Congelacion Semen PDF
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Congelacion Semen PDF
Dr. Decuadro-Hansen
Director Técnico de IMV
Cassou Francia
Colaboradores:
1 y 2 de mayo de 1997
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Criterios de evaluación de un eyaculado
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Evaluación de semen
Volumen
Motilidad masal
Motilidad individual
Concentración
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Uso del fotómetro
• Encender el fotómetro 30 minutos antes de realizar la lectura.
• Calibrar con 4 ml de SF(1) (blanco). SF: Cl Na 9 ‰ o 7 ‰.
• Pajuela mediana: vol. útil 0.49 ml, vol. total tomado 0.52 ml
• Pajuela fina: vol. útil 0.21 ml, vol. total tomado 0.23 ml.
• Diluir 20 µl de semen en 4 ml de SF (tasa de dilución 1/200).
La muestra de semen se saca de la mitad del tubo.
• Homogeneizar y colocar en la cubeta del fotómetro.
• Esperar 3 segundos la estabilización de las turbulencias formadas luego de
homogeneizar la cubeta (mezcla suero fisiológico-semen), ya que las mismas
pueden modificar la lectura. En el modelo de fotómetro IMV Aiglon estos 3
segundos están incluídos en el programa informático, por lo tanto es suficiente
apretar la tecla "measure" para que el fotómetro comience a realizar la lectura a
los 3 segundos.
• Establecer el número de espermatozoides por pajuela(2).
• Realizar la lectura de los ml de diluyentes necesarios y el número de dosis
finales.
(1) Puede utilizarse citrato de sodio al 2.92%. No utilizar suero formolado porque
modifica la concentración.
(2) El número de espermatozoides por pajuela debe asignarse en función de la calidad
original del semen, la edad del toro y de su ritmo de colecta. Con toros muy fértiles
pueden utilizarse concentraciones extremadamente bajas de 5-8 millones de
espermatozoides totales/pajuela, siempre que el toro tenga un ritmo de colecta continuo
(ej. 2 eyaculados 2 veces por semana).
En Francia utilizan:
15 millones de espermatozoides totales en toros de elite
20 millones de espermatozoides totales en toros estandar
23 millones de espermatozoides totales en toros de testaje (fertilidad desconocida).
Cambiar el filtro del fotómetro cada 3 años y la lámpara cada 1.5 años. La
precisión del fotómetro es del 95%.
Test de Schalm
0.5 ml de semen + 2.5 ml de reactivo (el mismo que CMT). Mezclar por
rotación de la paleta CMT durante 30 segundos.
Es conveniente realizar este test cada 15 días de rutina o si se
constatan problemas de calidad (ej. disminución de la concentración o de la
motilidad sin causas aparentes, eyaculados "grises" o más de 30% de
anormalidades).
Si el resultado es Schalm+ realizar examen clínico. Frente a sospecha
de seminovesiculitis subclínica, recolectar líquido de vesículas seminales
con sonda uretral humana nro. 8 y realizar test de Schalm y control
microbiológico al líquido vesicular.
También se puede enviar semen para realizar control microbiológico
y antibiograma. Se administra como tratamiento preventivo.
florfenicol hasta obtener el resultado del antibiograma y poder utilizar el
antibiótico recomendado.
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Frotis
Anormalidades mayores
Anormalidades menores
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primeras manifestaciones clínicas frente a la degeneración testicular. La
dexametasona a altas dosis puede provocar este defecto.
Que el eyaculado tenga anormalidades no indica necesariamente que
no se pueda congelar, en algunos casos se puede compensar aumentando
las dosis inseminante.
Preparación de Eosina/Nigrosina
En el frotis se evalúa:
a) Integridad de la membrana
Frotis de Eosina/Nigrosina
Frotis de Eosina/Azul de Anilina
Colorantes fluorescentes: SyBR14+PI (SyBR14
marca espermatozoides vivos de verde y PI
marca espermatozoides muertos de rojo)
Colorante fluorescente Hoechst 3358
b)Acrosoma
Frotis en inmersión a 1250 x en contraste de
fase para ver anormalidades de acrosoma (una
de las más comunes es el acrosoma en botón)
Colorantes fluorescentes
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Para evaluación en "fase líquida" de anormalidades por DIC se utiliza la
fijación de Hancock:
a) Semen fresco:
Se diluye 50 µl de semen puro (2 gotas) en 2 ml de suero fisiológico
formolado al 4% tibio y se homogeneiza.
b) Semen congelado:
b.1. en diluyente tris/yema de huevo
1 pajuela fina en 2 ml de suero fisiológico formolado al 4%
1 pajuela mediana en 4 ml de suero fisiológico formolado al 4%.
Centrifugar a 300 g durante 10 minutos (no más de 1.000 R.P.M.)
Sacar el sobrenadante y agregar 2 o 4 ml de suero fisiológico
formolado.
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BIOCIPHOS PLUS™
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El producto está listo para ser utilizado. Debe utilizarse dentro de las
6 hs de reconstituido para evitar la contaminación microbiana.
Si se quiere congelar la solución reconstituida: homogeneizar, hacer
alicuotas y congelar en freezer. No dejar pasar mucho tiempo antes de
congelarlo. No recongelar.
Puntos importantes
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VFD- eyaculado= Volumen de diluyente a agregar
141.6 ml - 5 ml = 136.6 ml
136.6 - 5 ml (diluyente tampón) = 131.6 ml
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LAICIPHOS 488
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• A partir de este momento fraccionar a los efectos de preparar los 2
diluyentes:
1. El diluyente "caliente" a 32-34ºC al cual se le agrega 3% de glicerol.
2. El diluyente "frío" a 4ºC al cual se le agrega 11% de glicerol.
• A los efectos de fluidificar el glicerol, calentarlo en baño maría
aproximadamente a 45-50ºC durante 10 a 15 minutos. Esto permitirá ser
más exacto en la medición de cantidades (3 y 11%), ya que al ser más
fluido se adhiere menos y se aspira mejor con las jeringas.
• Hacer caer el glicerol en el medio de la mezcla Laiciphos/yema/agua
evitando que toque las paredes del frasco ya que resulta difícil
"despegarlo".
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La pajuela
Puntos importantes
• IMV ha desarrollado una pajuela por especie animal o uso. Así existe una
pajuela para semen fresco de toro diferente a la de semen congelado, una
pajuela para semen de conejo, etc.
• Las pajuelas son: transparentes
transparentes coloreadas o pastel
coloreadas (24 colores)
finas (0.25 ml) o medianas (0.50 ml)
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• Cerrar suavemente sosteniendo al mismo tiempo las pajuelas. Las mismas
se deslizarán. Luego cerrar el sujetador. Cada sujetador contendrá un
número exacto de pajuelas (ej. 15 pajuelas de 0.5 ml).
• Alinear las pajuelas por golpeteo del lado opuesto al de llenado
(evitar siempre la contaminación).
• Preparar el soporte de cubetas (Ref. IMV GC 003) y las cubetas de
plástico (Ref. IMV GC 000) así como el junquillo (Ref. IMV EA 101) y los
dientes que vienen con las cubetas.
• Preparar el polvo sellador (Ref. IMV según colores, hay 6 ej. verde
EA 581) y la bomba de aspiración con su pedal.
Conectar el peine de aspiración 15 brocas (Ref. IMV B 103) en el
caño que sale de la bomba y enchufar la misma. A los efectos de realizar el
llenado de las pajuelas, tomar las primeras 15 pajuelas (por el sujetador) e
introducir los dientes del peine en la abertura de la pajuela del lado del
tapón usina. Para ello, y a los efectos de agilizar es conveniente: acercar en
diagonal el peine y las pajuelas e introducir las dos primeras del lado más
cercano al caño, a posteriori elevar el sujetador y todas las pajuelas
ingresarán en los dientes.
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Por lo tanto la bomba o la máquina selladora debe ser regulada en función
de esto.
La burbuja de aire debe ser grande. Las agujas de llenado o los
dientes del peine de llenado manual le confieren el tamaño ideal.
La pajuela puede sellarse por ultrasonido (máquinas IMV) o por
alcohol polivinílico. El sellado por calor es menos eficaz y puede originar
la explosión de la pajuela.
Al sellar con alcohol polivinílico recordar:
• Preparar el polvo en una caja de Petri.
• Achatar la superficie con la tapa de la caja de Petri.
• Colocar el conjunto a 4ºC al practicar esta forma de llenado.
• Golpear repetidamente el conjunto de pajuelas sobre el polvo sellador.
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Congelación
b) Congeladora programable.
Puntos importantes
Curva de congelamiento
El pasaje de líquido a sólido se produce a -10ºC. Hasta -10ºC la
velocidad de enfriamiento es de 5ºC/minuto, a los -10ºC se realiza el
seeding, desde -10ºC hasta -100ºC es de 40ºC/minuto y desde -100ºC hasta
-140ºC es de 20ºC/minuto. Luego va al termo de nitrógeno líquido.
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Descongelado y armado de la pistola
Puntos importantes
1ª evaluación
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A los efectos de calificar correctamente una pajuela cuya
concentración en espermatozoides sea alta, es altamente recomendable
diluirla en citrato de sodio (1.4 g en 50 ml de agua bidestilada). Ej. 500 ul
de citrato de sodio precalentado en tubo a 34ºC en el cual se diluye el
contenido de una pajuela. No usar suero fisiológico al 9‰ porque se
produce un shock osmótico, usar al 7‰ .
3. Acrosomas
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Combinaciones de antibióticos
Protocolo
I Agregar ATB y dejar 5 minutos a 32ºC,
II Agregar primera fracción s/glicerol y ATB. Enfriar de 32ºC a 4ºC >2hs
III Agregar segunda fracción s/ATB y todo el glicerol.
Clases UFC/ml
I <500
II 500-5000
III >5000
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Limpieza e higiene de materiales
Vaginas artificiales
Luego de colectar:
• Colocar en baño de agua tibia y sumergir 15 minutos con clorhexidina en
concentraciones débiles. También se pueden utilizar amonios cuaternarios.
• Cepillar con jabón neutro, usar limpiatubos.
• Enjuagar bien con agua.
• Enjuagar con agua destilada.
• Rociar con alcohol 70º (no 90º porque altera la goma).
• Secar.
Material de vidrio
Higiene de toros
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Exigencias sanitarias para los toros dadores en Francia
Establecimiento de origen:
Rodeo libre de Brucelosis, Tuberculosis y Leucosis.
Toro: libre de enfermedades infecciosas del bovino (listas A y B de la OIE)
Madre del toro: libre de Brucelosis, Tuberculosis y Leucosis.
Que no haya síntomas clínicos de IBR.
Se hace el control de cuarentena al toro durante 60 días (pruebas
oficialmente aceptadas).
TBC ID y comparada
Leucosis ID o ELISA
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Sospecha de IBR
Semen fresco
En Francia, Holanda, Irlanda y Nueva Zelanda trabajan una proporción
con semen fresco. En Francia esa proporción es el 2%. Conservan semen a
4ºC durante 4 días. El tercer día cae un poco la fertilidad. Se trabaja con
una pajuela especial. Se obtienen 4-5 veces más dosis (2.5 a 5 x 106
espermatozoides/dosis).
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