Proteólisis en queso azul danés durante la maduración

Resumen
La proteólisis en queso azul danés se estudió durante la maduración de 9 semanas. Niveles de pH
4.6 N soluble como el porcentaje del N total aumentó de 7.2% a 25%, lo que indica una proteólisis
extensa. Urea-poliacrilamida los electroforetogramas en gel confirmaron el alcance de la
proteólisis a través de la acción de la quimosina y la plasmina temprano en la maduración, pero
más tarde la acción de las proteinasas de Penicillium roqueforti se hizo evidente. El proteolítico la
especificidad de las proteinasas PR-R de Penicillium roqueforti en αs1 y b-caseína se determinó en
un modelo sistema. Las regiones más susceptibles a la acción de la proteinasa en αs1-caseína
fueron 6-40, 69-99, 124-147 y 155-199, con un total de 91 sitios de escisión identificados; regiones
en β-caseína susceptibles a la proteólisis fueron 43-87, 101-119, 161-185 y 192-209 con un total de
118 sitios de escisión identificados. Un gran número de péptidos se identificaron extractos de
queso durante la maduración de 9 semanas, principalmente de las regiones α1-caseína
1-40, 105-136 y 150-176 y regiones β-caseína 6-14, 46-68, 101-140 y 193-209.
1. Introducción

El azul danés es una variedad de queso semiblando con una cuajada blanca de juguete y una fina
corteza comestible. El queso se madura a - 10 C y una humedad relativa del 85-90% (Kinsella y
Hwang, 1976b). Tiene un contenido de grasa de 25-30% (-50-60% en materia seca) y está
envejecido durante ocho a doce semanas (UE, 2017). El principal bioquímico cambios durante la
maduración del azul danés y variedades relacionadas implican proteólisis, lipólisis y metabolismo
de la lactosa residual y de lactato y citrato. El aroma del queso azul está dominado por n-
metilcetonas, producidas a partir de ácidos grasos a través de los primeros cuatro pasos de β-
oxidación provocada por Penicillium roqueforti (Kinsella & Hwang, 1976b). Reducción de la firmeza
/ dureza de la textura del queso (ablandamiento) generalmente ocurre a medida que avanza la
maduración debido a la proteólisis y la desacidificación.

La proteólisis durante la maduración del queso ha sido un área de gran interés y por lo tanto ha
sido ampliamente revisado (Ardo, McSweeney, Maghboul, Upadhayay y Fox, 2017; Zorro &
McSweeney, 1996; Fox, Singh y McSweeney, 1995; Sousa, Ardo, & McSweeney, 2001; Upadhyay,
McSweeney, Maghboul y Fox, 2004). El queso azul se somete a una extensa proteólisis durante
maduración (Gripon, Desmazeaud, Le Bars y Bergere, 1977; Hewedi y Fox, 1984; Kinsella y Hwang,
1976a). Una comparación intervarietal de queso azul fue realizado por Zarmpoutis, McSweeney y
Fox (1997) donde estos quesos exhibieron mucho más extensa degradación de las caseínas que en
Cheddar.

Enzimas proteolíticas (proteinasas y peptidasas) del iniciador los cultivos y el moho degradan las
caseínas ampliamente, por lo tanto, causando cambios de textura y desarrollo de aroma
produciendo compuestos precursores (péptidos y aminoácidos) para más metabolismo (Ardo,
McSweeney, Magboul, Upadhyay y Fox, 2017; Sousa, Ardo, € y McSweeney, 2001). La extensa
proteólisis en el queso azul danés se asocia en gran medida con el principal microorganismo
secundario, Penicilium roqueforti, a través de la acción de enzimas extra e intracelulares, incluidas
las metaloproteinasas, aspártico-proteinasas, aminopeptidasas y carboxipeptidasas ácidas
(Madkor, Fox, Shalabi y Metwalli, 1987; Zarmpoutis, McSweeney, Beechinor y Fox, 1996;
Zarmpoutis et al., 1997).
Las aspartil y las metaloproteinasas actúan específicamente sobre αS1 y β-caseínas y se han
caracterizado (Gripon, 1993). La actividad máxima de proteasa en el micelio y en el medio
extracelular ocurre cuando el micelio ha alcanzado un crecimiento completo (Cantor, van den
Tempel, Hansen y Ardo, 2004). La actividad de estas enzimas (aspartil y metaloproteasas de moho)
es máxima en el queso azul en el momento de la esporulación del moho (Cantor, van den Tempel,
Hansen y Ardo, 2004 €), que es de alrededor de ~ 4 w en caso de Queso azul danés. La
metaloproteasa es activa de pH 4.5 a 8.5, y las aspartil proteasas varían de 3.5 a 6.5 (Trieu-Cuot,
Archieri-Haze y Gripon, 1982b) que corresponde al pH del queso azul danés (pH 4.8e5.8) durante
la maduración. (Zarmpoutis et al., 1997). La metaloproteasa y las aspartil proteasas tienen una
amplia especificidad e hidrolizan tanto αS1 como a β-caseínas. La metaloproteasa escinde la
βcaseína en Pro90-Glu91, que a menudo no es hidrolizada por proteasas debido a su residuo de
prolina, y también en Lys28-Lys29, que también es escindida por plasmina (Le Bars & Gripon, 1981;
Trieu-Cuot et al., 1982b; Trieu-Cuot y Gripon, 1983). Las aspartil proteasas hidrolizan las caseínas
solo en péptidos de alto peso molecular, incluido αS1-CN (f24-199) producido por escisión en
Phe23-Phe24 en αS1-caseína, que también es el sitio principal de escisión de quimosina en esta
proteína (Ardo et al., 2017; Trieu-Cuot, Archieri-Haze y Gripon, 1982a). Las aspartil proteasas
producen péptidos de alto peso molecular al escindir βcaseínas en Arg1-Lys29, Lys29-Val209, Lys97-
Val209 (Le Bars & Gripon, 1981; Trieu-Cuot et al., 1982b; Trieu-Cuot & Gripon, 1983). Sin embargo,
la acción completa y precisa de las enzimas del moho sobre las caseínas sigue sin dilucidarse.

2. Materials and methods

2.1. Fabricación de queso

Se obtuvieron muestras de queso azul danés comercial hasta 9 semanas de maduración de Arla
Foods, Vojens, Dinamarca. Los quesos se fabricaron en tres lotes independientes con una
diferencia de 2 a 3 días. La leche se pasteurizó a 74 ° C durante 15 s, se añadieron CaCl2 y cultivo
de moho (Penicillium roqueforti cepa PR-R) después de la pasteurización seguido de la adición de
un cultivo iniciador mesofílico para iniciar la acidificación. Se añadió cuajo y la cuajada coagulada
se cortó y se agitó para liberar suero. El pH se controló durante 24 h después de la adición del
cultivo iniciador. La cuajada de queso se rellenó en moldes con un diámetro de 20 cm. Las
cuajadas se volvieron 4 veces en 24 h. Los quesos se maduraron en condiciones estándar de
maduración para queso azul y se muestrearon el día 0 [sin sal (OOS)], 2 semanas, 4 semanas, 7
semanas y 9 semanas. Las muestras se mantuvieron congeladas a 20 ° C hasta el análisis.

2.2. Preparación de muestras y análisis de composición.

Las cuñas congeladas (~ 1.5-2 kg) con una corteza muy delgada fueron descongeladas,
desmenuzadas y mezcladas completamente. El contenido de humedad de los quesos se determinó
utilizando un método de secado en horno (IDF, 1982). Se usó un medidor de pH calibrado para
medir el pH de las suspensiones de queso hechas de 30 g de queso y 60 g de agua desionizada. Se
prepararon fracciones de quesos solubles e insolubles a pH 4,6 en todos los puntos de tiempo
según lo descrito por Kuchroo y Fox (1982). El contenido de proteína cruda y nitrógeno de los
quesos y los extractos solubles de pH 4.6 se determinaron por el método macro-Kjeldahl (la
proteína cruda se informa como N 6.38; IDF, 1986), el porcentaje de grasa se determinó por el
método Gerber (IIRS, 1955) .

2.3. Análisis de proteólisis

La descomposición proteolítica se estudió mediante electroforesis de urea-poliacrilamida (urea-

PAGE) de fracciones insolubles liofilizadas de pH 4.6 (Andrews, 1983; O'Mahony, Lucey y
McSweeney, 2005; Shalabi y Fox, 1987). Los geles se tiñeron con azul brillante Coomassie G250
(Blakesley y Boezi, 1977) y se tiñeron con varios lavados con agua destilada. Los contenidos de
aminoácidos libres individuales (FAA) se determinaron de acuerdo con Fenelon y Guinee (2000) a
partir de extractos congelados de pH 4,6 solubles de quesos a 7 w y 9 w de maduración. Las
muestras se desproteinizaron primero mezclando volúmenes iguales de ácido tricloroacético (TCA)
al 24% (v / v).

El perfilado de péptidos se realizó mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) y

espectroscopía de masas (MS). Para UPLC, se prepararon muestras filtrando extractos solubles de
pH 4.6 a través de filtros de acetato de celulosa de 0.22 mm (Sartorious GmbH, Gottingen,
Alemania) y se mantuvieron a 4 ° C durante el análisis. Los perfiles de péptidos se determinaron
usando un sistema de núcleo Waters Acquity UPLC H-Class con un detector Waters Acquity UPLC
TUV (doble longitud de onda) y el calentador de columna Acquity 30-A, el sistema se interconectó
con el software Empower 3 (Waters Corp., Milford, MA, ESTADOS UNIDOS). La columna utilizada
fue una columna Acquity UPLC BEH C-18 (Waters Corp.). La elución se controló a 214 nm con una
fase móvil de dos disolventes A: ácido fórmico al 0,1% (v v1) (SigmaeAldrich, Darmstadt, Alemania)
en agua Milli-Q y B: ácido fórmico al 0,1% (v v1) en acetonitrilo (SigmaeAldrich ) con un caudal de
0,2 ml min1 durante un tiempo de ejecución de 60 min.

Los péptidos en extractos solubles a pH 4.6 se determinaron por LC-MS usando un Waters Acquity
G2 Q-TOF LC-MS, modelo XEVOG2QTOF # YBA051, acoplado a un Waters Acquity UPLC. Las
muestras se filtraron a través de filtros de acetato de celulosa de 0,22 mm y se inyectó un
volumen de 10 ml en un sistema central Waters Acquity UPLC H-Class. Las muestras se eluyeron a
214 nm usando una fase móvil compuesta de dos solventes. El disolvente A era ácido fórmico al
0,1% (v / v) en agua Milli-Q y el disolvente B era ácido fórmico al 0,1% (v / v) en acetonitrilo. El
análisis se realizó a una temperatura de fuente capilar de 120 C, temperatura de desolvatación a
450 C y voltaje de pulverización de 3,0 kV. Las muestras se analizaron en el modo de resolución
con un rango de masa de 50 a 2000 Da. Se bombearon muestras y disolventes a través de una
bomba Waters Acquity SDS con un límite de alta presión de 1031,24 bar a un caudal de 0,2 ml
min1, pasando a través de la columna Acquity UPLC BEH C-18. La detección de péptidos fue
realizada por Waters Acquity UPLC LG, utilizando un detector de matriz de fotodiodos (PDA). La
elución estaba usando los solventes descritos anteriormente pero con un gradiente de 97% de
solvente A, 3% de solvente B a 0.0 min; 60% de A, 40% de B a los 47 min; 15% de A, 85% de B hasta
51 min y 97% de A, 3% de B hasta el final de la ejecución, con un caudal de 0,20 ml min1.

Los datos sin procesar adquiridos fueron procesados por el software Mass Lynx v4.1 también
utilizado para controlar el instrumento durante las ejecuciones de muestras y comparados a través
del software Protein Lynx Global Server (PLGS) v2.4 (Waters Corp., Milford, MA, EE. UU.) Para
ejecutar comparativos la base de datos de secuencias busca caseína bovina αS1-caseína y β-
caseína. Los datos obtenidos de LC-MS se compararon con los valores de área de pico del análisis
de UPLC configurando el detector PDA (LCMS) en un ancho de banda de resolución de 1.2 nm y un
canal 3D, para proporcionar un espectro de alta calidad e imitar mejor el doble UV / sintonizable
Detector de Vis (TUV) basado en valores de tiempo de retención ya que ambas técnicas se
ejecutaron con configuraciones instrumentales similares.

2.4. Determinación de la especificidad de Penicillium roqueforti PRR sobre las caseínas

Penicillium roqueforti PR-R, la cepa utilizada para hacer queso, se obtuvo como un concentrado de
inóculo y se almacenó a 4 C. El inóculo (1 g) se hidrató en 10 ml de agua destilada que contenía
Tween 80 al 0,01% (Sigma, Francia) antes a la inoculación en suspensión 1: 1 de 100 ml de caldo de
papa y dextrosa (Sigma Aldrich Co, St. Louis, MO, EE. UU.) (Le Drean et al., 2010) y 100 ml de leche
de leche desnatada en polvo al 10% (LHSM) (Kerry, Listowel, Irlanda). Esta suspensión se incubó en
una incubadora orbital (Stuart Scientific, Staffordshire, Reino Unido) durante 7 días a 25 ° C (Le
Drean et al., 2010) a una velocidad de 100 rev min1. Cuando se cultivó, toda la biomasa micelial se
centrifugó a 9000 g durante 45 minutos a 4 ° C en una centrífuga Sorvall. El filtrado se filtró a
través del papel Whatman número 113. El filtrado se almacenó congelado en alícuotas a 20ºC.

Los péptidos derivados de las principales caseínas presentes en este hidrolizado se identificaron
por Q-ToF LCMS como se describió anteriormente.

2.5. análisis estadístico

Cada análisis experimental se repitió por triplicado para cada muestra de queso. Todos los análisis
estadísticos se realizaron con R® 16 (R versión 3.4.0; R Foundation for Statistical Computing,
Universidad de Auckland, Auckland, Nueva Zelanda). Las diferencias de medias entre lotes y
puntos de tiempo de maduración se probaron mediante análisis de varianza (ANOVA
unidireccional) a un nivel de significancia, a, de 0.05 (P 0.05), a lo largo del estudio.

3. Resultados y discusión

3.1. Análisis composicional del queso azul danés.

La composición fisicoquímica del queso azul danés se informa y los valores de pH, humedad, grasa,
sal, proteínas y nitrógeno en el queso, humedad en sólidos sin grasa, grasa en materia seca y
nitrógeno soluble en pH (SN) 4.6 como un El porcentaje de nitrógeno total (SN total) se muestra en
la Tabla 1. Los niveles de humedad oscilaron entre 43.2 y 47.6%. La humedad en sólidos no grasos
(MNFS) aumentó de 61.8% a 69% durante la maduración. El contenido de grasa fue de 29.0% a
32.6%, sin cambios significativos, excepto en el último momento de maduración (9 w). La materia
grasa en seco (FDM) varió de 51.7% a 59.7%, sin diferencias significativas. Los valores de humedad,
grasa, MNFS y FDM fueron similares a los quesos azules previamente reportados en la literatura
(Diezhandino, Fernández, Gonz alez, McSweeney y Fresno, 2015; Wolf, Perotti y Zalazar, 2010;
Zarmpoutis et al., 1997 ) El contenido de proteína cruda (% N 6.38) permaneció alrededor del
18.0% hasta 7 semanas y aumentó significativamente al 24% en 9 semanas de maduración. El
nitrógeno total en el queso varió entre 2.83% y 3.78% durante la maduración de 9 semanas. El pH
aumentó significativamente de 4.87 a ~ 5.7-5.8 durante la maduración. El aumento del pH resulta
del metabolismo del lactato, lo que resulta en la producción de CO2 y H2O (Fox, Lucey y Cogan,
1990; Gori, Ryssel, Arneborg y Jespersen, 2012).

3.2. Proteólisis

Los niveles de nitrógeno soluble en pH 4.6 como porcentaje del nitrógeno total (pH 4.6-SN / TN) en
los quesos azules daneses durante la maduración aumentaron significativamente de 7.6% a 29.9%
(Tabla 1), lo que indica un aumento en el grado de proteólisis hasta 9 w de maduración. Los
valores fueron bajos para los quesos OOS y 2 w donde el crecimiento del moho fue bajo a
moderado, los valores más altos se encontraron en la cuarta semana y más tarde, lo que refleja el
crecimiento de los mohos de 2 a 5 semanas. El marcado aumento de la proteólisis en el queso azul
danés después de 4 w refleja la extensa acción proteolítica de Penicillium roqueforti, que apareció
alrededor de esa etapa de maduración (Trieu-Cuot y Gripon, 1983; Zarmpoutis et al., 1996). El
valor (29.9%) encontrado a las 9 w, (edad a la cual el queso azul danés está comercialmente
empacado) en este estudio fue comparable con otras muestras de quesos azules comerciales
listos, incluido el queso azul irlandés, Chetwynd (~ 32% e 36% ; Zarmpoutis, McSweeney,
Beechinor y Fox, 1996), pero fueron inferiores a los valores informados para los quesos
Gorgonzola y Stilton (45% e55%; Zarmpoutis et al., 1996).

La proteólisis en queso azul danés también se evaluó mediante ureaPAGE de fracciones insolubles
liofilizadas a pH 4,6 como se muestra en la Fig. 1. Los electroforetogramas mostraron una
degradación extensa de aS1 y bcaseína a partir de 4 w en adelante, con la descomposición inicial
de b-caseína fue por La acción de la plasmina formando las g-caseínas (Zarmpoutis et al., 1997)
seguida de una alta tasa de proteólisis por la acción de las enzimas del moho. Se observó un
aumento significativo en la proteólisis a las 4 w y más adelante en el presente estudio, cuando el
moho se había hecho visible (Gripon et al., 1977; Le Bars & Gripon, 1981). Se generó un mayor
número de péptidos a las 4 w y las etapas posteriores de maduración y reflejó el desarrollo de
Penicillium roqueforti y sus proteinasas en los quesos

Se generó un gran número de fragmentos de péptidos durante la maduración como se puede

observar en los cromatogramas UPLC (Fig. 2) de extractos de OOS solubles a pH 4.6, quesos de 4 w
y 9 w. Se observó un claro aumento en la complejidad de los perfiles de péptidos a 4 w y 9 w, en
comparación con OOS. Se observaron picos con mayor intensidad a partir de los tiempos de
retención de 2-10 min en todos los cromatogramas. Durante la maduración, el número (tanto
hidrofóbico como hidrófilo) y el tamaño de los picos aumentaron desde el inicio (OOS) hasta el
intermedio (4 w) hasta el final de la maduración (9 w). Muchos de los péptidos de liberación tardía
parecían (36e43 min de tiempo de retención) hidrolizarse progresivamente después de 4 w de
maduración. Se produjo una gran cantidad de péptidos (Fig. 2) durante la maduración. El mayor
número de picos de péptidos se observó a las 4 w de maduración y coincidió con el crecimiento de
Penicillium roqueforti; sus enzimas son muy activas al pH de este queso (~ 4.8e5.8; Cantor et al.,
2004). Como se observó en otras variedades de queso azul veteado como Gorgonzola y Silton
(Zarmpoutis et al., 1997), los cromatogramas apuntan hacia una proteólisis extensa durante la
maduración.
Los extractos solubles de pH 4.6 de los quesos a 7 w y 9 w (Fig. 3) contenían 20.57 y 35.59 mmol
de queso g1 de FAA total, respectivamente. La concentración de aminoácidos individuales a 9 w
fue (mmol g1 de queso): ácido glutámico, 5,41; leucina, 4,84; lisina 4.12. La histidina y la valina
también tuvieron valores comparativamente más altos a 9 w (2,67 mmol de queso g1) que las de 7
w (2,41 mmol de queso g1), como se muestra en la Fig. 3. Un alto contenido de ácido glutámico
podría explicarse por su presencia en altas cantidades en las caseínas o tal vez la formación de α-
cetoglutarato que actúa como co-sustrato para aminotransferasas (Vincente, Iba nez, Barcina ~ y
Barron, 2001). Altas concentraciones de leucina (4,84 mmol de queso g1), fenilalanina (2,3 mmol
de queso g1) y valina (4,12 mmol de queso g1) a las 9 w sugirieron la división preferencial de
enlaces peptídicos que implican residuos hidrófobos también observados en estudios de
Zarmpoutis et al. (1997) y Diana, Rafecas, Arco y Quilez (2014) sobre queso azul. La menor
concentración de ciertos FAA, por ejemplo, cisteína y triptófano, probablemente se deba a su
presencia en bajas cantidades en regiones de caseínas ampliamente degradadas (Eren-Vapur y
Ozcan, 2012; Ganesan y Weimer, 2007; Lauer y Baker, 1977). Los niveles de FFA fueron
comparables con los encontrados en estudios sobre otras variedades de queso azul como
Gorgonzola y Stilton (Zarmpoutis et al., 1997).

3.3. Acción de enzimas de Penicillium roqueforti PR-R

sobre las caseínas

Las enzimas que catalizan la proteólisis durante la

maduración de los quesos azules daneses son el
coagulante, la plasmina, las proteinasas de moho y
varias proteinasas y peptidasas iniciadoras. Se conoce la
especificidad de las quimosinas, plasminas y lactococcal
proteinasas (lactocepinas) en las caseínas (Ardo et al.,
2017; Upadhyay, McSweeney, Magboul y Fox, 2004),
pero la especificidad de las aspartil y metaloproteinasas
de Penicillium roqueforti en la caseína queda por
determinar en detalle. Por lo tanto, se diseñó un experimento para determinar las especificidades
exactas de las proteinasas de moho en las caseínas. La complejidad del hidrolizado fue evidente a
partir de los cromatogramas UPLC (Fig. 4). Los péptidos derivados de caseína identificados en el
hidrolizado de PR-R se usaron para mapear los sitios de escisión (Fig. 5A, B). Solo los péptidos con
los valores más altos de intensidad relativa de LCMS para αS1-caseína y β-caseína (Material
suplementario, Tabla S1) se usaron para determinar los sitios de escisión. Los términos N y C de los
fragmentos peptídicos junto con su secuencia se enumeran en el material complementario, Tabla
S1. Los péptidos producidos en los hidrolizados de PRR se compararon con los péptidos que se
sabe que se producen en los hidrolizados por acción de la quimosina, la plasmina y las
lactocepinas.
Ciertas regiones de αS1-caseína (residuos 5-40, 69-99, 124-147 y 155-199) contenían múltiples
sitios de escisión y se escindieron ampliamente por las proteinasas PR-R. Los principales sitios de
corte de la PR-R en αS1-caseína fueron Pro5-Ile6, Lys7-His8, Leu11-Pro12, Glu14-Val15, Phe23-Phe24,
Phe24-Val25, Glu30-Val31, His79-Ile80, Gly126-Ile127, Met135-Ile136, Gln155-Leu156, Leu157-Asp158, Trp164-
Tyr165, Asn184-Pro185, Asn190-Ser191 y Met196-Pro197. Un importante derivado de quimosina el péptido
αS1-CN (f1-23) (Fox y McSweeney, 1996) producido por la escisión de Phe23-Phe24, estuvo ausente
del hidrolizado en este estudio, ya que podría haberse hidrolizado rápidamente en fragmentos
más pequeños. También las aspartil proteasas de moho (Claverie Martin y Vega-Hernández, 2007)
mostraron una especificidad similar a la de la quimosina (Ardo et al., 2017; Breen, Fox y
McSweeney, 1995; Fernández, Singh y Fox, 1998; Singh, Fox , Højrup y Healy, 1994; Singh, Fox y
Healy, 1995, 1997; Upadhyay et al., 2004) y los péptidos αS1-CN (f6-13 / 14/15) y αs1-CN (f8-14) se
produjeron en el PR -R hidrolizados por escisión en los enlaces Gln13-Glu14, Glu14-Val15 y Leu16-
Asn17; estos sitios también se dividen por la actividad de quimosina (McSweeney, Pochet, Fox y
Healy, 1994). De manera similar, las proteinasas PR-R cortaron enlaces en Pro5-Ile6, Lys7-His8,
Phe23-Phe24, Ser66-Ser67 y Ala175-Pro176, que también se cortaron mediante proteinasas o
lactocepinas asociadas a la envoltura celular (Breen et al., 1995; Fernandez et al., 1998; Singh et
al. , 1994, 1995, 1997). Los sitios Glu84-Asp85 - Ile81-Glu82 también son susceptibles a la acción tanto
de la quimosina como de las lactocepinas y las proteinasas PR-R (Material complementario Tabla
S1). El fragmento N terminal αS1-CN (f165-189), producido por escisión en Ala164-Trp165, que es un
sitio de escisión principal de proteinasas PR-R en αS1-caseína; Este sitio también es escindido por
la acción de la quimosina y las lactocepinas (Fox y McSweeney, 1996). El péptido aS1-CN
(f157e164), que se identificó en el hidrolizado de PR-R, tiene una acción inhibitoria de la ECA y es
un péptido bioactivo notable (Sanchez-Rivera et al., 2014) y se encontró en el hidrolizado de PR-R.

En el caso de la β-caseína, las regiones 47-67, 101-119, 161-185 y 192-209 se escindieron

ampliamente por las proteinasas PR-R. Los sitios de escisión de PR-R identificados en b-caseína
fueron Glu5eLeu6, Glu14-Ser15, Ile66-His67, Glu100-Ala101, Phe119-Thr120, Asn132-Leu133, Thr154-Val155,
Ser168-Lys169, Lys176-Ale177,Pro 186 –Ile187 .Ciertos sitios de escisión identificados en b-caseína en el
hidrolizado de PR-R fueron los mismos que los de la plasmina (Ardo, Lilbæk, Kristiansen, Zakora, €
& Otte, 2007; Ardo, Pripp, € & Lillevang, 2009; Rehn, Petersen, Hallin Saeden, y Ardo, 2010 €) de la
siguiente manera: Lys97-Val98, Lys105-His106, Lys113-Tyr114, Lys169-Val170, Lys176-Ala177 y Arg202-Gly203.
Los enlaces Thr78-Gln79, Thr154-Val155, Ser164-Leu165, Leu191-Leu192 y Pro200-Val201 escindidos por las
proteinasas PR-R también se escindieron por acción de lactocepinas (Ardo et al., 2017),
produciendo fragmentos de péptidos β-CN (f79-85), β-CN (f16-85), β-CN (f16-85), β-CN si-CN
(f165-168 / 169/170), βCN (f165-176) y β-CN (f192-197), β-CN (f193-197), βCN (f201e207). Se
observó que las proteinasas PR-R producían una serie de fragmentos por escisión en sitios que
contenían prolina (Gly203-Pro204, Tyr180-Pro181, Ala103-Pro104, Leu137-Pro138) o isoleucina (Ile49-His50,
Ile66-His67, Ile207-Ile208) como un enlace anterior, como también se observó anteriormente, como
parte de un enlace anterior. Cunningham y O'Connor, 1997; Fox y McSweeney, 1996). Los
fragmentos de péptido de β-caseína en hidrolizados de PR-R con bioactividad informada
incluyeron el fragmento de péptido opioide β-CN (f60e66), producido por escisión en Val59-Tyr60,
fragmento de péptido β-casomorfina-7 β-CN (f114-119) producido por escisión en Lys113-Tyr114 y
angiotensina Fragmento de péptido inhibidor de la enzima convertidora I (ACE) β-CN (f47e52)
producido por escisión en Gln46-Asp47 (Sanchez-Rivera et al.,
3.4. Identificación de péptidos en queso azul danés

El objetivo principal del presente estudio fue la identificación de péptidos en los extractos solubles
en pH 4.6 de los quesos azules daneses producidos durante 9 w de maduración. Se obtuvo una
gran cantidad de datos de péptidos a partir de análisis LCMS y UPLC de los extractos solubles a pH
4,6. Los análisis de LCMS encontraron 922 (4 w), 664 (7 w) y 749 (9 w) fragmentos de caseína aS1 y
1049 (4 w), 714 (7 w) y 804 (9 w) fragmentos de βcaseína. Se produjeron un total de 3270
fragmentos de caseína αS1 y 3668 fragmentos de βcaseína al final de la maduración de 9 w. Sin
embargo, solo se consideraron los 50 fragmentos peptídicos con el valor más alto de intensidad
relativa de aS1-caseína y β-caseína (material suplementario Tabla S2) (Fig. 6A, B). Los valores de
intensidad relativa cuantifican la cantidad de un ion producido en relación con el ion más
abundante (Zhang et al., 2010) y, por lo tanto, están relacionados con la concentración. El mayor
número de fragmentos de péptidos se produjeron a 4 w y 9 w. Los péptidos identificados en el
estudio actual se compararon con las especificidades de escisión de las proteinasas PR-R (Sección
3.3) junto con las especificidades conocidas de quimosina, plasmina y lactocepinas (Ardo et al.,
2017; Fernandez et al., 1998; Upadhyay et al. , 2004).2014).
Los principales fragmentos de caseína αS1 producidos durante la maduración fueron αS1-CN (f1-
16), (f8-14), (f10-16), (f10-18), (f14-20), (f31-40), (f37-63), (f73-85), (f109-128), ( f112-135), (f115-
136), (128-158), (f157-164), (f166-172) y (f166-176) y los principales fragmentos de β-caseína
fueron β-CN (f23 / 25-34), (f61-75), (f102 / 113 / 130-136) , (f164-175). La mayoría de los péptidos
de aS1-caseína (Fig. 6A) se derivaron de los residuos 1e40, 105e136 o 150e176. En el caso de la β-
caseína, las regiones más susceptibles a la proteólisis estaban entre los residuos 6-14, 46-68, 101-
140 y 193-209 (Fig. 6B). Los fragmentos peptídicos producidos a partir de αS1-caseína por acción
de las proteinasas PR-R incluyeron αS1-CN (f14-20), (f31-40), (f37-63), (f73-85), (f109-128), (f112-
135), (f115-136), (f129-158), (f166-172) y (f166-176). No está claro por qué el fragmento
quimiosindicado principal, αs1-CN (f1-23) (Fox & McSweeney, 1996), estuvo ausente en las
primeras etapas (OOS y 2 w) de maduración, pero se encontró a las 7 w y 9 w. Los péptidos
producidos por la acción de la quimosina y / o lactocepinas incluyeron αS1-CN (f8-14), (f24-30),
(f10-16 / 18), (f. 149-158) y (f157-164). En las primeras etapas de maduración, se observó el
fragmento αS1-CN (f12-25) en OOS y 2 w. Péptido que produce caseína hidrolizada por plasmina
fragmentos que incluyen αS1-CN (f33-47) y αS1-CN (f105-128) (Breen y otros, 1995; Fernández y
otros, 1998; Singh y otros, 1994; 1995; 1997; Upadhyay y otros, 2004). También se observó la
acción de varias peptidasas junto con la acción de las proteinasas PR-R y otras enzimas
proteolíticas. Los fragmentos producidos por la acción de las proteinasas PR-R incluyeron β-CN
(f59-66), (f85-91), (f78-93), (f109-119), (f126-132), (f130-141), (f177-182), (f184-190) y (f193-207 /
209 )

La β-caseína se hidrolizó en Lys97-Val98, que es un sitio de escisión principal de las proteinasas PR-R
(Sección 3.3) y otras proteinasas de moho (Le Bars & Gripon, 1981; Trieu-Cuot et al., 1982a; b). Las
regiones más susceptibles de la caseína dieron como resultado fragmentos producidos por la
acción de las proteasas PR-R y la plasmina (Fox y McSweeney, 1996); los péptidos producidos
fueron b-CN (f28e40 / 45/55), (f100e116 / 119/131), (f184e190). Los péptidos β-CN (f46-55), (f47-
56 / 57/58), (f81 / 84-102) y (f102-115 / 116) fueron producidos por la acción de las lactocepinas.
Las condiciones de pH (5-5.8; Møller, Rattray y Ardo, 2012; Mulvihill y Fox, 1978; Pelissier, Mercier
y Ribadeau-Dumas, 1974; Visser y Slangen, 1977) en los quesos azules daneses durante las etapas
de maduración posteriores permiten la acción. de quimosina en β-caseína que produce
fragmentos peptídicos que incluyen β-CN (f7 / 8-25) y (f101 / 102-114 / 115/116). Entre los
péptidos identificados, Sanchez-Rivera et al. Informaron actividad inhibidora de la ECA. (2014) en
fragmentos αS1- CN (f157164) y β-CN (f133-139). Estos péptidos se encontraron durante la
maduración de 9 semanas del queso azul danés. Muchos péptidos tanto de αS1 como de β-caseína
no pudieron atribuirse a la acción de las proteinasas PR-R, quimosina, plasmina y lactocepinas;
Estos péptidos pueden haber sido procesados aún más por la acción de las peptidasas.
4. Conclusiones

El presente estudio investigó en detalle la proteólisis en el queso azul danés, incluida la

determinación de los sitios de acción de las proteinasas de P. roqueforti en αS1 y β-caseína y la
identificación de numerosos péptidos producidos durante las 9 w de maduración. Los niveles de
nitrógeno soluble en pH 4.6 aumentaron significativamente después de 4 semanas de maduración
y fue indicativo de una extensa proteólisis primaria. Los perfiles de péptidos UreaPAGE, FAA, LCMS
y péptidos UPLC de los extractos solubles de pH 4.6 mostraron diferencias cualitativas y
cuantitativas considerables durante la maduración del queso. Se determinaron los sitios de
escisión específicos para la acción de las proteinasas PR-R sobre αS1-caseína y β-caseína en
hidrolizados y ayudar a identificar qué péptidos se produjeron en el queso durante la maduración
por la acción de estas enzimas. Este estudio podría ser útil para comprender los mecanismos
complejos de la proteólisis durante la maduración del queso azul y aclarar la relación de la
actividad proteolítica en el queso con las enzimas de Penicillium roqueforti específicamente en el
queso azul danés.

Agradecimientos

Este proyecto fue financiado por Food for Health, Irlanda (FHI). Los autores también desean
agradecer a Arla Foods Denmark por toda su ayuda y apoyo.