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Apuntes del

CURSO DE EVALUACION Y CONGELACION


DE SEMEN BOVINO

Dr. Decuadro-Hansen
Director Técnico de IMV
Cassou Francia

Colaboradores:

Dr. Rumelio Spiazzi Dr. Andrés García Riva


Director Técnico de CLIA SENASA ....

1 y 2 de mayo de 1997

Centro de Inseminación Artificial


CLIA S.A.
Urdinarrain, Entre Rios
Argentina
Criterios de calidad en un Centro de Inseminación Artificial
El semen bovino destinado a la inseminación artificial debe
responder a los siguientes criterios de calidad:

1º) Calidad sanitaria:


Debe estar libre de todo agente patógeno transmisible por semen.

2º) Calidad biológica:


2.a. Un mínimo de 8 millones de espermatozoides con motilidad
progresiva rectilínea (MPR) por pajuela después de la congelación y
> 25 % de espermatozoides con MPR.
2.b. Entre 6 y 8 millones de espermatozoides con MPR si el semen
posee >30% de espermatozoides con MPR y una tasa de anormalidades
<25%.
2.c. Entre 6 y 8 millones de espermatozoides con MPR si el semen
posee >30% de espermatozoides con MPR y datos de fertilidad (si sobre
300 primoinseminaciones el porcentaje de no retorno 60/90 es equivalente
al obtenido con más de 8 millones de espermatozoides con MPR).

La concentración óptima de espermatozoides por dosis es toro


dependiente. En el 20% de los toros no existe correlación significativa entre
la concentración por dosis y la tasa de no retorno.

El número de espermatozoides con MPR de una pajuela se obtiene


multiplicando el porcentaje de espermatozoides con MPR por el número de
espermatozoides totales en la pajuela.

3º) Calidad bacteriológica:


Es testigo indirecto de la calidad higiénica del CIA. El objetivo es
lograr que el 95% de las pajuelas contengan menos de 500 UFC totales.

4º) Identificación correcta:


La pajuela debe estar correctamente identificada. En primer lugar la
identificación debe corresponder al semen contenido en la pajuela, en
segundo lugar la identificación puede presentar exigencias reglamentarias
(ej. en la CEE se identifica es status sanitario del toro para IBR).

ISO 9002 da las normas de calidad para un CIA. El primer CIA en


adoptarlas fue el de Quebec.

2
Criterios de evaluación de un eyaculado

Un eyaculado puede ser congelado si responde a:

Criterios Frecuencia de control Límite de utilización

Aspecto c/eyaculado Ausencia de


alteraciones

Concentración c/eyaculado ≥0.3 x 109/ml(1)

Motilidad masal c/eyaculado ≥3

Motilidad individual c/eyaculado ≥70%

% espermatozoides Sobre los 2dos ≤25%


anormales eyaculados de las 3
primeras colectas
cuando comienza a
producir semen, luego
sobre el 2do eyaculado
1 vez por mes

% espermatozoides con ≤15%


anormalidades mayores

(1) no acepta menos porque se produciría un shock osmótico por el glicerol.

3
Evaluación de semen

Volumen

Se estima en base al peso, ya que es más exacto que por lectura


directa. Se utiliza la fórmula siguiente:

Volumen= Peso seminal/densidad promedio del semen (1.05)

Dos factores falsean la exactitud de la medida directa del volumen:


1) la espuma y 2) la imprecisión de las graduaciones.
Se utilizan tubos de recolección descartables y se pesa con balanza
de precisión.

Motilidad masal

Se evalúa en la periferia de una gota gruesa de 5 µl, sobre


portaobjetos sin cubre en platina térmica a 37-38ºC. Se califica de 0 a 5.

Motilidad individual

Diluir 7 µl de semen en 700 µl de diluyente precalentado a 32ºC. De


la dilución tomar una gota de 10-12 µl y colocarla entre porta y
cubreobjetos precalentados. Se califica el porcentaje de espermatozoides
con MPR y el vigor.

Concentración

Pueden realizarse 4 tipos de determinaciones:

a) subjetiva por observación macroscópica del aspecto del


eyaculado o al evaluar la motilidad masal.
b) por hemocitometría.
c) por fotometría.
d) por coulter counter.

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Uso del fotómetro
• Encender el fotómetro 30 minutos antes de realizar la lectura.
• Calibrar con 4 ml de SF(1) (blanco). SF: Cl Na 9 ‰ o 7 ‰.
• Pajuela mediana: vol. útil 0.49 ml, vol. total tomado 0.52 ml
• Pajuela fina: vol. útil 0.21 ml, vol. total tomado 0.23 ml.
• Diluir 20 µl de semen en 4 ml de SF (tasa de dilución 1/200).
La muestra de semen se saca de la mitad del tubo.
• Homogeneizar y colocar en la cubeta del fotómetro.
• Esperar 3 segundos la estabilización de las turbulencias formadas luego de
homogeneizar la cubeta (mezcla suero fisiológico-semen), ya que las mismas
pueden modificar la lectura. En el modelo de fotómetro IMV Aiglon estos 3
segundos están incluídos en el programa informático, por lo tanto es suficiente
apretar la tecla "measure" para que el fotómetro comience a realizar la lectura a
los 3 segundos.
• Establecer el número de espermatozoides por pajuela(2).
• Realizar la lectura de los ml de diluyentes necesarios y el número de dosis
finales.
(1) Puede utilizarse citrato de sodio al 2.92%. No utilizar suero formolado porque
modifica la concentración.
(2) El número de espermatozoides por pajuela debe asignarse en función de la calidad
original del semen, la edad del toro y de su ritmo de colecta. Con toros muy fértiles
pueden utilizarse concentraciones extremadamente bajas de 5-8 millones de
espermatozoides totales/pajuela, siempre que el toro tenga un ritmo de colecta continuo
(ej. 2 eyaculados 2 veces por semana).
En Francia utilizan:
15 millones de espermatozoides totales en toros de elite
20 millones de espermatozoides totales en toros estandar
23 millones de espermatozoides totales en toros de testaje (fertilidad desconocida).
Cambiar el filtro del fotómetro cada 3 años y la lámpara cada 1.5 años. La
precisión del fotómetro es del 95%.

Test de Schalm
0.5 ml de semen + 2.5 ml de reactivo (el mismo que CMT). Mezclar por
rotación de la paleta CMT durante 30 segundos.
Es conveniente realizar este test cada 15 días de rutina o si se
constatan problemas de calidad (ej. disminución de la concentración o de la
motilidad sin causas aparentes, eyaculados "grises" o más de 30% de
anormalidades).
Si el resultado es Schalm+ realizar examen clínico. Frente a sospecha
de seminovesiculitis subclínica, recolectar líquido de vesículas seminales
con sonda uretral humana nro. 8 y realizar test de Schalm y control
microbiológico al líquido vesicular.
También se puede enviar semen para realizar control microbiológico
y antibiograma. Se administra como tratamiento preventivo.
florfenicol hasta obtener el resultado del antibiograma y poder utilizar el
antibiótico recomendado.

5
Frotis

Se realiza en semen fresco y descongelado. Se realiza 1 vez por mes


a los 2dos eyaculados. Se evalúa: % de espermatozoides vivos y muertos y
anormalidades mayores y menores. La congelación no modifica en forma
significativa el % de anormalidades.
Diluir 20 µl de semen puro en 4 ml de SF precalentado (1/200).
Colocar una gota de 10 µl de semen diluido y una gota de 10 µl de
colorante (Eosina/Nigrosina o Eosina/Azul de anilina) sobre porta
precalentado. Mezclar durante 10 segundos y esperar 30 segundos sin tocar
la gota para que el colorante penetre en los espermatozoides. Realizar el
frotis. Secar a temperatura ambiente y examinar a 400 x o más. El azul de
anilina da un mejor contraste que la nigrosina.

Anormalidades mayores

• Gota citoplasmática proximal


• Cabezas anormales, ej. piriformes
• Colas fracturadas o enrolladas
• Deformación de la pieza intermedia
• Espermatozoides mal desarrollados, cabezas dobles o triples
• Cráteres
• Acrosoma en botón

Anormalidades menores

• Gota citoplasmática distal


• Colas sueltas
• Cola replegada
• Cabezas estrechas o gigantes
• Ruptura parcial del cuello.

Si la evaluación se realiza por contraste de interferencia diferencial (DIC) a


1250 x se puede permitir un mayor porcentaje de anormalidades totales (ej.
30%). Es el único que permite visualizar los cráteres. El frotis clásico (E/N
o E/AN) no permite diagnosticar este problema. Se encuentran 2 tipos de
cráteres: aislados y en diadema o collar de perlas. Se considera una de las

6
primeras manifestaciones clínicas frente a la degeneración testicular. La
dexametasona a altas dosis puede provocar este defecto.
Que el eyaculado tenga anormalidades no indica necesariamente que
no se pueda congelar, en algunos casos se puede compensar aumentando
las dosis inseminante.

Preparación de Eosina/Nigrosina

1 g eosina + 2 g nigrosina + 3.57 g trisodiocitrato + agua bidest. tibia


csp 100ml.
Homogeneizar bien y filtrar con gasa de 4 espesores. Esta solución
se puede guardar a 4ºC chequeando mensualmente el pH. Se le puede
disminuir el pH agregando una solución de ácido cítrico concentrada hasta
pH 6.7

Preparación de Eosina//Azul de Anilina

1g eosina + 8 g azul de anilina + 2 g trisodiocitrato + agua bidest. tibia csp


100 ml.

Los colorantes puros pueden adquirirse en IMV.

En el frotis se evalúa:

a) Integridad de la membrana
Frotis de Eosina/Nigrosina
Frotis de Eosina/Azul de Anilina
Colorantes fluorescentes: SyBR14+PI (SyBR14
marca espermatozoides vivos de verde y PI
marca espermatozoides muertos de rojo)
Colorante fluorescente Hoechst 3358

El test de resistencia osmótica (realizado entre porta y cubre, no en


frotis) evalúa también la integridad de la membrana.

b)Acrosoma
Frotis en inmersión a 1250 x en contraste de
fase para ver anormalidades de acrosoma (una
de las más comunes es el acrosoma en botón)
Colorantes fluorescentes

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Para evaluación en "fase líquida" de anormalidades por DIC se utiliza la
fijación de Hancock:
a) Semen fresco:
Se diluye 50 µl de semen puro (2 gotas) en 2 ml de suero fisiológico
formolado al 4% tibio y se homogeneiza.

b) Semen congelado:
b.1. en diluyente tris/yema de huevo
1 pajuela fina en 2 ml de suero fisiológico formolado al 4%
1 pajuela mediana en 4 ml de suero fisiológico formolado al 4%.
Centrifugar a 300 g durante 10 minutos (no más de 1.000 R.P.M.)
Sacar el sobrenadante y agregar 2 o 4 ml de suero fisiológico
formolado.

b.2. en diluyente Biociphos plus™


1 pajuela fina en 2 ml de suero fisiológico formolado al 4%
1 pajuela mediana en 4 ml de suero fisiológico formolado al 4%.
Luego homogeneizar.
Cuando se utiliza leche se debe centrifugar 2 o 3 veces.
Se deja caer 2-3 ml de la dilución en un portaobjetos. Después se
pone vertical para que corra el líquido. Se deja secar vertical y luego se
sumerge en agua destilada durante 5 minutos. Se seca y se coloca un
cubreobjetos, poniendo previamente una gota de agua. Se observa a
1250 x en aceite de inmersión.

Envío de muestras de semen al laboratorio


a los efectos de diagnosticar anormalidades
Preparación de suero formolado para envío al laboratorio para frotis
(cuando se colecta a campo):
40 g Cl Na + 10 ml formol + agua bidest. csp 1000 ml.
Colocar 2 gotas de semen con pipeta pasteur (o 50 µl) + 2 ml de suero
formolado.

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BIOCIPHOS PLUS™

El BIOCIPHOS PLUS™ es un diluyente para semen bovino


desarrollado por la Compañía IMV. Sus principales ventajas son:
No contiene sustancias de origen animal
Extremadamente fácil de preparar
Gracias a su claridad facilita un mejor análisis de los
espermatozoides

Está disponible esterilizado en frascos de 100 ml e incluye: una


solución salina concentrada con glicerol (6.4%), sustituto de yema de
huevo y antibióticos gentamicina, tilosina, lincomicina y espectinomicina
(de acuerdo a la legislación europea).

Preparación del BIOCIPHOS PLUS™

• Homogeneizar el frasco B+ y colocarlo en baño maría a 32ºC durante 10-


15 minutos.
• Preparar 400 ml de agua bidestilada estéril apirógena y colocarla en baño
maría a 32ºC durante 10-15 minutos.

Evitar que el nivel de agua sea muy alto.


• Secar el frasco B+ y el recipiente con 400 ml de agua bidestilada.
• Dejar caer el B+ en un recipiente seco, estéril sin tocar los bordes.
• Agregar los 400 ml de agua bidestilada. Homogeneizar bien.
• Enjuagar el frasco B+ 2 o 3 veces con la solución reconstituida.
• Homogeneizar la mezcla por rotación y no sacudiendo, lo cual evita la
oxigenación del producto.

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El producto está listo para ser utilizado. Debe utilizarse dentro de las
6 hs de reconstituido para evitar la contaminación microbiana.
Si se quiere congelar la solución reconstituida: homogeneizar, hacer
alicuotas y congelar en freezer. No dejar pasar mucho tiempo antes de
congelarlo. No recongelar.

La decongelación del B+ debe ser realizada de la siguiente manera:


• Sacar el frasco B+ reconstituido del freezer
• Colocarlo en baño maría a 32ºC
• Una vez descongelado, secar el recipiente y homogeneizar el producto ya
que el glicerol tiende a sedimentar (densidad 1.257).

Protocolo de dilución con BIOCIPHOS PLUS™

Utilizar protocolo DILUCION UNICA A 32ºC


Semen en pajuelas a 4ºC

Puntos importantes

• Conservar el frasco B+ a 4ºC (el producto puede transportarse a


temperatura ambiente y al resguardo de la luz).
• Es recomendable trabajar con baños maría a 32ºC. En efecto, el principio
de la congelación de semen es bajar el metabolismo celular, hacerlo desde
la colecta sin realizar un shock térmico.
• Al llegar el semen se hace el tamponado con igual cantidad de diluyente.
Se homogeneiza. Se deja 10 minutos a 32ºC en baño maría.
• Calcular la dilución final directamente por fotometría o en base a la
siguiente fórmula:
V1 x C1 = V2 x C2
V1= volumen recolectado, C1= concentración del eyaculado, V2=valor a calcular del
semen diluido y C2= concentración final de la pajuela.

Ej. Volumen del eyaculado= 5 ml


Concentración= 1.700 x 106 esp/ml
Esp. totales/pajuela=30 x 106 esp/pajuela

V1 (ml) x C1 (esp/ml) = V2 (ml) x C2 (esp/ml)


5 x 1.700 x 106 = V2 x 60 x 106
V2= 5 ml x 1.700 x 106 esp/ml =141.6 ml = Volumen final diluido(VFD)
60 x 106 esp/ml

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VFD- eyaculado= Volumen de diluyente a agregar
141.6 ml - 5 ml = 136.6 ml
136.6 - 5 ml (diluyente tampón) = 131.6 ml

Total de pajuelas = Vol. de diluyente + Vol. eyaculado


Vol. pajuela

Total de pajuelas = 136.6 ml + 5 ml = 283


0.5 ml

• Dejar caer el eyaculado tamponado sobre el diluyente y no homogeneizar.


Es muy práctico utilizar mamaderas (vende IMV) por diferentes razones:
a) espesor de vidrio que permite un descenso correcto de la
temperatura,
b) calidad del vidrio que permite la esterilización por calor seco
(180ºC 1 h),
c) forma tubular.

• Dejar 10 minutos a temperatura de laboratorio (20ºC).


• Homogeneizar y realizar el llenado de pajuelas a temperatura ambiente.
El sistema integrado imprime las pajuelas llenas. Debe aislar las pajuelas
del frío de la vitrina. Las pajuelas se colocan verticalmente con el tapón
hacia abajo en un gobelet (no más de 300 pajuelas finas ni más de 150
pajuelas medianas/gobelet). Colocar el gobelet en una vitrina refrigerada y
ventilada a 4ºC. Debe pasar de 32ºC a 4ºC en no más de 1-1.50 h.
• También puede realizarse un enfriamiento horizontal sobre racks,
colocando 4 racks en una caja de cartón fina a 4ºC.
Acostumbrarse a agregar hielo en el agua del recipiente pero sólo a partir
del momento en que la temperatura llegó a 20ºC. Esto es importante si la
vitrina refrigerada no es ventilada.
• Hacer el equilibramiento (3-7 hs).

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LAICIPHOS 488

Preparación del diluyente

Seguir las instrucciones de preparación al pie de la letra.

• Abrir el sachet del Laiciphos y retirar el sobre con el desecante.


• Colocar el contenido en un recipiente y agregar 400 ml de agua
bidestilada estéril calentada a 40ºC en baño maría.

• Agitar enérgicamente por rotación, evitando la oxigenación del diluyente.


• Colocar 50 ml de yema de huevo fresco en 100 ml de agua bidestilada a
50ºC. Homogeneizar la mezcla. Utilizar jeringas para medir la yema de
huevo (no urilizar jeringas con émbolo de goma).

• Mezclar la yema de huevo/agua con el Laiciphos/agua.


• Con la solución obtenida, "enjuagar" varias veces el
frasco que se utilizó para preparar la mezcla de yema
de huevo/agua.

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• A partir de este momento fraccionar a los efectos de preparar los 2
diluyentes:
1. El diluyente "caliente" a 32-34ºC al cual se le agrega 3% de glicerol.
2. El diluyente "frío" a 4ºC al cual se le agrega 11% de glicerol.
• A los efectos de fluidificar el glicerol, calentarlo en baño maría
aproximadamente a 45-50ºC durante 10 a 15 minutos. Esto permitirá ser
más exacto en la medición de cantidades (3 y 11%), ya que al ser más
fluido se adhiere menos y se aspira mejor con las jeringas.
• Hacer caer el glicerol en el medio de la mezcla Laiciphos/yema/agua
evitando que toque las paredes del frasco ya que resulta difícil
"despegarlo".

Protocolo de dilución del LAICIPHOS

• Tamponar el eyaculado con igual volumen de Laiciphos a 32ºC y 3% de


glicerol. Dejar caer el diluyente sobre las paredes del tubo de colecta (ej. 5
ml de semen + 5 ml de diluyente).
• Colocar el tubo de eyaculado tamponado en baño maría a 32ºC durante 5
a 10 minutos.
• Practicar la dilución 1 a 32ºC y 3% de glicerol dejando caer el eyaculado
tamponado sobre el diluyente.
• La cantidad de diluyente 1 debe ser el 50% del volumen total de
diluyente. Si hay que emplear 40 ml de diluyente 3% de glicerol, considerar
que ya se utilizó 5 ml para tamponar, por lo tanto utilizar 35 ml.
• Tomar agua del baño maría a 32ºC y colocarla
en un recipiente plástico. Luego colocar la
mamadera en dicho recipiente. Colocar un
termómetro de alcohol en el agua.
• Llevar el conjunto a una vitrina refrigerada a 4ºC.
• Si la temperatura no desciende rápidamente es
recomendable colocar cubitos de hielo en el agua
pero a partir de que el termómetro indique 20ºC.
• Cuando llega a 4ºC practicar la dilución 2 con el Laiciphos 11% glicerol a
4ºC en 2 veces con 15 a 20 minutos de intervalo entre ellas. Ej. 20 ml,
esperar 20 minutos y agregar los últimos 20 ml.
• Equilibramiento a 4ºC durante 5 hs.
• Llenado de pajuelas. No olvidar enfriar las pajuelas y los racks a 4ºC
antes de cargar las pajuelas y los racks.
• Congelar.
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Puntos importantes

• El diluyente Laiciphos contiene leche descremada 100% de alta calidad


seleccionada por estudios de eficacia biológica así como 2 tampones
salinos, 2 sustratos energéticos, 1 estabilizador de la membrana espermática
y 4 antibióticos.
• Es recomendable conservar los sachets en heladera pero dentro de una
bolsa de plástico a los efectos de evitar la humedad. No obstante es posible
la conservación a temperatura ambiente sin alteración de la calidad
biológica del producto.
• Utilizar yemas de huevos frescos. Lavar previamente la cáscara y
desinfectar con alcohol 70º. Separar bien la yema de la clara, perforar la
membrana vitelina con una aguja estéril.
• Preparar el diluyente 1 hora antes de utilizarlo, homogeneizar antes de
practicar la dilución.
• Utilizar agua de alta calidad: bidestilada, estéril, apirógena o calidad
equivalente. El agua es el principal constituyente de un diluyente, su
calidad debe ser excelente (pH 5-7, baja resistividad eléctrica, etc.).
• Medir el glicerol a agregar con jeringas de plástico sin émbolo de goma
(ej. Laiciphos I 32ºC (97 ml + 3 ml de glicerol).

Protocolo de dilución de USA (CSS)

1. Agregar antibióticos al eyaculado, sin el diluyente y dejar 3 a 5


minutos antes de la dilución.
2. Dilución: se realiza a 32ºC con
base salina
yema de huevo
antibióticos
sin glicerol (USA sostiene que los ATB no actúan en
presencia de glicerol)
3. Vitrina o heladera a 4ºC: se lleva de 32ºC a 4ºC.
4. Dilución: se realiza a 4ºC con
base salina
yema de huevo
glicerol
sin antibióticos
5. Equilibramiento
6. Llenado de pajuelas
7. Congelación.
Nota: el disertante considera que el protocolo europeo es superior en eficacia biológica
y similar en eficacia microbiológica.

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La pajuela

Puntos importantes

• IMV ha desarrollado una pajuela por especie animal o uso. Así existe una
pajuela para semen fresco de toro diferente a la de semen congelado, una
pajuela para semen de conejo, etc.
• Las pajuelas son: transparentes
transparentes coloreadas o pastel
coloreadas (24 colores)
finas (0.25 ml) o medianas (0.50 ml)

Cómo llenar y sellar las pajuelas

Existen 2 sistemas de llenado:

a) Llenado y sellado por ultrasonido automático con máquinas MRS


I, MRS III, sistema integrado (llena, imprime y sella 13.000 pajuelas/h).

b) llenado y sellado manual con polvo alcohol polivinílico:

• Preparar los sujetadores con suficiente antelación para lo cual


tomar un pequeño puñado de pajuelas y colocarlas en el ángulo del
sujetador.

15
• Cerrar suavemente sosteniendo al mismo tiempo las pajuelas. Las mismas
se deslizarán. Luego cerrar el sujetador. Cada sujetador contendrá un
número exacto de pajuelas (ej. 15 pajuelas de 0.5 ml).
• Alinear las pajuelas por golpeteo del lado opuesto al de llenado
(evitar siempre la contaminación).
• Preparar el soporte de cubetas (Ref. IMV GC 003) y las cubetas de
plástico (Ref. IMV GC 000) así como el junquillo (Ref. IMV EA 101) y los
dientes que vienen con las cubetas.
• Preparar el polvo sellador (Ref. IMV según colores, hay 6 ej. verde
EA 581) y la bomba de aspiración con su pedal.
Conectar el peine de aspiración 15 brocas (Ref. IMV B 103) en el
caño que sale de la bomba y enchufar la misma. A los efectos de realizar el
llenado de las pajuelas, tomar las primeras 15 pajuelas (por el sujetador) e
introducir los dientes del peine en la abertura de la pajuela del lado del
tapón usina. Para ello, y a los efectos de agilizar es conveniente: acercar en
diagonal el peine y las pajuelas e introducir las dos primeras del lado más
cercano al caño, a posteriori elevar el sujetador y todas las pajuelas
ingresarán en los dientes.

• Accionar el pedal de la bomba 15 segundos antes de aspirar. Descender


las pajuelas en la cubeta y al observar que el semen sube, cerrar el
"orificio" superior con el dedo.
• Desactivar la bomba y golpear las pajuelas 3 o 4 veces en los
dientes para que se forme la burbuja de aire.
• El tapón usina debe ser humidificado de la siguiente manera:

Humidificar el primer algodón


El alcohol polivinílico
y el inicio del segundo algodón.

16
Por lo tanto la bomba o la máquina selladora debe ser regulada en función
de esto.
La burbuja de aire debe ser grande. Las agujas de llenado o los
dientes del peine de llenado manual le confieren el tamaño ideal.
La pajuela puede sellarse por ultrasonido (máquinas IMV) o por
alcohol polivinílico. El sellado por calor es menos eficaz y puede originar
la explosión de la pajuela.
Al sellar con alcohol polivinílico recordar:
• Preparar el polvo en una caja de Petri.
• Achatar la superficie con la tapa de la caja de Petri.
• Colocar el conjunto a 4ºC al practicar esta forma de llenado.
• Golpear repetidamente el conjunto de pajuelas sobre el polvo sellador.

No tocar las pajuelas con la mano.

• Verificar que todas las pajuelas hayan sido selladas correctamente.


• Retirar el exceso de polvo sellador suavemente con papel.
• Colocar las pajuelas verticalmente en un recipiente de agua a 4ºC a los
efectos de polimerizar el alcohol polivinílico.

• Secar la extremidad de la pajuela y colocar en racks.


El polvo sellador debe abarcar aproximadamente 1/3 de la burbuja de aire.
La explosión de la pajuela se evita por:
buena humidificación del tapón,
buen sellado,
presencia de burbuja de aire.

17
Congelación

Puede realizarse de diferentes formas:


a) Vapores de nitrógeno: el rack debe colocarse a una temperatura entre
-90ºC a -110ºC. La altura del rack con respecto al nivel de nitrógeno puede
variar enormemente según el recipiente utilizado. Debe permanecer en
vapores de nitrógeno durante un mínimo de 9 minutos.

b) Congeladora programable.

Puntos importantes

• Atención con la manipulación de las pajuelas.


• Trabajar rápidamente.
• Una vez que pasaron los 9-10 minutos llenar un gobelet con nitrógeno
líquido, introducirlo en la congeladora, tomar rápidamente las pajuelas en
el sentido de los dientes del rack y sumergirlas de inmediato en el nitrógeno
líquido.

Curva de congelamiento
El pasaje de líquido a sólido se produce a -10ºC. Hasta -10ºC la
velocidad de enfriamiento es de 5ºC/minuto, a los -10ºC se realiza el
seeding, desde -10ºC hasta -100ºC es de 40ºC/minuto y desde -100ºC hasta
-140ºC es de 20ºC/minuto. Luego va al termo de nitrógeno líquido.

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Descongelado y armado de la pistola

Puntos importantes

• Pajuela fina: mínimo 34ºC por 21 segundos (pasa de -196ºC a 34ºC en


21 segundos). Se puede realizar a 37ºC por 1 minuto.
• Pajuela mediana: mínimo 35ºC por 30 segundos. Se puede realizar 37ºC
por 1 minuto.
• Calentar el pistolete antes de introducir la pajuela.
• Secar bien la pajuela.
• Verificar su sellado e identificación.
• Sacudir la pajuela y colocarla en la pistola.
• Cortar la pajuela sobre la burbuja de aire.
• Armar la pistola con la vaina y llevarla en la espalda (lugar del cuerpo con
34ºC).

Se admite que en todo el proceso (dilución, enfriado, congelación y


descongelación) muere aproximadamente entre el 40-50% de los
espermatozoides.

Evaluación de semen descongelado

1ª evaluación

Se realiza 48 hs postcongelación. Tomar 3 pajuelas de cada


eyaculado al azar. Descongelar a 37ºC por 1 minuto. Se junta el contenido
de las 3 pajuelas en un tubo y de allí se toman 3 gotas (10-12 ul c/u) y se
colocan sobre un portaobjetos precalentado, colocando un cubre sobre cada
una (colocar el cubre rápido para que no se seque la gota).
Existe un "efecto pajuela" y un "efecto gota", por eso se evalúan 3
pajuelas y se toman 3 gotas.

Siempre colocar el objetivo del microscopio en el centro de la gota porque


cuando pasa el tiempo los espermatozoides van hacia los bordes. Siempre
realizar la observación rápidamente.
De esta forma evaluar:
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1. Porcentaje de vivos y motilidad

Es el estudio del porcentaje de reanimados y el vigor de los mismos.


Dicho examen permite monitorear el trabajo de laboratorio y estimar la tasa
de no retorno. Utiliza una clasificación subjetiva del vigor.
1. no hay motilidad progresiva
2. hay motilidad progresiva y no hay rapidez
3. hay motilidad progresiva y hay rapidez
4. amplitud de movimiento progresivo con vibración de cabeza (ALH)
Se da mucha importancia al vigor, más que al porcentaje de
reactivados. La correlación existente entre la motilidad a la descongelación
inmediata y la tasa de no retorno es del orden de 0.5. Sin embargo las
misma es dependiente de la concentración de espermatozoides por pajuela.

2. Test de termoresistencia (TTR)

Consiste en poner el semen a determinada temperatura e ir haciendo


evaluaciones a medida que pasa el tiempo. Existen variaciones de este test
(más de 10 protocolos en todo el mundo). Variaciones según los CIA:
-temperatura de 25 a 39ºC,
-baño maría con o sin agua circulante, dejarlo prendido o apagarlo,
-tiempos: puede ser T0, T1h, T2h, T3h, etc.,
-pajuelas directamente en el baño maría o se coloca el contenido dentro de
un tubo,
-oscuridad o luz.
No esiste un lenguaje común con respecto al TTR a nivel mundial lo
que lo hace poco comparable. El problema es la armonización entre
centros. En Francia menos de un 10% de los CIA practican el TTR, además
no encuentran correlación entre este test y la fertilidad.
Procedimiento:
Tomar 3 tubos y colocar el contenido de 2 pajuelas en cada uno y
llevarlos a baño maría a 35-36ºC a la oscuridad, con agua no circulante.
Realizar las determinaciones a T0, T1h, T2h y T3h.

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A los efectos de calificar correctamente una pajuela cuya
concentración en espermatozoides sea alta, es altamente recomendable
diluirla en citrato de sodio (1.4 g en 50 ml de agua bidestilada). Ej. 500 ul
de citrato de sodio precalentado en tubo a 34ºC en el cual se diluye el
contenido de una pajuela. No usar suero fisiológico al 9‰ porque se
produce un shock osmótico, usar al 7‰ .

3. Acrosomas

Se evalúa el porcentaje de espermatozoides con acrosoma alterado.


Se puede realizar por: a) contraste de fase aumento 1250 x
b) Fluorescencia.

4. Test de resistencia osmótica

Es una prueba de integridad de membrana. Se coloca el contenido de


una pajuela en una solución hipoosmótica de fructosa y citrato de sodio
(100 mosm/kg de agua). Se utilizan 2 ml y 1 ml de sn hipoosmótica para
pajuelas mediana y fina respectivamente. Se incuba en baño maría 60
minutos a 37-38ºC. Colocar 2 gotas de 6 µl entre porta y cubreobjetos por
cada tubo. Se cuentan 200 células a 400 x. Los espermatozoides con colas
enrolladas están vivos (reaccionantes). Cuanto más colas enrolladas, mejor
calidad. Debe haber un 40% de reaccionantes. Se realiza a diferentes
tiempos: To, T1h, T2h.

Solución para test de termoresistencia


Fructosa 9g
Citrato trisódico 4.9 g
csp 1.000 ml agua destilada

De todas las evaluaciones, las de mayor importancia son las de


motilidad y calidad de la misma y porcentaje de vivos.
No existe ningún examen in vitro que esté altamente
correlacionado con la fertilidad.
Luego de esta primera evaluación se realiza un almacenamiento
transitorio hasta que a los 30 días se hace el almacenamiento definitivo tras
una nueva evaluación.

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Combinaciones de antibióticos

1. Sistema CSS (Certified Service Semen) de NAAB (National


Association of Animal Breeders):

Gentamicina (Lab. Schering) 250 ug/ml


Tilosina (Lab. Elanco) 50 ug/ml
Lincomicina (Lab. Upjohn) 150 ug/ml Concentraciones
Espectinomicina (Lab. Upjohn) 300 ug/ml finales

USA solamente acepta esta combinación de antibióticos para


diluyentes y solamente de estos laboratorios.

Protocolo
I Agregar ATB y dejar 5 minutos a 32ºC,
II Agregar primera fracción s/glicerol y ATB. Enfriar de 32ºC a 4ºC >2hs
III Agregar segunda fracción s/ATB y todo el glicerol.

2. Sistema CEE (europeo). Protocolo 88/407.


2.1.Igual combinación que CSS (GTLS). 6.5-7% glicerol.
2.2. Penicilina 500 UI/ml
Estreptomicina 500 mg/ml
Espectinomicina 300 ug/ml
Lincomicina 150 ug/ml.

Las finalidades del uso de ATB son :


• Controlar la flora banal: proteus, micrococos, estreptococos, etc.
• Controlar la flora patógena eventualmente presente en el semen:
Campylobacter foetus, Haemophilus somnus, Mycoplasma bovis,
Mycoplasma bovi genitali, Ureaplasma.
• Mejorar la resistencia osmótica del semen al descongelarlo.
Hoy de dice que la combinación GTLS subestima el control del
mycoplasma. El componente del diluyente que más contamina el semen es
la yema de huevo.
Normas OIE: <500 UFC/pajuela

Clases UFC/ml
I <500
II 500-5000
III >5000

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Limpieza e higiene de materiales

Vaginas artificiales

Luego de colectar:
• Colocar en baño de agua tibia y sumergir 15 minutos con clorhexidina en
concentraciones débiles. También se pueden utilizar amonios cuaternarios.
• Cepillar con jabón neutro, usar limpiatubos.
• Enjuagar bien con agua.
• Enjuagar con agua destilada.
• Rociar con alcohol 70º (no 90º porque altera la goma).
• Secar.

No lavar a más de 60ºC porque se altera la goma.


Nunca utilizar una vagina húmeda ni recién rociada con alcohol. En
caso de utilización inmediata, lavarla con suero fisiológico antes de
colectar.

Material de vidrio

• Enjuagar con agua.


• Cepillar con detergente neutro (sin fosfatos).
• Enjuagar con agua.
• Enjuagar con agua destilada.
• Secar.
• Rociar con alcohol 70º, que arrastra el agua y seca las gotitas.
• Tapar con papel de aluminio.
• Colocar en estufa a 180ºC por 1 hora.

Higiene de toros

Los toros se lavan 1 vez/mes. Se cortan los pelos periprepuciales.


Utilizar lubricante KY de J&J y aceite de hígado de bacalao para los toros
que tienen la mucosa lesionada. La cavidad prepucial no se lava excepto si
la zona periprepucial está sucia o si hay lesiones en el orificio prepucial.
Solo lavar la cavidad prepucial si se va a realizar electroeyaculación,
porque a veces eyaculan dentro del prepucio. Se realiza con suero
fisiológico luego de hacer orinar al toro por masaje circular del orificio
prepucial externo.

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Exigencias sanitarias para los toros dadores en Francia

Establecimiento de origen:
Rodeo libre de Brucelosis, Tuberculosis y Leucosis.
Toro: libre de enfermedades infecciosas del bovino (listas A y B de la OIE)
Madre del toro: libre de Brucelosis, Tuberculosis y Leucosis.
Que no haya síntomas clínicos de IBR.
Se hace el control de cuarentena al toro durante 60 días (pruebas
oficialmente aceptadas).

Enfermedad Primeros 30 días Segundos 30 días

TBC ID y comparada

Brucelosis Wright 2ME y Wright 2ME y


fij. de complemento fij . de complemento

Leucosis ID o ELISA

BVD aislamiento viral

IBR SN o ELISA SN o ELISA

Campylobact. IFD o cultivo de líq. prepucial

Trichomoniasis cultivo de líq. prepucial

Se realiza cultivo bacteriológico de semen (UFC) y examen clínico


del toro.

Estos controles los hace un servicio semioficila (UNCEIA). Luego se


realizan controles bianuales (Brucelosis, Tuberculosis, Leptospirosis,
Leucosis, IBR, BVD, Trichomoniasis y Campylobacteriosis) y clínico del
toro.

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Sospecha de IBR

Luego de obtener un examen serológico negativo y con sospecha de


animales infectados latentes practicarse el Test de LCR que permite el
descubrimiento de estos casos.
• D0 (día 0): serología IBR.
• D1 a 4: inyección de una cantidad equivalente a 12 mg del ester
monofosfórico ácido anhidro de dexametasona c/100 kg de PV.
• D5 a 10: hisopado nasal y prepucial.
• D20: serología IBR.
• D30: serología IBR.

En el intercambio de semen entre países de la CEE se tiene sumo


cuidado con IBR. En caso de países que tengan toros seropositivos
(vacunación o infección ?) en sus CIA se practica un control virológico del
semen importado (5 pajuelas en el laboratorio para el control de
reproductores Maison, Alfort).
A su vez en Europa se debe marcar en la pajuela el status sanitario
del toro con respecto a IBR (IBR pos o IBR neg).

Semen fresco
En Francia, Holanda, Irlanda y Nueva Zelanda trabajan una proporción
con semen fresco. En Francia esa proporción es el 2%. Conservan semen a
4ºC durante 4 días. El tercer día cae un poco la fertilidad. Se trabaja con
una pajuela especial. Se obtienen 4-5 veces más dosis (2.5 a 5 x 106
espermatozoides/dosis).

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