Ciclos Cicadianos

TESIS CARRERA DE DOCTORADO EN FÍSICA
CICLOS CIRCADIANOS: ESTRUCTURAS

EMERGENTES EN POBLACIONES DE OSCILADORES
ACOPLADOS.
Guadalupe Cascallares
Doctorando
Dr. Pablo M. Gleiser

Director
Miembros del Jurado

Dr. Sergio A. Cannas (Universidad Nacional de Córdoba)
Dra. Inés Samengo (Instituto Balseiro)
Dr. Mauricio P. Sica (Instituto Balseiro)
Agosto de 2017
Fı́sica Estadı́stica e Interdisciplinaria – Centro Atómico Bariloche
Instituto Balseiro
Universidad Nacional de Cuyo
Comisión Nacional de Energı́a Atómica
Argentina
A las moscas que perecieron en el proceso.
Índice de contenidos
Índice de contenidos v
Índice de figuras ix
Índice de tablas xiii
Resumen xv
Abstract xvii
1. Introducción 1
1.1. Ritmos biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.1. Relojes endógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2. Ritmos circadianos: algunas definiciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3. Organismos modelo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.3.1. Organismos modelo en cronobiologı́a. . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.4. El reloj molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.5. Mediciones en cronobiologı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.5.1. Actogramas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.5.2. Curva de respuesta de fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.5.3. Periodograma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.6. Objetivos de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2. Cianobacterias 21
2.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2. Reloj circadiano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.3. Ventanja intrı́nseca vs extrı́nseca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.4. El modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4.1. El oscilador circadiano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.4.2. La modulación de las horas luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.5. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.6. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
v
vi Índice de contenidos
3. Mamı́feros 35
3.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.2. Reloj circadiano en mamı́feros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.2.1. El reloj maestro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.2.2. Los relojes periféricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.2.3. El reloj molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.2.4. Acercamiento a datos experimentales . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.3. El fenómeno de sincronización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.3.1. Perspectiva histórica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.3.2. Algunas definiciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.3.3. El modelo de Kuramoto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.3.4. Modelos de sincronización en mamı́feros . . . . . . . . . . . . . 48
3.4. El modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.5. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.6. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4. Drosophila melanogaster 63
4.1. La mosca de la fruta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.2. Su relevancia circadiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.2.1. El reloj molecular en Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.2.2. Redes neuronales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.3. Desarrollo de un dispositivo de monitoreo de la actividad locomotora . 69
4.3.1. Configuraciones espaciales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.3.2. PySolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.4. Sujetos de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.4.1. Crı́a y mantenimiento de las moscas . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.4.2. Sistema GAL4/UAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4.3. Lı́neas de Drosophila utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.5. Actividad locomotora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.5.1. Leyes de potencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.5.2. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.6. Oviposición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
4.6.1. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.6.2. Protocolo del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.6.3. Periodograma de Lomb-Scargle . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.6.4. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.6.5. Proyectos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
4.7. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Índice de contenidos vii
5. Conclusiones 105
A. Dispositivo d-Tracker 107
Bibliografı́a 113
Publicaciones asociadas 127
Agradecimientos 129
Índice de figuras
1.1. Caracterización de una función periódica. . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2. Componentes del sistema circadiano y sus vı́as de interacción. . . . . . 6
1.3. Crecimiento de Neurospora crassa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4. Actividad locomotora en Drosophila melanogaster. . . . . . . . . . . . . 9
1.5. Reloj molecular básico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.6. Desfasaje entre los niveles de proteı́na y mARN. . . . . . . . . . . . . . 12
1.7. Reloj molecular en cianobacteria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.8. Reloj molecular simplificado de Drosophila. . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.9. Reloj molecular simplificado de mamı́feros. . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.10. Actogramas en double-plot. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.11. Ejemplo de curva de respuesta de fase para un animal nocturno. . . . . 17
2.1. Fenotipos circadianos en cianobacteria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2. Esquema del modelo teórico del oscilador circadiano en cianobacterias. 27
2.3. Duración del dı́a durante 2012 para diferentes latitudes de Sudamérica. 28
2.4. Competencia entre distintas cepas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.5. Efecto de la modulación de la luz en la competencia entre cepas. . . . . 31
2.6. Crossover en la competencia debido a la modulación en la luz. . . . . . 32
3.1. Núcleo supraquiásmatico, reloj maestro en mamı́feros. . . . . . . . . . . 37

3.2. Bioluminiscencia en rodajas del núcleo supraquiasmático de ratón. . . . 40
3.3. Bioluminiscencia de PER2::LUC para uno de los canales ajustados. . . 41
3.4. Señal de bioluminiscencia de PER2::LUC para un canal sin oscilaciones. 42
3.5. Señal de bioluminiscencia de PER2::LUC para un canal no ajustado. . 42
3.6. Perı́odos de cada oscilador ajustado antes y después del cambio de medio. 43
3.7. Instantáneas de la evolución temporal de las fases de 100 osciladores. . 46
3.8. Frecuencias efectivas Ω en función de las frecuencias naturales ω. . . . . 47
3.9. Parámetro de orden σ en función de la intensidad de acoplamiento k . . 48
3.10. Esquema del modelo teórico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.11. Sincronización de fase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.12. Parámetro de orden S como función del acoplamiento entre grupos. . . 53
ix
x Índice de figuras
3.13. S vs k para distintos σ2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.14. S vs k para distintos k2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.15. Ω vs ω . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.16. Evolución temporal de la fase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.17. Evolución de la fase de 10 osciladores en el cluster principal. . . . . . . 58
3.18. S vs k para distintos retardos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.19. Diagramas k1 -k2 para distintos retardos. . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.1. Estadios del ciclo vital de Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

4.2. Dimorfismo sexual en Drosophila. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.3. Actogramas de los primeros mutantes reloj de Drosophila . . . . . . . . 65
4.4. El reloj molecular central en Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.5. Ciclo adicional del reloj molecular de Drosophila. . . . . . . . . . . . . 68
4.6. Red neuronal circadiana en la mosca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.7. Pistas rectangulares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.8. Pistas circulares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.9. Máscaras del Pysolo-Video. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.10. Trayectorias de ocho moscas en las pistas rectangulares. . . . . . . . . . 74
4.11. Representación esquemática del sistema GAL4/UAS. . . . . . . . . . . 76
4.12. Actogramas para una mosca CS y per nula. . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.13. Ejemplo de un objeto fractal: el Triángulo de Sierpinski. . . . . . . . . 79
4.14. Ejemplo del análisis de las fluctuaciones en el movimiento de una mosca CS. 80
4.15. Histogramas de las fluctuaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.16. Discretización de la señal de distancias recorridas por segundo. . . . . . 82
4.17. Distribución de la tasa de eventos de quietud y movimiento. . . . . . . 83
4.18. Ajuste de la distribución de intervalos de actividad para una mosca CS. 84
4.19. Intervalos de actividad y sueño para una mosca CS de dı́a y noche. . . 85
0
4.20. Intervalos de actividad y sueño para una mosca per de dı́a y noche. . . 85
4.21. Los intervalos de actividad colapsan para los ratones. . . . . . . . . . . 86
4.22. Los intervalos de actividad colapsan también para las moscas. . . . . . 87
4.23. Intervalos de actividad para las moscas CS en el caso de DD. . . . . . . 88
4.24. Cálculo de tiempos intereventos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.25. Distribución de tiempos de quietud e intereventos para las moscas CS. . 89
4.26. Distribución de tiempos de quietud e intereventos para las moscas per nulas. 90
4.27. Distribución de la tasa de eventos para una mosca CS. . . . . . . . . . 91
4.28. Colapso de la distribución de R para una mosca CS. . . . . . . . . . . . 91
4.29. Colapso de la distribución de R para todas las moscas CS en LD. . . . 92
0
4.30. Distribución de la tasa de eventos para una mosca per . . . . . . . . . . 93
4.31. Factor de Allan y Fano para moscas CS y per 01 . . . . . . . . . . . . . . 94
Índice de figuras xi
4.32. Setup del experimento de oviposición. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

4.33. Comportamiento de oviposición para una mosca en 6 dı́as en LD. . . . 98
4.34. El reloj molecular controla la oviposición. . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
4.35. La disminución de per en el cerebro genera arritmicidad. . . . . . . . . 100
4.36. Las neuronas LNv no controlan la ritmicidad en la puesta de huevos. . 102
4.37. Ovipositor automático. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
A.1. Esquema del d-Tracker. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

A.2. Vista exterior del d-Tracker. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
A.3. Vista del interior del d-Tracker. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
A.4. Incubadora para realizar los experimentos de registro de actividad locomotora.111
Índice de tablas
1.1. Los ritmos biológicos tienen distintos perı́odos. . . . . . . . . . . . . . . 4
4.1. Algunos de los principales mutantes de Drosophila. . . . . . . . . . . . 66

4.2. Ajustes de de los tiempos de quietud y actividad para las moscas CS. . 84
4.3. Los mutantes nulos de per y tim no tienen ritmos de oviposición . . . . 98
4.4. Importancia de per en el cerebro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
4.5. Se detectan ritmos de oviposición en las moscas pdf G4 > per RN Ai . . . . 101
xiii
Resumen
Todos los seres vivos, desde las bacterias a los humanos, tienen la capacidad de sin-
cronizarse y anticiparse a los cambios periódicos impuestos por el ambiente, lo cual les
otorga una ventaja evolutiva. Los ritmos circadianos, que son los ritmos cuyo perı́odo
es cercano a la duración de un dı́a, son generados por relojes a nivel molecular, que
se sincronizan con el ambiente y se organizan para dar como resultado un comporta-
miento con ese perı́odo. En esta tesis estudiamos tres de los organismos modelos más
estudiados en cronobiologı́a: las cianobacterias, los ratones y la mosca de la fruta.
En cianobacterias analizamos el efecto de la modulación de la luz en la compe-
tencia entre cepas mutantes para el reloj. Utilizando un modelo teórico, se estudió el
valor adaptativo del reloj. Propusimos un experimento sencillo para comprobar las
predicciones del modelo.
Para estudiar el reloj de mamı́feros también se utilizó un modelo matemático. Es-
tudiamos la sincronización entre dos grupos de osciladores acoplados basados en la
evidencia experimental de la existencia de dos grupos en el núcleo supraquiasmático,
que es el reloj central de los mamı́feros. Encontramos que en algunos casos el compor-
tamiento global del sistema no es intuitivo y por ejemplo incrementar el acoplamiento
entre ambos grupos puede ir en contra de una mayor sincronización global.
Por último, trabajamos en colaboración con la Dra Lorena Franco en la creación
de su laboratorio de Drosophila melanogaster. Desarrollamos un dispositivo para hacer
registro de la actividad locomotora de las moscas y realizamos experimentos con moscas
wild-type y moscas mutantes en el reloj. Encontramos que las propiedades estadı́sticas
de la actividad de la mosca son similares a las del ratón en el caso de las moscas
wild-type. En el caso de las mutantes se evidencia en los patrones de movimiento
que su reloj no funciona correctamente. Además, nos interesamos en un output menos
estudiado, que es el comportamiento de oviposición. En primer lugar comprobamos que
este ritmo también es circadiano. En búsqueda de cuál es la jerarquı́a de los relojes que
controlan este ritmo, realizamos experimentos con distintos mutantes. Encontramos
que las moscas con el reloj alterado en todos sus tejidos no presentan ritmicidad en la
puesta de huevos y que las neuronas reloj son necesarias para mantener el ritmo.
Palabras clave: CICLOS CIRCADIANOS, SINCRONIZACIÓN, REDES COMPLE-
JAS
xv
Abstract
All living organisms, including animals, plants and many tiny bacteria, have the ability
to synchronize and predict periodical environmental changes, which put organisms at
a selective advantage in evolutionary terms. Circadian rhythms are those behavioral
and physiological changes that follow a roughly 24-hour cycle, responding primarily
to light and darkness. These rhythms are driven by a molecular clock. In this thesis,
we will study circadian rhythms in three important model organisms: cyanobacteria,
mice, and the fruit fly.
We analyzed the effect of having a modulation in the amount of light when two
different strains of cyanobacteria grow in competition. Using a theoretical model, we
studied the adaptative value of the clock. We have proposed a simple experiment, in
order to verify our results.
We also used a mathematical model to study the mammalian clock. In mammals,
the pacemaker neurons are located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the brain,
which can be divided between a ventrolateral core and a dorsomedial shell region.
We studied the synchronization properties of a system formed by two groups of fully
coupled phase oscillators. Even for such a simple system, we show that counterintuitive
behaviors can take place. In particular, we show that in some cases increasing the
coupling between the oscillators can hinder global synchronization.
Finally, we have worked in collaboration with Dr. Lorena Franco, who is starting
her Drosophila’s lab. We developed a tracking system to monitor the fly’s locomotor
activity, and performed experiments with wild-type and mutant flies. We found that
several statistical properties of the locomotor activity are similar in mice and flies,
and showed that the activity patterns in mutant flies are different from wild-type flies.
We have also analyzed a poorly studied circadian rhythm, the egg-laying behavior. In
the first place, we studied the molecular clock participation on egg-laying behavior by
analyzing oviposition in control flies. Then we studied if oviposition is regulated by
central or peripheral clocks and found that the central molecular clock is necessary for
rhythmic oviposition.
Keywords: CIRCADIAN RHYTHMS, SYNCHRONIZATION, COMPLEX NET-

WORKS
xvii
Capı́tulo 1
Introducción
En toda la naturaleza existen comportamientos periódicos que son el resultado de

la interacción entre distintos subsistemas. Los ritmos circadianos, es decir, los procesos
que siguen el perı́odo de un dı́a impuesto por la rotación terrestre, son un ejemplo de
ello. Esta tesis abordará el estudio de los ciclos circadianos tanto desde lo teórico como
desde lo experimental, haciendo uso de las herramientas de la fı́sica estadı́stica.
La organización de la tesis refleja la evolución cronológica del trabajo. Si bien no es

la evolución en complejidad de los organismos elegidos, si la es en cuanto a la variedad
de herramientas utilizadas y aprendidas. En este capı́tulo, explicaremos los conceptos
básicos necesarios para comprender los capı́tulos siguientes. En la segunda parte, que
consta de los capı́tulos 2 y 3, utilizamos modelos matemáticos sencillos y simulaciones
computacionales para estudiar distintos aspectos relacionados con los ritmos circadia-
nos. En el capı́tulo 2 estudiaremos el efecto de la variación en la duración del ciclo
de luz y oscuridad en la competencia entre distintas cepas reloj de cianobacterias. En
el capı́tulo 3 presentaremos un modelo sencillo para estudiar la sincronización entre
dos grupos de osciladores, semejantes a los grupos de osciladores que forman el reloj
en mamı́feros. También se comentarán los resultados obtenidos del análisis de datos
experimentales de ratón durante una visita al laboratorio del Dr Hanspeter Herzel en
el Instituto de Biologı́a Teórica. Por último, en el capı́tulo 4 contaremos sobre el tra-
bajo en colaboración con la Dra Lorena Franco en la formación de su laboratorio de
Drosophila. Este capı́tulo se divide en el estudio de dos ritmos circadianos diferentes, la
actividad locomotora y la oviposición. Para realizar los experimentos de actividad lo-
comotora se construyó un dispositivo de monitoreo y se analizaron los datos obtenidos,
comparándolos con otros organismos modelo. También describiremos los experimentos
realizados con las moscas midiendo la puesta de huevos de hembras en forma individual
junto a los resultados obtenidos.
1
2 Introducción
1.1. Ritmos biológicos

A la Tierra le toma 365 y 1/4 dı́as completar una revolución alrededor del Sol, y a
ese tiempo le llamamos año. En el primer dı́a del invierno, entre el 20 y el 23 de junio
en nuestro hemisferio, el Sol se encuentra a la mayor distancia angular negativa del
ecuador celeste. Esto implica que en los siguientes meses las noches se irán acortando y
los dı́as serán más largos, dando lentamente la bienvenida a la primavera. Durante miles
de años las distintas culturas que habitaron el planeta, desde los griegos en occidente
a los chinos en oriente, celebraron este dı́a, dándose cuenta de la periodicidad del ciclo
de luz-oscuridad, de las estaciones y de las mareas.
Dentro del hemisferio sur, los pueblos originarios quechua, aymara y mapuche, que
tienen una economı́a agraria, celebran el año nuevo indicado por el solsticio de invierno
como una época de renovación y purificación. Este fenómeno marca la finalización del
perı́odo de cosecha y el principio de una nueva época de siembra. Para los incas, el Inti
Raymi (o fiesta del sol) es la celebración mediante ritos y sacrificios de un perı́odo en
el cual la tierra descansa y se prepara para una nueva siembra.
Los sacrificios debı́an hacerse para no tener que alimentar a los animales durante
el invierno, lo que daba la oportunidad de comer carne fresca. Las bebidas estaban
fermentadas y todo se conjugaba para dar por finalizada la noche más larga y celebrar el
poder de la luz y la vida sobre la oscuridad y la muerte. De esta forma y hasta nuestros
dı́as ha llegado una organización del tiempo festivo por causas que fueron claras y
evidentes en su origen. Gracias a la predictividad y regularidad de los ciclos solares y
lunares se estructuraron las actividades rituales. En otras palabras, nuestros ancestros
notaron la ritmicidad de su entorno, y tomaron ventaja de ello para su evolución como
sociedad.
La interacción de la Tierra con el Sol y la Luna da lugar a variaciones ambientales
periódicas como las horas diarias de luz y oscuridad, las estaciones o las mareas. La
influencia predecible del medio ambiente sobre todos los seres vivos les dio la posibilidad
de adaptarse para responder con variaciones comportamentales y fisiológicas que se
ajustan a la frecuencia de los ciclos externos. Aquellos que adquirieron la capacidad de
anticiparse y sincronizarse con el medio obtuvieron una ventaja evolutiva, y con ella,
el éxito y supervivencia.
A los fenómenos biológicos que ocurren en intervalos regulares de tiempo se los
denomina ritmos biológicos [1]. La disciplina que estudia estos ritmos en las funciones
corporales es la cronobiologı́a (de chronos, tiempo en griego), y vale destacar que nada
tienen que ver con los biorritmos propuestos por el médico austriaco Wilhelm Fleiss,
en los que se intenta predecir la vida de un individuo basándose en cuando nació. Los
biorritmos son una pseudociencia basada en la numerologı́a, que carece de pruebas
cientı́ficas sólidas.
1.1 Ritmos biológicos 3
Las funciones rı́tmicas están bien definidas matemáticamente, y expresan la re-

petición de una variable cada determinado intervalo de tiempo. Ası́, podemos dejar
definidos los conceptos que caracterizan el ritmo: amplitud (A), perı́odo (τ ) y fase (φ).
La amplitud es la mitad de la distancia entre el valor más alto y más bajo del ciclo.
El perı́odo es el tiempo que tarda la función en completar un ciclo, y su inversa, la
frecuencia, es el número de veces que se repite un evento en una unidad de tiempo. La
fase es un punto especı́fico en el ciclo, es decir, nos dice en que momento de la escala
temporal está ubicado el ritmo. En general, la fase está referida a otra función periódica
que puede ser externa (hora del dı́a, etc.) o bien interna (otro ritmo biológico). Para
caracterizar la fase se utiliza el momento en el que ocurre el pico máximo de la variable
rı́tmica, tiempo denominado “acrofase” (Figura 1.1).
Figura 1.1: Caracterización de una función periódica. El perı́odo, la amplitud y la fase

son los tres componentes que caracterizan a una onda. También se marca la acrofase en la figura,
que corresponde a la fase en el máximo de la función.
Los ritmos biológicos se clasifican según su perı́odo. El ciclo de luz-oscuridad es pro-

bablemente uno de los de mayor influencia en la evolución, ya que dividió a las especies
entre aquellas de actividad diurna o nocturna, generando diferencias temporales en los
comportamientos de las especies que permiten la coexistencia en el mismo hábitat. Los
ritmos que se repiten con un perı́odo cercano a un dı́a se los llama circadianos. Pero
también los hay con perı́odo menor a un dı́a (ritmos ultradianos), como la respiración,
y con perı́odo mayor (ritmos infradianos), como la migración e hibernación, asociados
a las estaciones (Tabla 1.1).
4 Introducción
Tipo de ritmo Perı́odo Ejemplo
Ultradianos 0.1 s Electroencefalograma
1s Ritmo cardı́aco
6s Respiración
Circadiano 24 h Sueño-Vigilia
Temperatura corporal
Circamensual 28 d Ciclo ovulatorio
Circanual 365 d Hibernación
Migración
Tabla 1.1: Los ritmos biológicos tienen distintos perı́odos. Se presentan algunos ejemplos
de ritmos con perı́odos que van desde las décimas de segundo al año.
1.1.1. Relojes endógenos

Si bien las primeras observaciones registradas de ciclos circadianos datan de 500
A.C., la primera evidencia de que los ritmos circadianos son generados por un sistema
endógeno fue presentada en 1729 por el astrónomo fránces Jean-Jacques de Mairan,
quien estudió el movimiento de las hojas de la planta Mimosa pudica [2]. El observó que
la planta extendı́a sus hojas durante el dı́a y las retraı́a durante la noche. Para deter-
minar si este movimiento era una mera respuesta a la luz solar, en el primer experi-
mento cronobiológico conocido, metió una planta en un armario, aislándola del ciclo
de luz-oscuridad. De esta forma comprobó que los movimientos rı́tmicos de las hojas
continuaban realizando un ciclo cercano a 24 horas, sugiriendo un mecanismo endógeno
que controla el movimiento de las hojas aún en ausencia de estı́mulos externos. La con-
clusión de de Mairan fue que existı́a un “reloj interior” que regulaba la conducta de la
planta.
Una amplia evidencia experimental del origen endógeno de los ritmos fue exten-
diéndose más allá de los primeros estudios en plantas hacia una gran variedad de es-
pecies como bacterias [3], insectos [4], pájaros [5], roedores [6], primates [7] y humanos
1.2 Ritmos circadianos: algunas definiciones. 5
[8]. Para comprobar que el ritmo es endógeno, siguiendo la metodologı́a implementada

por de Mairan, se realizan experimentos donde se aı́sla a la especie estudiada y se la
coloca en condiciones ambientales constantes para ver si persiste el ritmo. Al perı́odo
del ritmo en ausencia de señales ambientales para sincronizarse, se lo conoce como
free-running, y puede ser un poco mayor o menor a 24 horas dependiendo la especie.
1.2. Ritmos circadianos: algunas definiciones.

Los ritmos circadianos se definen como aquellos cuyo perı́odo free-running está entre
20 y 28 horas. El término circadiano fue utilizado por primera vez por el cronobiólogo
Franz Halberg en los ’60, y viene del latı́n circa, “alrededor” y diem “dı́a”. Las propie-
dades que deben poseer los relojes circadianos fueron resumidas por Colin Pittendrigh
[9]:
Son endógenos y tienen oscilaciones auto-sostenidas, ya que al aislarlos del medio

ambiente se mantienen con un perı́odo cercano a 24 horas.
Se sincronizan con los cambios cı́clicos del ambiente, como el ciclo de luz-oscuridad.
A la clave exógena que sincroniza al ciclo con el ambiente se la conoce como zeit-
geber, en alemán “dador de tiempo”. El zeitgeber más efectivo es la luz, pero
también funcionan otros como la temperatura, las interacciones sociales o la dis-
ponibilidad de alimento.
Presentan compensación térmica, es decir, el perı́odo es estable ante cambios de

temperatura dentro del rango fisiológico.
De manera conceptual, al sistema o reloj circadiano lo podemos pensar como la

conjunción de tres elementos: un sincronizador exógeno o zeitgeber, un oscilador central
o pacemaker y una eferencia del reloj o output. En un ejemplo clásico, la luz sincroniza al
reloj central para dar como resultado el ciclo de sueño-vigilia. Los procesos de conexión
que tienen estos tres componentes son la sincronización que induce el zeitgeber entre
el medio ambiente y el oscilador central, quien a su vez está acoplado con los ritmos
que controla.
6 Introducción
Figura 1.2: Componentes del sistema circadiano y sus vı́as de interacción. El zeitgeber
sincroniza al oscilador central del organismo, quien acopla a todos los osciladores y dan como
resultado distintos outputs con perı́odo cercano a 24 horas. Figura modificada de [10], pág. 1164.
La información temporal brindada por el oscilador central a las eferencias regula la

generación de procesos metabólicos y comportamentales. Además, en algunos relojes
circadianos más complejos, aparecen otros mecanismos de regulación del sistema como
la retroalimentación de los efectores al oscilador central y el enmascaramiento, que es
la influencia del sincronizador directamente sobre los efectores del ritmo [1].
1.3. Organismos modelo.

En nuestro planeta habitan infinidad de especies diferentes en formas y complejidad,
pero muchas comparten los mismos principios generales en sus procesos biológicos. Es
por esto que las investigaciones de varias disciplinas, como la genética, la evolución y
el desarrollo, han centrado sus esfuerzos en unos pocos animales elegidos debido a que
gracias a su tamaño y su rápida reproducción facilitan su manipulación experimental
[11]. Los organismos modelo pueden ser encontrados entre los distintos reinos, desde
procariotas a plantas y animales. Ası́, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster
y el ratón Mus musculus son ejemplos de organismos sometidos a un profundo estu-
dio, para los cuales se han desarrollado distintas técnicas genéticas que permiten su
manipulación.
Uno de los aspectos más interesantes del uso de organismos modelo es que el cono-
cimiento de un proceso en un organismo puede ayudar a comprender un proceso similar
en otro organismo más complejo. Un caso paradigmático es la identificación de genes
en Drosophila que llevaron al descubrimiento de genes homólogos en mamı́feros. Por
ejemplo, las personas que sufren de sı́ndrome de la fase de sueño avanzada (FASPS,
1.3 Organismos modelo. 7
por sus siglas en inglés) tienen un avance en la fase de su ciclo de sueño-vigilia y un

perı́odo endógeno más corto que el normal. Este sı́ndrome se descubrió luego de hallar
genes en la mosca relacionados a los ciclos circadianos, que causaban este mismo efecto
[12].
1.3.1. Organismos modelo en cronobiologı́a.
Como ya mencionamos, los ritmos circadianos pueden ser encontrados en casi todos
los organismos que se enfrentan diariamente a los cambios ambientales. Para compren-
der los mecanismos subyacentes al reloj circadiano y su importancia adaptativa, se lo
ha estudiado en bacterias, hongos, plantas y animales. En los párrafos siguientes ha-
remos un resumen del reloj de un organismo representativo de cada reino, yendo de
menor a mayor complejidad.
Las cianobacterias son los microorganismos que crearon la atmósfera de oxı́geno del
planeta y posibilitaron la vida tal y como la entendemos actualmente. Los primeros rit-
mos encontrados en cepas de cianobacterias fueron oscilaciones durante la fotosı́ntesis
y la fijación de nitrógeno, aunque inicialmente no estaban asociados al reloj circadiano
[13]. No fue hasta 1986 que Huang et al [14, 15] demostraron que la fijación de nitrógeno
en Synechococcus sp. RF-1 satisface las tres propiedades de los ritmos circadianos: per-
sistencia ante condiciones ambientales constantes, reseteo de la fase y compensación
térmica. Este es el único organismo procariota del que se conoce un reloj circadiano
completo. Una de las cepas de cianobacteria más utilizadas como organismo modelo es
Synechococcus elongatus, cuya manipulación es simple. El desarrollo de varias herra-
mientas genéticas para esta cepa ha permitido el estudio de los relojes circadianos en
procariotas. Aunque el reloj de las cianobacterias es más simple que otros conocidos,
aún quedan muchos elementos por descubrir para comprender sus mecanismos [13].
Neurospora crassa, el moho rojo del pan, fue uno de los primeros microbios euca-
riotas en ser adoptado como modelo. Su rápido crecimiento, su sencillo mantenimiento
en el laboratorio y la secuenciación de su genoma completo [16] lo convirtieron en un
organismo modelo. En cronobiologı́a, su utilidad se debe al sencillo registro de su out-
put circadiano: durante su desarrollo asexual produce esporas conocidas como conidias
con intervalos cercanos a las 24 horas. Estos ritmos fueron reportados por primera vez
en 1959 por Colin Pittendrigh [17]. En condiciones ambientales constantes tiene un
perı́odo de ≈ 22,5 horas, aunque puede ser entrenado a un ciclo de 24 horas y presenta
compensación térmica. El hallazgo del alelo band, que permite una clara visualización
de la formación de esporas (Figura 1.3), se convirtió en una herramienta clave para el
estudio de ritmos circadianos en Neurospora [18].
8 Introducción
Figura 1.3: Crecimiento de Neurospora crassa. Plato de Petri con Neurospora inoculada
en el centro con agar como medio de crecimiento. Las bandas correspondientes al crecimiento
de esporas de cada dı́a pueden observarse en amarillo, separadas por delgadas lı́neas oscuras.
Imagen tomada de http://lakinthomas.lab.yorku.ca
Desde las primeras observaciones de de Mairan, se sabe que el movimiento de las

hojas de la planta Mimosa está controlado por el reloj biológico. Actualmente, el or-
ganismo modelo en biologı́a vegetal es la planta Arabidopsis thaliana, donde se han
encontrado diversos procesos regulados por el reloj circadiano, desde la apertura de
estomas y movimiento de hojas hasta la expresión génica y fosforilación de proteı́nas
[19]. Aunque ya se han identificado más de 25 genes asociados al funcionamiento del
reloj de Arabidopsis, las funciones de muchos de estos genes aún son desconocidas [20].
Hace ya 100 años que Thomas Hunt Morgan convirtió a Drosophila melanogaster
(Drosophila, amante del rocı́o, melanogaster, de vientre negro) en el principal organismo
modelo de la genética clásica al elegirla como modelo para sus experimentos sobre
herencia. En 1910 descubrió al primer mutante, white eye, que es una mosca que a
diferencia de las wild-type, que tienen los ojos rojos, los tiene blancos, como su nombre
lo indica. Este trabajo le valió el premio Nobel. Morgan eligió a Drosophila por su
corto ciclo vital, su alta fecundidad y su sencilla manipulación. Drosophila presenta
muchos ritmos circadianos fácilmente medibles en el laboratorio. Aunque inicialmente
se midió el ritmo en la eclosión, actualmente el más utilizado es la actividad locomotora
(Figura 1.4), que persiste ante condiciones constantes por varias semanas. La mosca
presenta dos picos de actividad, uno al amanecer y otro al atardecer, con una siesta
en el medio. Se observa que la mosca tiene la capacidad de anticipar los cambios en el
ciclo externo, por lo que comienza a tener actividad antes de que se produzca el cambio
de iluminación. Además, al prenderse o apagarse la luz, incrementa su actividad como
respuesta al cambio.
1.3 Organismos modelo. 9
Figura 1.4: Actividad locomotora en Drosophila melanogaster . A la izquierda se grafica

la actividad de una mosca durante cuatro dı́as en un double-plot, es decir, cada dı́a se repite al
final de una fila y al principio de la siguiente. A la derecha se puede observar una ampliación
del dı́a 1, lo que permite ver marcado con flechas la anticipación al cambio en la iluminación.
Las barras blancas y negras representan los perı́odos de luz y oscuridad respectivamente. ZT es
el tiempo impuesto en el sistema por la variable rı́tmica ambiental. Por convención, cuando el
Zeitgeber es la luz por ejemplo, ZT0=‘luces prendidas’ y ZT12=‘luces apagadas’ en un ciclo de
12 horas de luz y 12 de oscuridad. Figura modificada de [21].
Otro factor que convirtió a Drosophila en un organismo modelo muy importante de

los ritmos circadianos es la homologı́a que se encontró entre invertebrados y mamı́feros
en su control. El estudio a nivel circadiano de las moscas es un excelente ejemplo de
cómo los organismos modelo pueden facilitar el estudio de mecanismos moleculares
que dan lugar a comportamientos complejos, como los ritmos de sueño/vigilia en hu-
manos [22]. Además, su red neuronal es simple. Se conocen alrededor de 150 neuronas
reloj en el cerebro de la mosca de un total de alrededor de 250.000 neuronas, lo cual
permite identificar la función de distintos subgrupos de neuronas [23]. Actualmente se
está haciendo un gran esfuerzo e invirtiendo muchos recursos para obtener el conecto-
ma de Drosophila, es decir, el mapa de las conexiones entre las neuronas del cerebro.
Laboratorios como Janelia ya han conseguido tener partes completas del conectoma
descifradas, particularmente las del sistema visual [24].
Por último, uno de los organismos modelo más importantes para estudiar el reloj
es el ratón (Mus musculus), debido a las similaridades de su reloj con el del humano.
Sin embargo, en la historia de la cronobiologı́a, el primer roedor en tener un lugar
importante fue el hámster Mesocricetus auratus. En 1985 Michael Ralph identificó un
hámster que al pasarlo a oscuridad constante (DD, del alemán Dauer-Dunkel, que
significa permanentemente oscuro) exhibı́a un perı́odo endógeno de 22 horas, el más
corto reportado en esta especie. Esta mutación espontánea, denominada tau, resultó ser
tal que su fenotipo es heredable [25]. A partir del hámster tau se encontró que el reloj
maestro de los mamı́feros se encuentra en el núcleo supraquiasmático (NSQ). Al lesionar
esta zona del hipotálamo, los animales se volvı́an arrı́tmicos. Pero aún más interesante,
10 Introducción
si se le transplantaba un NSQ intacto, la ritmicidad era recuperada y se manifestaba el

fenotipo del donante [26]. Desde el punto de vista de la genética habrı́a sido interesante
que esta mutación casual se hubiera dado en el ratón y no en el hámster, ya que en ese
entonces habı́a muchas más herramientas genéticas desarrolladas [27].
El primer gen reloj identificado en ratones fue Clock, descubierto a través de un

ensayo de búsqueda por mutagénesis [28]. Las ventajas de Mus musculus por sobre el
hámster son el genoma completamente secuenciado y la posibilidad de poder realizar
genética reversa, caracterı́sticas que hacen del ratón no sólo un organismo modelo en
cronobiologı́a, sino también en otras áreas de investigación.
En esta tesis estudiaremos con distinto grado de detalle los relojes de tres de los
organimos descriptos: cianobacteria, ratones y Drosophila. Abordamos el estudio de los
ritmos circadianos con diferentes niveles de complejidad, analizando desde las ventajas
que otorga el reloj a nivel poblacional en el caso de las cianobacterias a considerar los
mecanismos moleculares en Drosophila.
1.4. El reloj molecular
Los ritmos circadianos están determinados genéticamente por un conjunto de genes

denominados “genes reloj”. Los genes reloj codifican proteı́nas que tienen expresión
cı́clica y son necesarias para la generación y mantenimiento de los ritmos. Los experi-
mentos de Konopka y Benzer en 1968 mostraron por primera vez que el comportamiento
rı́tmico podrı́a tener una base genética [29]. Konopka logro aislar tres alelos de un único
gen (denominado period o per ) de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster que
aceleraba, frenaba o paraba al reloj circadiano.
La base molecular de los relojes tiene elementos comunes en todos las especies
estudiadas hasta el momento [30]. El mecanismo molecular básico del reloj consiste
en un ciclo de retroalimentación negativa. Los componentes positivos del ciclo inician
la transcripción de los genes reloj, generando secuencias de ARNm en el núcleo que
son transportadas al citoplasma, dando lugar a la traducción de proteı́nas, que al
acumularse, reprimen su propia sı́ntesis (Figura 1.5).
1.4 El reloj molecular 11
Figura 1.5: Reloj molecular básico. Componentes del reloj basado en un ciclo de retroali-
mentación negativa. La flecha normal indica que se promueve la transcripción, mientras que la
flecha plana indica represión. Ası́, las proteı́nas reloj reprimen su propia sı́ntesis.
De esta forma se genera un ciclo autoregulatorio de oscilaciones a nivel genético

con un perı́odo cercano a las 24 hs [30, 31]. En la Figura 1.6 se muestra un ejemplo
de las oscilaciones en las proteı́nas y en los niveles de sus mARN para algunos genes
reloj de la mosca. Se observa que hay un delay entre los picos de ambos, debido a
procesos postraduccionales, como la fosforilación y la ubiquitinación. La fosforilación
es la unión de proteı́nas con grupos fosfatos, que puede hacer que se impida la inter-
acción de una proteı́na con alguna otra. La ubiquitinación es la unión de proteı́nas
con una molécula de ubiquitina, que es una proteı́na pequeña de 76 aminoácidos. El
proceso de ubiquitinación es esencial en numerosos procesos como el acortamiento y
degradación de proteı́nas. Estos procesos son fundamentales para mantener el perı́odo
de las oscilaciones cercano a 24 horas.
En los próximos párrafos nos vamos a centrar en el reloj molecular simplificado

de los tres organismos modelos relevantes para este trabajo: cianobacterias, la mosca
Drosophila melanogaster y el ratón. Para evitar confusiones usamos la convención en
biologı́a, según la cual los genes se denotan con letras minúsculas (por ejemplo, per ),
los ARNm comienzan con mayúscula (Per) y las proteı́nas y complejos proteicos se
escriben sólo con mayúscula (PER).
12 Introducción
Figura 1.6: Desfasaje entre los niveles de proteı́na y mARN. Expresión de cuatro genes
reloj y de sus respectivas proteı́nas. Se puede observar, en el caso de per y tim, los dos genes reloj
principales de la mosca, que el pico en la expresión de proteı́na, que es por la noche, no coincide
con el de su mARN, que es por la tarde.
Los mecanismos del reloj molecular en mamı́feros y en Drosophila están conserva-

dos. Como ya mencionamos, en ambos el oscilador circadiano involucra la transcripción
y traducción cı́clica de los genes reloj mediante ciclos de retroalimentación negativa [32].
A diferencia de éstos, el mecanismo principal del reloj en cianobacterias consiste en un
oscilador postraslacional (OPT) conectado con un ciclo transcripcional de retroalimen-
tación negativa (CTRN) [33].
Los componentes básicos del reloj en Synechococcus elongatus fueron identificados

como las proteı́nas KaiA, KaiB y KaiC [34]. En ese momento, parecı́a que el mecanismo
era un ciclo transcripcional de retroalimentación negativa. La expresión del complejo
KaiBC es regulada en forma positiva por KaiA y tanto positiva como negativa por KaiC,
dependiendo de su estado de fosforilación. Este ciclo hace que los genes reloj oscilen
en forma circadiana. Pero en 2005 los experimentos de Nakajima et al [35] mostraron
que el estado de fosforilación de KaiC continua ciclando cuando las tres proteı́nas son
mezcladas en un tubo de ensayo con ATP. Este ritmo persiste con perı́odo circadiano
y tiene compensación térmica. In vivo, este oscilador de tres proteı́nas funciona como
un oscilador postraslacional [35, 36]. Finalmente, Kitayama et al sugirieron que ambos
osciladores son necesarios para la coordinación del reloj [37]. En la Figura 1.7 se muestra
el esquema del funcionamiento a nivel molecular del reloj de cianobacterias.
Figura 1.7: Reloj molecular en cianobacteria. A diferencia de otros organismos, un os-

cilador postraslacional es el reloj maestro, quien se acopla con un ciclo de transcripcional de
retroalimentación negativa. El ciclo de fosforilación de kaiC forma el mecanismo principal del
reloj. Figura modificada de [38].
El reloj circadiano en Drosophila melanogaster está formado por dos ciclos trans-
cripcionales de retroalimentación negativa, como se muestra en la Figura 1.8. En el
primer circuito, el dı́mero CLOCK/CYCLE (CLK/CYC) activa la transcripción de los
genes period (per ) y timeless (tim). PER y TIM dimerizan y se trasladan al núcleo
hacia la medianoche, donde se unen a CLK/CYC, inhibiendo su unión al ADN y la ac-
tivación de la transcripción. Aunque el pico máximo en la transcripción de per y tim es
alrededor de ZT16, las respectivas proteı́nas alcanzan su pico 6 horas después [39]. Este
retraso temporal se debe a las fosforilaciones que sufren PER y TIM. PER es fosforila-
do por DOUBLETIME (DBT), mientras que TIM es fosforilado por SHAGGY (SGG).
Los procesos de fosforilación y desfosforilación son fundamentales para mantener el
14 Introducción
fenotipo circadiano [40]. En particular, la fosforilación por parte de SGG está involu-
crada en la estabilización de TIM [41] y en la traslocación al núcleo de PER y TIM
[42].
En un segundo loop, CLK/CYC activa la transcripción de PDP1ǫ (Par Domain
Protein 1ǫ) y VRI (vrille). Sus funciones son opuestas: VRI inhibe la transcripción
de clk, mientras que PDP1ǫ la estimula. Este segundo ciclo se entrelaza con el de
PER/TIM, dando más estabilidad al sistema [40]. La función de este segundo ciclo aún
no es clara, ya que alterar la fase de clk tiene sólo un pequeño efecto en la fase o el
perı́odo del comportamiento [43, 44].
Figura 1.8: Reloj molecular simplificado de Drosophila. PER y TIM reprimen su ex-
presión mediante CLK y CYC, que al dimerizarse activan la transcripción de per y tim. Clk es
regulado en forma negativa por VRI y positiva por PDP1ǫ, quien a su vez es regulado positiva-
mente por CLK–CYC y negativamente por PER–TIM. De esta forma es CLK quien interconecta
los dos ciclos, estabilizando el ciclo circadiano. Figura modificada de [39].
Para sincronizarse con el ciclo ambiental, Drosophila utiliza el fotoreceptor de luz

azul CRYPTOCHROME (CRY) [21]. La luz activa a CRY, que al unirse a TIM co-
mienza su degradación. Durante el principio de la noche, que es cuando comienza la
acumulación de TIM, un pulso de luz lleva a un retardo en esta acumulación, lo cual
explica porque un pulso de luz genera retardos en la fase del ritmo. En cambio, si el
pulso de luz es hacia el final de la noche, se acelera el proceso de degradación de TIM,
lo que induce a un adelantamiento en la fase del ritmo.
Por último, el reloj de los mamı́feros, al igual que el de Drosophila, está formado
por dos ciclos de transcripción con retroalimentación negativa, como se muestra en la
Figura 1.9. Como ya mencionamos, un aspecto saliente es que varios de los genes reloj
de la mosca tienen sus homólogos en mamı́feros, incluidos los humanos. En el caso del
sı́ndrome FASPS, las responsables son mutaciones en los genes per2 y ck1δ, homólogos
de per y dbt respectivamente [12, 45].
Figura 1.9: Reloj molecular simplificado de mamı́feros. CLOCK y BMAL1 promueven la

expresión las proteı́nas period PER1 y PER2 y los criptocromos CRY1 y CRY2. A lo largo del dı́a,
PER y CRY se acumular y dimerizan en el citoplasma, donde son fosforiladas por caseı́nas kinasas.
Luego traslocan al núcleo donde interactuando con el complejo CLOCK/BMAL1 reprimen su
propio activador. Al final del ciclo, PER y CRY se degradan por proteolisis, permitiendo comenzar
un nuevo ciclo. Un ciclo secundario formado por el activador Ror y el inhibidor Rev-ERb controla
la expresión de BMAL1. Figura modificada de [40].
En el primer ciclo de los mamı́feros, los elementos positivos son CLOCK y BMAL1
(del inglés Brain and Muscle ARNT-Like protein), que es el homólogo de CYC. El
heterodı́mero formado por CLOCK y BMAL1 se une a una región del ADN llamada
E-box, que es una secuencia nucleotı́dica de 6 bases (CACGTG) ubicada en la región
regulatoria de los genes relacionados con el reloj circadiano, activando el proceso de
transcripción. Luego, la transcripción de los genes per y cry es promovida. Las proteı́nas
PER1, PER2, CRY1 y CRY2 funcionan como elementos negativos del reloj. PER y
CRY se unen formando heterodı́meros que ingresan al núcleo y regulan negativamente
su propia transcripción inhibiendo al complejo CLOCK-BMAL1. La degradación de
PER y CRY es inducida por la fosforilación por parte de las caseı́nas kinasas CK1δ y
CK1ǫ, con lo que se deja de inhibir a CLOCK-BMAL1 y el ciclo vuelve a comenzar. A
diferencia de Drosophila, las propiedades de CRY como fotoreceptor aún no han sido
demostradas [46].
El segundo mecanismo regula la expresión de Bmal1. El heterodı́mero CLOCK-
BMAL1 ingresa al núcleo y activa la transcripción del gen Rev-erbα y RORα. La
familia de proteı́nas ROR (α, β y δ) activa la expresión de Bmal1, mientras que REV-
ERBα y REV-ERBβ la reprimen.
16 Introducción
1.5. Mediciones en cronobiologı́a

1.5.1. Actogramas
En cronobiologı́a, cuando se registra una variable (serie de tiempo) la representación
más común es un gráfico llamado actograma. En él se representan los dı́as sucesivos en
el eje de las ordenadas (Y) y las horas del dı́a (de 0 a 24) en el eje de las abscisas (X).
El momento de actividad se representa con una barra negra y usualmente se grafica
en double-plot, es decir, con el gráfico duplicado en el eje X, para poder diferenciar
mejor las distintas etapas durante el dı́a, la noche y las transiciones. En condiciones de
luz/oscuridad, el animal está sincronizado y su actividad comienza siempre a la misma
hora y por lo tanto su perı́odo es el del ciclo externo. En condiciones ambientales cons-
tantes, sin embargo, el perı́odo endógeno de los animales puede variar según la especie.
Esto hace que, en ausencia de un ciclo de luz/oscuridad que actúe como sincronizador,
los animales comiencen a estar activos cada dı́a un poco antes o después. En la Figura
1.10 se muestra el actograma de una rata wild-type (cepa silvestre de laboratorio), es
decir sin ninguna alteración o mutación en su reloj. Se observa que al pasar a con-
diciones de oscuridad constante (indicado con la flecha en la figura de la derecha) su
actividad comienza cada dı́a un poco más tarde, ya que su perı́odo endógeno es mayor
a 24 horas. En condiciones constantes, dada la ausencia de señales ambientales, el ani-
mal mantiene sus ritmos según su reloj biológico: podemos ası́ hablar de dı́a subjetivo
(aquel momento en que el animal se comporta como si fuera de dı́a) y noche subjetiva
(cuando el reloj endógeno indica que deberı́a ser de noche).
(a) (b)
Figura 1.10: Actogramas en double-plot. (a) Esquema de un actograma.(b) Actograma

representativo de la actividad locomotora en rueda de una rata wild-type expuesta bajo un
ciclo de luz/oscuridad (LD) y luego en condiciones ambientales de oscuridad constante (DD).
En ausencia de un ciclo sincronizador, la actividad de la rata comienza a desfasarse, ya que su
perı́odo endógeno es un poco mayor a 24 horas.
1.5 Mediciones en cronobiologı́a 17
1.5.2. Curva de respuesta de fase

El efecto del zeitgeber en función del momento del ciclo en el que se aplica fue
observado por primera vez en algas por Pittendrigh [9]. Este fenómeno, representado
por la “curva de respuesta de fase” (CRF), describe la variación de la respuesta de
un organismo ante un estı́mulo sincronizador: dependiendo de cuando sea aplicado, el
estı́mulo puede adelantar la fase, retrasarla o no tener ningún efecto, como se muestra
en el ejemplo de la Figura 1.11. Los pulsos durante el dı́a subjetivo, no tienen efectos
(A). Si el pulso se aplica al final del dı́a subjetivo o al principio de la noche subjetiva, se
produce un retraso en su fase (B y C, respectivamente). Por último, los pulsos aplicados
en la segunda mitad de la noche subjetiva producen adelantos de fase (D y E). Los
adelantos o retardos de fase se representan en unidades de tiempo o en grados.
Figura 1.11: Ejemplo de curva de respuesta de fase para un animal nocturno. La CRF
clásica muestra el efecto de un pulso de luz sobre el cambio de fase en la actividad locomotora
de animales colocados en oscuridad constante. Luego de 4 dı́as en un ciclo LD12:12, la rata
pasa a DD. En el dı́a 0 se aplica un pulso de luz de 15 minutos de duración. Figura tomada de
http://cronos.unq.edu.ar/tutorial.html.
El estudio de las curvas de respuesta de fase en distintas especies ha conducido a

18 Introducción
la formulación de las siguientes leyes:
Las curvas de respuesta de fase están presentes en todas las especies.
Son idénticas en un animal nocturno o diurno, es decir, para especies con el mismo
perı́odo endógeno la CRF es igual sólo que desplazada 12 horas.
Las curvas de respuesta de fase difieren entre individuos o especies en cuanto a

la magnitud del efecto observado en la fase.
Las curvas de respuesta de fase para la luz dependen de la intensidad del estı́mulo
aplicado.
Algunos de los efectos del zeitgeber sobre las curvas de respuesta de fase son
inmediatos (los retardos de fase), mientras que otros sólo se manifiestan al cabo
de unos dı́as (los adelantos de fase).
Es destacable que las curvas de respuesta de fase indican que durante gran parte
del ciclo diario, el estı́mulo luminoso es ineficaz para modificar el perı́odo circadiano.
También es importante que la mayor eficacia del estı́mulo se da en las transiciones de
luz a oscuridad o viceversa [47].
1.5.3. Periodograma
Para confirmar que además de rı́tmico un proceso es circadiano, necesitamos estimar
su perı́odo. Muchos de los métodos asumen que el perı́odo es estacionario, por lo que si
tenemos una serie de datos que sufre alguna perturbación que pueda inducir un cambio
de fase, debemos calcular el perı́odo antes y después de la perturbación. Aquı́ vamos a
presentar dos de los métodos más utilizados en cronobiologı́a para estimar el perı́odo.
Chi-cuadrado: Uno de los métodos más populares para estimar el perı́odo circa-
diano es el periodograma Chi-Cuadrado desarrollado por Sokolove y Bushell [48].
Dada una serie temporal, se calcula para un rango dado de perı́odos (por ejemplo
entre 18 y 32 horas) los valores medios obtenidos al resolver una matriz resultado
de seccionar la serie de datos de acuerdo con el periodo ensayado. El periodo más
significativo es aquel que hace que la variación de las medias sea máxima. Este
tipo de periodograma requiere un muestreo regular de los datos y disponer de
información sobre unos 10 ciclos completos.
Transformada de Fourier: la transformada de Fourier es un método basado en el

ajuste de los datos con funciones coseno y seno que difieren en su perı́odo. El
resultado es un espectro que muestra las frecuencias y amplitudes de los com-
ponentes individuales. La periodicidad dominante es aquella ajustada con mayor
amplitud.
1.6 Objetivos de la tesis 19
1.6. Objetivos de la tesis

El objetivo general de la tesis fue el estudio de los ritmos circadianos en tres orga-
nismos modelo: cianobacterias, ratones y la mosca Drosophila. El objetivo general se
desglosa en los siguientes objetivos especı́ficos:
1. Estudiar mediante un modelo matemático el valor adaptativo del reloj utilizando

cianobacterias como modelo. Analizar el efecto de la modulación de las horas luz
en la competencia entre diferentes cepas reloj.
2. Estudiar el fenómeno de sincronización en el núcleo supraquiasmático, que es

el reloj central en mamı́feros. Analizar el rol de las interacciones entre los dos
grupos de neuronas que conforman este núcleo y estudiar la formación de grupos
sincronizados.
3. Desarrollar un dispositivo de monitoreo de la actividad locomotora de la mosca

Drosophila melanogaster con alta resolución espacial y temporal. Realizar regis-
tros de moscas individuales rı́tmicas y arrı́tmicas y utilizar herramientas de la
fı́sica estadı́stica para estudiar los patrones circadianos obtenidos.
4. Analizar la influencia del reloj circadiano en el comportamiento de oviposición,

cuantificando la puesta de huevos de moscas individuales normales y mutantes.
Capı́tulo 2
Cianobacterias
El valor adaptativo del reloj se demostró por primera vez utilizando cepas de ciano-
bacterias. Se hizo competir una cepa con reloj normal, cuyo perı́odo es cercano a las 24
horas, y una cepa mutante con un perı́odo endógeno diferente bajo ciclos externos de
distinta relación de luz y oscuridad. Se observó que la cepa con mejor fitness, es decir,
con mayor tasa de reproducción, era aquella cuyo perı́odo endógeno era más cercano
al perı́odo del ciclo externo de luz y oscuridad [49]. Sin embargo, estos experimentos
fueron realizados con ciclos fijos, mientras que en la naturaleza la relación entre la can-
tidad de luz y oscuridad cambia de acuerdo a la estación. En este capı́tulo analizaremos
el efecto de la modulación de la luz en la competencia entre cepas de cianobacterias
utilizando un modelo teórico.
2.1. Introducción
Las cianobacterias, también conocidas como algas verdeazuladas, son microorganis-
mos que, aunque desconocidos para muchas personas, ocuparon un rol fundamental en
la historia del desarrollo del planeta. Fueron los primeros organismos en desarrollar la
fotosı́ntesis oxigénica, con lo que inundaron la atmósfera de O2 hace unos 2.500 millo-
nes de años. Antes de eso, la atmósfera tenı́a una quı́mica muy diferente, incompatible
con la vida como hoy la conocemos, por lo que el resto de los organismos tuvo que
adaptarse a la presencia de oxı́geno [50].
Las cianobacterias siguen ocupando hoy un rol importante. Fueron los principales
productores primarios de la biosfera durante al menos 1.500 millones de años, y lo
siguen siendo en los océanos, teniendo un rol relevante en el ciclo de nitrógeno (N)
y carbono (C). Son también un modelo biológico muy importante, ya que en algunos
casos se conoce su genoma completo y son uno de los grupos más simples en los que
se observa multicelularidad. Se utilizan en la industria para optimizar la generación de
biocombustibles y son fuente de suplementos alimenticios, como la Spirulina [50].
Las cianobacterias son organismos procariotas (sin núcleo celular diferenciado) cu-
21
22 Cianobacterias
yas células miden sólo unos micrómetros (µm) de diámetro, pero son más grandes que
la mayorı́a de las otras bacterias. Hay más de mil tipos catalogados, y habitan diver-
sos ambientes, desde lagos congelados a volcanes y desiertos, pero su principal hábitat
son los medios acuáticos. Son organismos fotosintetizadores, y comparten con otras
bacterias la habilidad de usar el N2 atmosférico como fuente de nitrógeno [51].
Comparadas con otros procariotas, las cianobacterias pueden ser células grandes,
complejas y de una gran diversidad. Hay unicelulares, filamentosas, ramificadas, y con
gran variación en el tamaño. Pueden también formar colonias con diferente grado de
complejidad [52].
Son organismos que sólo tienen un ciclo de vida haploide, multiplicandose asexual-
mente por bipartición, produciendo poblaciones de células idénticas. Esto limita la
recombinación genetica en la población. Sin embargo tienen tres alternativas para so-
lucionar esto. Pueden intercambiar material genético a traves del pilus, que conecta
dos células adyacentes, pueden absorber material genético libre o a traves de virus.
Las mutaciones también son comunes. Las colonias de cianobacteria se reproducen por
fragmentación de filamentos, en la que un segmento de la colonia se rompe y se mueve
deslizandose [51].
Las cianobacterias tienen una caracterı́stica que muy pocos procariotas poseen y es
la capacidad de llevar a cabo diferenciación celular. Esta diferenciación, que supone una
expresión génica diferencial, lleva a la generación de células especializadas, como por
ejemplo los heterocistos. Los heterocistos son células distribuidas a lo largo o al final
del filamento, los cuales tienen conexiones intercelulares con las células vegetativas
adyacentes, de tal manera que existe un continuo movimiento de los productos de
la fijación de nitrógeno desde los heterocistos hacia las células vegetativas y de los
productos fotosintéticos desde las células vegetativas hacia los heterocistos.
Todo ello hace de las cianobacterias organismos ideales para el estudio de la fo-
tosı́ntesis, de la asimilación de carbono y nitrógeno, y en particular para estudiar el
reloj circadiano en procariotas.
2.2. Reloj circadiano

Como ya mencionamos, los ritmos circadianos son la adaptación de todos los orga-
nismos al ciclo de luz-oscuridad terrestre de 24 horas. En el caso de las cianobacterias,
son organismos cuya reproducción depende de la intensidad de luz, la temperatura y
la humedad, pero en condiciones favorables la bipartición puede darse cada 4-5 horas.
Debido a esto, durante muchos años los biólogos se negaron a creer que organismos tan
simples como los procariotas pudieran haber evolucionado lo suficiente para tener ciclos
circadianos, ya que su ciclo de vida es inferior a la duración de un dı́a. Sin embargo, las
cianobacterias no sólo tienen ritmos de aproximadamente 24 horas a nivel poblacional,
pasándo la información del tiempo de madres a hijas, sino que además son uno de los
2.3 Ventanja intrı́nseca vs extrı́nseca 23
pocos organismos en los que el valor adaptativo de los ritmos fue comprobado.
En 1985 fue descubierto el primer ritmo circadiano en procariotas: el de fijación de
nitrógeno, el cual es regulado para ser máximo durante la noche [3, 14, 53]. En ese
trabajo se utilizó la cianobacteria Synechococcus RF-1, la cual mostró ritmo sostenido
durante cuatro dı́as, con un free-running que fue decayendo de 26 a 22 horas [14]. Esta
regulación nocturna es significativa evolutivamente porque la nitrogenasa, la enzima
que rompe el nitrógeno atmósferico durante la fijación de nitrógeno, es inhibida por
el oxı́geno, y durante la fotosı́ntesis se produce oxı́geno. De esta manera, el sistema
circadiano separó dos procesos incompatibles: la fotosı́ntesis y la fijación de nitrógeno
[54]. Además, esto transformó a Synechococcus en uno de los modelos más simples para
estudiar las bases moleculares del reloj circadiano.
En 1995, Liu et al [55] fueron capaces de identificar los genes que conforman el
reloj principal en Synechococcus elongatus: kaiABC (kai es ciclo en japonés y ABC son
los tres genes que lo forman). El mecanismo básico está regulado por la fosforilación
de kaiC, como mencionamos en la introducción.
Si cualquiera de los tres genes kai sufre una mutación o es eliminado, el fenotipo
circadiano es afectado, ya sea perdiendo ritmicidad o alterando la duración del free-
running. Además, las células de Synechococcus parecen ser capaces de “recordar” en
qué fase del ciclo circadiano se encontraban, de forma tal de transmitir a las células
hijas esta información durante la división. Ası́, aunque cada célula de Synechococcus
se divida varias veces en un dı́a, la colonia completa mantiene su ritmo circadiano a lo
largo del mismo [34, 56].
2.3. Ventanja intrı́nseca vs extrı́nseca

Una vez descubiertos los ritmos también en organismos simples como las bacterias,
los biólogos comenzaron a preguntarse, dado que la adaptación al ciclo terrestre de 24
horas está presente en todos los organismos, cuál es la ventaja evolutiva que provee.
Esto dió origen a dos hipótesis sobre la función de esta ventaja. La hipótesis de la
ventaja extrı́nseca plantea que el reloj circadiano permite a los organismos anticiparse
a los cambios predecibles, como es el ciclo de luz-oscuridad, para ajustar sus funciones
biológicas como comer o reproducirse a la hora más conveniente de acuerdo a su entorno.
En cambio, la hipótesis de ventaja intrı́nseca sugiere que el reloj circadiano permite una
óptima coordinación temporal de las funciones fisiológicas [57]. En este caso, el reloj
circadiano deberı́a dar ventaja evolutiva tanto en ambientes con condiciones cı́clicas
como en condiciones constantes.
Para poder determinar cual de las dos hipótesis es la correcta, Woelfle junto a sus
colaboradores evaluaron la fitness relativa, es decir, la capacidad que tiene una clase de
organismos con respecto a otras de perpetuarse en la siguiente generación, en el caso de
competencia entre distintas cepas de cianobacteria [49]. En sus experimentos utilizaron
24 Cianobacterias
una cepa de cianobacteria wild-type, cuyo perı́odo free-running es τ = 25 horas y cepas

mutantes en el reloj circadiano, tanto con perı́odos free-running más cortos (τ = 22
horas) como más largos (τ = 30 horas). Estas cepas crecieron en un mismo plato de
Petri, compitiendo por el espacio y los recursos bajo ciclos externos de luz-oscuridad de
distinta periodicidad. Ellos encontraron que la cepa que gana la competencia, es decir,
que tiene mejor fitness relativa, es aquella cuyo perı́odo free-running es más cercano al
perı́odo del ciclo LD. Esta diferencia en la fitness relativa se da aún cuando las tasas de
crecimiento de cada cepa, al reproducirse sin competencia, no son significativamente
diferentes, como puede observarse en el panel (B) de la Figura 2.1. Además, la cepa
arritmı́ca tiene mejor fitness que la wild-type cuando compiten en un ambiente de luz
constante (LL), mientras que la cepa wild-type es vencedora bajo un ciclo LD12:12,
sugiriendo que el ritmo endógeno es sólo una ventaja en ambientes cı́clicos [49]. Esto
se observa en el panel (C) de la figura, donde se grafica la fracción de cada cepa. En
LD, la fracción de cepa mutante tiende a cero, y solo aumenta la fracción de cepa
wild-type, mientras que con ciclos LL no hay diferencias significativas. Este trabajo
dió una de las evidencias más fuertes a favor de la hipótesis de la ventaja en la fitness
que implica tener sincronización entre el perı́odo endógeno y el perı́odo del ciclo dado
por el ambiente.
Figura 2.1: Fenotipos circadianos en cianobacteria. (A) Fenotipos circadianos de la cepa

wild-type y tres mutantes en el gen kaiC. Se observa que la cepa wild-type y el mutante ClabR
tienen oscilaciones con un free-running de 25 h, mientras que los otros dos son arrı́tmicos. (B)
Tasa de crecimiento en cultivos puros en LL y LD12:12 (los colores corresponden a las cepas del
panel (A)). (C) La diferencia en la finess sólo se observa en condiciones periódicas. En ciclos LD,
la fracción de cepa mutante tiende a cero, mientras que en ciclos LL no hay diferencias entre las
cepas en comparación. Figura modificada de [49].
2.4 El modelo 25
Ouyang et al. [58] propusieron dos mecanismos diferentes para explicar las diferen-
cias entre la fitness de las dos cepas compitiendo en la misma cápsula de Petri: puede
ser debido a la competencia por recursos finitos o debido a la secreción de un agente
difusible que sea capaz de inhibir la reproducción de una cepa distinta de cianobacteria.
Roussel et al. [59] propusieron modelos matemáticos para descubrir cuál de estas dos
hipótesis era la más probable. Ellos encontraron que el modelo basado en la inhibición
mutua era consistente con las observaciones experimentales de [58]. En este modelo el
mecanismo de competencia esta dado por la secreción de un inhibidor de crecimiento,
que es producido durante la fase de dı́a subjetivo (sL) de las células.
Siguiendo esta propuesta sobre el mecanismo de competencia, Gonze et al [60]
propusieron un modelo matemático sencillo para simular la competencia entre cepas,
en el cual los parámetros utilizados en sus ecuaciones coinciden con los valores obte-
nidos en el trabajo experimental de Woelfle et al. [49]. Elegimos este modelo sencillo
debido a que los parámetros del mismo fueron ajustados mediante experimentos reali-
zados con Synechococcus elegantus. Por ejemplo, aún se desconoce cuál de los estados
fosforilados de kaiC está involucrado en la activación y cuál en la supresión, debido a
inconsistencias en los reportes. Si bien hay diferentes modelos matemáticos propuestos
para los mecanismos moleculares del reloj en Synechococcus, ninguno de ellos ha sido
verificado experimentalmente [38].
2.4. El modelo
Para el modelado de cada cepa de cianobacteria utilizamos el modelo de Gonze et
al. [60], que está formado por un oscilador sensible a la luz, que representa el oscilador
circadiano celular, acoplado mediante un inhibidor que difunde. Las ecuaciones de
evolución de las células de la población Ni y el nivel del inhibidor I son:
n n
dNi X dI X Vmax I
= ki Ni (1 − Nj ), = Ni (pi − ) (2.1)
dt j=1
dt i=1
K M + I
 
k si t está en L y la colonia i está en sL o si I < Ic p si la colonia i está en sL
ki = pi =
0 en cualquier otro caso, 0 en cualquier otro caso.
(2.2)
En las ecuaciones, Ni representa la concentración de la cepa de cianobacteria i,
ki es la tasa de crecimiento de cada cepa, p representa la tasa de producción del
inhibidor, Vmax es la tasa máxima y KM es la constante de Michaelis que caracteriza
la degradación enzimática del inhibidor. L corresponde a los momentos de luz del ciclo
externo y sL a los momentos del dı́a subjetivo. Los valores de los parámetros utilizados
para reproducir los resultados experimentales son Vmax = 1000, k = 1,8, Ic = 0,01,
26 Cianobacterias
p = 500 y KM = 0,05.
2.4.1. El oscilador circadiano
Al igual que en el trabajo de Gonze et al. utilizamos una versión modificada del
oscilador de Van der Pol para producir oscilaciones sostenidas [60]. A pesar de su
simpleza, este modelo matemático es capaz de describir oscilaciones circadianas.
dx
dt
π
= 24 12 (xc + 0,13( x3 + 43 x3 − 105
256 7
x ) + B(t)),
B(t) (2.3)
dxc
dt
π
= 24 12 (−x( 24
τx
)2 + 3 xc − 0,15B(t)x)
con

5 en fase luminosa (L),
B(t) = (1 − x3 )0,39ρ0,23 , ρ = (2.4)
0 en oscuridad (D).
Estas ecuaciones fenomenológicas producen oscilaciones en la variable circadiana

x con un perı́odo cercano a τx . La variable xc es una variable complementaria y B(t)
representa el acoplamiento entre el ciclo externo de luz-oscuridad, que depende de
la intensidad de luz ρ, y del oscilador celular. De esta forma, B(t) es quien da la
información sobre el momento del dı́a L o D y x(t) quien contiene la información sobre
el tiempo subjetivo, sL o sD.
En la Fig. 2.2 hay un gráfico esquemático del modelo, donde se puede observar como
el crecimiento de cada población está acoplado con el oscilador circadiano. Cada cepa
crece sólo cuando su dı́a subjetivo (fase sL) coincide con la fase luminosa externa (2)
y cuando su noche subjetiva (sD) coincide con L pero sólo si la cantidad de inhibidor
está por debajo del valor crı́tico Ic (1). El inhibidor es secretado en la fase sL y luego
se degrada.
2.4 El modelo 27
Figura 2.2: Esquema del modelo teórico del oscilador circadiano en cianobacterias.
Explicación del funcionamiento del modelo hecha por Gonze et al. [60]. El inhibidor I is producido
en 3, durante la fase sL, y es degradado el resto del dı́a. Cada cepa crece en 1, si su fase sD coincide
con L y I < Ic , y en 2, independientemente del nivel de I.
2.4.2. La modulación de las horas luz

Los experimentos y las simulaciones computacionales descriptas anteriormente fue-
ron realizados utilizando intervalos de luz y oscuridad fijos. Sin embargo, en la natu-
raleza esto no es real. La relación entre la cantidad de horas de luz y oscuridad no es
constante, ya que se modifica en las distintas estaciones. Partiendo de la hipótesis de
que estos cambios estacionales pueden afectar la competencia entre las distintas cepas,
estudiamos los efectos de la modulación en los tiempos de luz-oscuridad.
Desde hace mucho se conoce que las variaciones en la longitud del dı́a generan una
respuesta que se ve reflejada en un cambio fisiológico. En 1920, W. W. Garner y H. A.
Allard estudiaron una variedad de tabaco que no florecı́a durante el verano, sino que
lo hacı́a en otoño, cuando la duración del dı́a era inferior a 14 horas. Basándose en la
respuesta al fotoperı́odo, dividieron las plantas en dos categorı́as: plantas de dı́a corto
para describir al tabaco y otras plantas que florecen a finales de verano y a principios
de otoño, cuando los dı́as son más cortos (como la soja y la violeta) y las plantas de
dı́a largo, que florecen en verano (como el trébol, las petunias y el trigo) [61]. Sin
embargo, luego se descubrió que no es la duración del dı́a lo crı́tico, sino la duración
28 Cianobacterias
de la noche [62].
En los animales la diapausa (estado dinámico de baja actividad en insectos), la
migración o el comportamiento sexual son ejemplos de cambios anuales controlados
por el fotoperı́odo. Al llegar al fotoperı́odo crı́tico, se desencadenan diversos procesos
biológicos que se sincronizan con las estaciones, incluso en lugares cerca del ecuador,
donde los cambios son muy sutiles.
En la Fig. 2.3 mostramos como la longitud del dı́a depende de la latitud [63]. La
figura compara la duración del dı́a para el dı́a 21 de cada mes en tres ciudades: Quito
(Ecuador), que se encuentra cerca del ecuador en la latitud 0◦ 15′ , Jujuy (Argentina),
que está localizada cerca del trópico de Capricornio en la latitud 24◦ 01′ y Ushuaia, la
ciudad más austral cuya latitud es 54◦ 48′ . Podemos observar que durante los equinocios,
las tres ciudades reciben 12 horas de luz.
En nuestro modelo, a pesar de que los cambios en el fotoperı́odo no son constantes
a lo largo del año y depende de las estaciones, decidimos modificar la longitud de la
fase de luz en un monto fijo para simplificar las ecuaciones.
18
16
14
Daylength (h)
12
10
8
Quito, Ecuador
Jujuy, Argentina
6
Ushuaia, Argentina
4
Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec
th
21 Day of Each Month
Figura 2.3: Duración del dı́a durante 2012 para diferentes latitudes de Sudamérica.
Cantidad de horas luz en Quito (lı́nea del Ecuador), Jujuy (Trópico de Capricornio) y Ushuaia.
2.5 Resultados 29
En las simulaciones, realizadas en Mathematica, para modelar las fluctuaciones en

la longitud del dı́a agregamos o quitamos minutos cada dı́a al ciclo externo LD. Por
ejemplo, si agregamos 12 minutos de luz por dı́a a un ciclo LD12:12, luego de cinco
dı́as el ciclo externo de 24 horas tendrá 13 horas de luz y 11 de oscuridad.
2.5. Resultados
Comenzamos la competencia entre cepas con igual fracción de cepa wild-type (τx =
25h) y mutante de perı́odo largo (τx = 30h) y cantidades iguales de luz y oscuridad.
Para reproducir las condiciones del experimento, donde las muestras eran diluidas y
sampleadas cada 8 dı́as [49], nosotros diluimos las cepas después de 8 ciclos de luz-
oscuridad dividiendo por un factor 100 las variables N1 , N2 e I.
En primer lugar analizamos el caso en el que hay fases de coexistencia entre las
dos cepas, como en los experimentos de Woelfle et al [49]. Cuando el perı́odo del
ciclo externo LD es T = 28, corresponde a un valor intermedio entre el perı́odo free-
running de ambas cepas, con lo que pueden coexistir por un tiempo largo. El objetivo
de comenzar con este perı́odo del ciclo externo es ver si la modulación en la luz es capaz
de romper la coexistencia. Efectivamente, cuando comenzamos a modificar el ciclo para
que los dı́as sean más largos y las noches más cortas, la coexistencia se termina, como se
muestra en la Figura 2.4. Esto se debe a que los dı́as más largos benefician al mutante
de perı́odo largo.
30 Cianobacterias
Figura 2.4: Competencia entre distintas cepas. (A) Resultado de la competencia entre la
cepa wild-type (lı́nea continua) y el mutante de perı́odo largo (lı́nea punteada) donde se observa
coexistencia para T = 28 h. (B) La coexistencia se termina luego de ≈ 8 dı́as adicionando 3
minutos de luz por dı́a. Ahora el mutante de perı́odo largo es capaz de ganar la competencia, ya
que el fotoperı́odo es más cercano a su perı́odo free-running.
En la Figura 2.5 podemos observar en el panel izquierdo la fracción de células wild-

type como función del tiempo para un ciclo LD fijo (curva azul rayada) y en el caso
en que agregamos 30 minutos de luz cada dı́a (curva roja continua). En el panel (A),
en el que los ciclos fijos son LD12:12, vemos que el primer dı́a las curvas son similares,
pero a partir del segundo dı́a el mutante de perı́odo largo tiene un FRP más cercano
al perı́odo del ciclo LD, con lo que la fracción de wild-type comienza a decrecer. En
el panel de la derecha mostramos la fracción de células del mutante de perı́odo largo
para el mismo caso.
2.5 Resultados 31
Figura 2.5: Efecto de la modulación de la luz en la competencia entre cepas. Ve-

mos cómo afecta la modulación en la cantidad de luz (30 minutos por dı́a) al resultado de la
competencia entre la cepa 1 (wild-type, τx = 25 h) y la cepa 2 (long-period mutant, τx = 30 h)
llevados a cabo en dos condiciones: (A) LD12:12 y (B) LD15:15. Se muestran la fracción de la
cepa 1 (panel izquierdo) y de la cepa 2 (panel derecho) en función del tiempo; en rojo cuando
hay modulación, es decir, la proporción de L y D cambian cada dı́a, y en azul los ciclos fijos.
Nuestros resultados muestran una nueva forma de testear la competencia experi-

mentalmente. Si bien ambas cepas no podrı́an coexistir en la naturaleza, ya que por
los efectos estacionales una de ellas morirı́a, esto nos permite probar en el laboratorio,
donde simular los cambios en la longitud del dı́a es muy sencillo, si efectivamente es
mediante un inhibidor que una cepa puede ganar la competencia. Probar las predic-
ciones teóricas del modelo serı́a muy simple, ya que no es necesario diluir los cultivos.
Como se muestra en la Figura 2.5, luego de ocho dı́as de competencia entre las dos
cepas, una diferencia de aproximadamente el diez por ciento entre las dos poblaciones
deberı́a ser observado para comprobar los resultados predichos.
Otro resultado interesante puede observarse en la Figura 2.6. En este caso, agre-
gamos 12 minutos de luz cada dı́a. Durante los primeros dı́as, el crecimientos fue el
esperado. La cepa wild-type pudo tener mejor fitness que la cepa mutante, ya que el ci-
clo externo era LD12:12. Sin embargo, luego de ocho dı́as, cuando la fase luminosa tenı́a
32 Cianobacterias
más de 13 horas, un crossover es observado. La cepa mutante comenzó a tener mejor

rendimiento, ya que su perı́odo endógeno se volvió más cercano al del ciclo LD. Esto
también podrı́a ser testeado experimentalmente, aunque en este caso si serı́a necesaria
la dilución de las muestras cada 8 dı́as.
0,8
Mutant
N1/(N1+N2)
0,6
0,4
Wild Type
0,2
0
0 10 20 30
Time (Days)
Figura 2.6: Crossover en la competencia debido a la modulación en la luz. Compe-

tencia entre una cepa mutante de perı́odo largo y una cepa wild-type en un ciclo LD12:12 para
los mismos parámetros que en la Figura 2.5, pero agregando 12 minutos de luz al ciclo por dı́a.
Se observa un crossover luego de 8 dı́as.
2.6. Conclusiones
Es probable que el reloj circadiano proporcione una ventaja adaptativa en todos
los reinos, ya que la resonancia entre el reloj interno y el ciclo de luz-oscuridad externo
asegura una relación de fase óptima entre la fisiologı́a y el medio ambiente en el que
el individuo está inmerso, permitiendo una mayor aptitud. Esto ya se probó en cia-
nobacterias [49], realizando un experimento pionero en el que se puso en competencia
dos cepas con distintos relojes en ciclos externos. Encontraron que la cepa con un re-
loj endógeno con perı́odo más cercano al perı́odo del ciclo externo de luz y oscuridad
tenı́a mejor tasa de reproducción. Este experimento fue el primero en poder mostrar la
importancia adaptativa del reloj, y sentó un protocolo para realizar el mismo experi-
2.6 Conclusiones 33
mento en otras especies. Siguiendo esta idea, recientemente se probó el valor evolutivo
del reloj en plantas [64]. Utilizando la planta Arabidopsis y poniendo en competencia
a dos plantas con distintos relojes, se obtuvo que un perı́odo del ciclo externo diferente
al endógeno reduce el contenido de clorofila de las plantas, reduce el crecimiento y
aumenta la mortalidad.
Sin embargo, los mecanismos subyacentes en la mejora del fitness aún no se conocen.
En el caso de las cianobacterias varios modelos han sido propuestos, todos con evidencia
a favor y en contra [65]. En este trabajo utilizamos un modelo que basa la interacción
entre las cepas en un inhibidor difusible en el medio de cultivo. Nuestro estudio estuvo
motivado por las fluctuaciones en las horas luz del dı́a a lo largo del año, las cuales
suelen verse reflejadas en el comportamiento de los organismos. Nosotros estudiamos
como estas fluctuaciones en la cantidad de luz afectan la competencia entre cepas de
cianobacteria con relojes con perı́odos endógenos diferentes.
Encontramos que la parte estacional no parece ser quien controla la dinámica de la
competencia entre cepas distintas, ya que es demasiado lento el cambio y no permite
la adaptación de los relojes, de forma que la cepa desfavorecida se muere. En con-
traposición, propusimos un protocolo para hacer experimentos sin hacer diluciones, lo
cual implica trasvasar las cianobacterias en diferentes cápsulas de Petri. Haciendo uso
de la modulación de la luz, es posible influenciar las poblaciones de cianobacterias en
perı́odos de tiempo muy cortos. De esta forma, se pueden evaluar los resultados de las
simulaciones computacionales y nuestra predicción en la composición de las dos cepas
luego de sólo ocho dı́as de competencia podrı́a ser verificada. Ası́ se podrı́a estudiar la
influencia del reloj en perı́odos cortos siguiendo un protocolo muy simple.
Capı́tulo 3
Mamı́feros
En este capı́tulo se estudiará un modelo matemático del proceso de sincronización

entre dos grupos de osciladores acoplados basados en la evidencia experimental de
la existencia de dos grupos de neuronas en el reloj de los mamı́feros. Dicho modelo
pretende analizar el comportamiento del sistema frente a distintos acoplamientos a
partir de la fase y la frecuencia.
En primer lugar se hará una introducción al reloj de los mamı́feros, en cuanto a
su composición anatómica y molecular, y se comentará la experiencia en el análisis de
datos del reloj de ratones durante una visita en el laboratorio del Dr Hanspeter Herzel
en el Instituto de Biologı́a Teórica en Berlin, Alemania. Luego se introducirá el modelo
matemático que utilizamos para estudiar las propiedades de sincronización entre ambos
grupos. Por último, mostraremos los resultados que obtuvimos junto a las conclusiones
del capı́tulo.
3.1. Introducción
Los roedores han tenido un fuerte impacto en la vida de los humanos desde los
comienzos de la civilización. Pasaron de ser una plaga culpable de enfermedades a ser
utilizados como mascota doméstica. Actualmente, los roedores, en particular el ratón
Mus musculus, son uno de los principales organismos modelo en biologı́a y medicina
para comprender los procesos de los mamı́feros [66].
Para muchos cientı́ficos durante la década de 1930, los ratones eran la elección
obvia para los experimentos genéticos en mamı́feros, ya que son pequeños, prolı́ficos,
de corto perı́odo gestacional y se adaptan fácilmente a la vida en bioterios, además
de generar menos empatı́a en la población no cientı́fica que gatos o monos [67]. Pero
también resultó que humanos y ratones no sólo compartimos el 99 por ciento de nuestros
genes, sino que también tenemos las mismas enfermedades hereditarias como diabetes,
cáncer, glaucoma, obesidad, anemia, hipertensión, asma y enfermedades neurológicas
[68]. Es por esto, junto a las siguentes técnicas de manipulación genética desarrolladas
35
36 Mamı́feros
en ratones, que el ratón es el principal organismo modelo para estudiar los mamı́feros
[69]:
Creación de ratones transgénicos mediante la inyección de secuencias de ADN en

un embrión.
Creación de ratones con desactivación génica o knock-out, en los cuales un gen es

desactivado por completo, ayudando a hallar la función del gen.
Capacidad de insertar secuencias especı́ficas en lugares determinados del genoma.
3.2. Reloj circadiano en mamı́feros

A mediados del siglo XX, Curt Richter encontró el área aproximada del cerebro
donde se encuentra el reloj circadiano de los mamı́feros. A través de una serie de expe-
rimentos pioneros en los cuales lesionó el cerebro de ratas, descubrió que el comporta-
miento circadiano del animal sólo se veı́a afectado al lesionar un área especifica: la parte
frontal del hipotálamo localizado sobre el quiasma óptico. En 1972, Robert Moore [70]
a través de la vı́a retinohipotalámica llegó hasta los núcleos supraquiasmáticos (NSQ),
y luego de una ablación bilateral halló pérdida de ritmo en la secreción de hormonas
y actividad locomotora y de bebida. Experimentos posteriores en los que se hicieron
transplantes de NSQ normales en ratones mutantes mostraron que la ritmicidad puede
ser recuperada [26, 71] . Experimentos similares en otros mamı́feros confirmaron que
el reloj central se encuentra en el núcleo supraquiasmático.
3.2.1. El reloj maestro

En los organismos pluricelulares, la expresión oscilatoria de cada célula debe ser
sincronizada por una estructura jerárquicamente superior para poder dar lugar a los
ritmos circadianos. Como ya mencionamos, en los mamı́feros se encontró que el núcleo
supraquiasmático constituye el reloj central. El núcleo supraquiasmático contiene apro-
ximadamente 20000 neuronas, cada una de las cuales contiene un oscilador celular
autónomo. Estructuralmente, cada uno de los lóbulos del NSQ puede ser dividido en
dos regiones claramente identificables: la región ventrolateral (VL) o core y la región
dorsomedial (DM) o shell, como se puede observar en la Figura 3.1. El core recibe la in-
formación lumı́nica, principalmente a través del tracto retino-hipotalámico y transmite
esta información al shell, permitiendo la sincronización con el ambiente. Sin embargo,
las propiedades de sincronizacón de cada grupo son diferentes. Las oscilaciones en las
células del core son de baja amplitud, lo que permite la sincronización con el ambiente,
mientras que las oscilaciones en el shell son robustas, dando lugar a oscilaciones aún en
ausencia de información del ambiente. Además, las regiones VL y DM expresan dife-
rentes neurotransmisores para sincronizar sus señales. Las neuronas del core expresan
3.2 Reloj circadiano en mamı́feros 37
principalmente polipeptido intestinal vasoactivo (VIP), mientras que la mayorı́a de las

neuronas de la zona DM expresan arginina vasopresina (AVP).
A pesar de toda esta heterogeneidad, los multiples osciladores son capaces de gene-
rar ritmos coordinados en el NSQ “in vivo” [60]. Sin embargo, a nivel de cada oscilador
celular, hay un amplio rango en los perı́odos circadianos que varı́an de 22 a 30 horas
[72, 73] y en las fases [74, 75]. Es por esto que el acoplamiento entre las diferentes neu-
ronas que forman el NSQ parece ser crı́tico para el correcto y preciso funcionamiento
del oscilador maestro.
(a) (b)
Figura 3.1: Núcleo supraquiásmatico, reloj maestro en mamı́feros. (a) Ubicación en

el cerebro humano del núcleo supraquiásmatico. (b) Fotomicrografı́a de una rebanada de cerebro
donde se observa los neuropéptidos en cada una de las regiones del NSQ. En rojo se marcó el
neuropéptido AVP y en verde el neuropéptido GPR. Figura modificada de [76]
Vı́as de entrada al reloj
El principal zeitgeber que tienen los mamı́feros es la luz, por lo cual los ojos son
necesarios para la sincronización con el ciclo de luz-oscuridad. Para mantener informado
al NSQ sobre qué está pasando en el ambiente, la principal vı́a fisiólogica desde las
células ganglionares de la retina a los NSQ es el tracto retino-hipotálamico (TRH). En
los somas de las células ganglionares se expresa el pigmento melanopsina y el principal
neurotransmisor que utilizan estas neuronas para hacer sinápsis es el glutamato (GLU).
Vı́as de salida
Las vı́as de salida del NSQ transmiten información a otras zonas del cerebro in-
volucradas en la regulación de los patrones de comportamiento, sueño-vigilia y de
temperatura corporal, y a los centros neuroendócrinos. El NSQ traduce la información
del ambiente a través de códigos neurales y humorales, los cuales dan la fase de osci-
lación. Muchas de las eferencias son cortas y terminan en el mismo NSQ o en el área
subparaventricular, llegando a otras zonas hipotalámicas, como el núcleo paraventri-
cular (NPV), que tiene conexión con la glándula pineal. Esta es una de las vı́as más
38 Mamı́feros
estudiadas, ya que controla la secreción de melatonina. Esta hormona está implicada

en la regulación del sueño y en la ritmicidad circadiana y circanual [77].
3.2.2. Los relojes periféricos

En el organismo no hay un sólo reloj, sino un montón de relojes distribuidos en
todos los órganos. El NSQ tiene influencia en otros tejidos u órganos, lo que hizo
pensar que estos tejidos también deberı́an contener células que cuenten con osciladores
circadianos moleculares. Tiempo más tarde fueron encontradas las mismas proteı́nas
reloj expresadas en el NSQ en cultivos celulares de corazón, riñon, hı́gado y páncreas
entre otros [78]. Recientemente se descubrió que el tejido adiposo también tiene células
reloj. La liberación de moléculas por parte de estas células para regular el hambre tiene
un marcado ritmo circadiano [79]. A estos osciladores se los llama “periféricos”, ya que
no están en el cerebro. Estos osciladores no son autónomos, ya que sin el control
del NSQ se desincronizan y pierden amplitud en sus oscilaciones [80]. Mientras que
las oscilaciones de las células del NSQ persisten por un mes en cultivo, la expresion
circadiana de células de tejidos periféricos se pierde en 2 a 7 dı́as [81].
Por otro lado, se ha visto que algunas señales, como cambios en el horario de ali-
mentación, alteran la expresión circadiana de los genes reloj en el hı́gado y otros tejidos
periféricos, pero no afectan su expresión en el NSQ. Esto sugiere que bajo ciertas condi-
ciones, el control del ritmo de los osciladores periféricos se puede desacoplar del control
del NSQ, para adaptarse a condiciones particulares sin afectar al reloj central. Esto a su
vez permitirı́a optimizar la fisiologı́a celular, de tal forma que se restrinja la expresión
de ciertos genes cuando sus productos son requeridos. Cuando estas condiciones parti-
culares desaparecen, el NSQ puede sincronizar a los osciladores periféricos de regreso a
su ritmo normal [81]. Por lo tanto, la jerarquı́a de los relojes permite adaptarse mejor
a las condiciones ambientales, como la accesibilidad a alimento.
3.2.3. El reloj molecular

Como ya mencionamos, la estructura del reloj se mantiene en todos los reinos: los
llamados genes reloj y las proteı́nas que estos codifican interactúan de forma tal de dar
lugar a oscilaciones moleculares a través de mecanismos de autoregulación negativa.
Muchos de los genes reloj se expresan en forma oscilatoria, como los genes reloj period
1 y 2 (per1 y per2 ), criptocromo 1 y 2 (cry1 y cry2 ) y Bmal1, mientras que otros,
como Clock, se expresan en forma constante [82].
En el caso de los mamı́feros, el mecanismo molecular del reloj está compuesto de
dos ciclos (loops) de retroalimentación negativa conectados. En el loop principal, las
proteı́nas de los genes Bmal1 y Clock, BMAL1 y CLOCK respectivamente, forman el
dı́mero BMAL1- CLOCK que se unen a los E-box (genes objetivo), que son regiones
promotoras que activan la transcripción de varios genes: Per, Cry y Rev-erbα. Luego,
cuando las proteı́nas PER y CRY están sintetizadas, forman complejos que al ingresar
al núcleo actúan como reguladores negativos inhibiendo directamente su propia trans-
cripción al desplazar al complejo BMAL1-CLOCK de su sitio de unión con la E-box.
Esto inhibe la transcripción de Per y Cry y, por consecuencia, hay una reducción de los
niveles de PER-CRY, lo que permite que BMAL1-CLOCK vuelva a unirse a la E-box
para iniciar nuevamente el ciclo [83, 84].
En el loop auxiliar, cuando BMAL1-CLOCK se une a la E-box, induce la transcrip-
ción del gen Rev-Erbα. Luego, la proteı́na REV-ERBα transloca al núcleo e inhibe la
transcripción del gen Bmal1. Por lo tanto, cuando los complejos PER-CRY desplazan a
BMAL1- CLOCK de la E-box, la disminución en la transcripción de Rev-Erbα permite
la transcripción de Bmal1, restableciendo los niveles de la proteı́na BMAL1. Este loop
no es esencial para la generación de ritmos, pero le da mayor robustez [27, 85].
Estos loops tardan aproximadamente 24 horas en completar un ciclo. Esto es gracias
a los procesos post-traduccionales, como la fosforilación y la ubiquitinación, que están
mediados por las proteı́nas Caseina Kinasa epsilon (CK1ǫ) y Caseina Kinasa delta
(CK1δ). Mutaciones en estas enzimas producen severos daños en el reloj. Por ejemplo,
en los humanos, mutaciones en estos genes son las responsables del sı́ndrome de la
fase del sueño avanzada, en el que los afectados se duermen anormalmente temprano
y despiertan antes de lo previsto [12].
3.2.4. Acercamiento a datos experimentales

En el grupo del Dr Hanspeter Herzel, en el Instituto de Biologı́a Teórica de la
Universidad Humboldt de Berlin analicé datos del laboratorio del Dr. Jihwan Myung en
Osaka, Japón. Recientemente, el grupo experimental de Jihwan Myung [86] realizó un
estudio donde se encontró que el perı́odo de oscilación de la expresión de BMAL1 es
especı́fico a las distintas subregiones del NSQ. También observaron que el acoplamiento
no afecta fuertemente el perı́odo de las oscilaciones, con lo que concluyeron que los
perı́odos forman la base de la codificación de las estaciones en el NSQ.
El objetivo de este proyecto fue continuar esta lı́nea de cuantificación, analizando y
modelando datos experimentales de este grupo de la respuesta del NSQ ante cambios
de concentración del principal neurotransmisor en el medio de cultivo, VIP, midiendo
la bioluminiscencia de otro de los componentes del reloj molecular, Per2.
El experimento se realizó utilizando ratones transgénicos knock-in PER2::LUC, es
decir, con una luciferasa. Los ratones fueron mantenidos en ciclos de luz-oscuridad (LD)
de 12 horas y decapitados entre 30 y 60 dı́as postnatales. El NSQ se cortó en rodajas,
que a su vez fueron microseccionadas quirúrgicamente en subregiones dorsal y ventral
y cultivadas por separado. Debido a la semejanza esquemática de las microsecciones
con una bola de arroz ’onigiri’ japonesa, llamaron a las microsecciones ’onigiri’. Las
secciones elementales onigiri del NSQ fueron aisladas en forma dorsal (D), ventral (V)
40 Mamı́feros
y total (W) (Figura 3.2). Luego se tomaron imágenes de la bioluminiscencia de las

microsecciones, como se observa en la Figura 3.2. Cuanto más oscura es la imagen
mayor expresión de PER2 hay en esa sección. Las imágenes fueron filtradas para re-
mover el ruido y se les aplicó un kernel para transformarlas en una grilla, donde cada
celda corresponde a un pixel. Las oscilaciones se definen como las series temporales de
bioluminiscencia obtenidas de cada celda. A las 72 horas se aplicó el neuropéptido VIP
al medio sobre el cual se encontrabas las rodajas de NSQ con el objetivo de evaluar el
rol de éste en los perı́odos de cada oscilador.
Figura 3.2: Bioluminiscencia en rodajas del núcleo supraquiasmático de ratón. Señal

de bioluminiscencia de PER2::LUC en la región ventral y dorsal del NSQ a un tiempo dado para
los distintas cortes realizados.
Se aplicó un filtro Hodrick-Prescott a los datos crudos para obtener la componente

cı́clica de la serie temporal. El filtro de Hodrick-Prescott separa una serie de tiempo
yt en una componente secular o de tendencia Tt y un componente cı́clico Ct tal que
yt = Tt + Ct . Es equivalente a un spline cúbico más suave, con la porción suavizada en
Tt . La función del filtro tiene la forma m
P 2 Pm−1 2
t=1 Ct + λ t=2 ((Tt+1 − Tt ) − (Tt − Tt−1 )) .
Luego de aplicar el filtro, las oscilaciones en la bioluminiscencia de PER2::LUC en
algunos canales se pudieron observar mejor.
Para poder medir el perı́odo y la fase de las oscilaciones, las curvas fueron ajusta-
das. Dado que las oscilaciones de bioluminiscencia en todos los canales iban perdiendo
amplitud progresivamente a lo largo de las horas, se eligió probar con un coseno amor-
tiguado:
f (t) = A exp−λt cos(ωt + φ) (3.1)
Los valores de los parámetros fueron calculados usando la función curvefit del pa-
quete Scipy en Python. Un ejemplo de la señal de un canal que pudo ser filtrada y
ajustada puede observarse en la Figura 3.3. Varias de las señales no presentaban osci-
laciones o no pudieron ser bien ajustadas. Dos ejemplos de ello son mostrados en las
Figuras 3.4 y 3.5.
35000
30000
Original data
25000
20000
15000
10000
5000
0 50 100 150 200 250
Time [hs]
10000
Filtered signal - Signal fitting
8000
6000
4000
2000
0
−2000
−4000
−6000
−8000
0 50 100 150 200 250
Time [hs]
Figura 3.3: Bioluminiscencia de PER2::LUC para uno de los canales ajustados.

Ejemplo de la señal original, la filtrada y la ajustada para uno de los canales. En este caso se
observan oscilaciones. La ventana temporal de la aplicación de VIP no fue considerada para el
ajuste.
42 Mamı́feros
10000
9000
8000
7000
Original data
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0 50 100 150 200 250
Time [hs]
5000
4000
3000
2000
1000
−1000
0 50 100 150 200 250
Time [hs]
Figura 3.4: Señal de bioluminiscencia de PER2::LUC para un canal sin oscilaciones.

Ejemplo de una señal en la que no se encontraron ritmos periódicos.
40000
35000
30000
Original data
25000
20000
15000
10000
5000
0 50 100 150 200 250
Time [hs]
10000
8000
6000
4000
2000
−2000
−4000
−6000
0 50 100 150 200 250
Time [hs]
Figura 3.5: Señal de bioluminiscencia de PER2::LUC para un canal no ajustado.

Ejemplo de señales en las que las oscilaciones no son significativas.
El perı́odo fue calculado como 2π/ω. En la Figura 3.6 se graficó el perı́odo de

las oscilaciones tanto antes como después de las aplicación de VIP para las neuronas
dorsales (D), ventrales (V) y para todo el cerebro (W) de los canales que pudieron ser
ajustados.
3.3 El fenómeno de sincronización 43
34 D
V
32 W
30
Period after VIP
28
26
24
22
2020 22 24 26 28 30 32 34
Period before VIP
Figura 3.6: Perı́odos de los datos que pudieron ser ajustados antes y después de la
aplicación de VIP. Luego de aplicar el neurotransmisor VIP, los perı́odos de gran parte de las
células se acercan a las 24 horas.
Puede observarse en la Figura 3.6 que en promedio el perı́odo de las oscilaciones

luego de aplicación de VIP es más cercano a las 24 horas. Al haber presencia del
neurotransmisor, se esperaba justamente que la distribución heterogénea de perı́odos
de las neuronas individuales se reduzca a un perı́odo único cercano al dı́a. Sin embargo,
tanto antes como después de la aplicación de VIP, se encontraron perı́odos mucho
más largos que lo razonable. Esto puede deberse a algún artefacto en el protocolo del
experimento o bien a que los datos probablemente no hayan sido ajustados en forma
correcta debido a la baja amplitud de las oscilaciones.
Como conclusión de esta experiencia analizando datos de bioluminiscencia de roda-
jas de NSQ de ratón, aprendı́ la dificultad de analizar datos de experimentos complejos.
Debido a la dificultad en las mediciones experimentales, las oscilaciones obtenidas eran
de baja amplitud, por lo que medir los perı́odos de las mismas no fue sencillo. Sin
embargo, a través del ajuste de las señales se logró obtener datos para varias de las
series temporales.
3.3. El fenómeno de sincronización

Reconocido por primera vez por Christiaan Huygens en 1665, el fenómeno de sincro-
nización es muy frecuente en la naturaleza. Sistemas como relojes, marcapasos cardı́acos
o el aplauso de una audiencia muestran una tendencia a funcionar en forma sincroni-
zada [87].
44 Mamı́feros
3.3.1. Perspectiva histórica

El origen de la palabra sincronización es de raı́z griega y significa “ocurrir en el
mismo tiempo”. El significado original de esta palabra se ha mantenido hasta hoy en
el uso coloquial, como un acuerdo o correlación en el tiempo de diferentes procesos.
La primera descripción del fenómeno de la sincronización fue presentada en el siglo
XVII por Christiaan Huygens. Él observó que dos relojes de péndulo, luego de un
perı́odo de tiempo, oscilaban con el mismo ritmo. Además, notó que oscilaban en
antifase: los péndulos se movı́an en direcciones opuestas, con una diferencia de fase
igual a π. Curiosamente, esto sucedı́a aún si los dos péndulos no eran idénticos. Huygens
comprobó que este comportamiento solo aparecı́a si los péndulos eran colgados de
ganchos colocados en la misma viga de madera. A partir de esta observación, supuso
que la sutil interacción a través de la viga de madera era lo que daba lugar a un
comportamiento colectivo: la sincronización.
Huygens estaba en lo cierto, ya que se ha demostrado que este fenómeno depende de
las propiedades de las interacciones entre los osciladores. Otra caracterı́stica a destacar
es que la sincronización es un efecto esencialmente no lineal y ha sido encontrado en
muchos sistemas fı́sicos, incluyendo los sistemas caóticos, en los cuales fue observada
por primera vez por Pecora y Carrol [88].
3.3.2. Algunas definiciones

En general, sincronización significa un ajuste en los ritmos de objetos oscilantes de-
bido a una débil interacción. Existen varios ejemplos de osciladores en diferentes cam-
pos: circuitos electrónicos, lásers, reacciones quı́micas o las células del nodo sinoatrial
del corazón. Hay algunas caracterı́sticas que son comunes a todos los osciladores auto-
sostenidos: (i) el oscilador autosostenido es capaz de mantener el mismo ritmo mientras
que una fuente de energı́a esté disponible, (ii) la forma de la oscilación está determi-
nada por parámetros internos del sistema y (iii) la oscilación es estable ante pequeñas
perturbaciones. Uno de los principales atributos de un sistema oscilatorio es el tiempo
que necesita para repetir el evento. En un oscilador periódico, este tiempo está deter-
minado por el perı́odo de la oscilación T . La inversa del perı́odo define la frecuencia
f = 1/T del oscilador. La frecuencia angular está definida por ω = 2πf = 2π/T , y
también es llamada “frecuencia natural”. Otra cantidad importante que caracteriza al
oscilador es la fase. La señal x(t) del oscilador puede ser escrita como
x(t) = A(t)ei(ωt+φ0 ) ,
donde A(t) es la amplitud de la oscilación, ω la frecuencia angular y φ0 la fase inicial

del oscilador. Esta fase juega un rol importante en la identificación de la sincronización.
Cuando dos o más osciladores con diferentes frecuencias intrı́nsecas están débilmente
acoplados pueden ajustar sus ritmos y comenzar a oscilar con una frecuencia común.
Este fenómeno es conocido como phase-locking. Si dos osciladores no idénticos tienen
sus propias frecuencias f1 y f2 , la diferencia de frecuencias ∆f = f1 − f2 cuantifica que
tan diferentes son los osciladores acoplados. Si la diferencia de frecuencias en el sistema
sin acoplamiento no es muy grande, se produce el phase-locking.
Además del phase-locking, para que se produzca la sincronización es necesaria una
interacción adecuada entre los osciladores. En una situación experimental no siempre es
claro cómo medir esta cantidad. Por ejemplo, en el experimento descripto por Huygens,
depende del tipo de viga que se utilice. Si la viga es totalmente rı́gida, el movimiento
del péndulo no afecta el soporte, y entonces no hay forma de que los dos relojes in-
teractúen, es decir, la fuerza de acoplamiento es cero. Por el contrario, si la viga no
es rı́gida, sino que puede vibrar o doblarse en cierta medida, existirá una interacción
entre ambos relojes que permitirá la sincronización. Finalmente, una viga demasiado
blanda, tampoco conducirá a una sincronización de los relojes.
Si dos osciladores se mueven en la misma dirección y casi simultáneamente, entonces
sus fases φ1 y φ2 se parecen y su estado es llamado sincronización de fase. Si los dos
osciladores se mueven es direcciones opuestas, el estado de sincronización se llama en
antifase, esto es la diferencia de fase es π radianes [87].
3.3.3. El modelo de Kuramoto

Para modelar los osciladores circadianos utilizamos osciladores cuya dinámica pe-
riódica puede ser descripta por una sola variable, su fase φ. A cada oscilador se le
caracteriza por una variable de fase φ, que varı́a como φ(t) = ωt + φ(0), donde ω es
la frecuencia natural del oscilador. Cuando alcanza el valor 2π, la fase se resetea a 0.
Al acoplar un conjunto de osciladores de fase, se obtiene un modelo fenomenológico de
sistemas complejos en cuya evolución aparecen fenómenos de sincronización. Estos mo-
delos han sido estudiados extensamente, con aplicaciones a sistemas fı́sicos, tecnológicos
y biológicos [87, 89–93].
Uno de los modelos de osciladores de fase más estudiados es el propuesto por Yoshiki
Kuramoto [89] en 1975, en el cual los osciladores son idénticos. El acoplamiento global
está dado por una función periódica de la diferencia de las fases de los osciladores
acoplados. La dinámica de cada oscilador evoluciona de la siguiente forma:
N
dφi k X
= ωi + sin (φj − φi ), (3.2)
dt N j=1
donde i = 1, . . . , N, ωi es la frecuencia natural del oscilador i, k es la intensidad de

acoplamiento y N es el número de osciladores. Se puede ver que el modelo de Kuramoto
es la formulación matemática moderna del fenómeno observado por Huygens, donde
46 Mamı́feros
los osciladores intercambian energı́a por una fuerza de interacción.

La ecuación 3.2 es una ecuación de campo medio del sistema: vemos que la dinámica
individual está acoplada al campo medio de la población. Si el campo medio es nulo
(incoherencia), entonces cada oscilador evoluciona como si no hubiese acoplamiento,
y sigue su frecuencia natural. Por otro lado, si el campo medio es distinto de cero, el
comportamiento es menos trivial.
En el caso que todos los osciladores tengan la misma frecuencia natural y el acopla-
miento sea positivo, el sistema alcanza el estado de sincronización total. Esto se muestra
con un ejemplo en la Figura 3.7, donde se puede observar la evolución temporal de las
fases de 100 osciladores con frecuencias naturales idénticas.
t=0 t=3 t=6 t=9

Figura 3.7: Instantáneas de la evolución temporal de las fases de 100 osciladores. Los
100 osciladores tienen frecuencia naturales ωi =0 y distribución homogénea de fases. La intensidad
del acoplamiento es k = 1. Notar como para tiempos mas largos los osciladores se sincronizan en
fase.
Sin embargo, es más habitual encontrar en la naturaleza osciladores con cierto grado
de diversidad en sus propiedades individuales. Consideramos grupos de osciladores
cuyas frecuencias naturales están dadas por una distribución g(ω).
Medidas de sincronización
Como resultado de las interacciones entre los distintos osciladores, la frecuencia φ̇i
suele diferir de su frecuencia natural ωi . Es por esto que se define la frecuencia efectiva
Ωi que se calcula como el promedio de φ̇i sobre tiempos largos,
t+T
1
Z
Ωi = φ̇i (t′ )dt′ (3.3)
T t
A un valor crı́tico del acoplamiento, aparecen grupos de osciladores sincronizados

en la misma frecuencia efectiva, como se ve en la Figura 3.8. El número de elementos
en el cluster sincronizado aumenta conforme la intensidad del acoplamiento es mayor.
A partir de cierto valor crı́tico del acoplamiento, el número de osciladores comienza
a crecer rápidamente. El valor de la frecuencia de sincronización y del acoplamiento
crı́tico depende de la distribución de frecuencias elegida. Si la distribución es simétrica
alrededor de una frecuencia ω0 , luego la frecuencia de sincronización es justamente ω0 .
También puede mostrarse que el acoplamiento crı́tico está dado por
2
kc = (3.4)
πg(ω0)
(a) k = 0,5 (c) k = 1,8
(b) k = 1,56 (d) k = 2,5
Figura 3.8: Frecuencias efectivas Ω en función de las frecuencias naturales ω para

cuatro acoplamientos. Los osciladores comienzan a sincronizarse alrededor de ω = 0. Al incre-
mentar el acoplamiento k este cluster de osciladores sincronizados crece y se ve como una lı́nea
horizontal.
Para cuantificar la sincronización del sistema utilizamos el parámetro de orden de

Kuramoto
N
iΦ 1 X iφj
σe = e , (3.5)
N j=1
donde Φ(t) es la fase media. σ(t) da una medida de la coherencia de los osciladores
(0 ≤ σ ≤ 1). En la Figura 3.9 se muestra la solución de la ecuación 3.5 para tres grupos
de osciladores acoplados de distinto tamaño en función del acoplamiento. Se observa la
transición de fase cerca del valor crı́tico de k, la cual es más abrupta para sistemas más
48 Mamı́feros
grandes. Para un sistema infinito se observa una transición continua de segundo orden.
√
Como la distribución elegida es g(ω) = exp(−ω 2 /2)/ 2π, la transición está cerca a
kc ≈ 1, 56.
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5
k
Figura 3.9: Parámetro de orden σ en función de la intensidad de acoplamiento k.

Se presenta el parámetro de orden para tres ensambles de osciladores: N = 100 (negro), 200
(rojo) y 400 (verde) con distribución Gaussiana en sus frecuencias naturales. La transición en la
sincronización ocurre a kc ≈ 1,596.
Una vez que se supera el kc , aparece el cluster de osciladores sincronizados que vimos
en la Figura 3.8. Cuando la distribución g(ω) tiene más de un máximo, pueden formarse
más clusters. Si los máximos están bien separados, una vez formados los clusters estos
se comportan como osciladores únicos, interactuando con los demás clusters [94, 95].
3.3.4. Modelos de sincronización en mamı́feros

En ratones, la presencia de luz constante (LL) induce la pérdida de ritmicidad en
la actividad locomotora. En el caso de los hámsters, el efecto de LL es más complejo,
ya que lleva a una partición en el ritmo de actividad locomotora en dos componentes
separadas por 12 horas, fenómeno conocido como “splitting”. Es decir, en lugar de te-
ner la mayor actividad concentrada sólo durante la noche, pasan a tener dos momentos
3.4 El modelo 49
de actividad separados por 12 horas. Estas componentes en general permanecen man-

teniendo una relación de fase estable, pero pueden cambiar el estado de acoplamiento
y volver a manifestar un ritmo único [96].
A partir de estas observaciones que Pittendrigh y Daan hicieron estudiando los rit-
mos circadianos en el hámster, fue desarrollado un modelo conceptual [96]. Propusie-
ron que el reloj del hámster está compuesto por dos osciladores mutuamente acoplados,
uno al que denominaron “morning” (M), que es acelerado por la luz y sincroniza con
el amanecer, y otro denominado “evening” (E), cuya frecuencia disminuye por la luz y
sincroniza con el crepúsculo [97]. Además, la relación de fase determinada por el aco-
plamiento entre ambos puede ser modificada por la historia previa de iluminación [98].
Hay evidencias experimentales a favor y en contra de este modelo [97]. Por ejemplo,
en un experimento se encontró evidencia que apoya que los osciladores del shell y del
core funcionarı́an como dos redes separadas constituyendo los osciladores E y M [99].
Sin embargo, hay muchas neuronas reloj que no pueden ser identificadas ni como M ni
como E [100].
Al estudiar los ritmos circadianos desde una perspectiva fı́sica, los modelos exis-
tentes se basan en un conjunto de ecuaciones diferenciales ordinarias acopladas que
describen oscilaciones. Estas ecuaciones pueden describir desde sencillas oscilaciones de
fase a los mecanismos de retroalimentación negativa caracterizados por todas las pro-
teı́nas que intervienen. Como veremos cuando introduzcamos el modelo en la próxima
sección, en este trabajo utilizaremos el mecanismo más sencillo posible, teniendo como
variables solo la fase y la frecuencia de las oscilaciones. Consideraremos dos grupos de
osciladores circadianos que interactúan. Cambiando las propiedades del acoplamiento
entre los dos grupos de N osciladores, hallaremos comportamientos cualitativamente
similares a algunos resultados experimentales.
3.4. El modelo
Para modelar las dos poblaciones en el NSQ, utilizamos dos grupos de osciladores
de fase. La ruta a la sincronización de dos ensambles de osciladores acoplados fue por
primera vez estudiada en [101], donde Okuda y Kuramoto consideraron poblaciones
acopladas de osciladores de fase idénticos en caso de ruido. A este mismo modelo
se lo utilizó para estudiar la sincronización en caso de asimetrı́a en el acoplamiento
entre grupos [102, 103], considerando diferentes distribuciones de frecuencia [104],
para describir estados de quimeras [105] y como aplicación al estudio de epilepsia
[94]. Nosotros nos interesamos en el rol de las interacciones en las propiedades de
sincronización del modelo. En particular, consideramos los efectos de distribuciones
asimétricas, sistemas de tamaño finito y retardos temporales. Estos ingredientes limitan
fuertemente el análisis analı́tico [106], por lo que nos enfocamos en las simulaciones
numéricas.
50 Mamı́feros
(1) (2)
El sistema está formado por dos tipos de osciladores con frecuencias ωi y ωj ,
los cuales están acoplados con acoplamiento intragrupos ki (i = 1, 2) y acoplamiento
intergrupos k en una dirección y qk en la otra. τ es el retardo temporal entre grupos.
El esquema del modelo se muestra en la Figura 3.10. Cuando k = 0, los dos grupos
están desacoplados, con lo que las propiedades de sincronización de cada grupo son
independientes de las del otro, y sólo dependen de los acoplamientos intragrupos k1 y
k2 . La asimetrı́a en el acoplamiento permite un cambio de roles entre grupos, ya que
cambiando el valor del parámetro q podemos analizar como un grupo tiene influencia
sobre el otro. El acoplamiento está modelado como campo medio y la interacción es
global (todos con todos). Las ecuaciones para la dinámica de la fase de cada oscilador
son:
(1) N1 N2
dφi k1 X (1) (1) qk X
(1)
= ωi + sin (φj (t) − φi (t)) + sin (φj (2) (t − τ ) − φi (1) (t))(3.6)
dt N1 j=1 N2 j=1
(2) N2 N1
dφi k2 X (2) (2) k X
(2)
= ωi + sin (φj (t) − φi (t)) + sin (φj (1) (t − τ ) − φi (2) (t))(3.7)
dt N2 j=1 N1 j=1
Figura 3.10: Esquema del modelo teórico. Dos grupos de osciladores conectados todos
con todos con acoplamiento entre grupos k en una dirección y qk en la otra. Cada grupo tiene
acoplamiento interno k1 y k2 respectivamente.
Utilizamos una distribución Gaussiana de frecuencias naturales
1 −(ω − ω0 )2
g(ω) = √ exp , (3.8)
2πσ 2 2σ 2
3.5 Resultados 51
(1) (2)
donde cada grupo tiene un valor medio distinto ω0 y ω0 . El modelo permite análisis
analı́tico, y se puede mostrar que el acoplamiento crı́tico para cada grupo es kc =
2/[πg(ω0)] [87, 89, 91–93].
Para caracterizar la sincronización de fase global usamos el parámetro de orden S
[94]:
1 T0 +T r1 eiΦ1 + r2 ei(Φ2 +Φ )
Z ∗
S= | |dt (3.9)
T T0 2
donde r1 y r2 son los parámetros de orden de cada grupo y Φ∗ es la diferencia de fase
más probable en un perı́odo de tiempo T , que puede ser medida del máximo de la
distribución de probabilidad de la diferencia de fase ∆Φ(t) =mod(Φ1 (t) − Φ2 (t), 2π)
[107]. Cuando ambos grupos están sincronizados en fase, S es el promedio de r1 y r2 ,
pero cuando no hay sincronización de fase entre los subsistemas se espera que S tenga
un valor bajo.
Las poblaciones interactuantes de osciladores de Kuramoto han sido estudiadas
intensamente en varios trabajos recientes. En particular, el ansatz de Ott-Antonsen
[108] para osciladores de Kuramoto con distribución de frecuencias Lorentziana ha
facilitado el análisis teórico de este tipo de modelos. Utilizando este ansatz, en [106],
fue hecho el análisis de bifurcaciones para este sistema en el lı́mite N infinito.
3.5. Resultados
En esta sección mostraremos los resultados que obtuvimos al estudiar la sincroni-
zación entre dos grupos de osciladores de Kuramoto con interacción global. Utilizando
simulaciones numéricas analizamos cómo la intensidad en el acoplamiento de cada gru-
po y entre grupos afecta la sincronización local y global.
En búsqueda de la formación de clusters localmente sincronizados, en primer lugar
analizamos la frecuencia media de cada grupo. En la fila de arriba de la Figura 3.11
graficamos la frecuencia media Ω como función de la frecuencia natural ω para los
osciladores del grupo 1 (azul) y 2 (rojo) para cuatro valores diferentes de acoplamien-
to entre grupos. La figura muestra claramente la presencia de clusters sincronizados,
que aparecen como lı́neas horizontales. Estos son osciladores con frecuencias naturales
distintas que ahora todos tienen la misma frecuencia media. Ambos grupos poseen un
acoplamiento interno mayor al valor crı́tico, por lo que, como era esperado, aparece
un cluster sincronizado con frecuencia media Ω(1,2) , centrado en el valor medio de la
(1,2)
distribución ω0 . Incluso para valores bajos del acoplamiento entre grupos, algunos
(2)
osciladores del grupo 1 sincronizan sus frecuencias con la frecuencia media ω0 . Esto
puede observarse como un pequeño cluster azul en medio de la lı́nea horizontal roja en
el primer panel, cuando k = 0,05. Los primeros osciladores en sincronizarse son aque-
llos cuyas frecuencias naturales son cercanas a Ω2 . A medida que el acoplamiento entre
grupos aumenta, más osciladores del grupo 1 aparecen en el cluster principal. Este efec-
52 Mamı́feros
to puede ser revertido cambiando el valor del parámetro q. Por ejemplo, para q = 0,5
los resultados son cualitativamente similares, pero en este caso son los osciladores del
grupo 2 los que saltan al cluster centrado en la frecuencia Ω1 .
Figura 3.11: Sincronización de fase. (Panel superior) Frecuencia media Ωi como función de
las frecuencias naturales ωi para los osciladores del grupo 1 (azul) y 2 (rojo) para cuatro valores
distintos del acoplamiento entre grupos: A) k = 0,05, B) k = 0,1, C) k = 0,2, D) k = 0,5. Los
osciladores sincronizados aparecen como lı́neas horizontales. (Panel inferior) Instantáneas de las
fases de los clusters sincronizados. Los vectores muestran el valor del parámetro de orden para
cada grupo. Todas las figuras corresponden a los valores de los parámetros k1 = 1,8, k2 = 1,4,
(2) (1)
q = 2, σ1 = 1, σ2 = 0,5, y ∆ω = ω0 − ω0 = 1.
Un efecto interesante puede ser observado para k = 0,2 en la Figura 3.11 (C), don-
de se observa un fenómeno de “resonancia”. Un pequeño cluster de osciladores aparece
cerca de Ω = −0,5. La formación de clusters con diferentes frecuencias promedio es
usual en sistemas conectados localmente o con estructura de red [92, 107]. Sin embargo,
también aparecen en sistemas totalmente conectados aunque no haya heterogeneidades
en la estructura de red, si las hay en la intensidad del acoplamiento [109–111]. Este
tipo de clusters han sido observados experimentalmente en grupos de osciladores con
interacciones quı́micas que fueron descriptos como osciladores de fase de Kuramoto con
distribución de frecuencias con varios picos por Kiss et al. [94, 95]. Es importante re-
saltar la formación de estas estructuras a pesar de que sea un modelo de campo medio.
Desde un punto de vista biológico, estas estructuras podrı́an ser necesarias para per-
mitir la aparición de diferentes jerarquı́as cambiando el acoplamiento. De hecho, como
ya mencionamos, ha sido observado que el acoplamiento entre las neuronas del NSQ
juega un rol importante para asegurar oscilaciones circadianas robustas pero flexibles
[112]. A medida que el acoplamiento entre grupos se hace más fuerte, los osciladores
de ambos grupos se sincronizan en la misma frecuencia media, y finalmente un único
3.5 Resultados 53
cluster formado tanto por osciladores del grupo 1 como del grupo 2 es observado.
En el panel inferior de la Figura 3.11 presentamos “fotos”de las fases de los os-
ciladores distribuidas en el cı́rculo unidad. Para mayor claridad sólo presentamos las
fases de los osciladores que pertenecen al cluster principal. También presentamos el
parámetro de orden de Kuramoto como un vector para cada grupo. El largo de la fle-
cha representa el grado de sincronización de fase, y la dirección apunta hacia la fase
media. Para poder comparar las cuatro instantáneas utilizamos las mismas condiciones
iniciales. Para k = 0,05 la sincronización de fase del grupo 2 es mucho más grande que
la del grupo 1. Eventualmente ambos grupos se sincronizan con la misma frecuencia y
ambos parámetros de orden crecen, mostrando como era esperado que la sincronización
entre grupos ocurre. Este fenómeno se debe a la asimetrı́a entre clusters introducida
por el parámetro q. Se puede ver como los osciladores no sincronizados tanto del grupo
1 como del 2 más cercanos al grupo sincronizado del grupo 2, se terminan uniendo
a este cluster con Ω2 . A medida que el acoplamiento es más intenso, más oscilado-
res se sincronizan en este cluster. Además, la frecuencia promedio final Ω no coincide
exactamente con Ω2 ya que aún quedan osciladores no sincronizados que modifican la
frecuencia efectiva.
Para poder caracterizar cuantitativamente la sincronización de fase global, en la
Figura 3.12 mostramos el comportamiento de S como función del acoplamiento entre
grupos k. Encontramos que S presenta un comportamiento no monótono. Para k = 0
el parámetro de orden tiene un valor alto S ≈ 0,6, el cual es esperado ya que ambos
grupos poseen un acoplamiento interno por encima del valor crı́tico kc y ya se pueden
observar clusters sincronizados de cada grupo. Para un acoplamiento entre grupos bajo
(k < 0,1) el efecto en la sincronización global es pequeño, aunque ya se puede observar
un decaimiento en S. A medida que k aumenta más, S decrece, alcanzando un mı́nimo
para k ≈ 0,2, y luego aumenta monotonamente con k.
Figura 3.12: El parámetro de orden de sincronización global S como función del

acoplamiento entre grupos k. S tiene un comportamiento no monótono con k. La figura
corresponde a los parámetros k1 = 1,8, k2 = 1,4, q = 2, σ1 = 1, σ2 = 0,5, y ∆ω = 1.
El comportamiento no monótono del parámetro de orden de fase (Ecuación (3.5))

ya ha sido observado en el modelo de Kuramoto cuando las frecuencias naturales son
54 Mamı́feros
distribuidas en forma aleatoria en redes con estructura diluida, como redes libres de
escala [113]. Este efecto se debe a la sincronización para acoplamientos bajos entre
osciladores vecinos con frecuencias naturales similares. A medida que el acoplamiento
aumenta estos grupos localmente sincronizados interactúan y comienzan a sincronizarse
entre ellos, llevando al parámetro de orden a valores más altos.
En nuestro modelo el sistemas está totalmente acoplado, y el comportamiento no
monótono emerge de la competencia entre clusters sincronizados del grupo 1 y 2. Como
ya se mencionó, cuando k ≈ 0,2 los osciladores del grupo 1 pasan al cluster del grupo 2,
llevando a un decrecimiento del parámetro de orden del grupo 1. Esto afecta la sincro-
nización global, hasta que el tamaño del cluster principal se vuelve lo suficientemente
grande.
Ahora vamos a enfocar nuestra atención en el ancho de la distribución de frecuencias
naturales de cada grupo. Se espera que este tenga una relación directa con el tamaño
de los clusters sincronizados, ya que modifica el valor del acoplamiento crı́tico. Hasta
ahora todos los resultados presentados son para desviación estandar de la distribución
Gaussiana del grupo 1 igual a σ1 = 1,0, mientras que para el grupo 2 era σ2 = 0,5,
(1) (2)
con lo que el valor crı́tico del acoplamiento era kc ≈ 1,59 y kc ≈ 0,79. Vamos a
analizar los efectos de modificar σ2 manteniendo la desviación estandar del grupo 1 fija
(2)
en σ1 = 1,0. En la Figura 3.13 graficamos S vs k para: (A) σ2 = 0,5 y k2 ≫ kc , (B)
(2) (2)
σ2 = 1,0 y k2 > kc y (C) σ2 = 2,0 y k2 < kc . Para tener una mejor noción también
mostramos cualitativamente la forma de las distribuciones (en negro el grupo con σ1
y en rojo el grupo con σ2 ). Los otros parámetros están fijos y son k1 = 1,8, k2 = 1,8,
q = 2 y ∆ω = 1.
(2)
Cuando el acoplamiento interno del grupo 2 es mucho mayor que kc , como en la
Figura 3.13 (A), el comportamiento no monótono es más agudo. Además, se observa
A B
que Smin > Smin . A medida que σ2 aumenta el comportamiento no monótono se sua-
viza, y la Figura 3.13 (C) muestra que para σ2 = 2,0 el parámetro de orden S tiene
comportamiento monótono. En este caso, para k = 0, el valor de S mucho mas bajo
que el observado en la Figura 3.13(A). Esto se debe a que como es tan grande la des-
viación estandar σ2 no permite la formación de clusters sincronizados para el mismo
acoplamiento interno k2 = 1,8.
Estudiamos el rol del acoplamiento interno de cada grupo teniendo en cuenta la
heterogeneidad de la distribución de frecuencias naturales de los dos grupos. En la
Figura 3.14 graficamos el parámetro de orden S como función del acoplamiento entre
grupos k para cuatro valores de k2 con σ1 = σ2 = 1,0. Si k2 ≤ kc (primera columna), S
crece monótonamente. En ese caso, la sincronización en el grupo 1 es lo suficientemente
fuerte para no ser influenciada por el grupo 2, por lo que no hay competencia entre
(2)
clusters sincronizados. Si k2 > kc , el comportamiento no monótono comienza a apa-
recer. Notar que para k = 0, el valor de S aumenta cuando la intensidad de k2 mayor.
3.5 Resultados 55
Este fenómeno es consecuencia de que la distribución de frecuencias ancha dificulta la

sincronización entre grupos.
Figura 3.13: S vs k para distintos σ2 . Parámetro de orden global S vs acoplamiento interno

k para tres valores de la desviación estandar de la distribución Gaussiana de frecuencias naturales
del grupo 2: (A) σ2 = 0,5, (B) σ2 = 1,0, (C) σ2 = 2,0. En el grupo 1 σ1 = 1,0 está fijo. La figura
corresponde a k1 = 1,8, k2 = 1,8, q = 2, y ∆ω = 1. A medida que el acoplamiento interno es
mayor que el acoplamiento crı́tico, el mı́nimo del parámetro de orden es más agudo.
Figura 3.14: S vs k para distintos k2 . El parámetro de orden global S en función del

acoplamiento entre grupos k para cuatro valores del acoplamiento interno del grupo 2, (A) k2 =
1,4, (B) k2 = 1,6, (C) k2 = 1,8 y (D) k2 = 3,0. Todas las figuras corresponden a los valores
σ1 = 1, k1 = 1,8, q = 2, ∆ω = 1 y 100 simulaciones independientes. Notar que el comportamiento
no monótono aparece para acoplamientos del grupo 2 por encima de su valor crı́tico.
También analizamos el efecto de modificar el tamaño de uno de los grupos dejando

fijo el tamaño del otro. En la Figura 3.15 mostramos los resultados cuando el tamaño
del grupo 2 está fijado en N2 = 200 osciladores y el tamaño del grupo 1 toma los
siguientes valores: (A) N1 = 40, (B) N1 = 80 y (C) N1 = 160. Graficamos la frecuencia
media como función de la frecuencia natural ω para cada oscilador. Se observa el mis-
mo comportamiento cualitativo para los tres casos. Para acoplamiento muy pequeño k
aparecen dos clusters sincronizados. A medida que k se hace más grande los oscilado-
res en el grupo 1 se mueven al cluster principal formado mayormente por osciladores
del grupo 2. Para acoplamiento k lo suficientemente grande todos los osciladores se
sincronizan en el mismo cluster.
56 Mamı́feros
En la Figura 3.16 mostramos la evolución temporal de la fase de 15 osciladores per-

tenecientes a los clusters sincronizados observados en la Figura 3.15. La figura muestra
como la relación de fase entre los grupos puede ser modulada manteniendo el aco-
plamiento entre los grupos pero cambiando el número de osciladores. Se han hecho
observaciones experimentales que sugieren que subpoblaciones de células dentro del
NSQ muestran distintas relaciones de fase cuya función podrı́a ser dar plasticidad para
la adaptación a distintos fotoperı́odos [114].
Figura 3.15: Ω vs ω. Frecuencia promedio Ω como función de la frecuencia natural ω para

tres tamaños del grupo 1 y tres intensidades del acoplamiento: (A) N1 = 40, (B) N1 = 80 y (C)
N1 = 160. El tamaño del grupo 2 es en todos los casos de N2 = 200. Las figuras corresponden a
k1 = 1,8, k2 = 1,4, q = 2 y ∆ω = 1. Observar que en los tres casos las frecuencias de los clusters
sincronizados son similares.
3.5 Resultados 57
Figura 3.16: Evolución temporal de la fase. Evolución temporal de la fase de 15 osciladores

en cada uno de los clusters observados en la Figura 3.15, para (A) N1 = 40 (B) N1 = 80 (C)
N1 = 160 cuando k = 0,1. Se observa que la relación de fase entre grupos cambia al modificar el
número de osciladores del grupo 1.
Como ya mencionamos, ha sido observado que los dos hemisferios del NSQ pueden
disociar su actividad y oscilar en antifase [115]. Li et al.. [116] mostró que los retardos
temporales son un factor clave para obtener patrones de oscilación en antifase. Hasta
ahora consideramos el modelo sin retardo temporal, por lo que vamos a ver que cambia
cuando τ 6= 0. En la Figura 3.17 mostramos que podemos obtener patrones antifase
cambiando el retardo temporal entre grupos. Cuando no hay delay, ambos grupos
oscilan en fase, pero al incrementar τ obtenemos comportamiento antifase con los
mismos parámetros y condiciones iniciales.
58 Mamı́feros
Figura 3.17: Evolución de la fase de 10 osciladores en el cluster principal. Todos

los sistemas inician con las mismas condiciones iniciales pero delay diferentes: (A) τ = 0 y (B)
τ = 4 . Cuando no hay delay, ambos grupos se sintonizan en fase y frecuencia, pero cuando τ = 4
aparece el comportamiento antifase. Los valores de los parámetros son k1 = 1,8, k2 = 1,4, q = 2,
σ1 = 1,0, σ2 = 0,5, ∆ω = 1.
Figura 3.18: S vs k para distintos retardos. (A) τ = 0, (B) τ = 2, (C) τ = 4 y (D) τ = 6.

Para retardos temporales más grandes, el comportamiento no monótono es menos agudo. Los
parámetros son los mismos que en la Figura 3.17.
También analizamos el efecto del retardo temporal en la sincronización global de

3.5 Resultados 59
fase. En la Figura 3.18 mostramos el parámetro de orden S como función del acopla-
miento entre grupos k para cuatro valores del retardo temporal τ y 500 simulaciones
independientes. En el caso de τ = 0 el comportamiento no monótono puede ser obser-
vado. Sin embargo, la presencia de delay es perjudicial para la sincronización global.
A medida que τ aumenta, el mı́nimo del parámetro de orden decrece y para mayores
valores de acoplamiento S toma valores más pequeños. Además, para retardos largos,
el sistema presenta mayores fluctuaciones, que se reflejan en el valor del parámetro de
orden.
La Figura 3.19 muestra las regiones de sincronización global para valores diferentes
de retardos temporales cuando k = 0,5. Encontramos que la región de sincronización
global se reduce al aumentar el valor de τ . En (A), casi para cualquier acoplamiento
interno el sistema alcanza un valor del parámetro de orden alto, incluyendo valores por
debajo y por encima del acoplamiento interno crı́tico. Observar que cuando el retardo
temporal aumenta, por ejemplo en (D), la región de sincronización está limitada a
(2)
valores del acoplamiento interno del grupo 2 por debajo del valor crı́tico (kc ≈ 0,79).
Figura 3.19: Diagramas k1 -k2 para distintos retardos. El color indica el valor del paráme-
tro de orden S para: (A) τ = 0, (B) τ = 2, (C) τ = 4 y (D) τ = 6. En estos diagramas k1 -k2
es posible notar como la región de mayor sincronización global camba de tamaño de acuerdo al
retardo temporal. Para delays grandes, la región de sincronización es menor y un acoplamiento
muy intenso en el grupo 2 no asegura la sincronización global. Las figuras corresponden a k = 0,5,
q = 2, σ1 = 1,0, σ2 = 0,5, ∆ω = 1.
60 Mamı́feros
3.6. Conclusiones
En los mamı́feros, el reloj central se encuentra en el núcleo supraquiásmatico dentro
del hipotálamo. Este tiene 20000 neuronas y puede dividirse en dos grupos distintos,
tanto anátomica como fisiólogicamente, el core y el shell. Cada uno de ellos está com-
puesto de miles de neuronas reloj, de las cuáles se conoce mucho detalle sobre cómo
oscilan a nivel molecular. Sin embargo, la interacción entre cada una de estas neuronas
y la intensidad de su acoplamiento, que regula la fisiologı́a de cada individuo y permi-
te la emergencia de un único perı́odo circadiano para el comportamiento es aún una
pregunta abierta.
Para abordar este problema tomamos el modelo más simple que se puede pensar,
considerando dos grupos de osciladores de fase totalmente acoplados con una distribu-
ción Gaussiana de frecuencias naturales y analizamos sus propiedades de sincroniza-
ción. A través de simulaciones numéricas estudiamos cómo las diferentes intensidades
de acoplamiento afectan la sincronización local y global. Encontramos que incluso en un
modelo simple como este se pueden obtener resultados antiintuitivos, ya que en algu-
nos casos aumentar el acoplamiento entre los grupos puede disminuir la sincronización
global.
Mostramos que modificando la intensidad en el acoplamiento pueden aparecer pe-
queños clusters de osciladores en diferentes frecuencias. Experimentalmente, se en-
contró que en el núcleo supraquiasmático hay un grupo de fase principal, que contiene
el 50 % de las neuronas, y dos grupos más, cada uno conteniendo el 10-20 % de neuronas
[100]. En este trabajo, Quintero sugiere que estos grupos surgen sólo debido a cambios
en el acoplamiento, lo cuál muestra que a pesar de la simpleza del modelo se pueden
recuperar propiedades de los grupos verificadas experimentalmente. Esto es importan-
te porque aún no hay acuerdo sobre si el núcleo supraquiasmático produce una sola
señal que representa el perı́odo promedio de sus osciladores o si está organizado como
un ensamble de distintos grupos de osciladores cuyo acoplamiento permite una única
señal. Esto se debe a las dificultades experimentales en la determinación de señales
oscilatorias en diferentes regiones de los tejidos (ver 3.2.4).
Además, mostramos que la relación de fase entre clusters sincronizados puede ser
modificada cambiando el número de osciladores en cada subpoblación y el retardo
temporal. Experimentalmente también se habı́a encontrado que en el caso del split-
ting, el lado derecho y el izquierdo del reloj maestro oscilan en antifase [115]. Esta
fenomenologı́a también puede ser explicada por el modelo de dos grupos conectados.
De esta forma, con el modelo más sencillo posible para los dos grupos de osciladores
del núcleo supraquiasmático, en el que no se tienen en cuenta los aspectos moleculares
de las neuronas reloj, logramos reproducir resultados hallados experimentalmente y
encontramos un comportamiento antiintuitivo del fenómeno de sincronización global.
Capı́tulo 4
Drosophila melanogaster
Los experimentos realizados con la mosca Drosophila melanogaster representan el

trabajo más extenso e interdisciplinario de esta tesis. En este capı́tulo comenzaremos
contando el desarrollo, las caracterı́sticas y funcionamiento de un dispositivo de moni-
toreo de actividad locomotora al que denominamos d-Tracker. Este dispositivo permite
hacer un monitoreo de la actividad locomotora individual de las moscas en pistas del
tamaño y forma que se desee. Luego describiremos los experimentos que realizamos re-
gistrando la actividad de distintas lı́neas de moscas y el análisis de los datos obtenidos.
Por último, contaremos los experimentos realizados para estudiar el comportamiento
de oviposición de hembras y los resultados obtenidos.
El trabajo realizado durante esta tesis formó parte de la creación del laboratorio
de Drosophila a cargo de la Dra Lorena Franco en el Instituto de Investigaciones en
Biodiversidad y Medioambiente (INIBIOMA), en la Universidad del Comahue. Las
actividades desarrolladas dejan como punto de partida para futuros experimentos pro-
blemas con los que nos fuimos encontrando ya resueltos.
4.1. La mosca de la fruta

Drosophila melanogaster, también conocida popularmente como la mosca de la fruta
o del vinagre, es un insecto cuyo ciclo vital consta de cuatro etapas: huevo, tres estadios
larvales, pupa y adulto. El ciclo de vida comienza con el huevo, que tiene forma ovoide
con dos pequeñas proyecciones que le ayudan a no hundirse en el medio de cultivo, y
generalmente eclosiona transcurridas 18 a 24 h desde su puesta. Si no dispone de un
sustrato de oviposición adecuado, disminuyendo ası́ el tiempo de eclosión, las hembras
pueden retener sus huevos y depositarlos más tarde en un estado de desarrollo avanzado.
A continuación, el estadio larval es la etapa principal de alimentación y consta de
2 mudas totales de exoesqueleto, proceso que se conoce como ecdisis. Este proceso
dura, en total, aproximadamente 4 dı́as. Transcurrido este tiempo, la larva deja de
alimentarse y entra en el estadio de pupa, en el que permanece inmovil adherida a
61
62 Drosophila melanogaster
la pared del recipiente que la contiene. Esta etapa dura aproximadamente 3 dı́as, al
cabo de los cuales emerge una mosca adulta. Los adultos viven alrededor de 20 dı́as en
el laboratorio, aunque el tiempo de vida difiere considerablemente entre individuos y
depende de las condiciones ambientales.
Figura 4.1: Estadios del ciclo vital de Drosophila. Luego de aproximadamente 10 dı́as la
mosca llega a adulta y eclosiona de la pupa.
La diferenciación entre machos y hembras puede realizarse a simple vista o con

la ayuda de una lupa. Las hembras son algo más grandes que los machos y tienen
el abdomen más puntiagudo. Además, en las hembras se distinguen cinco rayas en el
abdomen, mientras que el macho tiene solo tres con la útima más gruesa, lo que le da
un color más oscuro al final de su abdomen, como se observa en la Figura 4.2. De esta
caracterı́stica viene su nombre, ya que recordemos que melanogaster en latı́n significa
vientre negro.
Figura 4.2: Dimorfismo sexual en Drosophila. Esquema comparativo entre un individuo

macho (izquierda) y un individuo hembra (derecha). Se puede observar la diferencia en el tamaño
y la mancha negra en el abdomen de los machos.
4.2. Su relevancia circadiana

Desde el primer trabajo de Konopka y Benzer, la mosca de la fruta Drosophila me-
lanogaster se convirtió en un organismo fundamental para la cronobiologı́a [117]. En
ese trabajo, identificaron tres alelos de un mismo gen que modifica tanto la ritmicidad
de eclosión de las pupas a nivel poblacional como la actividad locomotora de las moscas
adultas. De esa forma, hallaron los tres fenotipos básicos caracterı́sticos de los ritmos
circadianos: perı́odo largo, perı́odo corto y arritmicidad [29]. En la Figura 4.3 se mues-
tran los actogramas para todos los casos. En el panel (A), se observa que la mosca tiene
4.2 Su relevancia circadiana 63
actividad durante el dı́a, con un perı́odo cercano a las 24 horas. En el panel (B), se
muestra el actograma de una mosca arrı́tmica, por lo cual se observa actividad a toda
hora. En los paneles (C) y (D), la mosca mutante mantiene su ritmicidad, pero con un
perı́odo más corto o más largo, respectivamente. Estos mutantes establecieron no sólo
que la ritmicidad circadiana tiene una base genética, sino que también constituyeron la
primera evidencia de que mutaciones en un gen pueden modificar el comportamiento
de un animal. Este, junto con otros descubrimientos, fue el ladrillo fundacional de la
búsqueda de los mecanismos básicos del funcionamiento del reloj circadiano [118].
Figura 4.3: Actogramas de los primeros mutantes reloj de Drosophila. Actividad

locomotora en ciclos de oscuridad constante para una mosca normal y los tres mutantes reloj
encontrados por Konopka y Benzer. En el caso de la mosca arrı́timica, la actividad locomotora
parece ser azarosa, de lo que se deduce que la mutación rompió el reloj interno del individuo.
Figura tomada de [29].
.
La identificación de otros mutantes en los años subsiguientes, de los cuales algunos

ejemplos se muestran en la Tabla 4.1, permitieron caracterizar genes cuyas mutaciones
inducen cambios en el fenotipo circadiano. Una vez que se caracteriza la mutación,
es necesario estudiar por medio de métodos moleculares y bioquı́micos cómo son los
procesos en los cuales participa este gen que permiten el correcto funcionamiento del
reloj molecular. Por ejemplo, el análisis de la expresión de per y de su promotor,
identificó una secuencia CACGTG, denominada caja E (“E-box”), requerida para la
activación transcripcional de per, y que representa un sitio de unión a ADN altamente
especı́fico para proteı́nas [119].
Gen Alelo mutante Perı́odo endógeno Referencia

period per S 19 h Konopka (1971) [29]
per L 29 h Konopka (1971)[29]
per 01 Arrı́tmico Konopka (1971) [29]

Konopka (1994) [120]
per T 16 h
Hamblen (1998) [121]
timeless tim0 Arrı́tmico Sehgal (1994) [122]

timblind 26 h Wulbeck (2005) [123]
Clock dClock Arrı́tmico Allada (1998) [124]
cycle cyc0 Arrı́tmico Rutila (1998) [125]

pigment
Arrı́tmico o ritmo débil Yoshii (2009) [126]
dispersing pdf 01
con perı́odo de 22.8 h Stoleru (2004) [127]
factor
doubletime dbtS 18 h Bao (2001) [128]
Splitting en dos componentes:
cryptochrome cry b Stanewsky (1998) [129]
perı́odo largo y corto
Tabla 4.1: Algunos de los principales mutantes de Drosophila. Caracterı́sticas de los

primeros mutantes encontrados para cada uno de los principales genes reloj.
4.2.1. El reloj molecular en Drosophila
Como ya se mencionó en la introducción general, el mecanismo molecular del reloj

de Drosophila consiste en dos ciclos transcripcionales de retroalimentación negativa.
Analizando la actividad locomotora de moscas modificadas genéticamente se hallaron
los genes principales del reloj y sus cascadas.
En el ciclo principal, mostrado en la Figura 4.4, el heterodı́mero CLOCK-CYCLE

(CLK/CYC) se une a las secuencias E-box y activa la transcripción de period y timeless,
los cuales tienen su pico máximo al inicio del dı́a subjetivo. Las proteı́nas TIM y PER se
acumulan y dimerizan en el citoplasma a lo largo de la noche, luego traslocan al núcleo
hacia la medianoche y junto con la quinasa DOUBLETIME se unen a CLK/CYC,
inhibiendo su unión al ADN y la activación de la transcripción [29].
4.2 Su relevancia circadiana 65
Figura 4.4: El reloj molecular central en Drosophila. CLK/CYC activa la transcripción

de per y tim. PER y TIM son modificadas por DOUBLETIME, CASEIN KINASE 2 y SHAGGY
(SGG) y son fosfatadas por PROTEIN PHOSPHATASE 2A (PP2A) y PROTEIN PHOSPHA-
TASE 1(PP1). PER y TIM dimerizan y reprimen la actividad de CLK/CYC. Figura modificada
de [130].
.
Si bien la retroalimentación transcripcional es el mecanismo fundamental [131],

los procesos postraduccionales son los que imponen los retrasos temporales entre la
activación transcripcional de CLK/CYC (tarde en el dı́a) y la represión ejercida por
PER/TIM (tarde en la noche), los cuales son necesarios para que el perı́odo endógeno
sea cercano a las 24 horas [130].
El segundo ciclo, que está interconectado con el primero a través de CLK/CYC, es

importante para mantener la fase y la amplitud del oscilador principal (Figura 4.5).
En este ciclo, el dı́mero CLK/CYC activa directamente la transcripción de Par domain
protein 1 (Pdp1 ) y vrille (vri ), dos reguladores transcripcionales cuyos productos pro-
teicos se unen al promotor de clk pero con funciones opuestas: mientras que VRI inhibe
la transcripción de clk, PDP1 la estimula. La acumulación retrasada de PDP1 respecto
de VRI establece el ritmo de acumulación de clk, el cual es antifásico respecto de per
y tim.
Figura 4.5: Ciclo adicional del reloj molecular de Drosophila. CLK/CYC activa
CLOCKWORK ORANGE (CWO), PAR DOMAIN PROTEIN 1 (PDP1) y VRILLE (VRI).
Figura modificada de [130].
.
El principal sincronizador para la mosca es la intensidad lumı́nica [132]. Las moscas

poseen tres órganos fotoperceptivos: los ojos compuestos, los ocelos y el órgano de
Hofbauer–Buchner (HB). Estos órganos forman parte de las vı́as de entrada de la
información lumı́nica, pero la comunicación del zeitgeber al reloj molecular depende
del fotopigmento CRYPTOCHROME (CRY) [133]. La luz activa a CRY, el cual se une
a TIM y promueve su degradación [129, 134, 135]. La falta de TIM deja inestable a
PER, que se hiperfosforila por DBT y es degradado, reseteando el reloj [136].
4.2.2. Redes neuronales

Los genes reloj se expresan en células de todo el cuerpo de Drosophila. Sin embargo,
el reloj central o pacemaker está formado por alrededor de 150 neuronas denomina-
das neuronas reloj distribuidas en ambos hemisferios [137]. Avances en las técnicas
genéticas y la construccion de proteı́nas marcadoras permitieron la identificación de
las neuronas reloj y sus proyecciones, revelando que las neuronas están conectadas
tanto bilateralmente como dentro de cada hemisferio [138].
Las neuronas reloj pueden dividirse según su ubicación en el cerebro, su tamaño
y expresión génica. Ası́ podemos encontrar dos grandes grupos, las neuronas laterales
(LN) y las neuronas dorsales (DN), que se dividen en subgrupos de muy pocas neu-
ronas. Las DN se subdividen en tres subgrupos a cada lado del cerebro, DN1, DN2 y
DN3. Por otro lado, las LN están formadas por cuatro pequeños subgrupos, también
ubicados a cada lado del cerebro. Estos subgrupos están conformados por las neuronas
posteriores laterales (LPN), neuronas laterales dorsales (LNd), neuronas laterales ven-
trales pequeñas (sLNv) y las neuronas laterales ventrales grandes (lLNv) (Figura 4.6).
Las neuronas LNv son importantes para la anticipación de la mañana, por los que se
las llama células M, mientras que las LNd/DN1 son importantes para la anticipación
4.3 Desarrollo de un dispositivo de monitoreo de la actividad locomotora 67
de la tarde, por lo que se conocen como células E (del inglés evening) [41, 139].
Figura 4.6: Red neuronal circadiana en la mosca. Red neuronal en el cerebro de una mosca
adulta en el que se resaltan las neuronas reloj. Medulla: médula, Compound Eye: ojo compuesto,
aMe: médula accesoria, Ocelli: ocelos, DN3: neuronas dorsales 3 (azul), LNd: neuronas laterales
dorsales (naranja), l-LNv: neuronas laterales ventrales grandes (marron), s-LNv: neuronas late-
rales ventrales pequeñas (rojo) , H-B: órgano de Hofbauer-Buchner, R7/8: fotorreceptores 7 y 8,
R1-6: fotorreceptores 1 a 6. Figura de [140].
.
A pesar de conocerse las neuronas que forman el pacemaker, cómo está conectado
el circuito y cuales son los neuropéptidos que intervienen en la comunicación entre
neuronas es aún una incognita [141]. El primer neuropéptido identificado fue PIGMENT
DISPERSING FACTOR (PDF), que es expresado por las lLNv y por todas salvo una
sLNv [142]. La principal función de PDF parece ser sincronizar los distintos osciladores
en el cerebro, ya que los mutantes nulos para este neuropéptido se vuelven arrı́timicos
a los pocos dı́as de pasar a condiciones constantes, ya que pierden la sincronı́a de las
oscilaciones moleculares dentro de las LNv y con otros grupos neuronales [143–145].
4.3. Desarrollo de un dispositivo de monitoreo de

la actividad locomotora
Algunos de los ritmos circadianos estudiados en Drosophila incluyen la eclosión [29],
la sensibilidad olfativa [146], la inmunidad [147], ciertos aspectos del cortejo [148], y
el aprendizaje y la memoria de corto plazo [149]. Pero el más estudiado es la activi-
dad locomotora, gracias al sistema automatizado DAM (del ingles Drosophila Activity
Monitoring), comercializado por la empresa Trikinetics.
Los registros que se utilizan habitualmente proporcionan muy poca información, ya
que el dispositivo DAM solo permite saber cuantas veces cada mosca cruza un haz de
luz infrarroja en el medio de un tubo de vidrio. Cada vez que la mosca cruza el haz,
el dispositivo registra una entrada. Este dispositivo funcionó muy bien inicialmente
para estudiar los ciclos circadianos, ya que además de ser utilizado para determinar la
ritmicidad, permite monitorear 32 individuos al mismo tiempo. Actualmente se sigue
utilizando en todos los laboratorios de Drosophila como control de la ritmicidad de los
individuos.
Sin embargo, se sabe que tiene mucha pérdida de información, ya que sólo registra
la actividad de la mosca cuando ésta se mueve por determinada sección del espacio
disponible. Además, dado que las moscas deben caminar una mı́nima distancia entre
cada cruce, la resolución temporal del dispositivo DAM varı́a entre los 3 y 10 segundos.
La resolución espacial tampoco es buena: el tubo de vidrio tiene apenas 3 mm de
ancho, donde la mosca solo puede moverse caminando hacia adelante o hacia atrás, y
5 cm de largo [150]. Es por estas razones, además del alto costo de este equipo, que no
consideramos al sistema DAM para estudiar la organización temporal y espacial de la
actividad y descanso en Drosophila.
En este trabajo desarrollamos e implementamos un dispositivo al que llamamos
d-Tracker, con el que monitoreamos el movimiento de Drosophila con alta resolución
espacial y temporal. A continuación vamos a detallar el dispositivo, que nos permite
cuantificar la actividad locomotora y también comportamientos complejos como la
utilización del espacio. En el Apéndice 1 se puede observar el esquema del dispositivo.
El hardware del d-Tracker está compuesto por:
Cámaras web conectadas por USB. A todas las cámaras web se les extrajo el
filtro infrarrojo para que puedan registrar la actividad de las moscas en caso de
iluminación infrarroja.
Una caja contenedora que cumple la función de aislante para poder tener condi-
ciones de luz constantes y que sostiene las cámaras.
Una base que contiene tiras de luces LED blancas e infrarrojas conectadas a un
timer. La tapa de la base es un acrı́lico semitraslúcido que cumple el rol de difusor
para que pase la luz sin cegar las cámaras. En la parte superior la base cuenta
con pasadores para que las pistas de las moscas queden fijas.
Es importante destacar que la luz infrarroja no afecta el patrón de comportamiento

estudiado, ya que el sistema circadiano de Drosophila es insensible a la luz de longitud
de onda entre 850 y 950 nm. En un principio colocamos luces rojas en el dispositivo,
ya que consideramos que la longitud de onda era lo suficientemente alta para que no
sea visible por las moscas. Sin embargo, observamos que las moscas comenzaban a ser
activas de noche y más inactivas de dı́a. Una de las posibles razones para esto es el
’efecto de luz de luna’. Al estar expuestas a una luz de muy baja intensidad, las neuronas
que son responsables de los ritmos circadianos cambian su actividad en respuesta a estos
cambios lumı́nicos, lo cual servirı́a de adaptación a distintos fotoperı́odos [151]. Las

luces rojas podrı́an haber actuado como luz de baja intensidad, generando el mismo
efecto. A partir de ese experimento, se modificó el dispositivo y se utilizaron tiras
LED de luces infrarrojas. Además, observamos que al apagar o encender las luces
rojas/infrarrojas, se generaban fluctuaciones grandes en la temperatura del interior del
dispositivo, ya que generan mucho calor. Debido a esto se decidió mantener las luces
infrarrojas prendidas constantemente. Es por esto que otra posibilidad para el cambio
en el comportamiento podrı́a haber sido que se entrenen con las fluctuaciones en la
temperatura, por lo cual se comenzó a llevar registro de la temperatura en el interior
del dispositivo. Pensamos que el cambio en la actividad se debió a alguno de estos
dos efectos, pero como con las modificaciones en el dispositivo bastó para corregir el
problema, no nos concentramos en determinar a cuál de los dos fue.
4.3.1. Configuraciones espaciales.
Con el objetivo de estudiar el uso del espacio en distintas configuraciones geométri-

cas, utilizamos pistas rectangulares y circulares. Cabe destacar que en ambos casos la
mosca se encuentra más libre que en las pistas del sistema DAM, ya que puede caminar
con más espacio y hasta puede volar.
Las pistas rectangulares fueron construidas con láminas de policarbonato transpa-

rente, como se muestra en la Figura 4.7. Se las cortó de forma tal que queden 10 pistas
de 1 cm de ancho y 10 cm de alto. En uno de los extremos se colocó algodón, para per-
mitir el paso del aire pero evitando que la mosca escape, y el otro extremo se selló con
la comida preparada a base de harina de maı́z, como se muestra en el esquema de la
figura.
Al poner moscas en pistas contiguas la ritmicidad se veı́a afectada por la interacción

social. Esto lo notamos observando que cuando una mosca caminaba por el borde lateral
de su pista, la mosca vecina la seguı́a en su recorrido. Debido a esto decidimos dejar
pistas libres con el fin de evitar influencias sociales en el comportamiento de cada
individuo, ya que el tema no era de interés para los objetivos de esta tesis. Pero queda
el tema abierto para hacer experimentos de interacción social con el dispositivo en el
futuro.
Figura 4.7: Pistas rectangulares. A la izquierda se observa una foto de las pistas rectangu-
lares con moscas CS, con pistas libres entre moscas. A la derecha se observa el esquema de cada
pista, con la comida en un extremo y el algodón en el otro. La mosca se mueve libremente en el
espacio restante.
Para analizar el uso de un espacio circular, se utilizaron cápsulas de Petri de 6 y 10

cm de diámetro (Figura 4.8). Una sola mosca fue colocada por cada cápsula, de forma
tal de poder evaluar el comportamiento individual.
Figura 4.8: Pistas circulares. A la izquierda se observa una foto de una cápsula de Petri con
una mosca. A la derecha se observa el esquema de la pista, con la comida en el centro. La mosca
se mueve libremente en el espacio restante.
4.3.2. PySolo
El programa utilizado para registrar la actividad de las moscas en las pistas es
PySolo-Video, una extensión para adquisición de datos de PySolo. PySolo (del italiano
pisolo, siesta) es un software de análisis de datos desarrollado en el laboratorio de
Giorgio Gilestro [152]. El programa está escrito en Python y utiliza las librerias Numpy
y Scipy para los cálculos, y wxPython para la construcción de una interfaz amigable
para el usuario. PySolo-Video ofrece traducir el movimiento detectado en el video a

datos de posición en dos dimensiones o a distancia recorrida con resolución de un
segundo.
Una vez que las pistas con las moscas adentro están listas, se colocan en la caja y
se procede a preparar el programa para realizar el seguimiento de cada individuo. Para
esto en primer lugar se debe asociar una cámara web a un monitor. Luego con el mouse
se deben hacer “máscaras”, que delimitan la región donde se registra el movimiento
de la mosca. Para hacer esto se marcan las cuatro esquinas de la región deseada y
automáticamente se forma un poliedro, como se muestra en la Figura 4.9. Cada máscara
debe contener una sola mosca. Por último, se corre el programa PySolo-Acquire. Una
de las ventajas de este software es que permine monitorear hasta 32 moscas al mismo
tiempo, al igual que el dispositivo DAM. Sin embargo, para que entren las 32 pistas en
el cuadro de una cámara web, deben ser muy pequeñas.
Figura 4.9: Máscaras del Pysolo-Video. Limitación del espacio donde la mosca puede mo-
verse mediante la creación de una máscara para cada mosca en el caso de las pistas rectangulares.
A modo de ejemplo, se muestra en la Figura 4.10 la trayectoria de las moscas de la

Figura 4.9 seguidas durante treinta segundos. Los puntos rojos corresponden a los 30
registros de las ubicaciones hechos por el programa, uno por segundo. La lı́nea punteada
representa la trayectoria. Notar que todos los individuos eligen caminar por los bordes
de sus pistas, ya que prefieren evitar el centro. Esto es algo que ya se ha observado en
otros animales como ratones y ratas.
y (pixeles)
0 20 400 20 400 20 400 20 400 20 400 20 400 20 400 20 40

x (pixeles)
Figura 4.10: Trayectorias de ocho moscas en las pistas rectangulares. Se puede observar
la actividad de las ocho moscas monitoreadas por una cámara web durante treinta segundos. Los
puntos rojos corresponden a las posiciones a cada paso de tiempo, mientras que la lı́nea punteada
representa la trayectoria.
.
4.4. Sujetos de estudio

4.4.1. Crı́a y mantenimiento de las moscas
Para el mantenimiento y crianza de las lı́neas de Drosophila utilizadas en esta tesis
se preparó comida estándar a base de harina de maı́z, agar, levadura, sacarosa y nipagin,
un agente antimicrobiano. Las lı́neas se mantuvieron en viales de plástico de 2 cm de
diámetro y 10 cm de altura. Las moscas fueron mantenidas a 25o y 60 % de humedad en
un cuarto aislado adecuado para medir ritmos circadianos en Drosophila. La selección de
las moscas para cada experimento se realizó anestesiándolas con CO2 y observándolas
bajo lupa para distinguir machos de hembras. Mientras se las observaba eran colocadas
4.4 Sujetos de estudio 73
sobre una plataforma porosa con un flujo continuo de CO2. Se cuidó minimizar el
tiempo de exposición al CO2 para evitar afectar el comportamiento de las moscas
[153].
4.4.2. Sistema GAL4/UAS
Una de las técnicas genéticas más importantes que existen para manipular la mosca
es el sistema GAL4/UAS. Este sistema permite expresar cualquier gen, ya sea de mosca
o de cualquier otro organismo, de manera dirigida y especı́fica a cualquier tipo de células
y en cualquier momento del desarrollo de la mosca.
GAL4 es una proteı́na de levadura cuya función es activar la transcripción genética.

En la levadura, GAL4 es indispensable para que se expresen los genes involucrados
en que la levadura pueda digerir un tipo especial de azúcar (galactosa). GAL4 sólo
puede activar genes que tienen una secuencia reguladora que se llama UAS (Upstream
Activating Secuences, secuencias activadoras de la transcripción rı́o arriba), y los genes
de levadura para la digestión de galactosa tienen esta secuencia. La unión de GAL4
a las UAS es muy especı́fica y GAL4 no puede activar la transcripción de ningún gen
que no las contenga. En la mosca no existen genes homólogos a GAL4 y ningún gen de
mosca tiene secuencias UAS, por lo que si se hace una mosca transgénica que exprese
GAL4 no pasa nada, ya que no hay secuencias UAS endógenas. Sin embargo, si otra
mosca transgénica que tenga cualquier gen clonado rı́o abajo de las secuencias UAS
(gen efector) es cruzada con la mosca que expresa GAL4, la progenie que herede ambos
transgenes expresará el gen efector. Existe una gran colección de lı́neas que expresan
GAL4 en una gran variedad de células y tejidos especı́ficos. Por lo tanto, la expresión
del gen X puede ser accionada en cualquiera de estos patrones cruzando la lı́nea que
expresa GAL4 bajo un promotor especı́fico con moscas que portan el transgen UAS-gen
X [154].
A este sistema también se ha incorporado la utilización del inhibidor de GAL4,

GAL80, también proveniente de levaduras. Esto permite restringir la función de GAL4
en el patrón de expresión que determine el promotor utilizado para expresar a GAL80.
El esquema del sistema completo se puede observar en la figura 4.11.
Figura 4.11: Representación esquemática del sistema GAL4/UAS. El sistema GAL4-

UAS se basa en la crianza de moscas transgénicas que contienen un promotor especı́fico del
tejido que dirige la producción de GAL4 o construcciones transgénicas UAS. La progenie posee
una copia de las construcciones de GAL4 y UAS y expresa el transgén de interés bajo el control
del promotor de interés. Figura modificada de [154].
4.4.3. Lı́neas de Drosophila utilizadas
Para los experimento se utilizaron moscas wild-type (Canton-S) y moscas mutantes

nulas para per (per 01 ), tim (tim0 ) y el neuropéptido pdf (pdf 01 ).
También se expresaron distintos ARN de interferencia de per bajo un promotor

que se expresa en todo el cerebro de la mosca (elav-Gal4). La efectividad del ARN
de interferencia se evaluó mediante el análisis de su expresión por PCR (reacción en
cadena de polimerasa) en tiempo real. Para ello se cruzó la lı́nea elav-Gal4 con la lı́nea
UAS-perRNAi y se utilizó ARN total proveniente de cabeza de moscas adultas. Para
el análisis comportamental, se cruzó la lı́nea elav-Gal4 con la lı́nea UAS-perRNAi y
la progenie de estos cruzamientos, en particular las hembras vı́rgenes, ası́ como los
controles correspondientes fueron analizados. Además, se eliminó la expresión de per
en todo el cerebro de la mosca exceptuando a las neuronas LNv. Para ello el patrón
espacial de expresión de elav-GAL4 se restringió a las neuronas LNv por expresión del
represor GAL80 bajo el promotor pdf (lı́nea pdf-Gal80). Como ya mencionamos, la
combinación de lı́neas GAL4 y GAL80 en un mismo genotipo da como resultado la
expresión del RNA de interferencia de per en aquellas células que expresan sólo GAL4,
es decir en todas las neuronas del cerebro de la mosca excepto en las LNv cuyo reloj
funciona correctamente. La progenie de estos cruzamientos, en particular las hembras,
ası́ como los controles correspondientes fueron analizados. Todo esto fue realizado por
la Dra Lorena Franco y sus estudiantes Paula Drausal y Sabrina Riva en el laboratorio
sito en el Instituto de Investigación en Biodiversidad y Medio Ambiente (INIBIOMA).
4.5 Actividad locomotora 75
4.5. Actividad locomotora

En una primera aproximación a comprender los mecanismos que gobiernan al reloj
circadiano en Drosophila, la actividad locomotora de distintas moscas fue registrada
durante varios dı́as. Como ya mencionamos anteriormente, la resolución temporal es de
un punto por segundo para cada individuo. Una vez obtenidas las series experimentales
de la posición (x,y) de la mosca a cada paso de tiempo, se realizó el análisis estadı́stico
de los datos.
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
days
days
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
11 11
0 12 0 12 0 0 12 0 12 0
Zeitgeber time Zeitgeber time
Figura 4.12: Actogramas para una mosca CS y per nula. Registro de las distancias
recorridas por un macho CS (izquierda) y un macho per nulo (derecha) con resolución de un dato
por segundo durante 5 dı́as de LD y 5 dı́as de DD. Las barras grises representan las condiciones
de oscuridad.
En la Figura 4.12 puede observarse el actograma para una mosca Canton-S en la

izquierda y una mutante para per en la derecha que incluye todos los dı́as que duró el
experimento: cinco con ciclos LD12:12 y cinco con condiciones ambientales constantes
(DD). En el caso de la mosca wild-type, mientras está en LD pueden observarse los
dos picos de actividad y que se entrena con el ciclo, por lo que aparece la anticipación
al cambio de luces. Luego, cuando se cambia a DD, mantiene su ritmicidad pero al no
resetearse el reloj, que tiene un perı́odo endógeno ligeramente menor a las 24 horas,
los ciclos comienzan cada dı́a un poco antes. En cambio, en el caso de la mosca per 01 ,
puede verse que aún en LD la mosca no está entrenada, sino que aparece el fenómeno
de enmascaramiento. En lugar de anticipación a los cambios hay una startle response o
reflejo de sobresalto, es decir, al apagar las luces la mosca se asusta y comienza a mo-
verse mucho más que antes. Luego, al pasar a condiciones DD, se vuelve completamente
arrı́tmica, ya que su reloj está roto.
4.5.1. Leyes de potencia

Muchos procesos naturales pueden describirse por observables cuya función de den-
sidad de probabilidad sigue una ley de la forma f (x) = cx−α , donde a α se lo denomina
exponente de escala. A este tipo de comportamientos se los denomina ley de potencias.
Si tomamos el logaritmo en la ecuación anterior nos queda,
log(y) = log(c) − αlog(x), (4.1)
que es la ecuación de una recta de pendiente −α. Es decir, si en lugar de representar

los valores de x contra los de y en un gráfico, representamos sus logaritmos, log(x)
contra log(y), lo que obtenemos es una lı́nea recta. Por lo tanto si al graficar una
serie de datos en log-log podemos ajustar los datos con una recta, tenemos una ley de
potencias.
Una propiedad importante de las leyes de potencia es su invariancia ante cambios de
escala. Es decir, f (λx) = λ−α f (x) , conserva la misma forma. Las leyes de potencia son
caracterı́sticas emergentes de los sistemas complejos. Son aspectos de la estructura y
función de estos sistemas que permanecen con auto-similitud en una amplia variedad de
escalas espaciales y temporales. Estas leyes reflejan el resultado de reglas o mecanismos
simples, consecuencia de unos pocos principios fı́sicos, biológicos y matemáticos básicos.
En los sistemas fı́sicos, se observa invariancia de escala cerca de un punto crı́tico. Se
ha sugerido que la presencia de leyes de potencia en diversos sistemas biológicos podrı́a
implicar que éstos están próximos a una transición de fase continua. Sin embargo, hay
diferencias fundamentales entre la invariancia de escala que se encuentra en los sistemas
biológicos y fı́sicos. Los sistemas crı́ticos se pueden clasificar en términos de un pequeño
número de clases de universalidad y, dependiendo de las propiedades fundamentales
tales como la dimensionalidad y la simetrı́a, sólo se observan unos pocos exponentes de
escala. Sin embargo, la dinámica del comportamiento exhibe una variación considerable
en los valores de los exponentes de escala. Por último, los sistemas crı́ticos están en
equilibrio, mientras que la mayorı́a de los procesos que ocurren en los sistemas vivos,
incluyendo el comportamiento animal, no están en equilibrio. Por lo tanto, una imagen
fundamentalmente diferente es necesaria para explicar la universalidad de la invariancia
de escala en el comportamiento de los animales y la falta de universalidad de los
exponentes de scaling [155].
Un fractal es un objeto que es autosimilar, es decir, está formado por partes similares
al objeto completo. Por más que lo miremos a diferentes escalas, siempre observamos la
misma forma. Hay ejemplos naturales, como las costas marı́timas, que tienen las mis-
mas propiedades en distintas escalas, o ejemplos matemáticos, como el set de Cantor y
el triángulo de Sierpinski (Figura 4.13). Para caracterizar la autosimilaridad debemos
introducir la dimensión fractal, que describe el comportamiento ante los cambios de
escala de las estructuras fractales. Sea dE la dimension euclideana del espacio donde
está embebido el objeto fractal. El volumen V (l) de un objeto cualquiera puede ser cu-
bierto con cajas de tamaño l y volumen ldE . Como necesitarı́amos N(l) cajas, entonces
V (l) = N(l)ldE . Luego, para fractales esperamos N(l) ldf , donde
lnN(l)
df = liml→0 (4.2)
ln(1/l)
es la dimensión fractal, que es un número no entero. Por ejemplo, para el triángulo

de Sierpinski necesitamos N(l) = 3k triángulos de tamaño l = (1/2)k , con lo que
df = ln(3)/ln(2) = 1,585. Los objetos con df < dE son fractales.
Figura 4.13: Ejemplo de un objeto fractal: el Triángulo de Sierpinski. El fractal de

Sierpinski se puede construir tomando un triángulo cualquiera, eliminando el triángulo central,
uniendo los puntos medios de cada lado, y repitiendo hasta el infinito el proceso en los tres
triángulos restantes como el primero. De esta forma, la estructura triangular del principio se
repite en distintas escalas.
Asi como hay fractalidad en el espacio, también existe fractalidad temporal. Para
medir la fractalidad temporal se hace de la misma forma que medimos fractalidad
espacial: se construyen ventanas temporales en las que se cuentan la cantidad de eventos
que contiene, y se analiza como escala con los distintos tamaños de ventanas. De esta
forma, podemos obtener una cuantificación de la distribución de las fluctuaciones de
una serie temporal.
4.5.2. Resultados
El comportamiento usualmente se entiende como la respuesta a un estı́mulo. Sin
embargo, todos los animales tienen actividad espontánea. Este es el ejemplo de compor-
tamiento más sencillo que se puede pensar, ya que por ejemplo no incluye interacción
entre individuos. Es por esto que entender la actividad espontánea es importante para
comprender el comportamiento del animal [155].
Para realizar el análisis estadı́stico de las series temporales obtenidas en los experi-
mentos, en primer lugar se decidió que la variable de estudio sea la distancia recorrida
por cada individuo a cada paso de tiempo. Para esto, se transformaron las posiciones
p
x(t), y(t) dadas por el programa de tracking en distancias d(t) = x2 (t) + y 2(t).
En la Figura 4.14 se muestra el registro completo de la distancia d(t) recorrida
por una mosca macho Canton-S en oscuridad constante luego de haber sido entrenada
por un ciclo LD12:12 horas durante cinco dı́as. En primer lugar decidimos enfocarnos
en las fluctuaciones en la distancia recorrida por cada individuo. Para esto definimos
I(t) = d(t+1)−d(t), es decir, calculamos la diferencia entre la distancia recorrida entre
dos tiempos consecutivos. En el panel inferior de la Figura 4.14 se observa un ejemplo de
la señal I(t) normalizada por la desviación estándar para todos los dı́as en DD. En esta
figura se puede apreciar la naturaleza circadiana de la señal. Para comenzar a entender
cuáles son los procesos neuronales que hay detrás de estas fluctuaciones, calculamos
la densidad de distribución de I(t). Como se observa en el panel inferior de 4.14, esta
distribución no es Gaussiana. La forma de esta distribución se llama leptocúrtica, y
nos dice que los eventos de amplitudes grandes son mucho más probables que para una
distribución normal.
Figura 4.14: Ejemplo del análisis de las fluctuaciones en el movimiento de una mosca
CS. En el panel superior se observa las distancias recorridas por la mosca durante los dı́as de
oscuridad. A pesar de las condiciones constantes, la mosca sigue siendo rı́tmica. En el panel
inferior, a la izquierda mostramos las fluctuaciones en las distancias y a la derecha el logaritmo
de su densidad de probabilidad.
En la Figura 4.15 mostramos el logaritmo de la densidad de probabilidad de I(t)

para todos los individuos CS y per 01 del experimento (cada color corresponde a un
individuo). Dividimos las fluctuaciones en los dı́as correspondientes a LD y a DD.
Puede observarse que en ambos casos las distribuciones son similares. Sin embargo, se
observa que para las moscas mutantes en per, el triángulo es más ancho.
(a) CS - LD (c) per - LD
(b) CS - DD (d) per - DD
Figura 4.15: Histogramas de las fluctuaciones. Densidades de probabilidad de I(t) co-

rrespondientes a 9 moscas Canton-S (CS) y 9 mutantes para per. Las fluctuaciones tienen una
distribución leptocúrtica, que en el caso de las moscas mutantes es aún más ancha.
Luego se realizó una discretización de la señal obtenida, para lo cual se fijó una
distancia umbral, que corresponde a la mı́nima distancia recorrida para considerar
que la mosca estaba en movimiento. Considerando que la resolución espacial era de 5
pı́xeles por mm, y que el tamaño promedio de un macho equivale a 2 mm, la resolución
obtenida es muy buena. Es por esto que se deben eliminar los datos espurios como el
movimiento de las alas de la mosca cuando se encuentra quieta o pequeños errores del
programa en la búsqueda del animal, con lo cual si el umbral es demasiado bajo todo
esto entrarı́a dentro de la actividad de la mosca cuando no lo es. En forma contraria,
si el umbral que se fija es demasiado alto se eliminarı́a actividad real de la mosca. Se
encontró que en cierto rango de umbrales considerados, no hay cambios cualitativos en
las distribuciones obtenidas. Luego, se fijó el umbral en el mı́nimo valor para el que no
se observaron cambios. A todos los datos que superaron el umbral se les asignó un valor
1, mientras que a los datos que no lo hicieron se les asignó el valor 0, que representa el
estado de quietud del animal. De esta forma se obtuvieron secuencias binarias de unos
y ceros. Un ejemplo del proceso de discretización puede observarse en la Figura 4.16.
Figura 4.16: Discretización de la señal de distancias recorridas por segundo. Ejemplo

de la discretización de la señal: en azul se observan las distancias recorridas por la mosca durante
un minuto y medio. Si la señal pasa el umbral de 5 pixeles, se reemplaza el valor de la distancia
por un 1. En caso contrario se le asigna un 0.
Aunque todas las especies tienen patrones de actividad diferentes, en un trabajo

reciente de Lo et al [156], se encontró que durante la etapa de sueño cuatro especies de
mamı́feros presentan momentos de actividad. Mostraron que las distribuciones de los
tiempos de sueño y de movimiento durante el mismo siguen los mismos patrones. Luego
de analizar datos de ratones, ratas, gatos y humanos, encontraron que la duración de
los episodios de actividad durante el sueño de todos sigue una ley de potencias con el
mismo exponente. En el caso de las distribuciones de tiempos de sueño, todas siguen
una distribución exponencial con tiempos caracterı́sticos que dependen de la especie, en
relación a la masa corporal y la tasa metabólica. Esto sugiere un mecanismo universal
en la dinámica neuronal que controla el sueño [156].
En los invertebrados se ha observado una organización temporal similar en la acti-
vidad. Dadas las similaridades encontradas en los genes reloj entre mamı́feros y Dro-
sophila, vamos a analizar las distribuciones de los tiempos de quietud y movimiento en
la mosca en búsqueda de mecanismos universales en el comportamiento.
En la Figura 4.17 se grafica la superposición de la probabilidad acumulada de la
duración de todos los intervalos de quietud y movimiento de cada uno de los individuos
CS en (a) y per nulos en (b) graficadas en log-log. Analizamos en forma separada la
estructura temporal de los intervalos en los dı́as LD (color negro), DD (color rojo) y en
los dı́as totales (color azul). Los intervalos de quietud siguen una distribución tipo ley
de potencia en una gran parte del intervalo, mientras que los intervalos de actividad
siguen una distribución exponencial. En ningún caso hubo grandes diferencias entre LD
y DD para las moscas CS, mientras que para las per nulas la distribución de intervalos
de actividad tiene tiempos distintos en LD y DD.
(a)
(b)
Figura 4.17: Distribucion de la tasa de eventos de quietud y movimiento para todos

los individuos Canton-S y per0 Se analizó en forma separada los dı́as en LD (negro), en DD
(rojo) y el experimento completo (azul) para individuos normales (a) y para mutantes (b). Los
intervalos de quietud tienen una distribución tipo ley de potencia en gran parte del intervalo,
mientras que los de actividad tienen una distribución exponencial.
Para obtener los tiempos caracterı́sticos de los intervalos de actividad, hicimos el

ajuste de la distribución exponencial. En la Figura 4.18 mostramos el ejemplo del ajuste
Total LD DT DD DT Total WT LD WT DD WT
CS1 4.57 5.41 3.87 0.66 0.55 0.77
CS2 4.99 5.21 4.73 0.63 0.59 0.60
CS3 4.21 4.15 4.25 0.62 0.62 0.59
CS4 7.49 7.42 5.30 0.56 0.53 0.57
CS5 7.79 8.81 6.52 0.69 0.60 0.78
CS6 6.40 6.49 6.35 0.61 0.61 0.62
CS7 6.39 6.53 6.42 0.52 0.53 0.50
CS8 6.90 7.55 6.33 0.66 0.61 0.72
CS9 5.44 5.89 3.84 0.66 0.69 0.68
Distribución promedio 6.21 7.10 5.79 0.58 0.61 0.61
Tabla 4.2: Ajustes de de los tiempos de quietud y actividad para las moscas CS.
Tiempos caracterı́sticos obtenidos con los ajustes a una distribución exponencial para los tiempos
de actividad y a una ley de potencia para los tiempos de quietud.
para una mosca, y en la Tabla 4.2 se muestras los valores de los tiempos caracterı́sticos
obtenidos para todos los nueve individuos CS y para las distribuciones promedio. Estos
tiempos son similares para todos los individuos analizados.
Figura 4.18: Ajuste exponencial para los intervalos de movimiento. Al graficarlo el log-
normal se observa con mayor claridad la distribución exponencial. Al hacer el ajuste se obtiene
que para esta mosca el tiempo caracterı́stico es τ = 6,6. Para todos los individuos el ajuste es
similar.
Ueno et al analizaron las distribuciones de actividad y quietud de moscas wild-

type luego de registrarlas durante 24 horas en cápsulas circulares. Ellos analizaron las
series temporales separándolas en dı́a y noche. Para poder comparar los resultados y
los exponentes obtenidos, en la Figura 4.19 se grafica en log-normal la distribución de
los tiempos de actividad a la izquierda y en log-log la distribución de los tiempos de
quietud, ambos en DD. Al igual que ellos, encontramos que la distribución de tiempos
de quietud tanto de dı́a como de noche sigue una ley de potencias, sin diferencias
significativas entre ambos. Además, los exponentes de los ajustes son los mismos que
encontraron ellos. Que no haya diferencias significativas entre las distribuciones de dı́a
y de noche en DD, como ellos proponen, sugiere que la distribución de los tiempos de
quietud es independiente del reloj circadiano.
Figura 4.19: Intervalos de actividad y sueño para una mosca CS de dı́a y noche.
A la izquierda se grafica la distribución de tiempos de actividad en log-normal y a la derecha la
distribución de los tiempos de quietud en log-log.
Para verificar esto, calculamos las mismas distribuciones pero para una mosca nula
en per, es decir, que tiene el reloj roto, también en DD. Si la ley de potencias de los
tiempos de quietud dependiera del reloj, para estas mosca deberı́a ser distinta. En la
Figura 4.20 mostramos que para las moscas per 0 obtenemos las mismas distribuciones
que para las moscas CS. Nuevamente tanto de dı́a como de noche obtenemos una
ley de potencias para los tiempos de quietud y una distribución exponencial para los
tiempos de actividad. De estos resultados concluimos que el reloj no es quien genera
estas distribuciones.
Figura 4.20: Intervalos de actividad y sueño para una mosca per0 de dı́a y noche. A
pesar de tener el reloj roto, las distribuciones correspondientes al dı́a y la noche son iguales que
para las moscas CS, mostrando que no dependen del reloj.
Respecto a la diferencia con los resultados del trabajo de Lo [156], en el que los
tiempos de actividad siguen una ley de potencias y los de sueño una distribución
exponencial, vale destacar que en las moscas el sueño se define como un tiempo de
quietud mayor a cinco minutos, usualmente medido con el sistema DAM. Debido a la
alta resolución del d-Tracker, al igual que en el trabajo de Ueno, los tiempos de quietud
de esa longitud casi no aparecen. De hecho, la ley de potencias de la distribución de
tiempos de quietud tiene tiempos de segundos a pocos minutos.
Otro trabajo en el cual se analizaron las distribuciones de los tiempos de quietud
en mamı́feros es el realizado por Proekt et al [155]. Ellos propusieron un marco teóri-
co para encontrar invariancias de escala en sistemas fuera del equilibrio, incluyendo
comportamientos en animales. En particular, mostraron que la activación del com-
portamiento de actividad en ratones es invariante de escala. Siguiendo este trabajo,
calculamos la distribución de los tiempos de actividad, pero en este caso definiendolos
el tiempo entre dos episodios de quietud con un tiempo mayor a un tiempo umbral
Tth . Es decir, se considera que la mosca está descansado cuando para un tiempo mayor
a Tth se encuentra sin actividad. En el caso del trabajo de Proekt, ellos registraron
la actividad de ratones durante 22 dı́as y calcularon las distribuciones con tiempos
umbrales entre 30 y 1000 segundos. Encontraron que las distribuciones de los tiempos
de actividad colapsan al reescalarlas dividiendo al tiempo por Tth lo que se muestra en
el panel (B) de la Figura 4.21.
Figura 4.21: Los intervalos de actividad colapsan para los ratones. (A) Distribución
de los tiempos entre intervalos de quietud para ratones para tiempos umbrales Tth entre 30 y
1000 segundos. (B) Mismas distribuciones reescaladas dividiendo al tiempo por Tth . La actividad
de los ratones fue monitoreada durante 22 dı́as. Figura tomada de [155].
Al realizar lo mismo para las moscas Canton-S en LD, encontramos que las dis-
tribuciones además de colapsar, colapsan usando la misma función de scaling que en
los ratones. En la Figura 4.22 se muestran las distribuciones sin el scaling en el inset
y colapsadas en el cuadro principal. Esto tiene la misma forma para todas las moscas
analizadas. Además, el colapso es bueno en todo el rango, con un ancho similar al de
los ratones. Sin embargo, para ventanas del orden de los 30 segundos ya no funciona,
ya que los tiempos de los experimentos son distintos y en consecuencia su estadı́stica
también. Dado que la mosca vive alrededor de 20 dı́as, los experimentos son mucho
más cortos y se mezclan distintas etapas de la vida de la mosca adulta, mientras que el
ratón vive seis meses. Sin embargo, es notable que haya un rango donde da igual que
el ratón y con la misma función de scaling. Esto da una idea de algún mecanismo del
reloj compartido entre mamı́feros e insectos.
Figura 4.22: Los intervalos de actividad colapsan también para las moscas. Distribu-
ción de los tiempos entre intervalos de quietud para una mosca CS en LD para Tth entre 2 y 32
segundos reescaladas dividiendo al tiempo por Tth . En el inset se observan las distribuciones sin
el reescaleo.
En el caso de las moscas CS en DD, la funcion de scaling depende de cada mosca y

el colapso no se da en todo el rango. En la Figura 4.23 se muestra a modo de ejemplo
la distribución de los tiempos de actividad para dos moscas en DD. En el caso de una
0,9 0,35
la función de scaling es t/Tth , mientras que en el otro es t/Tth . Además, se observa
que solo hay colapso en la región de la izquierda, donde dado que es una distribución
de probabilidad acumulada, no nos da ninguna información.
0
10 Tth = 2
Tth = 4
Tth = 8
-1
Tth = 16
10
Tth = 32
0
-2
10
10
-1
10
-2
10
-3
10 -3
10
-4
10 0 1 2 3 4
-4
10 10 10 10 10
10 t
0 1 2 3
10 10 10 10
0.9
t/Tth
Figura 4.23: Intervalos de actividad para las moscas CS en el caso de DD. Se grafican
las distribuciones de dos moscas distintas. Se obtiene que la función de scaling depende de cada
individuo y además las distribuciones con distintas ventanas no colapsan en todo el rango.
Esto nos lleva a pensar de que a pesar de lo notable de la similaridad en los resul-
tados entre el ratón y la mosca para rangos cortos, la distribución de los tiempos de
quietud medida de esta forma no es una buena herramienta para estudiar la estadı́stica
de los patrones de quietud y movimiento de la mosca, ya que requiere una estadı́stica
más larga en el tiempo. Es por esto que decidimos, siguiendo el trabajo de Chialvo y
Antenodo [157], interpretar la actividad de las moscas como procesos de punto.
Un proceso puntual temporal es un proceso estocástico compuesto por una serie

temporal de eventos binarios que ocurren en tiempo continuo. A diferencia de los pro-
cesos de valor continuo, que pueden asumir cualquiera de los valores en cada punto
del tiempo, un proceso puntual puede tomar sólo uno de dos valores posibles, indican-
do si un evento ocurre en ese momento. En cierto sentido, esto hace que los modelos
de probabilidad usados para describir datos de procesos puntuales sean relativamente
fáciles de expresar matemáticamente. Sin embargo, la mayorı́a de las técnicas estándar
de procesamiento de señales están diseñadas principalmente para datos de valor con-
tinuo. En nuestro caso, un evento es una actividad de la mosca por encima del valor
umbral establecido. Luego, el proceso puntual quedará caracterizado por los intervalos
intereventos.
Como se observa en la Figura 4.24, un evento comienza con el primer segundo de

actividad, representado por un uno. El tiempo interevento se define como la cantidad
de pasos temporales desde ese momento al comienzo del segundo evento, independien-
temente si está mayormente compuesto por quietud (0) o movimiento (1).
Figura 4.24: Cálculo de tiempos intereventos. El tiempo interevento se define como la

cantidad de pasos entre el comienzo de un evento y el comienzo del siguiente. En el primer ejemplo
el ti es 43, mientras que en el siguiente ejemplo es de 18 pasos.
En la Figura 4.25 se grafican en log-log la densidad de probabilidad en función de

la frecuencia de ocurrencia de los tiempos intereventos (simbolos vacı́os) e inmovilidad
(llenos) para las moscas CS. Los tiempos están expresados en segundos. Cada curva
representa el acumulado de 8 moscas. Puede observarse claramente que tanto en LD
como en DD, entre los 60 y los 3000 segundos la distribución de los tiempos inter-
eventos, al igual que la de los tiempos de quietud, decae como una ley de potencias.
A diferencia de estos, ya vimos que la distribución de los intervalos de actividad sigue
una distribución exponencial. La estadı́stica de los intereventos está dominada por los
perı́odos de inmovilidad, ya que son en promedio mucho más largos. En este caso, no
se observan diferencias significativas entre los dı́as en LD y en DD.
(a) (b)
Figura 4.25: Distribución de tiempos de episodios de quietud e intereventos para

las moscas CS. Los sı́mbolos llenos corresponden a los intervalos de tiempos intereventos y los
vacı́os a los intervalos de tiempos de inmovilidad. Se analizaron los dı́as en LD (a) y en DD (b)
por separado. Se observa que en ambos casos las distribuciones son iguales, lo que muestra que
el reloj sigue funcionando.
Al analizar las distribuciones de los tiempos intereventos para las moscas mutantes
para el gen per, vemos que siguen una ley de potencias sólo en LD, lo que se muestra en
la Figura 4.26. La discrepancia entre ambas curvas se da especialmente para tiempos
largos. Además, se puede ver que las distribuciones de los tiempos intereventos y de
quietud son prácticamnete iguales incluso a tiempos cortos. Esto indica que al estar su
reloj roto, tanto en LD como en DD tienen otras patrones temporales de distribución
de eventos.
(a) (b)
Figura 4.26: Distribución de tiempos de episodios de quietud e intereventos para

las moscas per nulas. Los sı́mbolos llenos corresponden a los intervalos de tiempos intereventos
y los vacı́os a los intervalos de tiempos de inmovilidad. Se analizaron los dı́as en LD (a) y en DD
(b) por separado.
Luego, calculamos la distribución de la tasa de eventos R. Para esto, dividimos la

serie en n intervalos iguales de longitud T , y contamos el número de eventos N para
cada ventana. Luego, la tasa de eventos se define como Rn = Nn /T . En la Figura 4.27
se muestra la distribución de R para distintas ventanas de T graficadas en log-log.
El gráfico de la izquierda corresponde a una mosca CS en LD y el de la derecha a la
misma mosca en DD. Se puede ver que aunque cambia ligeramente, en ambos casos la
distribución de la tasa de eventos R tiene la misma forma, lo cual confirma que el reloj
sigue funcionando de la misma manera aún en condiciones ambientales constantes.
-1
10
-1
10
-2
10
-2
10
P(R)
P(R)
-3
-3 T = 128 10
10 T = 256
T = 512 T = 128
T = 1024 T = 256
T = 512
T = 1024
-4 -4
10 0 1 2 10 0 1 2
10 10 10 10 10 10
R R
(a) (b)
Figura 4.27: Distribución de la tasa de eventos para una mosca CS . La distribu-

ción de R tiene la misma forma para todas las ventanas. Nuevamente se analizaron en forma
independiente los dı́as en LD (a) y en DD (b) y no se encontraron diferencias para las moscas
wild-type.
En la Figura 4.28 se muestran las curvas de la misma mosca de nuevo en LD y DD

pero colapsadas. Es importante destacar que incluso en DD las curvas colapsan con
el mismo exponente en la función de scaling. Además, nuevamente encontramos que
se obtiene lo mismo que lo encontrado para ratones en el trabajo de Chialvo [157],
donde la distribución de la tasa de eventos colapsa también con la misma función de
scaling. Esto resulta inesperado, y refuerza la hipótesis de un mecanismo universal que
gobierna al reloj.
1
1
10
10
0
P(R) T
P(R) T
10
0
10
T = 128
T = 256
T = 512 T = 128
T = 1024 10
-1 T = 256
T = 512
T = 1024
-1
10
-2
-2 -1 0 10 -2 -1 0
10 10 10 10 10 10
0.82 0.82
R/T R/T
(a) (b)
Figura 4.28: Colapso de la distribución de R para una mosca CS . Las curvas colapsan
tanto en LD (a) como en DD (b) con la misma función de sclaing.
Por completitud, en la Figura 4.29 se muestra el colapso de las curvas para todos los
individuos CS del experimento. Aunque hay variabilidad entre individuos, la función
de scaling es la misma para todos.
Figura 4.29: Colapso de la distribución de R para todas las moscas CS en LD. Si bien
se observa variabilidad entre las moscas, las curvas de todas las moscas colapsan con el mismo
exponente en la función de scaling.
En el caso de las moscas per nulas, las distribuciones son claramente distintas entre
LD y DD, como se observa en la Figura 4.30. Nuevamente a la izquierda se grafica la
distribución de R de una mosca mutante en LD y a la derecha en DD. Se puede ver que
incluso en el caso de LD, cuando los individuos muestran el efecto de enmascaramiento
con el ciclo externo, las distribuciones no tienen invariancia de escala y las curvas
no se pueden colapsar. Esto nos indica que el reloj no está funcionando de la misma
forma que las moscas CS. Cuando la mosca per nula está en DD y tiene en condiciones
ambientales constantes, el cambio de escala de la distribución es significativo. En este
caso la distribución se muestra en log-normal, ya que R no llega a 20. Esto da cuenta
que en oscuridad total el reloj de las moscas mutantes no funciona.
0
10
T = 128 T = 128
T = 256 T = 256
T = 512 T = 512
-1 T = 1024 T = 1024
10
P(R)
P(R)
-2
10
-1
10
-3
10 0 1 2
10 10 10 0 5 10 15 20
R R
(a) (b)
Figura 4.30: Distribución de la tasa de eventos para una mosca per0 . A diferencia de
las moscas wild-type, para las mutantes si hay claras diferencias entre el análisis en LD (a) y en
DD (b).
Para evaluar la presencia de fractalidad en un conjunto de datos utilizamos el factor

de Fano (FF) y el factor de Allan (FA). El factor de Fano se define como la variancia
del número de eventos contados en un tiempo especı́fico o ventana temporal T dividido
por el promedio de eventos en esa escala de tiempo, y está dado por:
F F (T ) = (< Nk >2 − < Nk2 >)/ < Nk > (4.3)
Para un proceso fractal puntual, el FF varı́a como función de la ventana T como

FF(T ) = 1 + (T /T0 )α , donde α, llamado exponente fractal, es un factor entre 1 y 0.
Si α > 0, el fenómeno que representa contiene agregación de puntos sobre un perı́odo
relativamente grande de escalas de tiempo. Si α = 0, los procesos son Poissonianos y la
ocurrencia de tiempo es descorrelacionada. Otra medida que relaciona la variabilidad de
eventos sucesivos y que es útil para detectar eventos agregados en un proceso puntual,
es el factor de Allan. El FA se define como la varianza de la ocurrencia de eventos
para eventos especı́ficos de tiempo T dividido por dos veces el promedio del número de
eventos en un tiempo dado.
F A(T ) = (< (Nk+1 − Nk )2 >)/(2 < Nk >) (4.4)
Este factor se interpreta de manera similar al FF, pero a diferencia de este último,
el FA indica la variabilidad del número de eventos para ventanas temporales sucesivas.
En la Figura 4.31 se grafican los FF y FA en función de la ventana T para los dı́as
completos del experimento, dividiendo las series en tres casos: serie completa, dı́as en
LD y dı́as en DD. En el panel superior se muestra el caso de las series completas para
una mosca CS y una per 01 . Hay un rango donde ambos crecen como T d . Hacer un
cambio aleatorio entre los intervalos de quietud y movimiento modifica ambos factores
principalmente reduciendo el lı́mite superior de la región de escala de potencia. Esto

indica que las propiedades de escala son parcialmente debidas a la distribución de los
intervalos de quietud y movimiento. En el panel inferior se grafican las series divididas
entre los dı́as LD y DD para el mismo individuo. Puede observarse que en el caso de
la mosca CS no hay diferencias significativas entre ambos, mientras que para la mosca
mutante en per cambia la pendiente de ambos factores al pasar a DD.
Figura 4.31: Factor de Allan y Fano para moscas CS y per01 . Factor de Fano y Allan
como función del tamaño de la ventana temporal T. Se hizo el análisis de las series completas y
divididas entre el ciclo LD y el DD para un individuo salvaje (Canton-S) y un individuo mutante
nulo para per.
En resumen, los resultados muestran que el movimiento de las moscas CS es libre de

escala. Esto coincide con lo encontrado para ratones y humanos, lo que sugiere que hay
algún proceso universal que regula la ritmicidad en la actividad locomotora. Cuando el
reloj funciona con normalidad, no se encontraron diferencias significativas al analizar
separadamente los dı́as en LD y los dı́as en DD. En el caso de las moscas per 01 , el
reloj está roto y esto se ve reflejado en las propiedades estadı́sticas de sus patrones
de actividad. Con todas las herramientas utilizadas se observaron diferencias entre las
moscas wild-type y las mutantes.
4.6. Oviposición
En esta sección describiremos los experimentos realizados para dilucidar si el reloj
circadiano está involucrado en el comportamiento de puesta de huevos de las hembras
fecundadas en la mosca Drosophila melanogaster.
4.6 Oviposición 93
4.6.1. Antecedentes
Como mencionamos, la ritmicidad circadiana en Drosophila ha sido reportada en
distintos comportamientos, y entre ellos se encuentra la puesta de huevos de las hem-
bras fecundadas. La oviposición es un fenómeno complejo resultado de dos procesos
fisiólogicos: la vitelogénesis y la retención de huevos [158]. La deposición de huevos
fertilizados incluye una serie de eventos que comienza con la producción de oocitos
a la puesta de huevos en sitios seleccionados. Se encontró que la puesta de huevos en
Drosophila melanogaster tiene un ritmo cercano a las 24 horas, y que continúa en condi-
ciones constantes (DD), demostrando su naturaleza circadiana. También fue mostrado
que el perı́odo presenta compensación térmica (20, 24 y 28◦ ) y nutricional (dieta alta y
baja en proteı́nas) [159]. Sin embargo, el ritmo de oviposición está muy poco estudiado.
La mayorı́a de los estudios fueron realizados a nivel poblacional y no individual, con lo
que no es sorprendente que no se hayan detectado ritmos, ya que hay mucha variación
entre individuos. En los pocos estudios que hay donde las moscas fueron analizadas
en forma individual se encontró que al menos el 50 % de las moscas son rı́tmicas. Esto
hace suponer que la falta de ritmos en condiciones constantes (DD o LL) puede ser un
artefacto que surge de medirlos en poblaciones [160].
Aún queda por dilucidarse cuáles son las bases genéticas, cuál es el circuito neuronal
responsable de la puesta de huevos y si hay regulación hormonal entre otros aspectos
[160].
4.6.2. Protocolo del experimento

Los ensayos de comportamiento de oviposición se realizaron utilizando moscas de
5 o 6 dı́as post-eclosión. Antes de comenzar el ensayo, se introdujo una hembra y un
macho vı́rgenes en cada vial con comida durante tres dı́as, para que el macho fecunde
a la hembra. Luego de ese tiempo, se cambió la hembra a un vial nuevo que sólo tenı́a
una cucharita con comida y una espátula de levadura, para estimular la puesta de
huevos. En cada ensayo se transfirió cada hembra manualmente a un vial nuevo con
una cucharita sin huevos cada cuatro horas, y se retiró la cucharita con huevos del vial
para su posterior medición, como se observa en la Figura 4.32. De esta forma obtuvimos
seis puntos por dı́a (9 am, 1 pm, 5 pm, 9 pm, 1 am, 5 am) para cada hembra. El conteo
de los huevos se realizó en forma individual bajo lupa. Cada experimento se inició con
20 hembras sincronizadas en ciclos controlados LD de 12 horas, y fueron monitoreadas
en esta condición por dos dı́as y luego cambiadas a condiciones de oscuridad constante
(DD) por 7 dı́as consecutivos.
Tanto en los momentos de oscuridad de los primeros dos dı́as como en los ciclos de
oscuridad constante al ingresar al cuarto de las moscas contábamos con una luz roja
tenue para poder hacer el cambio de viales sin afectar el comportamiento de puesta de
huevos. La poca visibilidad y el cansancio en la madrugada fueron los dos principales

factores que llevaron a que varias moscas se escapen de los viales durante el traspaso,
perdiendo cantidad de individuos a lo largo del experimento.
Figura 4.32: Setup del experimento de oviposición.(a) Viales dispuestos en una gradilla
de metal. En cada vial se encuentra una mosca hembra y una cucharita con medio y levadura
sellado con algodón. (b) Cucharitas con medio y una punta de espátula con levadura, donde se
pueden observar los huevos puestos luego de un perı́odo de cuatro horas.
A lo largo de esta tesis se realizaron tres ensayos de puesta de huevos siguiendo el

procedimiento descripto con distintas lı́neas de moscas mutantes. En el primer ensayo
se trabajó con moscas Canton-S, per 0 y tim0 , para verificar si el reloj molecular esta
involucrado en el comportamiento de oviposición. En el segundo ensayo, se utilizaron
moscas que no expresan el gen reloj per pero sólo en el cerebro, a diferencia de las
mutantes per 0 que no expresan el gen en ningún tejido. Por último, en el tercer ensayo
se utilizaron moscas que no expresan per sólo en las neuronas LNv. En los dos últimos
ensayos también se midió la deposición de huevos en los controles correspondientes.
Todos los experimentos fueron realizados en el INBIOMA junto a la Dra Lorena Franco,
el Dr Sebastián Risau Gusman y el Dr Pablo Gleiser.
De acuerdo al periodograma obtenido, cada individuo se clasificó como rı́tmico,
débilmente rı́tmico o arrı́tmico:
Rı́tmico: los datos se ajustaron a una función con un perı́odo cercano a las 24
horas. El pico correspondiente al perı́odo asignado fue el único pico que pasaba
al menos una lı́nea de significancia.
Arrı́tmico: los datos no se ajustaron a ninguna función periódica.
Débilmente rı́tmico: se encontraron componentes rı́tmicos pero la probabilidad

asociada no alcanzó a superar alguna lı́nea de significancia.
4.6.3. Periodograma de Lomb-Scargle

Debido a problemas con el funcionamiento de las computadoras debido a razones
descriptas en el Apéndice A en reiteradas oportunidades en los distintos experimentos
la adquisición de datos se vió interrumpida. Es por esto que para analizar el perı́odo de
las series temporales de los experimentos utilizamos el periodograma de Lomb-Scargle.
El periodograma de Lomb-Scargle es una técnica de análisis espectral que puede
ser aplicada a series temporales no equiespaciadas en el tiempo y forma parte de los
métodos de análisis espectral por mı́nimos cuadrados. Para una serie temporal X(tn ),
donde n = 1, ..., N (número de elementos de la serie temporal) con media cero y
varianza σ 2 , el periodograma de Lomb-Scargle se define como:
Sˆτ (ωi ) XCτ2 (ωi ) XSτ2 (ωi )

1
P (ωi = 2πfi ) = = 2 + , (4.5)
2σ 2 2σ CCτ (ωi ) SSτ (ωi )
donde ωi es la frecuencia angular y fi forman el conjunto de frecuencias en las que
se desea calcular el periodograma. Cada término de la ecuación 4.5 está definido por:
N
X
XCτ (ωi ) = N X(τn )cos[ωi (tn − τ (ωi ))] (4.6)
n=1
N
X
CCτ (ωi ) = N X(τn )cos2 [ωi (tn − τ (ωi ))] (4.7)
n=1
XN
XSτ (ωi ) = N X(τn )sen[ωi (tn − τ (ωi ))] (4.8)
n=1
N
X
XCτ (ωi ) = N X(τn )sen2 [ωi (tn − τ (ωi ))] (4.9)
n=1
(4.10)
y τ que está definida por

Pn
1 n=1 sen(2ωi tn )
τ= arctan Pn (4.11)
2ωi n=1 cos(2ωi tn )
4.6.4. Resultados
Como primer medida se analizó el comportamiento de oviposición en hembras con-
trol (Canton S) ciclos de luz y oscuridad de 12 horas durante 6 dı́as. En la Figura 4.33
se grafica el promedio de los huevos puestos por cada hembra en cada punto medido.
Las barras grises representan las horas de oscuridad y las barras blancas las horas de
luz. Se observa que las hembras CS ponen huevos en forma rı́tmica con un perı́odo de
24.18 horas y un pico de deposición entre las 17 y las 21 hs. Cabe mencionar que sólo
el 50 % de las hembras mostró ritmicidad. Este porcentaje de hembras rı́tmicas podrı́a
atribuirse a la cantidad de dı́as de registro (sólo se analizaron los últimos 4 dı́as), ya
que la inspección visual de los periodogramas de todas las moscas examinadas (n= 15)
sugiere una clara tendencia a la ritmicidad que no resulta significativa con α = 0,05.
Figura 4.33: (a) Medición de los huevos puestos en cada punto. Se observa que el mayor
momento de puesta de huevos al comienza de la noche. (b) Periodograma Lomb-Scargle para la
serie de datos.
Primer ensayo
Con la idea de estudiar los efectos de la pérdida de función del reloj en el control
circadiano de oviposición, se realizaron experimentos de oviposición con hembras mu-
tantes nulas para los genes del reloj, per y tim, y hembras control en condiciones de
luz-oscuridad durante dos dı́as y luego oscuridad constante durante siete dı́as contando
la cantidad de huevos depositados por cada mosca cada cuatro horas. De esta forma se
buscaba poner en evidencia la naturaleza endógena del comportamiento de oviposición.
Bajo la sincronización impuesta por el ciclo de luz y oscuridad, tanto las moscas con
fenotipo salvaje como las mutantes en los genes reloj pudieron sincronizarse (Figura
4.34), mostrando en todos los casos un pico en la deposición en la medición correspon-
diente al intervalo entre las 17 y las 21 horas. Sin embargo en condiciones constantes
(DD) las hembras mutantes nulas para per y tim mostraron arritmicidad en el perfil de
oviposición en contraposición a las hembras control, donde casi el 70 % de ellas posee
un perı́odo muy cercano a las 24 hs (tabla 4.3). De estos resultados concluimos que el
reloj molecular es necesario para el control circadiano de la oviposición.
Genotipo N Perı́odo % rı́tmicas

CS 12 23.78 ± 0.2 66.6 (8/12)
per 0 12 – 0 (0/12)
tim0 12 – 0 (0/12)
Tabla 4.3: Los mutantes nulos de per y tim no tienen ritmos de oviposición. Se observa
que de las doce moscas de cada cepa, solo las CS presentan ritmo circadiano en la oviposición.
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f )
Figura 4.34: El reloj molecular controla la oviposición. Perfil representativo de la puesta

de huevos y su correspondiente periodograma Lomb-Scargle para una mosca: (a-b) CS, (c-d) per01
y (e-f) tim01 .
Segundo ensayo
En el primer ensayo concluimos que el reloj molecular es importante para la ge-

neración de ritmos en la puesta de huevos. Sin embargo, los mutantes utilizados no
expresan los genes reloj en ningún tejido, ni en el cerebro ni en los osciladores periféri-
cos. Con el objetivo de determinar si el ritmo de oviposición depende del reloj central,
se midió la puesta de huevos en la lı́nea elav > per RN Ai , que no expresa per en el
cerebro pero si lo hace en los otros tejidos. También se midió en sus controles elav/+
y per RN Ai /+. Las hembras fecundadas fueron monitoreadas durante dos dı́as en ciclos
LD de 12 horas, y luego cambiadas a condiciones de oscuridad constante (DD) durante
siete dı́as, contando los huevos depositados en las cucharitas cada cuatro horas.
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f )
Figura 4.35: La disminución de per en el cerebro genera arritmicidad. Perfil repre-

sentativo de la puesta de huevos y periodograma Lomb-Scargle para una mosca: (a-b) elav/+
(c-d) perRN Ai /+ y (e-f) elav > perRN Ai .
Durante los dos primeros dı́as, con el ciclo de luz y oscuridad, las tres lı́neas de
moscas se mantuvieron rı́tmicas manteniendo la mayor deposición de huevos entre las
17 y las 21 horas, como se observa en la Figura 4.35. Sin embargo, al pasarlas a DD,
observamos que las moscas de la lı́nea que no expresa per en el cerebro se vuelven todas
arrı́tmicas, mientras que los controles mantienen la ritmicidad en porcentaje superior
al 65 % de los individuos (Tabla 4.4). De esta forma confirmamos la predicción de
que la reducción panneuronal en los niveles de la proteı́na PER genera un fenotipo de
arritmicidad. Por lo tanto deducimos en la jerarquı́a de los relojes, el reloj del cerebro
es el maestro y los relojes periféricos siguen su ritmicidad.

elav/+ 15 24.29 ± 0.12 66.6 (10/12)
RN Ai
per /+ 10 24.46 ± 0.68 80 (8/10)
elav > per RN Ai 13 – 0 (0/13)
Tabla 4.4: Importancia de per en el cerebro. Se observa que más del 60 % de las moscas son
rı́tmicas cuando expresan per en el cerebro, mientras que ninguna de las moscas elav > perRN Ai
lo es. Los análisis corresponden a los 7 dı́as en DD.
Tercer ensayo
Por último, quisimos evaluar cuáles de los grupos neuronales involucrados en la

conformación del reloj maestro es el pacemaker para el comportamiento de oviposición.
Para esto utilizamos una lı́nea de Drosophila que no expresa per en las neuronas LNv,
pdf G4 > per RN Ai y los controles correspondientes pdf/+ y per RN Ai /+. Nuevamente
mantuvimos las moscas en viales con una sola mosca durante dos dı́as en LD y luego
fueron cambiadas por siete dı́as a condiciones de oscuridad constante. En este caso
observamos que todas las moscas se mantienen rı́tmicas a pesar de la ausencia de per
en este grupo neuronal, como se observa en la Figura 4.36. Con esto concluimos que las
neuronas LNv no son responsables del correcto funcionamiento del ritmo de oviposición.

pdf G4/+ 7 25.99 ± 0.5 71.4 (5/7)
RN Ai
per /+ 19 23.84 ± 0.27 52 (10/19)
pdf G4 > per RN Ai 16 23.84 ± 0.31 50 (8/16)
Tabla 4.5: Se detectan ritmos de oviposición en las moscas pdf G4 > perRN Ai .
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f )
Figura 4.36: Las neuronas LNv no controlan la ritmicidad en la puesta de hue-

vos. Perfil representativo de la puesta de huevos y periodograma Lomb-Scargle para una mosca
hembra: (a-b) pdf G4/+, (c-d) perRN Ai /+ y (e-f) pdf G4 > perRN Ai .
4.6.5. Proyectos
Actualmente se encuentra en proceso la construcción de un dispositivo para auto-
matizar los experimentos de puesta de huevos, que se muestra en la Figura 4.37. En el
mismo, cada mosca se encuentra sobre una pista de comida, y cada determinada ven-
tana temporal va avanzando sobre la misma. En este momento se encuentra en fase de
prueba, para encontrar posibles problemas como que la mosca se escape. Para esto se
están realizando experimentos con hembras previamente apareadas de la lı́nea Canton
S (CS) en ciclos LD y luego en condiciones constantes de oscuridad (DD). Al igual
que en los experimentos ya realizados en forma manual, esperamos obtener un pico de
4.7 Conclusiones 101
deposición de huevos entre las 17-21 hs.
Figura 4.37: Ovipositor automático. Dispositivo automatizado para colocar las moscas en
cápsulas que se desplazan automáticamente, de forma tal que los huevos pueden ser contados
sólo una vez por dı́a.
Los experimentos realizados en forma manual fueron el punto de partida para ve-
rificar la importancia del reloj en el proceso de oviposición. Sin embargo, debido a la
demanda humana que requieren los experimentos para poder medir los huevos cada
cuatro horas en forma individual, la cantidad de datos que tenemos es poca. La rea-
lización de este dispositivo es fundamental para poder estudiar grandes números de
moscas y poder avanzar de forma más rápida. Los experimentos con el dispositivo para
encontrar la jerarquı́a del circuito y el rol de las distintas neuronas podrı́an enmarcarse
dentro de un nuevo proyecto de doctorado.
4.7. Conclusiones
La actividad locomotora es sin lugar a dudas el ritmo circadiano más estudiado
en Drosophila. Los primeros experimentos estudiando este ritmo por Seymour Benzer
tienen más de 50 años [117]. Sin embargo, debido a las limitaciones en los dispositi-
vos de medición estándar, aún hay muchas propiedades de la actividad de las moscas
desconocidas, como las propiedades estadı́sticas del comportamiento que surge de la
interacción entre los osciladores del reloj central. Para poder estudiar ésto es necesario
contar con alta resolución espacial y temporal en los datos, por lo que desarrollamos
un nuevo dispositivo de monitoreo de actividad locomotora, el d-Tracker. A diferencia
de los dispositivos usados usualmente, en el que se registra cuando la mosca cruza un
haz de láser, en el d-Tracker registramos los datos por vı́deo, lo que nos permite tener
un gran detalle de las trayectorias de cada individuo. Ası́, logramos obtener nuevos
resultados de un ritmo muy conocido.
En este capı́tulo analizamos los datos registrados con el dispositivo d-Tracker para
moscas wild-type y mutantes para el gen per. Por un lado, encontramos que tanto las
distribuciones de los tiempos intereventos y de quietud como las distribuciones de las

tasas de eventos son cualitativamente iguales a las del ratón cuando la mosca tiene el
reloj normal. Pero aún más sorprendente que esto resulta que las funciones de scaling
también son las mismas, ası́ como el comportamiento de los factores de Allan y Fano,
que dan cuenta sobre la fractalidad de los procesos. Esto nos sugiere que bajo estas
distribuciones hay algún mecanismo del reloj compartido, o al menos algún proceso
que da alguna ventaja adaptativa de forma que fue conservado evolutivamente entre
insectos y mamı́feros. Por otro lado, comprobamos que en el caso de las moscas cuyo
reloj no funciona, los patrones de movimiento son distintos a los de las moscas normales.
Otro de los ritmos interesantes para ser estudiado en Drosophila es el comporta-
miento de oviposición. Si bien existen algunas evidencias de la ritmicidad en la puesta
de huevos, los estudios realizados hasta el momento sobre este ritmo son mayormente
a nivel poblacional, lo cual no permite saber con claridad si la puesta de huevos de
cada mosca es rı́tmica o no. Durante el trabajo desarrollado en esta tesis realizamos
experimentos midiendo la cantidad de huevos puestos por cada hembra contando los
mismos cada cuatro horas durante nueve dı́as. Esto requiere un gran esfuerzo a nivel
de dedicación y recursos humanos, ya que cada mosca es manipulada manualmente,
pero nos permite conocer con certeza que porcentaje de moscas es rı́tmica dentro de
cada genotipo.
En primer lugar verificamos que las moscas wild-type presentan un ritmo circadiano
en la oviposición. Luego, estudiamos lı́neas de moscas que carecen de alguno de los genes
principales involucrados en la generación de oscilaciones circadianas. Encontramos que
tanto las moscas per 01 como las moscas tim0 son arrı́tmicas al poner huevos. Para
identificar la jerarquı́a de los órganos periféricos como los ovarios en la puesta rı́tmica
de huevos, realizamos experimentos con moscas que carecen de per en el cerebro. Los
resultados de estos experimentos mostraron que la presencia de per en el cerebro es
fundamental para que se mantenga el ciclo circadiano. Por último, con el objetivo de
encontrar los circuitos neuronales que dominan la ritmicidad en el comportamiento
de oviposición, analizamos la puesta de huevos en moscas que no expresan de per
en las neuronas LNvs. Encontramos que la disminución de per en estas neuronas no
afectó la ritmicidad de las moscas. A partir de los resultados obtenidos, se diseñó un
ovipositor automático que nos permitirá realizar más experimentos con mayor cantidad
de individuos, y de esta forma mejorar la estadı́stica.
Capı́tulo 5
Conclusiones
El objetivo de esta tesis fue estudiar los ciclos circadianos en tres de los organismos
modelos más importantes en cronobiologı́a: las cianobacterias, los ratones y la mosca
de la fruta. Para ello se utilizaron modelos matemáticos con ecuaciones diferenciales,
simulaciones numéricas, se diseñó y construyó un dispositivo de monitoreo de actividad
locomotora para las moscas, se realizaron experimentos y se hizo el análisis estadı́stico
de los datos obtenidos.
En cianobacterias, estudiamos el valor adaptativo del reloj en el cambio de esta-
ciones, es decir, modelamos cómo las fluctuaciones en la cantidad diaria de luz afectan
la probabilidad de supervivencia cuando diferentes cepas de cianobacterias crecen en
competencia. Utilizamos un modelo matemático que basa la interacción entre las cepas
en un inhibidor difusible en el medio de cultivo.
Propusimos un protocolo experimental más simple que el usualmente utilizado, que
suele incluir trasvasar las cepas a distintas cápsulas diluyéndolas, se puede probar la
predicción del modelo. Con sólo ocho dı́as de competencia y sin diluciones, se puede
comprobar si la predicción del modelo sobre el porcentaje final de cada cepa de cia-
nobacteria es correcta. De esta forma, haciendo uso de la modulación de la luz, se
pueden acelerar los tiempos experimentales para estudiar la influencia del reloj y su
valor adaptativo.
En mamı́feros, estudiamos con un modelo matemático las propiedades de sincroni-
zación entre los dos grupos que forman el reloj central en el cerebro. Utilizando dos
grupos de osciladores de fase totalmente acoplados, analizamos los efectos del cambio
tanto en el acoplamiento interno de cada grupo como en el acoplamiento entre los
dos grupos en la sincronización local y global por medio de simulaciones numéricas.
Encontramos que incluso en este modelo sencillo pueden aparecer efectos antiitutivos,
ya que bajo determinadas condiciones aumentar el acoplamiento puede disminuir la
sincronización global.
Además, incluso con un modelo que no toma en cuenta los mecanismos de oscilación
103
104 Conclusiones
a nivel molecular de cada célula, pudimos reproducir resultados hallados experiemen-

talmente, cómo la formación de pequeños grupos en distintas frecuencias cambiando los
valores del acoplamiento y la relación antifase entre los dos grupos cambiando el retar-
do temporal. Nuestros resultados permitirı́an el desarrollo de un modelo más detallado
que tengan en cuenta los detalles moleculares que permitan responder una pregunta
aún abierta cómo cuáles son las caracterı́sticas de interacción y acoplamiento entre las
neuronas del núcleo supraquiasmático.
En Drosophila, estudiamos dos ritmos circadianos diferentes: uno estudiado desde
hace muchı́simos años, como la actividad locomotora, y uno del que se sabe muy poco,
el ritmo de puesta de huevos en las hembras. Para poder estudiar el ritmo de actividad
locomotora con una alta resolución espacial y temporal, diseñamos y fabricamos un
dispositivo para hacer monitoreo de la actividad locomotora de las moscas por vı́deo.
Una vez construido el dispositivo al que llamamos d-Tracker, realizamos experimentos
con moscas wild-type y mutantes para el gen per.
Encontramos que algunas de las propiedades estadı́sticas de la actividad de la mosca
son muy similares a las del ratón, lo cual da idea de un mecanismo del reloj conservado
entre insectos y mamı́feros. El hecho de que las propiedades de scaling y de fractalidad
sean tan similares entre la mosca y el ratón, junto con las similitudes entre ambos relojes
a nivel molecular ya conocidas, nos permite inferir que algunas propiedades del reloj
son conservadas evolutivamente. Además, encontramos similitudes y diferencias entre
las propiedades estadı́sticas de las moscas wild-type y mutantes, lo cual nos permite
distinguir entre mecanismos controlados o no por el reloj.
En el caso del ritmo de oviposición, lo estudiamos a nivel individual contando los
huevos puestos por cada hembra cada cuatro horas durante nueve dı́as. En primer
lugar, verificamos que las moscas wild-type presentan un ritmo circadiano. Haciendo
experimentos con mutantes, encontramos que la presencia de per en el cerebro es funda-
mental para que se mantenga el ciclo circadiano de oviposición, aunque la disminución
de per en las neuronas LNVs no afecta la ritmicidad de las moscas, por lo que queda
pendiente la búsqueda del circuito neuronal que domina el ritmo.
Los datos obtenidos en la segunda parte del trabajo son el resultado de la cola-
boración en el desarrollo del laboratorio de la Dra Lorena Franco. Los resultados de
esta tesis permitieron el diseño de un dispositivo automático para los experimentos
de oviposición y también el diseño de una incubadora que incorpora el dispositivo d-
Tracker para la obtención de datos de actividad locomotora. Estos nuevos dispositivos
permitirán considerar un aspecto interesante en el que se comenzó a trabajar, pero no
forma parte de esta tesis, y que involucra el estudio del uso del espacio que hacen las
moscas, un tema abierto y de actual interés para la comunidad de Drosophila.
Apéndice A
Dispositivo d-Tracker
El dispositivo para contener las pistas y registrar la actividad locomotora fue cons-
truido basándonos en el dispositivo propuesto por G. Gilestro [152]. El esquema del
d-Tracker puede observarse en la Figura A.1.
Figura A.1: Esquema del dispositivo de registro de actividad locomotora.
El d-Tracker consiste en una caja de fibrofacil que funciona como base y otra como
tapa. Las medidas de la base son 30 por 30 por 12 centı́metros de alto. En el fondo
de la base se colocaron tiras de luces LED blancas y rojas. La intensidad de la lux fue
105
106 Dispositivo d-Tracker
medida con un luxómetro y se obtuvo 2000 luz para las luces blancas y 200 para las
rojas. A partir del experimento en el que se observó actividad nocturna en las moscas,
se cambiaron las luces rojas por luces infrarrojas. Las luces blancas se conectan a la
corriente junto con un timer digital, que regula los intervalos en los que son prendidas.
Las luces infrarrojas se mantienen prendidas constantemente, para evitar fluctuaciones
grandes de temperatura. Además, para ayudar a disipar el calor producido por las luces
LED, se colocó un ventilador en uno de los costados de la base, el cual funciona durante
todo el experimento.
La base se tapa con un acrı́lico semitráslucido, de forma tal que la iluminación de

las tiras LED sea uniforme. Sobre el acrı́lico se colocan las pistas que contienen las
moscas. Para evitar corrimientos de las pistas, se colocaron pasadores del mismo ancho
que las pistas rectangulares, de forma tal que queden bien sujetas. En el caso de las
cápsulas de Petri, se sujetaron con cinta adhesiva. Sobre el acrı́lico también se coloca
un Thermochron, que es un datalogger o registrador de temperatura. El Thermochron
almacena el resultado de las mediciones en su memoria interna. El almacenamiento es
realizado en un intervalo de tiempo programable y definido por el usuario. De esta forma
pudimos tener registro de las fluctuaciones en la temperatura dentro del dispositivo.
Actualmente se cuenta con una incubadora que mantiene la temperatura constante en
25o .
La base junto con el acrı́lico y las pistas con moscas es aislado del exterior con una
tapa de 30 por 30 por 30 centı́metros. En la parte superior de la tapa se colocaron seis
cámaras web con conexión USB, sin los filtros infrarrojos. Las cámaras son conecta-
das a una computadora, que tiene instalado el PySolo-Video. En las imágenes de la
Figura A.2 se observan las imágenes del exterior del dispositivo en uno de los primeros
experimentos utilizando el d-Tracker, mientras que en la Figura A.3 se observan las
pistas ya acomodadas dentro del dispositivo. Una de las principales ventajas de este
dispositivo es el bajo costo, la sencilla implementación y la gran cantidad de individuos
que permite registrar.
107
Figura A.2: Vista exterior del d-Tracker. Fotos de una de las primeras implementaciones
del d-Tracker en el laboratorio.
108 Dispositivo d-Tracker
Figura A.3: Vista del interior del d-Tracker. Foto de las pistas acomodadas dentro de los
pasadores, con las luces rojas encendidas.
Uno de los mayores problemas a la hora de hacer los experimentos fueron la tem-
peratura y la humedad del cuarto de las moscas. En general, las moscas se encuentran
en una incubadora como con la que se cuenta ahora, y las computadoras que hacen
los registros están fuera de ella. Sin embargo, en nuestro caso, las computadoras se
encontraban bajo las mismas condiciones ambientales que las moscas: 25o constantes
y alta humedad, generada por un humidificador (usualmente un 80 %, medida con un
higrómetro). Esto generaba que en varias oportunidades las computadoras se calienten
y en consecuencia se reinicien. Para que el programa continue registrando en ese caso,
se utilizó un script escrito por el Dr. Sebastián Risau para relanzar el programa en caso
que se detenga.
Otro de los problemas a la hora de hacer registros fueron los cortes de luz, hecho no
poco habitual en Bariloche. Debido a esto se colocaron UPS para las luces, de forma tal
que las moscas no pierdan el entrenamiento. Para las computadoras no se pudo hacer
lo mismo ya que para alimentar dos notebooks se necesitan UPS más grandes y no se
contaba con los recursos para adquirirlas.
Actualmente contamos con una incubadora lista para comenzar a a hacer nuevos
experimentos. Dentro de la incubadora, que se muestra en la Figura A.4, las condiciones
109
de humedad y temperatura están perfectamente controladas. Esto nos da la posibilidad

de tener las computadoras fuera de la incubadora y de esa forma no exponerlas a
condiciones desfavorables para su correcto funcionamiento.
Figura A.4: Dentro de la incubadora la temperatura se mantiene sin fluctuaciones. Esto per-
mite tener las condiciones de humedad y temperatura controladas para las moscas, y tener las
computadoras fuera de ese ambiente.
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Publicaciones asociadas
1. What season suits you best? Seasonal light changes and cyanobacterial competi-
tion
G. Cascallares y P. M. Gleiser . Papers in Physics, doi: http://dx.doi.org/10.4279/PIP.070005
(2015)
2. Clustering and phase synchronization in populations of coupled phase oscillators

G. Cascallares y P. M. Gleiser, Eur. Phys J. B, vol 88, (2015)
125
Agradecimientos
A lo largo de estos últimos cinco años mi vida cambió en todos los aspectos. Me
mudé a Bariloche, teniendo por primera vez la experiencia de vivir sola, con una amiga
y en pareja. Viajé, me casé, tuve una hija. Pasé de la oficina al laboratorio, y me di
cuenta que me gusta más lo segundo. La pasé bien, mal y más o menos, pero de todo
algo aprendı́ y siempre hubo alguien que me dió una mano para seguir. Por eso quiero
agradecer a todos los que de una manera u otra forman parte de esta tesis.
Siguiendo un orden caprichoso, voy a comenzar con quienes vivieron más de cerca
este trabajo y con quienes compartı́ el dı́a a dı́a (y un par de noches):
A Pablo, por ser el mejor director de tesis de doctorado que tuve. Por transmitirme
su entusiasmo y hacer de esta tesis una montaña rusa de ideas y proyectos diferentes.
De cada uno aprendı́ algo. Por haberme escuchado cuando lo necesité e ignorado cuando
era necesario, aunque lo haya detestado. Gracias Pablo, te volverı́a a elegir.
A Lore y Seba, por las horas compartidas en el laboratorio y todo lo que aprendı́ de
las moscas.
A todos los de Fiestin. A los que pasaron por la “oficina 1”, en especial a Saltita,
Andy, Rodo, Alex e Isaias, por los mates, charlas y el frı́o compartido. A las chicas,
por los almuerzos, tés y otros encuentros. En especial a Caro por ser la primera en
acercarse, y a Marı́a y Lai por las largas charlas y juntadas a pesar de ser una misión
más difı́cil que el doctorado coordinarlas. A Damián, por los asados para cortar o
despedir la semana (siempre que el clima acompañe). A las tortas de los cumples. Al
técnico que la pifió en la primer semana que estuve acá y me prendió fuego el monitor.
A los asados de Mato.
A Meli, porque como dijo alguna vez, nunca es tarde para conocer a un gran ami-
go. Por las infinitas cosas compartidas y tortas hechas. Por soportarme (y a mi por
soportarte).
A CONICET por la beca y a la DAAD por darme la oportunidad de viajar a
Alemania. Al Dr Hanspeter Herzel por recibirme en Berlin y a Christoph Schmal por
trabajar conmigo.
A Rodri, por bancarme en todas. Por siempre estar ahı́ para convencerme de que
puedo todo lo que quiera y creer en mi. Por hacerme reir.
A Cata, por cambiar mi realidad y mis prioridades. Por levantarse todos los dı́as
127
con una sonrisa. Por soportar estos meses y los nervios que vinieron con ellos.
A mi mamá, por haber forjado gran parte de quien soy hoy. Por haberme apoyado
siempre.
A mis hermanos, porque forman parte de mis recuerdos más lindos.
Y a varios más que formaron parte de este camino, que por suerte no fueron pocos.
Gracias totales.

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TESIS CARRERA DE DOCTORADO EN FÍSICA

CICLOS CIRCADIANOS: ESTRUCTURAS

Dr. Pablo M. Gleiser

Miembros del Jurado

Fı́sica Estadı́stica e Interdisciplinaria – Centro Atómico Bariloche

Índice de tablas xiii

A. Dispositivo d-Tracker 107

Publicaciones asociadas 127

1.1. Caracterización de una función periódica. . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1. Fenotipos circadianos en cianobacteria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3.1. Núcleo supraquiásmatico, reloj maestro en mamı́feros. . . . . . . . . . . 37

3.13. S vs k para distintos σ2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

4.1. Estadios del ciclo vital de Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

4.32. Setup del experimento de oviposición. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

A.1. Esquema del d-Tracker. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

1.1. Los ritmos biológicos tienen distintos perı́odos. . . . . . . . . . . . . . . 4

4.1. Algunos de los principales mutantes de Drosophila. . . . . . . . . . . . 66

Keywords: CIRCADIAN RHYTHMS, SYNCHRONIZATION, COMPLEX NET-

En toda la naturaleza existen comportamientos periódicos que son el resultado de

La organización de la tesis refleja la evolución cronológica del trabajo. Si bien no es

1.1. Ritmos biológicos

Las funciones rı́tmicas están bien definidas matemáticamente, y expresan la re-

Figura 1.1: Caracterización de una función periódica. El perı́odo, la amplitud y la fase

Los ritmos biológicos se clasifican según su perı́odo. El ciclo de luz-oscuridad es pro-

Tipo de ritmo Perı́odo Ejemplo

Ultradianos 0.1 s Electroencefalograma

Circamensual 28 d Ciclo ovulatorio

Circanual 365 d Hibernación

1.1.1. Relojes endógenos

[8]. Para comprobar que el ritmo es endógeno, siguiendo la metodologı́a implementada

1.2. Ritmos circadianos: algunas definiciones.

Son endógenos y tienen oscilaciones auto-sostenidas, ya que al aislarlos del medio

Presentan compensación térmica, es decir, el perı́odo es estable ante cambios de

De manera conceptual, al sistema o reloj circadiano lo podemos pensar como la

La información temporal brindada por el oscilador central a las eferencias regula la

1.3. Organismos modelo.

por sus siglas en inglés) tienen un avance en la fase de su ciclo de sueño-vigilia y un

1.3.1. Organismos modelo en cronobiologı́a.

Desde las primeras observaciones de de Mairan, se sabe que el movimiento de las

Figura 1.4: Actividad locomotora en Drosophila melanogaster . A la izquierda se grafica

Otro factor que convirtió a Drosophila en un organismo modelo muy importante de

si se le transplantaba un NSQ intacto, la ritmicidad era recuperada y se manifestaba el

El primer gen reloj identificado en ratones fue Clock, descubierto a través de un

1.4. El reloj molecular

Los ritmos circadianos están determinados genéticamente por un conjunto de genes

De esta forma se genera un ciclo autoregulatorio de oscilaciones a nivel genético

En los próximos párrafos nos vamos a centrar en el reloj molecular simplificado

Los mecanismos del reloj molecular en mamı́feros y en Drosophila están conserva-

Los componentes básicos del reloj en Synechococcus elongatus fueron identificados

Figura 1.7: Reloj molecular en cianobacteria. A diferencia de otros organismos, un os-

Para sincronizarse con el ciclo ambiental, Drosophila utiliza el fotoreceptor de luz

Figura 1.9: Reloj molecular simplificado de mamı́feros. CLOCK y BMAL1 promueven la

1.5. Mediciones en cronobiologı́a

Figura 1.10: Actogramas en double-plot. (a) Esquema de un actograma.(b) Actograma

1.5.2. Curva de respuesta de fase

El estudio de las curvas de respuesta de fase en distintas especies ha conducido a

la formulación de las siguientes leyes:

Las curvas de respuesta de fase están presentes en todas las especies.

Las curvas de respuesta de fase difieren entre individuos o especies en cuanto a