un tratamiento
efectivo. Si bien todavía no se ha podido demostrar, es posible que los agentes
bacterianos que comúnmente se relacionan con las enfermedades uterinas, también
participen en los casos de ES. Por lo tanto, un tratamiento con ATB permitiría
eliminar dicha infección e incrementar las posibilidades de preñez en VR con ES.
Los desbalances hormonales, como se mencionó anteriormente, podrían ser
otro factor importante en el desencadenamiento del SVR. Junto con la P4, los E2 de
origen ovárico regulan la función uterina estimulando la producción de citoquinas
y factores de crecimiento que median funciones críticas en el establecimiento y
mantenimiento de la preñez. Los E2 en particular, estimulan la producción de EGF
en el útero que a su vez actúa como un importante regulador de la función uterina
y del desarrollo embrionario. Trabajos realizados en los últimos años han
demostrado una alteración en la concentración endometrial de EGF en VR (Katagiri

21
y Takahashi, 2004, 2006). La normalización de la concentración de EGF debido a
un tratamiento hormonal permitió mejorar la eficiencia reproductiva de dichos
animales (Katagiri y Takahashi, 2008). Por lo tanto, un tratamiento en el que se
combine P4 y altas dosis de BE podría ser una opción terapéutica eficaz, simple y
económica para restablecer la funcionalidad del útero y de esta forma, incrementar
las posibilidades de preñez en VR sin ES.
Teniendo en cuenta lo antes mencionado, el proceso de diagnóstico, en el
caso de las VR, debería identificar en primera instancia aquellas vacas que poseen
ES y que se beneficiarían con un tratamiento antibiótico sin descarte en leche; y en
segunda instancia asumir que las VR restantes tendrían perfiles anormales de EGF
y por lo tanto se beneficiarían utilizando un tratamiento hormonal que combine BE,
a una dosis mayor que la utilizada normalmente (5 mg vía im), DIV de P4 y PGF,
realizando la IA a celo detectado. Por lo tanto, los objetivos del siguiente capítulo
fueron: 1) determinar mediante CB la prevalencia de ES en VR, 2) evaluar mediante
US el efecto de la presencia de líquido en la luz uterina sobre la fertilidad de VR,
3) determinar el grado de acuerdo entre el diagnóstico de ES por US y CB, 4)
determinar si la ES en VR es producida por agentes bacterianos, 5) evaluar la
eficacia de la administración de 500 mg de cefapirina benzatínica intrauterina en
VR con ES y 6) evaluar la eficacia de un protocolo de sincronización que combina
progesterona y dosis más altas de BE en VR sin ES. Las hipótesis correspondientes
a dichos objetivos fueron: 1) la ES es un factor de riesgo importante para el
desencadenamiento del SVR, 2) la presencia de líquido en la luz uterina disminuye
la fertilidad en VR, 3) es posible realizar el diagnóstico de ES por US, 4) la ES en
VR es producida por agentes bacterianos, 5) la administración de 500 mg de

22
cefapirina benzatínica intrauterina es efectiva para el tratamiento de VR con ES y
6) la realización de un protocolo de sincronización combinando progesterona con
dosis más altas de BE es efectivo para el tratamiento de VR sin ES.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño experimental
Para la realización de este experimento se utilizaron VR Holando Argentino
(n= 432) de 14 tambos comerciales ubicados en las localidades de Bavio, Branden,
Lobos (Buenos Aires, Argentina) y Alejo Ledezma (Córdoba, Argentina) en un
sistema de producción pastoril con suplementación.
Definición del caso clínico
Se consideró VR aquellas vacas con ≥3 servicios a intervalos regulares de
tiempo (entre 17 y 25 días), vacías y clínicamente sanas (sin afecciones uterinas u
ováricas). Además, las VR incluidas en el experimento no presentaron registros de
abortos o tratamientos, ya sean hormonales o ATB, durante el período antes
mencionado.
Evaluación clínica
La evaluación clínica de las vacas comenzó con un examen mediante US
(ecógrafo Mindray™ 6600Vet, sonda lineal de 7.5 MHz) con el objeto de eliminar
aquellas vacas que se encontraban preñadas o que presentaban alguna afección o
anomalía en los ovarios o en el útero. Además, se realizó la técnica de flujeo manual
para eliminar las vacas con EC (Sheldon y col., 2002; Dominguez, 2006). Para el
23
flujeo manual se limpió la zona perineal y con una mano cubierta por un guante de
tacto nuevo y lubricado, se recolecto flujo vaginal desde la porción craneal de la
misma. El flujo se clasificó en 4 grados: FL0 corresponde a un flujo normal (EC0),
FL1 corresponde a un flujo con flóculos de pus (EC1; <50% de pus), FL2
corresponde a un flujo purulento sin olor (EC2; ≥50% de pus) y FL3 corresponde a
un flujo purulento y con olor fétido (EC3). Se consideraron los FL1-FL3 como
indicadores de EC. Por lo tanto, solamente aquellas VR en las que se confirmó
vacuidad y no presentaron EC o cualquier otra afección o anormalidad, se
incluyeron en el estudio. Los datos que se recolectaron de cada vaca fueron: número
de servicios, fecha del último parto, producción de leche, número de lactancia, CC
(utilizando la escala que va de 1 a 5, (Edmonson, 1989; Ferguson y col., 1994),
estructuras ováricas presentes (folículos ≥10mm y <10 mm, cuerpos lúteos, cuerpos
lúteos quísticos) y presencia de luz uterina (en mm).
Toma de muestras y diagnóstico de endometritis subclínica
El diagnóstico de ES se realizó utilizando primero la técnica de CB (n= 432;
técnica utilizada como Prueba de Oro), y posteriormente la US (n= 358; 74 de 432
VR no pudieron ser evaluadas por US). El diagnóstico de ES por CB se realizó
utilizando una pistoleta de acero inoxidable (similar a las que se utilizan para
inseminación) que constaba de dos partes, una pieza tubular externa y un vástago
interno que poseía en su extremo anterior 1 cm de rosca. En el extremo anterior de
ésta última se le adosó un cepillito estéril utilizado en ginecología humana
(Medibrush XL ®, Medical Engineering Co, SA). Posteriormente se colocó una
vaina de inseminación (IVM Technologies, Francia) para cubrir la pistoleta y el

24
cepillito. Una vez lista la pistoleta se procedió al enhebrado de la misma de modo
similar a la técnica utilizada en IA, pasado el cérvix se expuso el cepillito al
endometrio y se lo hizo rotar sobre el mismo. Antes de retirar la pistoleta del útero,
se retrajo el cepillito para que nuevamente quede cubierto por la vaina plástica de
inseminación. Para realizar la citología se hizo rotar el cepillito sobre un portaobjeto
nuevo y rotulado, y se lo fijó con espray Roby (Roby, Argentina). Por último, en el
laboratorio, las muestras fueron teñidas con tinción 15 (Tinción 15®, Biopur
Diagnostic). El conteo celular se realizó a 40 X, se contaron 200 células y de ellas
se obtuvo el porcentaje de PMN. El punto de corte para el diagnóstico de ES fue
≥5% PMN (Madoz y col., 2013) . El diagnóstico de ES por US se realizó
recorriendo todo el útero y midiendo el diámetro de luz uterina, en milímetros, en
la base de uno de los cuernos.
Toma de muestras para bacteriología
Las muestras bacteriológicas fueron tomadas a VR con ES (n= 48) y a VR
sin ES (n= 13). Éstas se obtuvieron utilizando la técnica de CB como se describió
anteriormente, con el agregado de una camisa sanitaria que se colocó por encima
de la vaina plástica de inseminación. Una vez que se ubicó la pistoleta en el útero,
la camisa sanitaria fue rasgada para luego exponer el cepillo. Una vez obtenida la
muestra se introdujo el cepillito en el medio de transporte Stuart (Eurotubo,
DeltaLab) el cual fue colocado en una caja de poliestireno expandido con
refrigerantes hasta su llegada al laboratorio.
En el laboratorio, las muestras fueron sembradas en medios para aerobios.
Se utilizó el medio Agar Sangre Base, con el agregado de 5% de sangre ovina

25
desfibrinada y Mac Conkey. Las placas fueron incubadas por 48 horas a 37°C. Las
bacterias se identificaron por las siguientes características: morfología de colonia,
coloración Gram, tipo de hemólisis y pruebas bioquímicas convencionales (Baron,
1995).
Tratamientos
Basándonos en el diagnóstico de ES por CB, las VR positivas a ES se
dividieron en dos grupos según el número de caravana. Las VR con número de
caravana par fueron tratadas con 500 mg de cefapirina benzatínica intrauterina
(Metricure, n=38), mientras que las VR con número de caravana impar no
recibieron tratamiento (n= 46). Las VR negativas a ES fueron divididas en 2 grupos
de la misma manera que se mencionó anteriormente. Las VR con número de
caravana par fueron tratadas con un protocolo de sincronización (n= 135), mientras
que las VR con número de caravana impar no recibieron tratamiento (n= 136). El
protocolo de sincronización antes mencionado se basó en la combinación de una
dosis más alta de BE combinado con un DIV de progesterona (Día 0: administración
de 5 mg de BE + DIV con 1 g de P4, día 7: administración de 150 µg cloprostenol
+ retiro del DIV). Todas las vacas fueron inseminadas a celo detectado, tomando el
primer celo posterior al tratamiento o al muestreo según el grupo asignado (Figura
2.1). El diagnóstico de gestación se realizó por US a los 35±5 días post IA. La
evaluación de la eficacia del tratamiento se basó en el porcentaje de preñez obtenido
a la 1° IA.
26
Diagnóstico de ES por CB
(Punto de corte: ≥5%)
ES+ ES-
Cefapirina CON Benzoato CON

(n= 39) (n= 46) (n= 135) (n= 136)
IA a celo detectado post tratamiento/muestreo
Figura 2.1. Diseño experimental y asignación de tratamientos correspondientes a

cada grupo.
Análisis estadístico
Para el análisis de este experimento se utilizó un diseño en bloques
completamente aleatorizado, donde se utilizó cada tambo como criterio de bloque
y a la vaca como unidad experimental. Los análisis descriptivos de las VR fueron
realizados con procedimiento UNIVARIATE de SAS (SAS, 2003). Para evaluar el
efecto del líquido en la luz uterina sobre la fertilidad (preñez a la 1º IA post
muestreo) se realizaron 2 modelos en el que se incluyó como efecto aleatorio al
tambo, y como efecto fijo al parto (1 vs. ≥ 2) y al resultado de la US (1 mm vs. ≥ 1
mm en el modelo 1, y < 2 mm vs. ≥ 2mm en el modelo 2), y su interacción. El grado
de acuerdo entre la técnica de CB y US para el diagnóstico de ES fue analizado por
el Coeficiente Kappa con procedimiento FREQ de SAS (SAS, 2003). Para evaluar
la probabilidad de aislamiento bacteriano en VR con y sin ES se utilizó el

27
procedimiento FREQ de SAS (SAS, 2003). Para evaluar el efecto de la ES
diagnosticada por CB y el efecto de los tratamientos (cefapirina benzatínica y BE)
(modelo tratamientos) en la fertilidad (preñez a la primera IA), se utilizó un modelo
lineal generalizado con una distribución binomial y un enlace logit (Procedimiento
LOGISTIC, SAS, 2003). En ambos casos se incluyeron también el efecto fijo del
parto (1 vs. 2+) y en el modelo tratamientos se utilizó, además, el efecto fijo del
tratamiento (tratamiento cefapirina benzatínica, si vs. no; tratamiento con un
protocolo de sincronización con dosis más altas de BE, si vs. no). Se consideró que
hubo diferencias significativas a partir de P <0.05, y se consideró que hubo una
tendencia a partir de P <0.1.
RESULTADOS
El análisis descriptivo de las VR incluidas en este trabajo se presenta en la
tabla 2.1. La prevalencia de ES en VR fue de 24% (104/432) por CB y de 20.3%
(73/358) por US utilizando como punto de corte ≥ 2 mm de líquido en la luz uterina.
Las VR con ≥ 1 mm de líquido en la luz uterina tuvieron iguales chances de preñez
que las VR sin líquido (RP= 0.875, P= 0.655, Tabla 2.2), siendo los porcentajes de
preñez de 20.4 y 22.6%, respectivamente. Contrariamente, las VR con ≥2 mm de
líquido en la luz uterina tuvieron 2 veces menos chances de quedar preñadas que
las que tuvieron <2 mm (RP= 0.456, P= 0.046, Tabla 2.2), siendo los porcentajes
de preñez de 15 y 27%, respectivamente. Debido a que el diámetro de la luz uterina
puede variar en condiciones fisiológicas durante el ciclo estral o con el número de
partos (Lenz y col., 2007), se midió cual fue la variación causada por los mismos y
se determinó si estos factores podrían afectar el diagnóstico de ES por US. Se

28
encontró que las VR con folículos ≥10 mm de diámetro tuvieron más líquido en la
luz uterina que las vacas que no tenían, 1.12 (0.82-1.41) vs 0.57 mm (0.24-0.90) de
luz uterina, respectivamente (IC95%, P= 0.004). Así mismo, las VR con cuerpo
lúteo (CL) tuvieron menos líquido en la luz uterina que las VR sin CL, 0.66 (0.40-
0.92) vs 1.02 mm (0.66-1.38), respectivamente (P= 0.057). Por último, la
interacción entre la presencia de folículos ≥10 mm y CL no afectó el volumen de
líquido en la luz uterina (P= 0.254). En cuanto al número de partos, primíparas y
multíparas tuvieron similar volumen de líquido en la luz uterina, 0.75 (0.35-1.15)
vs 0.93 mm (0.70-1.16), respectivamente (P= 0.390). Según estos resultados,
utilizando un punto de corte de 2 mm, las vacas normales que se encuentren en estro
o que sean multíparas, no estarían incluidas en el grupo de las vacas con un volumen
de líquido anormal. Por lo tanto, 2 mm de líquido en la luz uterina podría ser
utilizado como punto de corte para identificar VR con menor chance de quedar
preñadas. Por otro lado, no hubo correlación en el diagnóstico de ES por CB y US
en VR (Coeficiente Kappa= 0.03, 95% CI = -0.073 – 0.136, P= 0.54). Tampoco
hubo diferencias significativas entre los aislamientos bacterianos de VR con o sin
ES (P= 0.42, Tabla 2.3). Las VR con ES diagnosticadas por CB tuvieron un
porcentaje de preñez a la 1º IA similar a las VR sin ES (Tabla 2.4). No hubo
interacción entre CB x US en el porcentaje de preñez (P= 0.886, Tabla 2.4). Por
último, el tratamiento con cefapirina benzatínica en VR con ES o con dosis más
altas de BE en VR sin ES no tuvo efecto en el porcentaje de preñez a la 1ºIA (Tabla
2.5).
29
Tabla 2.1. Análisis descriptivo de las vacas repetidoras incluidas en el estudio.

Promedio ES Media Cuartiles n
1
Condición corporal 3 0.52 3 2.75-3.50 394
Inseminaciones artificiales (n) 4.4 2.1 4.0 3.0-5.0 432
Número de lactancia 2.80 1.53 3.0 2-4 398
Producción diaria de leche (kg) 26.2 8.2 26.4 21.0-31.4 139
Días postparto 275 160 226 173-326 402
1
Escala de condición corporal: 5 puntos (1-5).
Tabla 2.2. Efecto del líquido en la luz uterina sobre el porcentaje de preñez a la
primera inseminación artificial post muestreo en vacas repetidoras (n=
358).
% (n/N) RP (95% IC) P
US < 1 mm 22.6 (31 / 137) Referencia 0.655
≥ 1 mm 20.4 (38 / 186) 0.875 (0.485 - 1.578)
< 2 mm 26.8 (68 / 254) Referencia 0.046
≥ 2 mm 14.5 (10 / 69) 0.456 (0.211 - 0.985)
US: Ultrasonografía,
RP (95% IC): razón de probabilidad y 95% del intervalo de confianza,
Treinta y cinco vacas fueron excluidas del análisis estadístico por no tener
registros del resultado del diagnóstico de gestación (358-35= 323).
Tabla 2.3. Aislamientos bacterianos de vacas repetidoras con y sin endometritis

subclínica (n= 49).
Diagnóstico, % (n/N.)
Bacteria ES+ ES-
Corynebacterium spp. 3 (1/38) 0 (0/11)
Trueperella pyogenes 3 (1/38) 18 (2/11)
Bacillus spp. 32 (12/38) 9 (1/11)
Escherichia coli 5 (2/38) 9 (1/11)
Proteus spp. 0 (0/38) 27 (3/11)
Staphylococcus coagulasa - 5 (2/38) 0 (0/11)
Streptococcus beta hemolítico 3 (1/38) 0 (0/11)
Sin aislamiento 50 (19/38) 36 (4/11)
ES+: VR con ≥5% de neutrófilos diagnosticadas por CB,
ES-: VR con <5% de neutrófilos diagnosticadas por CB,
Doce de 61 muestras fueron excluidas del estudio por contaminación bacteriana
durante el muestreo.
30
Tabla 2.4. Efecto de la endometritis subclínica en el porcentaje de preñez a la

primera inseminación de vacas repetidoras diagnosticadas por
cytobrush o por ultrasonografía
% (n/N) RP (95% IC) P
CB <5% PMN 26.28 (72/274) Referencia 0.579
≥5% PMN 23.33 (21/90) 0.85 (0.49-1.49)
US <2 mm 26.8 (68/254) Referencia 0.046
≥2 mm 14.5 (10/69) 0.456 (0.211 - 0.985)
PMN: polimorfo nucleares neutrófilos,
RP (95% IC): razón de probabilidad y 95% del intervalo de confianza,
Interacción CB por US: 0.886,
Punto de corte utilizado para diagnosticar ES: ≥5% PMN (CB) y ≥2 mm (US).
Tabla 2.5. Efecto del tratamiento realizado a vacas repetidoras con o sin
endometritis subclínica sobre el riesgo de quedar preñadas a la primera
inseminación artificial.
Riesgo de preñez
Tratamiento % (n/N) RP (95% CI) P
Cefapirina Benzatínica NO 19.5 (9/46) Referencia 0.503
SI 25.64 (10/39) 1.42 (0.51-3.95)
Benzoato de estradiol NO 28.68 (39/136) Referencia 0.430
SI 24.44 (33/135) 0.81 (0.47-1.38)
OR (95% IC): razón de probabilidad y 95% de intervalo de confianza
DISCUSIÓN
La prevalencia de ES en VR de tambos de Argentina es del 24%, justo el
doble que la descripta en tambos de Austria (12%) (Pothmann y col., 2015) y la
mitad que la descripta en tambos de Israel (54%) (Salasel y col., 2010). La
diferencia en estos resultados puede deberse no solo a los puntos de corte utilizados
en cada trabajo (≥5% de PMN en los dos primeros, y ≥3% de PMN en el último),
sino también a variables relacionadas con cada tambo como manejo, tipo de
personal, nutrición, sistema de producción, clima, etc. Estas últimas son
importantes ya que podrían variar la prevalencia de la enfermedad incluso en
tambos de la misma región. Por otro lado, comparando la prevalencia de ES en VR

31
con vacas postparto de Argentina, encontramos que las primeras tienen una
prevalencia mayor (24% vs 17%) a pesar de haber cumplido el puerperio por
completo. No obstante, la ES (diagnosticada por CB) no afecta la fertilidad en VR
a diferencia de lo reportado en vacas postparto donde disminuye las chances de
preñez en un 30% e incrementa el IPC en 30 días (Madoz y col., 2013).
Contrariamente, la ES diagnosticadas por US reduce las probabilidades de preñez
en VR. Estos resultados concuerdan con los reportados por Kasimanickam y col.
(2004) en vacas postparto. Este autor, reportó que el porcentaje de preñez de vacas
con líquido en la luz uterina y sin endometritis clínica, fue menor comparándolo
con vacas sin líquido en la luz uterina. A su vez, el porcentaje de preñez fue incluso
menor cuando se daban ambas condiciones. En nuestro trabajo, no se encontró
efecto aditivo de ambas técnicas (CB vs. US). Según un trabajo realizado en ratones,
las causas del efecto negativo del líquido intrauterino sobre la fertilidad pueden
relacionarse con: 1) un efecto tóxico directo sobre el desarrollo del embrión, 2) un
mecanismo de interferencia en la implantación, 3) un efecto de lavado sobre el
embrión, y 4) una alteración de la receptividad endometrial por cambios en la
expresión génica (Lu y col., 2013).
El diagnóstico de ES por CB no tuvo correlación con el diagnóstico de ES
por US. Este resultado concuerda con otros estudios realizados en vacas postparto
(30 y 50 dpp) (Kasimanickam y col., 2004; Barlund y col., 2008; kappa= 0.28 y
kappa= 0.25 respectivamente). La falta de acuerdo entre ambas técnicas podría
deberse a que identifican distintos mecanismos de defensa frente a una injuria, en
el caso de la citología endometrial evalúa la respuesta inmune celular y la US
evalúa, indirectamente, el mecanismo de clearance uterino (Kasimanickam y col.,

32
2004). Los resultados bacteriológicos demuestran que el 50% de las VR con ES
fueron positivas al aislamiento bacteriano, pero la mayoría de las bacterias aisladas
raramente causan enfermedades uterinas o directamente no están relacionadas con
enfermedades uterinas (Corynebacterium spp, Bacillus spp, Proteus sp,
Staphylococcus coagulasa - and Streptoccocus beta hemolítico) (Sheldon y col.,
2002). De hecho, muchas de las bacterias aisladas se encuentran en el útero de vacas
postparto sanas (Prunner y col., 2014a; Wagener y col., 2015). Esto resultados
concuerdan con otro estudio que describe una amplia variedad de bacterias en el
útero de VR no relacionadas con infección uterina (Pothmann y col., 2015). Por lo
tanto, en acuerdo con otros estudios, en los que además incluyeron el aislamiento
de bacterias anaerobias (Madoz y col., 2014; Prunner y col., 2014b), podríamos
sugerir que las bacterias no serían la causa principal de ES en VR. No obstante,
sería necesario realizar otro estudio en el que se incluya un mayor número de
muestras y el aislamiento de bacterias anaerobias para confirmar dicha hipótesis.
Por último, contrariamente a nuestra hipótesis, tanto el tratamiento con
cefapirina benzatínica, como el tratamiento hormonal que contaba con una dosis
mayor de BE (5mg en el día 0 del tratamiento) más P4; no mejoraron el porcentaje
de preñez en la 1º IA post tratamiento en VR. En el caso de las VR con ES, a pesar
de que el número de animales incluidos en cada grupo no nos permite llagar a una
conclusión, los resultados de bacteriología descriptos arriba podrían explicar la
posible falta de eficacia del tratamiento (500 mg de cefapirina benzatínica
intrauterina). No obstante, (Kasimanickam y col., 2005) reportó que la cefapirina
benzatínica tuvo un efecto beneficioso al disminuir los DA de vacas tratadas con
respecto a los controles (no tratados), pero no tuvo efecto sobre el porcentaje de
33
preñez. Por otro lado, contrariamente a nuestros resultados, Katagiri y Takahashi
(2008) reportaron que el porcentaje de preñez fue mayor en VR tratadas con 5 mg
que en VR tratadas con 1 mg y 2.5 mg de BE. La razón para esta diferencia no es
fácil de determinar. Es posible que el gran número de tambos (n=14) incluidos en
el trabajo haya afectado negativamente nuestros resultados de fertilidad. Por otro
lado, estudios realizados más recientemente reportaron concentraciones normales
de E2 en VR (Bage y col., 2002; Pothmann y col., 2015), por lo que una dosis mayor
de BE no parecería ser necesaria, salvo en aquellos casos en los que los niveles de
E2 se encuentren por debajo de lo normal. Desafortunadamente, los niveles de
estradiol no fueron medidos en el presente trabajo por lo que no podemos confirmar
dicha hipótesis.
CONCLUSIONES
En conclusión, ES no es la causa principal de VR. La detección de ≥ 2 mm
de luz uterina está relacionada con un menor riesgo de preñez en VR.
Contrariamente, la detección de ≥ 5% PMN no está relacionada con el riesgo de
preñez en VR. Por lo tanto, podríamos decir que la presencia de líquido en la luz
uterina y la citología endometrial, no representan la misma afección. Por último, el
tratamiento con dosis más altas de BE en VR sin ES no tuvo un efecto beneficioso
en los porcentajes de preñez. Si bien los resultados muestran que no hubo efecto
beneficioso del tratamiento con cefapirina benzatínica en VR con ES, es necesario
incrementar el número de muestras para poder concluirlo. Por lo tanto, se requieren
más estudios para comprender los mecanismos que causan VR y de esta forma
poder establecer un tratamiento efectivo.

34
CAPÍTULO III
COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA ENDOMETRIAL EN
VACAS REPETIDORAS Y VACAS FÉRTILES DURANTE EL DIESTRO
INTRODUCCIÓN
Para que se establezca la gestación, es importante tanto la calidad del
ovocito como la del ambiente oviductal y uterino. En el caso de las VR, alguna de
estas condiciones no se cumple y por lo tanto fallan en quedar preñadas. Varios
estudios demuestran que la mayor parte de las pérdidas de preñez ocurren antes del
reconocimiento materno de gestación, el cual se da alrededor del día 15 de gestación
(Diskin y Morris, 2008; Bridges y col., 2013). Durante dicho período, en el que se
produce el crecimiento embrionario e inicio de la implantación, la expresión génica
endometrial no varía entre una vaca cíclica y una vaca preñada (Forde y col., 2011b;
Mamo y col., 2012; Brooks y col., 2014). Esto se debe a que, en cada ciclo estral,
el útero se prepara para recibir a un embrión. Esta condición es importante ya que,
el estudio de expresión génica endometrial en vacas fértiles y subfértiles, como lo
son las VR, nos podría ayudar a comprender los mecanismos por los que se
desencadena dicha subfertilidad.
Una vez que el ovocito es fertilizado, el embrión comienza su crecimiento
en el oviducto, el cual continuará en el útero unos 4 a 6 días más tarde (Brooks y
col., 2014). Desde la fertilización y hasta el estadío de blastocisto protruido (día 9
a 10), el embrión es relativamente autónomo, es decir no requiere del contacto con
el endometrio materno para sobrevivir (Forde y Lonergan, 2012). Posteriormente,

35
su crecimiento y desarrollo dependerá principalmente de las sustancias sintetizadas
y secretadas por el endometrio, que en conjunto se las denomina leche uterina o
histotrofo (Mamo y col., 2012). El histotrofo, está formado por proteínas (enzimas,
factores de crecimiento, citoquinas, factores de adhesión, proteínas de transporte y
proteínas derivadas del suero materno), lípidos, aminoácidos, azucares (glucosa,
fructosa), iones, exosomas y otros metabolitos (Mamo y col., 2012; Brooks y col.,
2014). Este, es la principal fuente de energía y nutrientes para el embrión, lo cual
se relaciona con el crecimiento y desarrollo del mismo y esto último con la
producción de interferón tau, indispensable para el reconocimiento materno de la
gestación (Mann y Lamming, 2001). Alrededor del día 13 comienza el proceso de
implantación, en el cual participan una gran variedad de moléculas en las que se
incluyen factores de crecimiento, prostaglandinas, hormonas y citoquinas
(Sugawara y col., 2010; Dorniak y col., 2011). Este complejo proceso, se caracteriza
por la elongación del conceptus, aposición, unión y adhesión del trofoectodermo al
endometrio (Forde y Lonergan, 2012).
Para que estos procesos sean exitosos se requiere de una serie de
interacciones muy bien sincronizadas entre ovarios, oviductos, útero y embrión
(Shimizu y col., 2010). Como mencionamos en el capítulo anterior, los E2 y P4 de
origen ovárico regulan, a nivel uterino, la expresión de una amplia variedad de
citoquinas y factores de crecimiento que cumplen un rol muy importante en el
crecimiento del conceptus, formación del histotrofo, e implantación (Bazer y col.,
2009; Singh y col., 2011; Forde y col., 2012; Brooks y col., 2014; Killeen y col.,
2014). Estas hormonas ejercen su acción uniéndose a sus receptores (ER y PR)
ubicados en el endometrio (células del epitelio luminal, glandular y del estroma) y

36
miometrio. La expresión de dichos receptores está regulada por ambas hormonas
(Ing y Tornesi, 1997). En líneas generales, el E2 tienen un efecto estimulador en la
expresión de ambos receptores, mientras que la P4 tiene un efecto inhibidor (Meikle
y col., 2001; Robinson y col., 2001). Los cambios de expresión de estos receptores
podrían relacionarse con alteraciones en la concentración sérica de ambas hormonas
y con cambios en la expresión endometrial de factores relacionados con el
establecimiento de la gestación.
Dentro de los factores de crecimiento cuya expresión está regulada por E2 y
P4 se encuentra el EGF. La actividad del mismo está relacionada con la receptividad
uterina, la cual se define como la condición fisiológica en la que se debe encontrar
el útero para que el crecimiento del conceptus y la implantación sean posibles
(Minten y col., 2013), y con el crecimiento embrionario.
Como se describió en el capítulo anterior, el EGF parecería tener un rol
importante en el desencadenamiento del SVR (Katagiri y Takahashi, 2004, 2006,
2008). La alteración de la concentración endometrial de EGF fue descripta en un
70% de VR sin endometritis subclínica (Katagiri y col., 2013). Este factor de
crecimiento es sintetizado por células endometriales y su función está relacionada
con el crecimiento, proliferación y diferenciación de células uterinas y del
trofoblasto (Akbalik y Ketani, 2013; Takatsu y col., 2015). Además, participa en la
estimulación de la síntesis de prostaglandinas (Zhang y col., 1992) a través de la
activación de la enzima prostaglandina peróxido sintasa 2 (PTGS2), también
conocida como ciclooxigenasa (Bany y Kennedy, 1995), cuya importancia en el
establecimiento de la gestación será descripto más adelante. Su función la ejerce a

37
través de la unión con su receptor (EGFR), quien forma parte de un grupo de 4
receptores transmembrana con actividad tirosin-kinasa (Akbalik y Ketani, 2013).
En mamíferos, el grupo de receptores antes mencionado se localiza en
diferentes tejidos del organismo, participando en la regulación de procesos
relacionados con el crecimiento, migración, proliferación y diferenciación celular
(Sagsoz y col., 2012). En el tejido uterino, estos receptores se expresan en diferentes
tipos celulares siendo mayor en el epitelio luminal y en el epitelio de las glándulas
superficiales (Sagsoz y col., 2012). A su vez se describió que, a nivel endometrial,
la expresión del EGFR se da principalmente durante el diestro medio y tardío
(Takatsu y col., 2015) y durante las etapas de pre-implantación e implantación
(Kliem y col., 1998; Hambruch y col., 2010). Por lo tanto, los cambios en la
expresión del sistema EGFR/EGF, podrían relacionarse con alteraciones en la
receptividad uterina en VR sin ES.
El Factor Nodal (FNod) forma parte de la super familia del factor de
crecimiento transformador β (Jones y col., 2006; Singh y col., 2011). Muchos de
los miembros de esta super familia participan en la remodelación endometrial, lo
cual es esencial durante el período de pre-implantación (Sugawara y col., 2010).
Así mismo, trabajos realizados en humanos y ratones reportan que el rol principal
del FNod estaría relacionado con la implantación, aunque todavía se desconoce su
función específica (Sugawara y col., 2010; Park y Dufort, 2013). Papageorgiou y
col. (2009), reportaron que el mismo fue detectado en el fluido uterino en humanos,
por lo que su presencia podría estar relacionada, además, con el desarrollo
embrionario.
38
La actividad del FNod está regulada por los niveles de éste y su inhibidor,
Lefty, quien actúa como antagonista impidiendo que el FNod se una a su receptor
(Park y Dufort, 2011). Un trabajo realizado en ratones postula que, la alteración en
la regulación de FNod/Lefty estaría relacionada con pérdidas embrionarias (Park y
Dufort, 2011). En bovino se han realizado pocos estudios sobre el FNod. Arganaraz
y col. (2013) estudiaron la expresión del FNod en el oviducto y útero de vacas
durante el ciclo estral y gestación temprana. Los resultados demuestran que el FNod
se expresa tanto en el oviducto como en el útero de vacas vacías y preñadas. A nivel
uterino, los mayores niveles de expresión se dieron durante el estro. La alteración
de la expresión del FNod y su antagonista, Lefty, podría estar relacionada con fallas
en el proceso de implantación en los bovinos (Arganaraz y col., 2013). Por lo tanto,
debido a la importancia que tendría este factor en el proceso de implantación y a la
falta de información del mismo, sería interesante estudiar la expresión endometrial
del FNod en VR sin ES durante el diestro.
Las prostaglandinas juegan un rol muy importante en el establecimiento de
la gestación ya que regulan la expresión de genes en el endometrio relacionados
con la elongación e implantación del embrión (Brooks y col., 2014; Takatsu y col.,
2015). De hecho, las concentraciones de prostaglandinas son mayores en el útero
de hembras gestantes que en aquella cíclicas o no gestantes (Brooks y col., 2014).
En ovinos, durante el día 10 y 12, la P4 induce la expresión endometrial de una gran
variedad de genes que codifican proteínas relacionadas con la adhesión celular, el
transporte de glucosa, transporte de aminoácido y enzimas, entre las que se
encuentra la PTGS2 (Dorniak y col., 2011). La PTGS2, se encarga de la síntesis de
prostaglandinas. Algunas de éstas, como prostaglandina E2 (PGE2) y prostaciclina

39
I2 (PGI2), son consideradas importantes reguladoras de la interacción entre el
conceptus y el endometrio durante la gestación temprana (Spencer y col., 2008).
Además, se describió que la PGE2 tienen un efecto luteotrófico (Katagiri y
Takahashi, 2006), lo cual favorece el mantenimiento de la gestación.
En bovinos, la expresión de PTGS2 es mayor durante el diestro medio y
tardío y durante la primera y última etapa de gestación (Arosh y col., 2003; Arosh
y col., 2004). A nivel celular, la expresión de PTGS2 es mayor en las células del
epitelio luminal que en las del estroma o miometrio (Arosh y col., 2004).
Recientemente, un estudio realizado en VR describió una alteración en la expresión
de PTGS2 (Wagener y col., 2017). Por lo tanto, la alteración de la expresión
endometrial de PTGS2 podría estar relacionada con la subfertilidad en VR.
Las alteraciones del ambiente uterino, producidas por cambios en la
expresión génica endometrial, podrían ser responsables de la disminución de la
fertilidad en VR (Hayashi y col., 2017). Por lo tanto, el estudio de la expresión
endometrial de transcriptos involucrados en el establecimiento y mantenimiento de
la gestación, nos ayudaría a comprender los mecanismos moleculares relacionados
con subfertilidad en VR. El objetivo del presente capítulo fue comparar la expresión
endometrial de ARNm de PR, ER, EGFR, FNod y PTGS2 entre VR sin ES y vacas
fértiles. La hipótesis correspondiente a dicho objetivo fue que la expresión
endometrial de ARNm de PR, ER, EGFR, FNod y PTGS2 difiere entre VR sin ES
y vacas fértiles.
40
Para la realización de este experimento se utilizaron vacas Holando
Argentino (n= 110) de tambos comerciales de las localidades de Castelli, Brandsen
y Lobos.
Definición del caso clínico
Al igual que en el capítulo anterior, se consideró VR (n= 59) aquellas vacas
con ≥3 servicios a intervalos regulares de tiempo (entre 17 y 25 días), vacías y
clínicamente sanas (sin afecciones uterinas u ováricas). Además, las VR incluidas
en el experimento no presentaron registros de abortos o tratamientos, ya sean
hormonales o ATB, durante el período antes mencionado. Por otro lado, se
consideró como vacas control (CF, n= 51) aquellas vacas con ≥ 30 dpp,
clínicamente sanas y que quedaron preñadas dentro de las primeras dos IA.
La evaluación clínica de las vacas se realizó de la forma descripta en el
capítulo anterior. En primer lugar se realizó un examen mediante US (ecógrafo
Mindray™ 6600Vet, sonda lineal de 7.5 MHz) y posteriormente se realizó la
técnica de flujeo manual para para el diagnóstico de EC (Sheldon y col., 2002;
Dominguez, 2006). Se incluyeron en el estudio solamente aquellas VR en las que
se confirmó vacuidad y no presentaron EC o cualquier otra afección o anormalidad.
En el caso de las CF, se incluyeron aquellas vacas que se encontraban clínicamente

41
sanas al momento de la evaluación y que posteriormente quedaron preñadas en las
primeras 2 IA.
Toma de muestras
La muestra consistió en 2 cepillados endometriales tomados mediante la
técnica de cytobrush. Uno de los cepillos se utilizó para el diagnóstico de ES y
posteriormente, junto con el otro cepillo, se utilizaron para el estudio de la expresión
de ARNm de PR, ER, EGFR, FNod y PTGS2.
El diagnóstico de ES se realizó como se describió en el capítulo anterior.
Las VR y CF que fueron positivas al diagnóstico de ES (conteo de PMN ≥5%)
fueron eliminadas del experimento.
Para el estudio de expresión génica, el material de ambos cepillos se
descargó en un eppendorf nuevo, libre de RNasas, que contenía 1 ml de
estabilizador de ARN (RNA later, Qiagen). Los mismos fueron rotulados y
colocados en gradillas refrigeradas hasta su llegada al laboratorio en donde fueron
almacenados a -20°C hasta su procesamiento.
Por último, se tomó una muestra de sangre de la vena coccígea y se depositó
en tubos de sangre de polipropileno. Una vez en el laboratorio la sangre fue
centrifugada a 600 rpm durante 10 min. El suero obtenido se colocó en tubos tipo
eppendorf de 1,5 ml y rotulados. El suero obtenido se almacenó por duplicado a -
20°C. Estas muestras fueron utilizadas para medir las concentraciones de P 4
mediante quimioluminiscencia (Progesterone II, inmunoanalizador Elecsys and Cobas
e, Roche®, Mannheim, Alemania).

42
Estudio de la expresión génica endometrial
a. Extracción de ARN
Antes de comenzar con la extracción de ARN, a cada eppendorf se le agregó
500 μl de PBS (Invitrogen Corp.) helado libre de RNasas, se centrifugó a 8000 rpm
durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. El objetivo de este paso fue formar
un pellet de células endometriales y eliminar el estabilizador de ARN.
Una vez que se obtuvo el pellet de células endometriales, a cada eppendorf
se le agregó 500 μl de Trizol (TriReagent, Molecular Research Center Inc.) y se
realizó la extracción de ARN según las indicaciones del fabricante, con la adición
de 2 μl de glicógeno al momento de la incorporación del isopropanol e incubación
de cada muestra a -20ºC durante toda la noche, con el objetivo de mejorar el
rendimiento de la extracción de ARN (Apéndice 1). Una vez obtenido el ARN, éste
fue cuantificado por espectrofotometría y tratado con DNasas (DNase I
amplification grade, Invitrogen Corp.) para eliminar el ADN genómico
contaminante. Una vez finalizado este paso, se realizó la retrotranscripción.
b. Retrotranscripción
Para la retrotranscripción se incubó 1 µg de ARN tratado con DNasa junto
con 1.5 μl de primers random hexamers (160 ng/ μl) (Random primers,
Biodynamics SRL) a 65ºC durante 10 min (Apéndice I). Se dejó la mezcla a
temperatura ambiente por 5 min. Posteriormente, se agregó a la mezcla 4 μl de First
Strand Buffer 5X (Invitrogen corp.), 2 μl de 0,1 M DTT, 1 μl de dNTPs 10mM y 1
μl de Inhibidor de ARNasas (RNAse Out, Invitrogen Corp.) y se la incubó a 37ºC
durante 2 min. Luego se le agregó 1 μl de la enzima retrotranscriptasa (MMLV,
Invitrogen Corp.), siendo el volumen final de la reacción igual a 20 μl. Se incubó a

43
25ºC por 10 min, luego a 37ºC por 50 min y a 70ºC por 15 in para inactivar la
enzima. El ADNc se almacenó a -20ºC hasta su utilización.
En todas las reacciones se procesó un control sin ARN y un control negativo
de retrotranscripción sin la enzima retrotranscriptasa.
c. Selección y validación de primers
Los primers seleccionados para el presente trabajo (Tabla, 3.1) fueron
tomados de la bibliografía y evaluados mediante herramientas bioinformáticas. En
el caso de EGFR y FNod, dado que no se encontraron primers que cumplieran las
condiciones necesarias para su utilización, se diseñó un par de primers específico
mediante el software Primer Premier (PREMIER Biosoft International).
Una vez recibidos los primers en el laboratorio, se realizó la validación de
los mismos. Para ello se pusieron a punto los parámetros en la qPCR, tomando en
cuenta el tamaño del amplicón producido y la temperatura de melting
proporcionada por el proveedor de los primers. Las temperaturas de annealing se
determinaron de forma empírica. Durante el proceso de validación, los productos
de PCR fueron sembrados en un gel de agarosa 1,5% con el fin de corroborar la
amplificación específica del producto en cuestión y la ausencia de dímeros de
primers. Adicionalmente, se corroboró que los negativos de retrotranscripción (sin
retrotranscriptasa) no presentaran producto de PCR y que en todas las reacciones se
amplificara el producto del peso molecular correspondiente.
Para el estudio del transcripto de FNod se testearon tres pares de primers
diferentes, para el estudio de EGF se testearon 4 pares de primers, para el estudio
de EGFR se testearon dos pares de primers y para el resto de los genes se testeó
uno. Una vez establecidos los parámetros de amplificación de cada par de primers,
44
se determinó la eficiencia de amplificación por qPCR a través de curvas de rango
dinámico para cada par de cebadores. Se realizaron amplificaciones por duplicado
de un ADNc correspondiente a una VR y sus diluciones 1/10, 1/100 y 1/1000. Todas
las curvas tuvieron una pendiente entre -3,2 y -3,5 y entre los duplicados la
desviación estándar fue en todos los casos < 0,167 según lo recomendado para
realizar estudios de expresión génica relativos (Bustin, 2002). Si bien se logró
obtener amplicones con los primers testeados de EGF, dicha PCR no mostró las
eficiencias de reacción necesaria (mayores a 90%) para ser incluido en el presente
estudio.
Tabla 3.1. Secuencia de los cebadores fordward (F) y reverse (R), tamaño del
producto de PCR y su referencia.
Tamaño del
Cebador Secuencia Referencia
producto
PR F: GAGAGCTCATCAAGGCAATTGG 227 pb Forde y col. (2011a)
R: CACCATCCCTGCCAATATCTTG
ER F: CCTCTCTCACTTCAGGCACA 99 pb Okumu y col. (2010)
R: ATCTCCAGCAGCAGGTCGTA
EGFR F: ATGCAGAAGGAGGCAAGGTC 166 pb Diseñado por la Dra.
R: GTCGAGATCTCACTCGCAGG Silvina Quintana
FNod F: CCCCTCGCTTATATGCTGAGTCT 68 pb Diseñado por la Dra.
R: TGCAGGCTACGGATGATGTC Belén Rabaglino
PTGS2 F: CTTAAACAAGAGCATCCAGAATGG 106 pb Sugimura y col. (2014)
R: GCTGTACGTAGTCTTCAATCACAATCT
GAPDH F: TTCTGGCAAAGTGGACATCGT 112 pb McGuire y col. (2004)
R: CTTGACTGTGCCGTTGAACTTG
PR: Receptor de progesterona.
ER: Receptor de estradiol.
EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico.
FNod: Factor Nodal.
PTGS2: prostaglandina-endoperóxido sintasa 2
GAPDH: gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa.
45
d. PCR en tiempo real
Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo utilizando una mezcla
preformada y optimizada de todos los componentes de la reacción (Mezcla Real,
Biodynamics SRL), exceptuando primers, moldes y agua, en un volumen final de
25 μl y por duplicado. La detección del producto amplificado se monitoreó en un
equipo Rotor Gene Q (Qiagen, Hilden, Alemania), que mide el aumento de la
fluorescencia en cada ciclo de PCR causado por la unión del EVA Green al ADN
doble cadena.
Se efectuó una curva de disociación en cada caso para corroborar que se
estaba amplificando el producto de tamaño esperado y asegurarse que no se forman
dímeros de primer que pudieran estar interfiriendo en la lectura de fluorescencia del
termociclador.
Todas las determinaciones se efectuaron con una concentración de
cebadores de entre 448 a 900 mM. El programa de ciclado consistió en una
desnaturalización inicial de la premezcla de 3 minutos a 95°C y cuarenta ciclos de
20 segundos a 95°C, 20 segundos a la temperatura de annealing específica del
primer y 20 segundos a 72 °C.
Para la determinación de los niveles relativos de expresión de cada marcador
se aplicó el método 2 delta-delta CT (Livak y Schmittgen, 2001). El gen endógeno
utilizado para el análisis de expresión génica fue Gliceraldehído-3 fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) utilizándose ADNc de muestras de vacas en anestro
como calibrador.
46
Para evaluar la diferencia de expresión relativa de los diferentes transcriptos
incluidos en el estudio entre VR y CF se utilizó un modelo lineal generalizado con
una distribución Poisson y un enlace logarítmico (Procedimiento GLIMMIX,
distribución Poisson, función Log Link; SAS, 2003). Se consideró que hubo
diferencias significativas a partir de P <0.05.
RESULTADOS
De las 59 VR muestreadas, 6 presentaron ES, 9 presentaron niveles de P 4
<1 ng/ml y 28 fueron utilizadas para poner a punto la técnica RT-qPCR en tiempo
real. De las 51 CF muestreadas, 8 presentaron ES, 18 presentaron niveles de P4 <1
ng/ml y 15 no quedaron preñadas en las primeras dos IA. Por lo tanto, 16 VR y 10
CF fueron incluidas en el estudio. No obstante, a través del análisis estadístico
utilizando el procedimiento UNIVARIATE de SAS (SAS, 2003), se determinó que
una de las 10 CF incluidas en el estudio presentaba valores atípicos por lo que no
se incluyó en el análisis estadístico final.
Los resultados obtenidos demuestran que hubo diferencias significativas en
la expresión de ARNm de EGFR (RP= -1.098; 95% IC= -1.66 – -0.54; P<0.01;
Figura 3.1), FNod (RP= -3.227; 95% IC -4.15 – -2.30; P<0.01; Figura 3.2) y PTGS2
(RP= 0.439; 95% IC= 0.39 – 0.49; P<0.01; Figura 3.3), siendo mayor la expresión
de EGFR y FNod en VR que en CF y menor la expresión de PTGS2 en VR que en
CF. En cuanto a PR y ER, no hubo diferencias significativas en la expresión de
ARNm entre VR y CF (RP= 0.229; 95% IC= -1.13 – 1.59; P>0.73; RP= -0.517;
95% IC= -1.27 – 0.23; P= 0.17, respectivamente)

47
7
Receptor EGF
CF B
6 VR
Expresion relativa
4
3
A
2
18
Factor Nodal
CF
16
VR
B
14
Expresion relativa
12
10
2
A
0
500
Prostaglandina-Endoperoxido Sintasa 2
450 CF
VR
400 A
350
Expresion relativa
300
B
250
200
150
100
50
Figura 3.1. Comparación de la expresión relativa de ARNm del receptor del factor
de crecimiento epidérmico (EGFR; panel superior), factor nodal (FNod;
panel intermedio) y de la enzima prostaglandina-endoperóxido sintasa
2 (PTGS2; panel inferior) en vacas repetidoras (VR, n=16) y en vacas
fértiles (CF, n=9; P<0.01).
48
3
Receptor para E2
CF
VR
Expresión relativa
2
2
Receptor para P4
CF
VR
Expresión relativa
Figura 3.2. Comparación de la expresión relativa de ARNm del receptor de

estradiol (ER; panel superior) y progesterona (PR; panel inferior) en
vacas repetidoras (VR, n=16) y en vacas fértiles (CF; P>0.15, P>0.73).
DISCUSIÓN
De acuerdo con nuestra hipótesis, se encontraron diferencias significativas
en la expresión génica endometrial en VR comparándolas con CF. Las mismas
corresponden a cambios en la expresión génica de EGFR, FNod y PTGS2, mientras
que no hubo diferencias significativas en la expresión génica de ER y PR.
A pesar de que varios trabajos concuerdan en la importancia del EGF y su
receptor (EGFR) para el establecimiento de la gestación en diferentes especies
(Katagiri y Takahashi, 2004; Tamada y col., 2005; Bukowska y col., 2011; Singh y
49
col., 2011; Sagsoz y col., 2014), nuestros resultados demuestran una mayor
expresión del ARNm de EGFR en VR comparándolas con CF. Una explicación
para este resultado podría ser que, la mayor expresión de ARNm de EGFR en VR
no necesariamente indicaría una mayor concentración del receptor a nivel celular,
ya que el ARNm normalmente sufre modificaciones posteriores al proceso de
transcripción cuyas alteraciones modificarían la expresión del receptor a nivel
celular (Blaustein y col., 2007; Pérez-Sala Gozalo, 2012). Si bien la expresión
génica es generalmente proporcional al número de copias de ARNm de un gen
determinado (Quintana, 2013), un estudio realizado en Noruega describió una falta
de correlación entre la expresión de ARNm evaluado a partir de RT-qPCR en
tiempo real y microarreglos, y la expresión de proteínas evaluada por
inmunohistoquímica (Jonsdottir y col., 2008). Por lo tanto, en futuras
investigaciones sería interesante incluir el estudio de la expresión de la proteína, a
través de técnicas como la inmunohistoquímica, para corroborar que la mayor
expresión de ARNm se relacione con una mayor expresión de ésta, en este caso
EGFR. Por otro lado, la alteración de los mecanismos que regulan la expresión de
este receptor podrían ser la causa del incremento en la expresión, en este caso
podrían estar alteradas las concentraciones de las hormonas esteroideas,
especialmente E2 o las de su ligando, el EGF, cuya alteración fue descripta en un
70% de VR sin ES (Katagiri y Takahashi, 2006).
Otro de los resultados obtenidos por el presente trabajo muestra una
diferencia significativa en la expresión del FNod, siendo mayor la expresión de este
factor en VR que en las CF. Este resultado es de suma importancia ya que, hasta el
momento, hay escasa información sobre el patrón de expresión, regulación y

50
función del FNod en bovinos. El primer trabajo que estudio y evidenció la presencia
del FNod en el tracto reproductivo del bovino fue realizado en Argentina y
Alemania (Arganaraz y col., 2013). A su vez, determinaron que a nivel endometrial
la expresión del ARNm fue mayor durante el estro y disminuyó 1.5 veces en el
diestro y preñez temprana (Arganaraz y col., 2013). En el presente trabajo, realizado
durante el diestro, la expresión del FNod fue mayor en VR que en CF. Este
incremento en la expresión de FNod, podría relacionarse con un incremento en la
expresión de su inhibidor, Lefty, ya que el FNod presenta un feed back positivo
sobre la síntesis de él mismo y sobre la síntesis de su inhibidor (Shen, 2007), quien
ha sido vinculado con casos de subfertilidad idiopática en humanos (Park y Dufort,
2013) y con pérdidas embrionarias en ratones (Park y Dufort, 2011).
Lamentablemente, en el presente trabajo no se estudió la expresión de Lefty, por lo
que no se puede comprobar dicha hipótesis. Por lo tanto, la alteración de la
expresión del FNod podría estar relacionada con subfertilidad en VR.
A su vez, en el presente trabajo se determinó una diferencia significativa en
la expresión génica endometrial de PTGS2 entre VR y CF, siendo menor la
expresión en VR que en CF. En acuerdo con dicho resultado, Wagener y col. (2017)
reportó una diferencia significativa en la expresión de PTGS2 entre VR y vacas
control, siendo la expresión de PTGS2 6 veces menor en VR. Estos resultados se
alinean con aquellos descriptos por Arosh y col. (2003) y Dorniak y col. (2011),
quienes describieron la importancia de las PG durante la implantación y el
reconocimiento materno de gestación. Por lo tanto, la menor expresión de PTGS2
en VR, podría relacionarse con una menor expresión de PG relacionadas con el
establecimiento de la gestación como la PGE quien a su vez presenta un efecto

51
luteotrófico. Por su parte, Ledgard y col. (2011), no encontró diferencias
significativas en la expresión de PTGS2 comparando vacas con un potencial de
fertilidad superior con vacas con un potencial de fertilidad inferior (el potencial de
fertilidad se basó en la capacidad de secretar PGF2α en respuesta a la
administración de oxitocina endovenosa). Teniendo en cuenta que las PG juegan un
rol importante en el establecimiento de la gestación (Brooks y col., 2014; Spencer
y col., 2016) y que la PTGS2 da lugar a la biosíntesis de prostanoides entre los que
si incluyen: prostaglandinas (PGF2α, PGE, PGD), prostaciclinas (PGI) y
tramboxanos (TXA2) (Arosh y col., 2003), cuyas funciones bilógicas varían
ampliamente, sería interesante para futuras investigaciones incluir el estudio de
moléculas relacionadas específicamente con la fertilidad, como los receptores de
PGE, para comprender mejor el rol que estas moléculas ejercen sobre las VR.
Por otro lado, no se encontraron diferencias significativas en la expresión
génica endometrial de ER y PR entre VR y CF. Teniendo en cuenta que las
hormonas esteroideas (E2 y P4) son responsables de regular sus propios receptores
y a su vez regulan la expresión de muchos otros genes involucrados en la
receptividad uterina, formación de histotrofo, crecimiento embrionario e
implantación, parecería extraño no encontrar diferencia en la expresión de éstos y
si en los otros tres transcriptos estudiados. Una de las razones podría deberse a que
la expresión de los ER y PR no es constante durante la etapa del diestro (Ing y
Tornesi, 1997; Spencer y col., 2008; Okumu y col., 2010), por lo tanto, dicha
característica podría dificultar la identificación de cambios en la expresión de los
mismo entre VR y CF. A su vez, la expresión de PR en las células del epitelio
luminal es baja a lo largo del ciclo estral y moderada en las células del epitelio
52
glandular y estroma (Robinson y col., 2001). Por lo tanto, la evaluación de la
expresión de los PR en células obtenidas por cepillado endometrial podría dificultar
la detección de cambios en la concentración de estos receptores.
Por último, las técnicas moleculares cada vez tienen mayor importancia en
los trabajos de investigación ya que proveen valiosa información para comprender
procesos tanto fisiológicos como patológicos a nivel molecular. Si bien existen
protocolos que permiten llevarlas a cabo, la gran cantidad de variables que incluye
el investigador para llevar a cabo su trabajo, como el tipo de muestras (células,
tejidos, líquidos), forma de almacenamiento (-80ºC, nitrógeno líquido), los insumos
a utilizar (dependiendo de los protocolos seleccionados, marcas), hacen que no
siempre sea sencillo poner a punto la técnica seleccionada (PCR, qPCR,
microarreglos). Por lo tanto, la descripción de un protocolo exitoso para la
realización de una de estas técnicas es sumamente valiosa para los investigadores
que las utilizan. En lo que respecta a este trabajo podemos decir que, es posible
almacenar células obtenidas de un cepillado endometrial de un animal vivo en un
estabilizador de ARN (RNA later, Qiagen) a -20ºC hasta su procesamiento y
posteriormente realizar la extracción de ARN con Trizol (TriReagent, Molecular
Research Center Inc.).
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos demuestran diferencias significativas en la
expresión génica endometrial de ARNm de EGFR, FNod y PTGS2 entre VR y CF,
siendo mayor la expresión de EGFR y FNod en VR que en CF y menor la expresión

53
de PTGS2 en VR que en CF. Por otro lado, no se observó diferencias significativas
en la expresión de ARNm de PR y ER entre VR y CF. Teniendo en cuenta la
complejidad de los mecanismos moleculares que intervienen en establecimiento de
la gestación y de la cantidad de moléculas que participan, este trabajo aporta valiosa
información que servirá de base para futuras investigaciones.

54
CAPÍTULO IV
IDENTIFICACIÓN DE ESCHERICHIA COLI Y TRUEPERLLA
PYOGENES POR MARCHA BACTERIOLÓGICA CONVENCIONAL Y
ESPECTROSCOPIA INFRARROJA TRANSFORMADA DE FOURIER EN
VACAS LECHERAS
INTRODUCCIÓN
Muchos trabajos han demostrado que las enfermedades uterinas como
metritis (MT), EC y endometritis subclínica ES, están asociadas a una disminución
de la fertilidad y a un incremento de los rechazos por causas reproductivas en vacas
lecheras (Giuliodori y col., 2013a, b; Madoz y col., 2013). En muchos casos la causa
es microbiana y Escherichia coli (E. coli) y Trueperella pyogenes (T. pyogenes)
son las bacterias patógenas más comúnmente aisladas de casos de MT, EC y en
algunos casos de ES (Prunner y col., 2014b). A éstas les siguen Prevotella sp,
Fusobacterium necrophorum, y Fusobacterium nucleatum (Sheldon y col., 2009).
El tratamiento para dichas afecciones se basa en la administración de antibióticos
de forma empírica. Esto se debe a que la mayoría de los veterinarios no toman
muestras bacteriológicas de rutina para completar el diagnóstico y definir un
tratamiento. Normalmente, para los casos de MT se recomienda ceftiofur, penicilina
procaínica o tetraciclina (administración subcutánea o intramuscular). Para los
casos de EC y ES se recomienda cefapirina benzatínica (administración
intrauterina) (Kasimanickam y col., 2005; LeBlanc, 2008). El inconveniente es que
el uso empírico de antibióticos podría ser un factor importante en la aparición de

55
cepas bacterianas resistentes (Santos y col., 2010c). Un estudio reportó que más del
50% de T. pyogenes aisladas eran resistentes a amoxicilina, ampicilina,
cloranfenicol, florfenicol, oxitetraciclinas y penicilinas (Santos y col., 2010b). Así
mismo se reportó que el 35% de E. coli aisladas fueron multidroga resistentes
(ampicilina-cloranfenicol-florfenicol) (Santos y col., 2010c). Recientemente, un
estudio reveló una posible resistencia a la cefapirina (cefalosporina de primera
generación), uno de los antibióticos más utilizados en el tratamiento de EC en vacas
lecheras (de Boer M, 2015). El uso de cefalosporinas para el tratamiento de
enfermedades en animales de producción es un tema controversial ya que éste es
un antibiótico de reserva en medicina humana. De hecho, muchos países han
implementado medidas para restringir el uso al mínimo y evitar así la resistencia
bacteriana (Trevisi y col., 2014; Kasimanickam VR, 2016; Kuipers A, 2016).
La marcha bacteriológica convencional se basa en las características
morfológicas, de crecimiento, propiedades bioquímicas y metabólicas de las
bacterias (Winn WC, 2006). A pesar de que este método es muy útil para identificar
bacterias, en la práctica diaria presentan algunas limitaciones que se observan de
manera específica y más evidente en algunos tipos bacterianos. Dentro de las
limitaciones podemos mencionar el tiempo para llegar a un diagnóstico y la
dificultad y falta de precisión para identificar algunos tipos bacterianos (Fernández
Olmos y col., 2010). Los métodos moleculares para la identificación bacteriana
permiten soslayar estas limitaciones.
La espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (TF-IR) es una técnica
que permite determinar la composición bioquímica (proteínas, lípidos, ácidos
nucleicos, polisacáridos, etc.) de cualquier material (Naumann y col., 1991). De

56
hecho, hace algunos años que se está utilizando como método de identificación
bacteriana (Kuhm y col., 2009). Gracias a que los microorganismos son
bioquímicamente diferentes unos de otros, el espectro que generan actúa como una
huella digital, permitiendo diferenciarlos en género, especie, tipo y serotipo (Beekes
y col., 2007). Esta diferenciación se basa en la distancia espectral entre
microorganismos, cuanta más distancia haya entre los espectros mayor la diferencia
bioquímica entre microorganismos. Por ello, es muy importante poseer una base de
datos con una gran cantidad de espectros de referencia. Contando con una base de
datos completa, TF-IR podría ser un método simple, relativamente rápido y de bajo
costo para la identificación de bacterias uterinas patógenas. No obstante, TF-IR no
es una herramienta que se puede utilizar a campo, sino que, al igual que el método
convencional, las muestras deben remitirse al laboratorio.
Los objetivos del presente trabajo fueron:1) determinar el grado de acuerdo
entre marcha bacteriológica convencional y la TF-IR; y 2) determinar si la base de
datos generada a partir de bacterias uterinas de vacas lecheras europeas podría ser
utilizada para la identificación de bacterias uterinas de vacas lecheras de nuestro
país. Las hipótesis correspondientes a dichos objetivos fueron:1) La TF-IR puede
ser utilizada para la identificación de bacterias uterinas de vacas lecheras, y 2) la
base de datos producida a partir de bacterias obtenidas de vacas lecheras europeas
puede ser utilizada para la identificación de bacterias uterinas de vacas lecheras de
nuestro país.
57
Para la realización del presente trabajo se utilizaron vacas Holando
Argentino (n= 64) de tambos comerciales de las localidades de Brandsen (35°17’S,
58°23’W) y Castelli (36°10’S, 57°78’W), provincia de Buenos Aires, Argentina.
La evaluación clínica se realizó en vacas entre 5 y 60 dpp que no habían
sido tratadas con antibióticos durante los 14 días previos al estudio. La revisación
de las vacas comenzó con la evaluación de la descarga vaginal (DV) a través de la
técnica denominada flujeo manual. Dicha técnica consiste en limpiar la zona
perineal e introducir suavemente una mano en forma de cuña cubierta por un guante
de tacto nuevo y lubricado. El flujo vaginal se obtuvo desde la porción craneal de
la misma y se lo clasificó en 4 grados: DV0 corresponde a un flujo normal, DV1
corresponde a un flujo con flóculos de pus (<50% de pus), DV2 corresponde a un
flujo purulento sin olor (≥50% de pus) y DV3 corresponde a un flujo purulento y
con olor fétido. Debido a que las muestras fueron tomadas de vacas con un amplio
rango de dpp, el grado de DV fue tomado como una clasificación descriptiva y no
como indicativo de MET o EC como lo describe (Williams y col., 2005)
Muestras bacteriológicas
Las muestras bacteriológicas fueron tomadas a cada una de las vacas
incluidas en el experimento independientemente del grado de DV (0-3). Para la
obtención de las muestras se utilizó la técnica cytobrush (CB) con el agregado de

58
una camisa sanitaria (SBS Cryo®Tec, Buenos Aires, Argentina) para evitar
contaminación proveniente de la vagina (Westermann y col., 2010). Para realizar la
técnica CB se utilizó una pistoleta de acero inoxidable (similar a las que se utilizan
para inseminación) que constaba de dos partes, una pieza tubular externa y un
vástago interno que poseía en su extremo anterior 1 cm de rosca al cual se le adosó
un cepillito estéril utilizado en ginecología humana (Medibrush XL ®, Medical
Engineering Co, SA, Argentina). Posteriormente se colocó una vaina de
inseminación (IVM Technologies, París, Francia) para cubrir la pistoleta y el
cepillito. Por encima de ésta se colocó una camisa sanitaria. Una vez lista la
pistoleta se procedió al enhebrado de modo similar a la técnica utilizada en IA. En
el cérvix, se tiró hacia atrás la camisa sanitaria para rasgarla. Pasado el cérvix se
expuso el cepillito al endometrio y en contacto con el mismo se lo hizo rotar unas
4 veces. Antes de retirar la pistoleta, el cepillito se retrajo para que quede protegido
nuevamente por la vaina plástica de inseminación. Una vez obtenida la muestra, se
introdujo el cepillito en un medio de transporte Stuart (Eurotubo, DeltaLab,
Barcelona, España) el cual se colocó en una caja de poliestireno expandido con
refrigerantes hasta su llegada al Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de
Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata.
En el laboratorio, cada cepillo fue cultivado en un medio agar sangre base,
con el agregado de 5% de sangre ovina desfibrinada (Laboratorios Britania, Buenos
Aires, Argentina). Las bacterias se identificaron por las siguientes características:
morfología de colonia, coloración Gram, tipo de hemólisis y pruebas bioquímicas
convencionales (Winn WC, 2006). Las colonias bacterianas obtenidas (n= 27)
fueron frezadas a -80 ºC hasta su envío al Instituto de Microbiología de la

59
Universidad de Medicina Veterinaria de Viena, Austria, donde fueron identificadas
por TF-IR.
TF-IR
En el Instituto de Microbiología, las muestras (n= 27) fueron re-cultivadas
en placas de agar sangre a 37 °C por 48 a 72 h para hacerlas crecer nuevamente. El
protocolo utilizado para la identificación de las bacterias por el método TF-IR fue
realizada según describieron Wagener y col. (2015) y será descripto brevemente a
continuación. Una submuestra de cada colonia se cultivó a 37 °C por 48 h en agar
sangre. De las colonias obtenidas se tomó otra submuestra y se cultivó en agar
tripticasa soya (Oxoid, TSA, Hampshire, Inglaterra) a 30ºC por 24 h. De las
colonias obtenidas en este medio se tomó una ansada (1mm de diámetro) de
material celular que fue suspendido en 100 µl de agua estéril desionizada y
homogeneizada. Una alícuota de 30 µl de esa suspensión fue colocada en una placa
de ZnSe y secadas en horno a 40 ºC por 40 min. Las mediciones por TF-IR se
realizaron cubriendo un rango espectral de 4000 a 500 cm-1 (Bruker Optics). El
análisis de los distintos espectros obtenidos fue analizado utilizando OPUS
software (versión 5.5; Bruker Optics GmbH).
La base de datos utilizada para la identificación de bacterias uterinas está
formada por más de 700 especies bacterianas (Wenning y col., 2008), incluyendo
más de 200 especies bacterianas aisladas de vacas lecheras con infección uterina de
tambos de Europa (Prunner y col., 2014b; Wagener y col., 2014; Wagener y col.,
2015).
60
El grado de acuerdo entre la marcha bacteriológica convencional y TF-IR
fue evaluada mediante el coeficiente Kappa, y la probabilidad de aislamiento
bacteriano según el grado de DV fue evaluado por regresión logística (Lauritsen,
2000-2008).
RESULTADOS
De las 64 muestras bacteriológicas, 9 (14%, 9/64) fueron excluidas del
análisis por contaminación. Por lo tanto, se analizaron los resultados de 55 muestras
bacteriológicas correspondientes a 55 vacas. Un 33% de vacas tuvieron DV0
(18/55), un 22% DV1 (12/55), un 10% DV2 (10/55), y un 27% tuvieron DV3
(15/55). Se aisló E. coli (n= 14), T. pyogenes (n= 12) y Staphylococcus coagulasa
negativo (SCN) (n= 1) en 27 vacas de 64 vacas muestreadas. En todos los casos las
bacterias crecieron en monocultivo.
Las muestras positivas a E. coli, T. pyogenes y SCN (n= 27) fueron enviadas
al Instituto de Microbiología, Viena, Austria, donde fueron nuevamente cultivadas
obteniendo un crecimiento bacteriano en 25 de 27 muestras enviadas. Las dos
muestras en las que no se obtuvo crecimiento bacteriano correspondían a T.
pyogenes. Por lo tanto, 25 muestras fueron evaluadas por TF-IR: 14 de E. coli, 10
de T. pyogenes y una muestra de SCN (Tabla 4.1).

61
Tabla 4.1. Efecto del grado de descarga vaginal en el riesgo de aislar Escherichia
coli y Trueperella pyogenes en vacas lecheras (n= 55)
Aislamiento bacterianoa
% (n) RP (95% IC) P
Descarga vaginal 0.06
(DV)
DV0 39 (7/8) Referencia
DV1 25 (3/12) 0.64 (0.21-2.01)
DV2 60 (6/10) 1.54 (80.71-3.33)
DV3 73 (11/15) 1.88 (0.98-3.63)
a
Determinado por marcha bacteriológica convencional.
b
RP (95% IC): Razón de probabilidad y 95% del intervalo de confianza.
FT-IR identificó 12 de las 14 muestras correspondientes a E. coli. Las otras
dos muestras fueron identificadas como Enterococcus faecium y Citrobacter
freundii. En el caso de T. pyogenes, FT-IR identificó ocho de las 10 muestras y las
dos restantes fueron identificadas como Streptococcus dysgalactiae. Por último,
FT-IR identificó la única muestra de SCN correctamente. El grado de acuerdo entre
la marcha bacteriologica convencional y FT-IR tuvo un coeficiente Kappa de 0.73
(95%CI = 0.52 – 0.95, P <0.001).
Basándonos en los resultados de la marcha bacteriológica convencional, la
probabilidad de aislar E. coli y T. pyogenes tendió a incrementerse junto con el
grado de DV (P= 0.06), siendo el porcentaje de aislamiento de 39% (7/18) en vacas
con DV0, 25% (3/12) en vacas con DV1, 60% (6/10) en vacas con DV2, y 73%
(11/15) en vacas con DV3 (Figura 1). La probabilidad de aislar E. coli o T. pyogenes
fue 1.88 veces más alta en vacas con DV3 que en vacas con DV0 (Tabla 1).
DISCUSIÓN
Si bien la mayoría de los autores concuerda en que TF-IR es una herramienta
que combina alta especificidad, bajo costo y fácil procesamiento, la mayoría de los
62
estudios que se han realizado comparan dicha técnica con técnicas moleculares
complejas y costosas (Kuhm y col., 2009; Samelis y col., 2011). Nuestro trabajo
compara TF-IR con la técnica de identificación bacteriana convencional,
ampliamente utilizada por los laboratorios, intentando proponer una alternativa más
eficiente que brinde resultados en un menor tiempo y a bajo costo. Nuestro trabajo
determinó que TF-IR tiene un grado de acuerdo bueno con la marcha bacteriológica
convencional para la identificación de E. coli y T. pyogenes. Este resultado
concuerda con un estudio reciente que demuestra que TF-IR mejora y facilita la
identificación de bacterias involucradas en casos de mastitis comparándolo con
métodos convencionales de diagnóstico (Schabauer y col., 2014). El tiempo que
lleva obtener el resultado bacteriológico es < a 3.5 días, lo cual es menor al tiempo
que lleva obtener un resultado por la marcha bacteriológica convencional, ya que
normalmente las placas se incuban una semana (especialmente cuando no hay
crecimiento previo de bacterias o cuando éstas son de crecimiento lento) y es más
laborioso (Fernández Olmos y col., 2010). No obstante, hubo 4 casos en los que la
identificación bacteriana por marcha bacteriológica convencional difirió de la
identificación por FT-IR. La razón de dicha diferencia no es fácil de determinar. En
líneas generales se pude decir que, para lograr un resultado preciso mediante FT-IR
es necesario tener una base de datos completa (Santos y col., 2010a) y tanto
mediante FT-IR como por marcha bacteriológica convencional las habilidades del
operador son de suma importancia (Bou y col., 2011). Si bien se ha utilizado la TF-
IR para la identificación de bacterias uterinas (Prunner y col., 2014b; Wagener y
col., 2015), a nuestro conocimiento, este es el primer estudio que compara la TF-IR
con la marcha bacteriológica convencional utilizando muestras uterinas de vacas

63
con distinto tipo de DV. No obstante, se requiere otro estudio con un mayor número
de muestras para confirmar dichos resultados.
Se ha demostrado que TF-IR tiene un gran poder de resolución lo que le
permite poder diferenciar microorganismos a distintos niveles taxonómicos
(Kirschner y col., 2001; Wenning y Scherer, 2013). De hecho, TF-IR es capaz de
identificar cambios en la composición bioquímica de bacterias cultivadas en
distintos medios (Wenning y col., 2008) o de bacterias que hayan mutado o hayan
variado su composición bioquímica para adaptarse a un nuevo hospedador
(Kummerle y col., 1998; Beekes y col., 2007; Grunert y col., 2013; Grunert y col.,
2014). El punto clave para que esta técnica sea exitosa es la cantidad de espectros
de referencia que contenga la base de datos (Kummerle y col., 1998; Wenning y
Scherer, 2013). Cuantos más espectros de referencia tenga la base de datos, mayor
es el poder de resolución de la técnica. La base de datos que utilizamos para nuestro
trabajo fue construida con espectros de bacterias uterinas de vacas lecheras
europeas. A pesar de que las bacterias a identificar provenían de un origen y sistema
de producción distinto, pudimos identificar las bacterias uterinas de vacas de
nuestro país. Una de las limitaciones del presente trabajo es que no se involucraron
bacterias anaerobias relacionadas con infecciones uterinas, lo cual hubiese sido de
gran interés. La razón principal por lo que no se hizo fue las dificultades para tomar
muestras con las condiciones necesarias para cultivo de anaerobios en los tambos
donde fueron tomadas las muestras. Por otro lado, en futuros trabajos, sería
interesante estudiar los cambios en el espectro de las bacterias cuando éstas se
vuelven resistentes a un antibiótico. Esto permitiría no solo identificar bacterias de
un modo más eficiente sino también identificar cepas resistentes.

64
En el presente estudio, la probabilidad de aislamiento bacteriano de una
muestra (E. coli y T. pyogenes) tendió a incrementarse junto con el grado de DV.
Esto concuerda con lo reportado por Williams y col. (2005) quien encontró una
correlación entre el aislamiento de bacterias reconocidas como patógenas (E. coli,
A. pyogenes, F. necrophorum y Prevotella melaninogenicus) y el grado de DV. Por
otro lado, (Williams y col., 2005; Westermann y col., 2010) encontraron una
correlación significativa entre T. pyogenes y grado de DV (P < 0.001), pero no entre
E. coli y el grado de DV (P= 0.21). Sorpresivamente, se observó una alta tasa de
aislamiento bacteriano en vacas con DV0. No obstante, la tasa de aislamiento
bacteriano en vacas con DV0 y DV1 fue menor que en vacas con DV2 y DV3. Este
resultado concuerda con lo reportado por Wagener y col. (2015) quien aisló E. coli
y T. pyogenes en vacas con todos los tipos de DV (0-3), siendo menor en vacas con
DV0 y DV1 que en vacas con DV2 y DV3. Si bien la evaluación de la DV podría
ayudar a determinar protocolos de tratamiento (por ejemplo, tratar con antibióticos
solo vacas con DV2 y DV3) para reducir el uso empírico de antibióticos, en muchas
vacas con DV2 y DV3 no se aíslan bacterias e incluso está demostrado que en
muchas vacas se desarrolla un proceso de autocura sin necesidad de tratamiento.
Por lo tanto, es necesario contar con nuevas herramientas que ayuden a los
veterinarios a tomar decisiones en cuanto a los tratamientos. El FT-IR podría ser
una herramienta que colabore con esto.

65
CONCLUSIONES
En conclusión, mediante la técnica de FT-IR es posible identificar E. coli y
T. pyogenes de muestras uterinas de vacas lecheras de Argentina utilizando la base
de datos realizada a partir de muestras de vacas lecheras de Austria y Alemania. No
obstante, se requieren más estudios para poder determinar si FT-IR puede ser
utilizado como una alternativa a la marcha bacteriológica convencional.

66
CONCLUSIONES GENERALES
La gran variedad de factores que participan en el desencadenamiento del
SVR, hacen que sea complejo su estudio. En la presente tesis se estudió el
diagnóstico y tratamiento de VR con y sin ES; la expresión génica endometrial de
transcriptos involucrados en el establecimiento y mantenimiento de la gestación en
VR y CF; y la identificación de bacterias uterinas patógenas a través de un método
más simple, relativamente más rápido y de bajo costo en comparación con la marcha
bacteriológica convencional. Los resultados de dichos estudios nos llevaron a las
siguientes conclusiones.
En el Capítulo II, determinamos que la ES no es la causa principal de las
VR ya que la prevalencia es del 24% y además no está relacionada con el riesgo de
preñez en VR. Contrariamente, la detección de ≥ 2 mm de luz uterina está
relacionada con un menor riesgo de preñez en VR. Por otro lado, la presencia de
líquido en la luz uterina, determinada a través de US, no se relaciona con la
presencia de PMN en el endometrio, determinada a través de citología endometrial.
El tratamiento con dosis más altas de BE en VR sin ES y el tratamiento con
cefapirina benzatínica en VR con ES, no tuvieron efecto beneficioso en los
porcentajes de preñez.
En el Capítulo III, determinamos que hubo diferencia en la expresión génica
endometrial de EGFR, FNod, y PTGS2 entre VR y CF; pero no hubo diferencias
en la expresión génica endometrial de ER y PR. Teniendo en cuenta la complejidad
de los mecanismos moleculares que intervienen en establecimiento de la gestación
y de la cantidad de moléculas que participan, este trabajo aporta valiosa información
que servirá de base para futuras investigaciones.

67
En el Capítulo IV, mediante la técnica de FT-IR es posible identificar E. coli
y T. pyogenes de muestras uterinas de vacas lecheras de Argentina utilizando la
base de datos realizada a partir de muestras de vacas lecheras de Austria y
Alemania. No obstante, se requieren más estudios para poder determinar si FT-IR
puede ser utilizado como una alternativa a la marcha bacteriológica convencional.

68
BIOGRAFÍA PERSONAL
La Medica Veterinaria Maria Jaureguiberry, nació en la ciudad de
Chascomús, provincia de Buenos Aires, el 10 de enero de 1986, y ha residido en la
ciudad de Castelli desde esa fecha junto a sus padres, Catalina M. Ortiz y Alejandro
M. Jaureguiberry, y sus hermanas Dolores, Milagro y Juana. Realizó sus estudios
primarios en la escuela Nº1 Domingo Faustino Sarmiento (1992-1998) y sus
estudios secundarios en la escuela Media Nº1 de Castelli (1999-2003).
Paralelamente estudió inglés en un instituto de la localidad de Castelli durante 7
años aprobando el examen de 6º año de adultos en la Cultural Inglesa de Buenos
Aires (diciembre de 2003). Realizó sus estudios universitarios en la Facultad de
Ciencias Veterinarias (FCV) de la Universidad Nacional de La Plata (UNLP)
durante el período 2004-2010. En el año 2009 obtuvo una beca de investigación
para estudiantes de la Secretaría de Ciencia y Técnica de la UNLP para trabajar en
“Endometritis clínica y subclínica en vacas de tambo: Diagnostico, prevalencia e
impacto sobre la eficiencia reproductiva”, bajo la dirección del Dr. Rodolfo Luzbel
de la Sota y la codirección de la Dra. Laura Vanina Madoz.
Una vez finalizados los estudios, en 2010, retornó a la ciudad de Castelli
donde trabajó en la veterinaria “San Narciso” en el área de pequeños animales
realizando un reemplazo por tres meses de la veterinaria encargada. Luego trabajó
durante dos meses en el tambo “La Polvorilla” en el sector de Guachera como
encargada de la misma.
En abril de 2011, la UNLP le otorgó una beca doctoral de Tipo A para
comenzar a trabajar en su proyecto de tesis doctoral. Como consecuencia de un

69
programa de Cooperación Científico-Tecnológica entre el Ministerio de Ciencia,
Tecnología e Innovación Productiva de la República Argentina (MINCyT) y el
Ministerio de Ciencia e Investigación de la República de Austria (BMWF) realizó
dos viajes de 45 días a la ciudad de Viena, Austria; como becaria del proyecto
“Diagnóstico y Tratamiento de Vacas Repetidoras con Endometritis Subclínica en
Tambos de Austria y Argentina” donde tuvo la oportunidad de trabajar en el cuarto
experimento de esta tesis bajo la dirección de los Drs. Marc Drillich y Monika
Ehling-Schulz. En abril de 2014 le fue otorgada una beca doctoral de tipo B de la
UNLP, pero renunció a la misma para aceptar una beca de CONICET para finalizar
su tesis doctoral. Como estudiante de postgrado participó en distintos proyectos y
realizó varios cursos relacionados con la temática de su tesis. Parte de los resultados
obtenidos de su tesis doctoral ya fueron publicados en congresos y revistas de
alcance nacional e internacional.
Desde el año 2011 ha desarrollado tareas de docencia universitaria como
Ayudante Diplomada dedicación simple de la Cátedra y el Servicio de
Reproducción Animal, y ha desarrollado las tareas de investigación
correspondientes a esta tesis doctoral en el marco de los Proyectos de Incentivos
docentes de la Catedra. El 31 de octubre de 2015 se casó con Juan Martin
Aristizabal y el 29 de diciembre de 2016 nació su hija Rosario.
Una vez finalizada esta tesis, durante su posdoctorado continuara con su
labor de investigación en el área de Neonatología bovina estudiando los factores de
riesgo relacionados con el crecimiento, morbilidad y mortalidad en terneras de
tambo en la Catedra y Servicio de Reproduccion Animal y en el CEDIVE de
Chascomús.
70
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87
APÉNDICE I
Protocolo de extracción de ARN a partir de células endometriales
conservadas en RNAlater
1. Desfreezar los tubos eppendorf correspondientes a cada muestra y colocar
500 μl de PBS helado libre de RNasas (Invitrogen Corp.) en cada uno.
2. Centrifugar durante 5 min a 8000 rpm para formar un pellet de células y
eliminar el sobrenadante.
3. Una vez formado el pellet, agregar a cada eppendorf 500 μl de Trizol
(TriReagent, Molecular Research Center Inc.) y resuspender con pipeta.
4. Incubar a Tº ambiente por 5 min.
5. Añadir 100 μl de cloroformo frío, tapar cada eppendorf y agitar
vigorosamente durante 20 seg e incubar a Tº ambiente por 3 min.
6. Centrifugar durante 15 min a 12000 rpm a 4ºC. Esto hará que cada muestra
quede separada en tres fases (fase superior: contiene ARN, fase intermedia:
contiene ADN y proteínas, fase inferior: contiene principalmente proteínas).
7. Transferir la fase superior a un eppendorf de 1,5 ml libre de RNasas.
8. Agregar 500 μl de isopropanol y 2 μl de glicógeno 5 mg/ml.
9. Mezclar con vortex 10 seg, e incubar a Tº ambiente por 10 min.
10. Incubar toda la noche a -20ºC.
11. Centrifugar 15 min a 12000 rpm a 4ºC para precipitar el ARN.
12. Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet con 1 ml de etanol 75% frío,
mezclar con vortex.
13. Centrifugar 5 min a 7500 rpm a 4ºC. Descartar el sobrenadante.

88
14. Dejar secar por 5 min.
15. Resuspender el ARN en 50 μl de agua libre de RNasas, mezclar
vigorosamente e incubar a 55ºC por 5 min.
16. Almacenar a 4ºC para uso inmediato o a -80ºC para almacenamiento a largo
plazo.
89
Protocolo para la digestión con DNasa
1. A 1,5 µg de ARN extraído, agregar 1 μl de DNasa buffer 10X y 0,5 μl de
inhibidor de ribonucleasas (RNaseOUT, Invitrogen Corp.).
2. Agregar 1 μl de DNasa libre de RNasas (DNase I Amplification Grade,
Invitrogen Corp.). Volumen final: 10 μl.
3. Incubar a Tº ambiente por 15 min.
4. Agregar 1 μl de EDTA 25 mM
5. Incubar a 65ºC durante 10 min para inactivar la DNasa.

90
Protocolo de retrotranscripción
1. Utilizar 1 µg de ARN digerido con DNasa.
2. Agregar 1,5 μl de cebadores random hexamers (160 ng/ μl).
3. Incubación a 65ºC por 10 min.
4. Dejar la mezcla a T° ambiente por 5 min.
5. Agregar 4 μl de First strand Buffer 5X, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl de dNTPs 10
mM y 1 μl de inhibidor de RNasa (RNaseOUT, Invitrogen Corp.).
6. Calentar a 37ºC por 2 min.
7. Agregar 1 μl de retrotranscriptasa (MMLV, Invitrogen). Volumen final de
reacción: 20 μl.
8. Incubar a 25ºC por 10 min.
11. Almacenar a 4°C para uso inmediato o a -20°C para almacenamiento
prolongado.
91
Protocolo de PCR en tiempo real
1. Agregar a un tubo de PCR 10 μl de premezcla de PCR en tiempo real con
intercalante Evagreen (Mezcla Real, Biodynamics SRL), 1 μl de primer
Forward y 1 μl de primer reverse, 1 μl de templado y 7 μl de agua. Volumen
final: 20 μl. Esto se realiza para cada muestra, por gen, por duplicado. Para
evitar errores de pipeteo se realiza una premezcla con todos los
componentes excepto el ADNc y se reparte en los tubos de PCR.
2. Llevar al termociclador utilizando el protocolo correspondiente (Tabla 1 y
2).
Tabla 1. Tiempo, temperatura y número de ciclos correspondientes al protocolo

utilizado en la presente tesis doctoral.
Tiempo Temperatura (ºC) Nº Ciclos
3 min 95
20 seg 95
20 seg Ver tabla 2 40
30 seg 72
Tabla 2. Temperatura de annealing correspondiente a cada par de primers.

Tº de annealing
Primer
(°C)
PR 50
ER 54
EGFR 57
FNod 56
PTGS2 50
GAPDH 60

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

Trabajo de Tesis para optar por el título de Doctor en Ciencias Veterinarias

DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE VACAS REPETIDORAS

Autor: MV, María Jaureguiberry

Director: MV, MSc, PhD, DECAR, Rodolfo Luzbel de la Sota

Codirector: MV, PhD, Marcelo Pecoraro

Lugar de Trabajo: Laboratorio de Reproducción Animal,

Miembros del Jurado:

La Plata, 3 de julio de 2017

A mi esposo Juan Martín y a mi hija Rosario,

A mis padres Catalina y Alejandro.

En primer lugar, quiero agradecer a mi director de tesis, el Dr. R. Luzbel de

la Sota, por brindarme con generosidad sus conocimientos y experiencias en el área

científica, por confiar en mí y darme la posibilidad de conocer otros grupos de

trabajo y sobre todo por su gran corazón.

Agradezco también a mi codirector, el Dr. Marcelo Pecoraro, y

especialmente al Dr. Marco Tizziano, por haberme guiado en el estudio de

A la Dra. Vanina Madoz y al Dr. Mauricio Giuliodori, quienes a través de

sus conocimientos y experiencias me han ayudado, aconsejado y apoyado en la

realización de este trabajo.

Además, le agradezco por haberme transmitido sus conocimientos sobre esta

hermosa profesión y sobre los valores importantes de la vida.

A las Dras. Silvina Quintana, Maia Marín y Mercedes Burucua por

brindarme su valiosa ayuda en el procesamiento de las muestras correspondientes

al estudio de expresión génica. Realmente fue un placer trabajar con ellas.

A los colegas veterinarios Tomás Díaz Pernía, Edgardo Alvarez, Roberto

Chiavonne, Ignacio, Conrado, Juan Francisco y Norberto Céspedes, Santiago

Uranga, Sebastián Rollie, Javier Roldán, Germán Domínguez y Horacion

A los productores y personal de trabajo, por haberme permitido, con total

generosidad, utilizar sus animales para los trabajos experimentales y colaborar

durante los muestreos.

A todos los integrantes de la Cátedra de Reproducción Animal,

especialmente a Lore, Walter, Joaquín, Facundo y Ramiro por brindarme su ayuda

A los Drs. Marc Drillich y Monika Ehling-Schulz por haberme dirigido en

el experimento correspondiente al capítulo IV, y a todo su equipo de trabajo por su

colaboración en la realización del mismo.

A la Universidad Nacional de La Plata, por haberme permitido realizar mis

Al CONICET, por haberme becado para finalizar mis estudios de posgrado.

A los jurados por sus sugerencias y correcciones que permitieron enriquecer

A mi familia, mis padres, hermanas, tías, cuñados y sobrinos; por el cariño

y apoyo incondicional de siempre.

A Juan Martín, mi esposo, por ayudarme con los muestreos cuando yo no

LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................... IX

LISTA DE TABLAS .............................................................................................X

LISTA DE FIGURAS ......................................................................................... XI

PUBLICACIONES REALIZADAS DE LA TESIS ....................................... XII

TITULO: DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE VACAS

RESUMEN ........................................................................................................ XIV

SUMMARY ...................................................................................................... XVI

INTRODUCCIÓN GENERAL ............................................................................ 1

1. Factores externos ........................................................................................... 3

2. Factores internos ............................................................................................ 7

ÚLTIMOS AVANCES EN VACAS REPETIDORAS .................................... 15

OBJETIVO GENERAL ..................................................................................... 16

OBJETIVOS PARTICULARES ....................................................................... 16

HIPÓTESIS RELEVANTES ............................................................................. 17

DIAGNÓSTICO, PREVALENCIA Y TRATAMIENTO DE VACAS

CAPÍTULO III .................................................................................................... 34