GESTIÓN DE LABORATORIOS

Facultad de Medicina Código:

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Carrera de Bioquímica Manual de prácticas de laboratorio
Versión: 1.0
Clinica de Parasitología Clínica
Plan: B011 Cód. asignatura: 15665 Página 1 de 7

PRÁCTICA 5:

PREPARACIÓN DE LAMINILLAS Y TINCIONES PARA HECES FECALES

1. Objetivo

- Indicar los procedimientos para la preparación de laminillas y las técnicas de tinción usadas para
la muestra fecal.

2. Resultados de aprendizaje esperados

- Describir el procedimiento para preparar laminillas permanentes siguiendo las instrucciones

descritas en la guía.
- Describir el procedimiento de la técnica de tinción tricrómica de acuerdo a lo señalado en la
literatura.
- Identificar amibas en placas con tinciones permanentes considerando la morfología de cada una
de las mismas.

3. Fundamento teórico

Las preparaciones teñidas son útiles para la identificación de trofozoitos y quistes de protozoarios y para
la confirmación de especies cuando los organismos encontrados tiene una morfología inusual o su
identificación es difícil (cuadro 1.1).

También sirven de material de referencia para consulta o entrenamiento, además las placas positivas
pueden ser enviadas a un laboratorio de referencia.

Cuadro 1.1 Tinciones para protozoarios

PARÁSITO
TINCIÓN FASE
INVESTIGADO
Tricrómica Protozoarios Quistes y trofozoitos
Hematoxilina-hierro Protozoarios Quistes y trofozoitos
Cromotropa Microsporidia Esporas
Cryptosporidium,
Kinyoun modificada Ooquistes
Isospora
Safranina modificada Cyclospora Ooquistes

4. Actividades prácticas

1. TINCIÓN TRICRÓMICA:
1.1. Propósito:
Facilita la detección e identificación de quistes y trofozoitos y permite mantener un archivo
permanente de los protozoarios encontrados. Los protozoarios pequeños que pueden ser
pasados por alto o ser mal identificados en las preparaciones húmedas son observados con más
detalles en las preparaciones teñidas.

La técnica Tricrómica de Whealtly para heces fecales es una modificación de la tinción de Gomori
para tejidos. Es un procedimiento rápido, simple que da como resultado frotis teñidos
uniformemente en los que se puede observar los protozoarios intestinales, células humanas,
levaduras y artefactos.
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1.2. Preparación de las placas:

Con las muestra de heces fecales frescas se realizan frotis que debe ser fijados inmediatamente
en el fijador de Schaudinn o PVA y secados con secador de pelo o en una placa caliente a 60ºC.
También pueden ser utilizadas para esta tinción muestras fijadas en PVA o SAF.

A. Muestra fresca:
- Tomar una porción de heces con un aplicador y colocarlo en un portaobjetos. Realizar un frotis
delgado llevando el material de adelante hacia atrás,
- Si es necesario, diluir las heces con solución salina.
- Inmediatamente colocar la placa en el fijador de Schaudinn durante 5 minutos a 50C o 1 hora
a temperatura ambiente. Es importante que la placa no se seque antes de la fijación.

Fijador de Schaudinn (modificado)

Cristales de Cloruro de Mecurio 4.5 g
Etanol al 95% 31.0 mL
Äcido Acético glacial 5.0 mL

- Disolver el cloruro de mercurio en un frasco con tapa, agitando a intervalos. Añadir el ácido
acético, tapar y mezclar por agitación.

B. Muestra preservada en PVA:

- Mezclar bien la muestra.
- Aplicar 2 o 3 gotas del material sobre un portaobjetos (dependiendo de su densidad).
- Con movimientos de rotación, esparcir el material en toda el área de la placa con la ayuda de
un aplicador.
- Fijar el frotis colocándolo en una placa caliente a 60° C por 5 minutos o deje secar al aire a
temperatura ambiente.
- Las placas, una vez fijadas, pueden ser teñidas inmediatamente o guardarse por varios meses
en un portaplacas o una caja para futuras tinciones.

1.3. Reactivos:
 Alcohol yodado al 70%: preparar una solución stock añadiendo cristales de yodo al etanol al
70% hasta obtener una solución oscura. Para usar: diluir la solución stock hasta obtener una
coloración café rojiza oscura, como de un té fuerte.
 Etanol al 70%
 Colorante tricrómico (puede adquirirse comercialmente)
 Etanol ácido al 90%: .5 mL de etanol al 90% + 0.5 mL de ácido acético glacial)
 Etanol al 95%
 Etanol absoluto (al 100%)
 Xilol

1.4. Procedimiento:
a) Para muestras frescas, remover la placa del fijador de Schaudinn y colocarla en etanol al 70%
por 5 minutos. Luego pasar la placa al etanol yodado al 70% por 1 minuto.
b) Para muestras preservadas en PVA, colocar la placa en etanol yodado al 70% por 10 minutos.
c) Colocar la placa en etanol al 70% por 5 minutos.
d) Pasar a un segundo etanol al 70% por 3 minutos.
e) Colocar en el colorante tricrómico por 10 minutos.
f) Desteñir en etanol ácido al 90% por 1 a 3 segundos.
g) Lavar varias veces en etanol al 100%
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h) Poner en 2 cambios de etanol al 100% por 3 minutos en cada uno.

i) Poner en 2 cambios de xilol por 10 minutos.
j) Montar el extendido con cubreobjetos y Permount.
k) Examinar en el microscopio con objetivo de inmersión. Deberá examinar de 200 a 300
campos del frotis.

1.5. Control de calidad:

Para cada tinción se debe incluir como control un frotis de material con un protozoario conocido
(por ejemplo, Giardia lamblia) preservado en PVA. Cuando la placa está bien fijada y la tinción se
ha realizado correctamente, el citoplasma de los trofozoitos tendrá un color verde azulado, a
veces con un matiz púrpura.

Los quistes tienden a tomar una coloración más púrpura. Los núcleos e inclusiones (cuerpos
cromatoides, glóbulos rojos, bacterias) y los cristales de Charcot Leyden toman una coloración
roja a veces con tintes púrpuras. El glucógeno es disuelto por los solventes y aparece como un
área clara en el organismo.

El material de fondo usualmente se tiñe de verde lo que proporciona un buen color de contraste
con los protozoarios.

2. TINCIÓN HEMATOXILINA-HIERRO:
2.1. Propósito:
Esta tinción permite la identificación de quistes y trofozoitos y puede ser usada como un método
de rutina. Presenta variación de la técnica clásica o la rápida que se utilizan para muestras fecales
frescas o con algunas modificaciones, para muestras preservadas en PVA.

2.2. Preparación de las placas:

A. Muestra fresca:
- Tomar una porción de heces con un aplicador y llevando el material de adelante hacia atrás,
realizar un frotis delgado en un portaobjetos.
- Si es necesario diluir las heces con solución salina.
- Inmediatamente colocar la placa en el fijador de Schaudinn durante 5 minutos a 50 C o 1 hora
a temperatura ambiente.
- Es importante que la placa no se seque antes de la fijación.

B. Muestra preservada en PVA:

- Mezclar bien la muestra.
- Aplicar 2 o 3 gotas del material en placa (dependiendo de su densidad)
- Con movimientos de rotación, esparcir el material en la placa, dejar secar.

2.3. Reactivos:
 Alcohol yodado al 70%: preparar una solución stock añadiendo cristales de yodo al etanol al
70% hasta obtener una solución oscura. Para usar: diluir la solución stock hasta obtener una
coloración café rojiza oscura, como de un té fuerte.
 Etanol al 50%.
 Mordiente: 4 g de sulfato de amonio férrico en 100 mL de agua destilada (preparar el
momento de usar).
 Solución de hematoxilina al 0.5%: 5 mL de solución stock (10 g de Hematoxilina en polvo
disueltos en 100 ml de etanol al 95% que debe ser preparada 6 semanas antes de usar) + 95
ml de agua destilada.
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 Decolorante: diluir el mordiente 1:1 en agua destilada.

 Etanol al 95%.
 Xilol.

2.4. Procedimiento:
a) Para muestras frescas, remover la placa del fijador de Schaudinn y colocarla en etanol
yodado al 70% por 5 minutos.
b) Para muestras preservadas en PVA, colocar la placa en etanol yodado al 70% por 20 minutos.
c) Colocar la placa en etanol al 50% por 3 minutos para muestras frescas y 10 minutos para
preservadas.
d) Lavar en agua corriente por 3 minutos.
e) Colocar en el mordiente de 10 a 20 minutos a 50 C o 12 a 24 horas a temperatura ambiente.
f) Dos cambios en agua destilada durante 3 minutos en total.
g) Colocar en la solución de hematoxilina de 5 a 10 minutos a 50 C o 12 a 24 horas a
temperatura ambiente.
h) Dos cambios en agua destilada durante 3 minutos en total.
i) Desteñir en la solución decolorante entre 1 a 3 minutos.
j) Lavar en agua durante 5 a 30 minutos.
k) Alcohol al 70% 3 minutos.
l) Alcohol al 95% 5 minutos
m) Xilol 3 minutos.
n) Montar el extendido con cubreobjetos y Permount.
o) Examinar en el microscopio con objetivo de inmersión. Deberá examinar de 200 a 300
campos del extendido.

2.5. Control de calidad:

Para cada tinción se debe incluir como control un extendido de material que tenga un protozoario
conocido. Cuando la placa está bien fijada y la tinción se ha realizado correctamente los
organismos se observan azulados o grisáceos con estructuras nucleares negras.

Los cuerpos cromatoides de los quistes de amebas y las inclusiones (glóbulos rojos, bacterias)
de los trofozoitos se tiñen de negro. El material de fondo usualmente se tiñe de azul-gris.

Los quistes y trofozoitos de protozoarios generalmente no se distorsionan, excepto los de

Chilomastix y Tricomona.

3. TINCIÓN CROMOTROPA
3.1. Propósito:
Este método fue desarrollado por el CDC (Control Disease Center) para diferenciar esporas de
Microsporidia del fondo de elementos fecales, usando varios componentes del método de la
tinción Tricrómica.

3.2. Muestra:
- Preparar un frotis delgado en un portaobjetos, utilizando aproximadamente 10 µL de una
suspensión de heces fijadas en formalina al 10% (no concentradas).
- Se pueden utilizar concentrados de formalina, pero el número de organismos será el mismo
que antes de la concentración.
- Fijar al calor en una placa caliente a 60ºC hasta que esté completamente seco (5 a 10
minutos).
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3.3. Reactivos:
 Metanol absoluto
 Colorante cromotropo
 Alcohol ácido: 995.5 mL de etanol al 90% + 4.5 mL de ácido acético glacial.
 Etanol al 95%
 Etanol al 100%
 Xilol

3.4. Procedimiento:
a) Fijar el frotis en metanol absoluto por 5 minutos.
b) Poner en el colorante por 90 minutos.
c) Decolorar en alcohol-ácido por 1 a 3 segundos.
d) Lavar por inmersión en etanol al 95%.
e) Poner en 2 cambios de etanol al 100% por 3 minutos en cada uno.
f) Poner en 2 cambios de xilol por 10 minutos cada uno.
g) Escurrir la placa y realizar el montaje con permount.
h) Examinar el extendido con objetivo de inmersión, al menos 200 a 300 campos.

3.5. Control de calidad:

En cada tinción se debe incluir una placa control de heces que contengan Microsporidia y que
hayan sido preservadas en formalina al 10%. Las paredes de las esporas de Microsporidia se
tiñen de un color rosa-rojizo y miden cerca de 1 µm.

Cambiar las soluciones posteriores al colorante cromotropo después de cada 10 placas para
obtener un buen lavado y deshidratación. Usar objetivo de 100 x para detectar el organismo,
magnificaciones más altas son mejores. A causa de la dificultad de identificación de las pequeñas
esporas es recomendable realizar una segunda observación para confirmar los hallazgos
positivos.

4. TINCIÓN ÁCIDO RESISTENTE (KINYOUN MODIFICADA)

4.1. Propósito:
Identificación de ooquistes de especies de coccidias: Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora, las
cuales son difíciles de identificar en las tinciones de rutina como la tricrómica. A diferencia de la
tinción ácido resistente modificada de Ziehl-Neelsen, esta no requiere el calentamiento de los
reactivos para la tinción.

4.2. Muestras:
Sedimento de la suspensión de heces al 10% en formalina al 10%, centrifugada por 2 minutos.
También pueden ser utilizados otros tipos de especimenes clínicos como líquido duodenal, bilis,
material pulmonar (esputo, lavado bronquial, biopsias).

4.3. Reactivos:
 Alcohol-ácido: 10 mL de ácido sulfúrico + 90 mL de etanol absoluto
 Metanol absoluto
 Carbol fucshina de Kinyoun
 Verde de malaquita al 3%: disuelva 3 g de verde de malaquita en 100 mL de agua destilada)

4.4. Procedimiento:
a) Tomar con una pipeta 1 o 2 gotas de la capa superior del sedimento y extender una película
delgada en el protaobjetos.
b) Dejar secar a temperatura ambiente.
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c) Fijar en metanol absoluto por 30 segundos a 1 minuto y dejar secar.

d) Teñir con Carbol fucshina de Kinyoun por 5 minutos.
e) Lavar brevemente con un chorro de agua destilada y escurrir.
f) Cubrir con alcohol ácido por 30 segundos.
g) Lavar la placa con un chorro de agua destilada.
h) Cubrir con verde de malaquita por 1 o 2 minutos.
i) Lavar con agua destilada.
j) Secar en una estufa caliente a 60º C por 5 minutos.
k) Realizar el montaje con un cubreobjetos y Permount.
l) Examinar usando objetivos de 10 o 40X.
m) Para ver la morfología interna, usar objetivo de inmersión. Se deben revisar 200 a 300
campos.

4.5. Control de calidad:

Debe incluirse en cada tinción una placa control de Crisptosporidium de una muestra preservada
en formalina al 10%. Criptosporidium se tiñe de color rosa-rojizo. El fondo debe teñirse de un
verde uniforme.

5. TINCIÓN DE SAFRANINA MODIFICADA (MÉTODO AL CALOR):

5.1. Propósito:
Para Cyclospora, Cryptosporidium e Isospora. Los ooquistes de Cyclospora en muestras clínicas
son demostrados con la tinción ácido resistente de Kinyoun modificada (en frío).

Sin embargo, con esta técnica, la tinción de los ooquistes varía de no teñidos a muy teñidos,
pudiendo así ser no identificados o mal identificados.

La técnica modificada de safranina produce una tinción más uniforme de estos ooquistes. La
tinción necesita ser calentada hasta hervir utilizando una placa caliente o un microondas.

5.2. Muestra:
Sedimento de un concentrado de muestra fresca o preservada en formalina. Pueden ser teñidos
otros tipos de muestras clínicas como fluido duodenal.

5.3. Reactivos:
- Alcohol ácido: añadir lentamente 3 mL de ácido clorhídrico a 97 mL de metanol absoluto.
Guardar a temperatura ambiente en un recipiente bien cerrado.
- Safranina (utilizar la misma de la tinción Gram)
- Verde de malaquita al 3%: disolver 3 g de verde de malaquita en 100 mL de agua destilada.
Almacenar a temperatura ambiente.

5.4. Procedimiento:
a) Preparar un frotis delgado y dejar secar la preparación sobre una placa caliente.
b) Fijar en alcohol ácido por 5 minutos.
c) Lavar con agua destilada.
d) Poner en safranina hirviendo por 1 minuto.
e) Lavar con agua destilada.
f) Contrateñir con verde de malaquita por 1 minuto.
g) Lavar rápidamente con agua destilada.
h) Dejar secar la placa y realizar el montaje con cubreobjetos y Permount.
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5.5. Control de calidad:

Incluya en cada tinción una muestra que contenga Cyclospora, preservada en formalina al 10%.
Los ooquistes de Cyclospora se tiñen de rojo naranja. El fondo se tiñe de un verde uniforme.

5. Presentación de resultados (Informe o reporte)

5.1 Realice el informe de laboratorio e indique los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio.

6. Guía para discusión de resultados-cuestionario

6.1 Discuta la importancia de las técnicas de tinción, mencionando su aplicación tanto en el área clínica
como en la investigación biomédica.

7. Conclusiones y recomendaciones
7.1 Indique las conclusiones y recomendaciones de la práctica en función de los resultados obtenidos el
análisis y la discusión, los objetivos de la práctica y a la bibliografía consultada.

8. Bibliografía
8.1 Ash L and Orihel T. Parasites: a guide laboratory procedures and identification. ASCP
8.2 Girard, R. (2014). Manual de Parasitología. Técnicas para Laboratorios de Atención Primaria de Salud
y para el Diagnóstico de las Enfermedades Infecciosas Desatendidas.3er. Edición. Honduras.
8.3 Shimizu, R. (2007). Parasitology.