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Fitorremediación en aguas dulces contaminadas

Chapter · January 2015

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Josefa Garcia Jesús M. Torres

University of Vigo University of Vigo
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Elisa Gonzalez-Romero
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 LA INVESTIGACIÓN DEL GRUPO
ESPECIALIZADO DE
TERMODINÁMICA DE LAS REALES
SOCIEDADES ESPAÑOLAS DE
FÍSICA Y DE QUÍMICA
2015

EDITORES:
MARTA MARÍA MATO CORZÓN
MANUEL MARTÍNEZ PIÑEIRO
JOSÉ LUIS LEGIDO SOTO
Editores:
Marta María Mato Corzón
Manuel Martínez Piñeiro
José Luis Legido Soto

ISBN: 978-84-8158-677-0
Depósito Legal:

Imprime: Tórculo Comunicaciones Gráficas, S. A.

Edición 2015
II
ÍNDICE

CAPÍTULO 8. FITORREMEDIACIÓN EN AGUAS DULCES

CONTAMINADAS.
S. Gómez-Fernández, J. García, J. M. Torres, E. González-Romero ............... 79

CAPÍTULO 9. INVESTIGACIÓN SOBRE EL COMPORTAMIENTO

TERMOFÍSICO DE MEZCLAS DE ARCILLAS CON DIFERENTES
AGUAS PARA USO EN REHABILITACIÓN.
C. P. Gómez, R. Moscoso, L. Mourelle, L. M. Casás, J. L. Legido ........... 95

CAPÍTULO 10. DETERMINACIÓN DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA Y

PROPIEDADES VISCOELÁSTICAS DE NANOFLUIDOS DERIVADOS
DEL GRAFENO.
C. H. Merino, J. Calvo-Bravo, M. Pérez-Rodríguez, M. M. Piñeiro , M.J.
Pastoriza-Gallego ........................................................................................... 109

CAPÍTULO 11. CAPACIDADES CALORÍFICAS DE NANOPOLVOS DE

ZNO, MGO Y ZRO2 Y NANOFLUIDOS BASADOS EN ETILENGLICOL A
TEMPERATURAS DESDE 243.15 K HASTA 473.15 K.
D. Cabaleiro, J.L. Legido, L. Lugo ................................................................. 121

CAPÍTULO 12. ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS BACTERIAS

A LA INFLUENCIA DE LOS ULTRASONIDOS UTILIZANDO TÉCNICAS
MICROCALORIMÉTRICAS.
C. Vázquez, T. P. Iglesias, N. Lago, M. M. Mato, J. L. Legido ...................... 133

CAPÍTULO 13. ESTUDIO EXPERIMENTAL DE LA

MICROESTRUCTURA EN LA TRANSICIÓN LÍQUIDO-GEL DE LAS
MEZCLAS DE EMIM-OS + AGUA.
O. Cabeza, E. Rilo, M. Domínguez-Pérez, L. Segade, S. García-Garabal, E.
López-Lago, L. M. Varela Cabo ......................................................................... 143

CAPÍTULO 14. CAPACIDAD CALORÍFICA MOLAR DE MEZCLAS

(1,8-CINEOL + ETANOL). MEDIDA Y MODELIZACIÓN MEDIANTE
UNIFAC Y COSMO-RS.
J. F. Martínez, S. Schneider, J. I. Pardo,A. M. Mainar, J. S. Urieta ......... 157

VIII
La investigación del Grupo
Especializado de Termodinámica de
las Reales Sociedades Españolas de
Física y de Química.
Vol. 7, año 2015, pp. 79-93

FITORREMEDIACIÓN EN AGUAS DULCES

CONTAMINADAS
Siria Gómez-Fernándeza, Josefa Garcíab, Jesús M. Torresb, Elisa González-
a
Romero

a
Departamento de Química Analítica y Alimentaria, Universidad de Vigo,
Lagoas-Marcosende s/n, 36310 Vigo. E-mail: eromero@uvigo.es
b
Departamento de Física Aplicada, Universidad de Vigo, Lagoas-Marcosende
s/n, 36310 Vigo

Resumen
El control de contaminantes antropogénicos es un reto prioritario en la conservación
del medio ambiente, sobre todo si se piensa en salvaguardar el recurso hidrológico
para las generaciones venideras. Sin embargo, es un recurso extremadamente mal
gestionado por las innumerables fuentes de contaminación, las cuales alteran las
propiedades del mismo, afectando a largo plazo los ecosistemas que dependen de él.
El objetivo principal de este trabajo es conocer como actúan las microalgas sobre
determinados contaminantes presentes en el agua, aplicando procesos de
biorremediación con ellas, que intervienen en el proceso como precursoras. Para
conocer su actuación, en primer lugar, se hace necesario caracterizar las muestras de
agua a través de sus propiedades físico-químicas para que aporten información
relativa a la calidad de la misma, investigando, al mismo tiempo, si cada uno de los
parámetros indicadores medidos, está dentro de los límites legales establecidos. En
segundo lugar, analizar si, dichas muestras, están libres de contaminantes y, en caso
de no estarlo, aplicar un proceso de bioremediación para eliminar al contaminante. A
modo de ejemplo, se describe la puesta a punto de un método de fitorremediación
con microalgas del ion fluoruro.

Palabras clave: Fluoruro, Potenciometría, Microalgas, Chlorella vulgaris,

Fitorremediación

INTRODUCCIÓN

El control de los recursos hidrológicos del planeta, así como los vertidos que se pueden
realizar a los mismos, se ha convertido en una necesidad para la conservación del medio
ambiente [1, 2]. Entre los recursos para combatir la contaminación están las plantas (hojas,
raíces, tallo), junto a especies acuáticas como las algas y microalgas, llamándose
fitorremediación al proceso de regeneración del medio ambiente por el uso de especies
vegetales.

Hoy en día, las algas y microalgas están adquiriendo una gran popularidad por sus
numerosas aplicaciones, ya sea en la industria alimentaria, cosmética, etc, aunque algunas
de estas aplicaciones se llevan utilizando desde tiempos muy remotos. Entre sus usos,
también está su implicación en procesos de recuperación medioambiental y pueden actuar,
además, como bioindicadores de la contaminación, de ahí que se realicen estudios acerca
del tipo de cepa, el número de individuos y de la variedad de especies en un determinado

79
S. GÓMEZ-FDEZ, J. GARCÍA, J. M. TORRES, E. GONZALEZ-ROMERO

medio. El beneficio adicional de las microalgas es el potencial ecológico de captura de

gases de efecto invernadero, como el CO2 de la atmósfera, así como de emisión de energías
fósiles. Por lo tanto, las microalgas son capaces de mitigar las emisiones de gases de efecto
invernadero y producen grandes cantidades de biomasa que pueden utilizarse para la
producción de biocombustibles, tratamiento de aguas residuales y otros propósitos
beneficiosos para el medio ambiente.

Muchos investigadores consideran a las microalgas verdes como un medio tecnológico

para la eliminación de contaminantes de las aguas residuales [3, 4]. Las microalgas son
eficientes para eliminar diferentes tipos de contaminantes y sustancias químicas tóxicas
tales como nitrógeno, fósforo, potasio, nitrito, sílice, hierro, magnesio y otros productos
químicos de aguas residuales municipales e industriales. Además, las microalgas tienen alta
capacidad de acumular metales pesados (cadmio, cromo, plomo, etc), metaloides (arsénico,
selenio, etc) y compuestos orgánicos tóxicos (hidrocarburos, colorantes, etc) para formar
biomasa que, posteriormente, puede ser utilizada para la producción de biocombustibles
[4]. Pueden ser utilizadas para la biorremediación de estas sustancias contaminantes y
crecer conforme a las condiciones ambientales, tales como luz, temperatura, pH, salinidad y
contenido de CO2. En la Tabla 1, se muestran diferentes cepas utilizadas en la eliminación
de contaminantes orgánicos (azo-compuestos, fenoles, etc) e inorgánicos (NO3-, NO2-,
NH4+, PO43-, CO2, metales pesados, U y B) de las aguas residuales [5].

Tabla 1. Contaminantes orgánicos e inorgánicos que pueden ser eliminados de las aguas
residuales por acción de las diferentes cepas de microalgas.

80
 FITORREMEDIACIÓN EN AGUAS DULCES CONTAMINADAS

La microalga Chlorella vulgaris, cuyo nombre común es clorela, es un alga verde

que se encuentra en la mayoría de los cuerpos de agua dulce y se incluye en
muchos suplementos dietéticos como un refuerzo del sistema inmunológico. La
Chlorella vulgaris contiene, en su mayor parte, luteína, pigmento de la familia de
los carotenoides, el cual aporta color amarillo a los alimentos, que proporciona,
entre otros, un elevado poder antioxidante, muy beneficioso para la salud humana,
hace que los alimentos procesados sean visualmente más atractivos y puede tener
usos industriales en la producción de energía. Los estudios científicos apoyan
cada uno de estos usos para la Chlorella vulgaris, pero no existe evidencia clínica
sobre el beneficio para la salud en los seres humanos. La variedad Chlorella spp
tiene muchas más aplicaciones, en el campo de la biorremediación de
contaminantes, que la variedad vulgaris u otras cepas de microalgas.

En todos los casos, las microalgas producen biomasa, que puede utilizarse en la
producción de biocombustibles y tratamiento de aguas residuales. La biomasa
microalgal cosechada se encuentra en un orden de tasa de mayor magnitud en
comparación con la biomasa procedente de usos agrícolas o productos forestales
en la misma latitud. El uso de microalgas, para la producción de energía
renovable, combinada con sistemas de tratamiento de aguas residuales eficientes a
un bajo coste, ofrece un prometedor enfoque integral del agua en la lucha contra el
cambio climático, la salud de los ecosistemas y su diversidad ecológica y los
problemas de energía.

En definitiva, hay varias razones para el cultivo de microalgas en aguas residuales

tales como: (i) tratamiento rentable, (ii) bajo requerimiento energético, (iii)
reducción en la formación de lodos y (iv) revalorización de la biomasa en la
producción de biocombustibles.

Entre las especies más controvertidas, por su ambigüedad en considerarlo tóxico o

esencial, es el ion fluoruro. La agencia Europea del Medioambiente, EEA, limita
los niveles de fluoruro en aguas de consumo humano y, estos niveles, no puede
estar por encima de 1 ppm [1]; mientras que la Agencia para la Protección
Ambiental de los Estados Unidos, EPA, considera que el fluoruro no es uno de los
elementos más peligrosos y ha estado permitiendo que, su contenido en aguas
potables, fuera en concentraciones superiores a 2 mg/L e incluso alcanzar niveles
de 4 mg/L, denominando a esas aguas fluoradas [6].

En el año 1997, Griffiths y Bryson [7],

descubrieron ciertos documentos
relacionados con la 2 ª Guerra Mundial y
el Proyecto Manhattan, el programa de
construcción de la primera bomba
atómica (1944), encontrando, entre estos
documentos, la siguiente nota: “La
evidencia clínica sugiere que el
hexafluoruro de uranio puede tener
un efecto marcado sobre el sistema
nervioso central …..… parece más
probable que tales efectos se deban
mas al Fluoruro que al Uranio”

81
S. GÓMEZ-FDEZ, J. GARCÍA, J. M. TORRES, E. GONZALEZ-ROMERO

El fluoruro fue el reactivo químico clave en la producción de la bomba atómica;

millones de toneladas eran esenciales para la fabricación de uranio enriquecido y
plutonio, destinados a la creación de armas nucleares durante la Guerra Fría. Los
documentos revelaban que, en lo relativo al programa de creación de la bomba
atómica norteamericana, el fluoruro era la amenaza más significativa para la
salud, especialmente para los trabajadores y las comunidades situadas en torno a
las instalaciones destinadas a su fabricación. Sin embargo, a los científicos que
crearon la bomba atómica, se les dijo que tenían que fabricar estudios falsos que
concluyeran que los fluoruros eran seguros para la salud pública con objeto de
presentarlas en litigios legales, en caso, de denuncias por envenenamiento con
fluoruro. Y así lo hicieron, generando la controversia con los estudios científicos
de la época, confirmados años después por los estudios de la Dra. Phyllis
Mullenix, jefa de toxicología en el Forsyth Dental Center en Boston, que realizó
una serie de estudios en animales en la década de 1990, los cuales demostraron
que, tal y como se expresaba en el artículo de Griffiths y Bryson, ”el fluoruro es
una potente toxina para el sistema nervioso central”.

Recientemente (2011), a consecuencia de haberse hecho públicos los documentos

del Programa Manhattan y desvelado el encubrimiento de los estudios
toxicológicos del fluoruro, la EPA y el Departamento de Salud y Servicios
Humanos redujeron los niveles recomendados a 0,7 miligramos de flúor por cada
litro de agua, la menor cantidad dentro del intervalo actual aconsejado: 0,7 a 1,2
miligramos por litro [8]. En España, el Ministerio de Medioambiente regula, como
criterio de calidad en los planes hidrológicos, que el valor medio anual de fluoruro
no pueda sobrepasar de las 1,7 ppm [9] o de 1 ppm para aguas elaboradas y
envasadas para el consumo humano [10].

En este trabajo, se analizan varias propiedades físico-químicas de aguas de

diferente procedencia para ver la calidad de la misma. Se investiga si cada uno de
los parámetros indicadores medidos, en las muestras de agua, están dentro de los
límites legales establecidos y, si dichas muestras, están libres o no de
determinados contaminantes. Asimismo, y como ejemplo de reducción de la
concentración de un contaminante, se describe la puesta a punto de un método de
fitorremediación con microalgas en muestras de agua contaminadas con el ion
fluoruro.

MATERIALES Y MÉTODOS

Todos los reactivos utilizados a lo largo del estudio fueron de grado analítico:
NaF (Merck), KI, I2, NaH2PO4 y Na2HPO4 (Panreac), NaOH, NaCl, C2H3NaO2,
C2H4O2 y C6H5Na3O7 (Prolabo). Para la preparación de disoluciones se utiliza
agua ultrapura suministrada por el sistema Ultrapure MilliQ Water, basado en el
proceso de Ósmosis Inversa RO1-Compact/C and UV System (Peter Taboada,
Spain). La disolución de Lugol, utilizada para parar el crecimiento de la microalga
y hacer el contaje de células, se prepara con una proporción de 100g de KI y 50g
de I2 en un litro de agua ultrapura, la cual se conserva a temperatura ambiente y en
ausencia de luz. El muestreo del agua de grifo se lleva a cabo dejando correr el
agua unos minutos y, de forma intermitente, se hace la recogida de la muestra.
Los puntos de muestreo se encuentran en el edificio de CC Experimentales de la

82
 FITORREMEDIACIÓN EN AGUAS DULCES CONTAMINADAS

UVIGO. Las aguas de mar fueron proporcionadas por el Talaso Atlántico y

recepcionadas con un filtrado previo.

El esquema 1 recoge la metodología empleada en este trabajo. La caracterización

físico-química de las muestras de agua se ha llevado a cabo utilizando técnicas
físicas para medir los parámetros físicos de densidad, viscosidad y tensión
superficial; técnicas físico-(bio)químicas para obtener los parámetros indicadores
de pH, conductividad eléctrica, cantidad total de oxígeno disuelto y turbidez, junto
con la técnica del contaje de células para aquellas muestras de agua que han
contenido el cultivo de microalgas. Una vez conocido el valor de los parámetros
anteriores en cada muestra de agua, se analiza la cantidad de ion fluoruro, como
aditivo y como potencial contaminante inorgánico en agua, mediante el uso de
técnicas electroquímicas. Se ha seleccionado la potenciometría con electrodos
selectivos de iones (ESI) para la determinación de este contaminante inorgánico
(Método Oficial Nº 4500-F-B: Standard Methods for the Examination of Water
and Wastewater, 21st Edition, 2005). Tratados todos los resultados obtenidos,
relacionados con la caracterización de la matriz de las muestras de agua, y
optimizado el método de análisis aplicado a la determinación del contaminante, se
procede a la aplicación del método de fitorremediación para eliminar con eficacia
el contaminante, usando cultivos de microalgas para la reducción de la
concentración del ion fluoruro presente, haciéndose el seguimiento del proceso
por el método potenciométrico propuesto.

Esquema 1. Metodología de trabajo empleada en este estudio. Caracterización de la matriz,

análisis de fluoruros por potenciometría con Electrodos Selectivos de Iones (ESI) y
fitorremediación con microalgas.

Caracterización de la matriz: Se hicieron medidas de propiedades físicas como

la densidad con un densímetro de tubo vibrante en forma de U, ANTON PAAR
DMA 4500, el cual se calibra con aire y agua ultrapura y se verifica todos los días.
El lavado del tubo vibrante se hace con etanol y acetona. Para la viscosidad se
utilizó un viscosímetro ANTON PAAR AMV 200 con un capilar de diámetro 0,9
mm y una bola con una densidad de 7,84 g/cm3. El calibrado se lleva a cabo con
agua o con un aceite, en función de la viscosidad de la muestra a medir,
calculando los parámetros de calibrado, a y b, en un rango de temperaturas entre
288,15K y 333,15K y en un intervalo de ángulos entre 30o y 70o. La tensión
superficial se midió con un tensiómetro LAUDA TVT 2, basado en el principio de
la gota colgante, donde la jeringa para la toma de muestra es de 2,5mL y el radio
del capilar donde se introduce la muestra es de 1,055mm. Se hacen medidas de
diez ciclos de tres gotas cada uno. En cuanto al seguimiento de los parámetros
indicadores de la calidad, se realizaron las medidas de los siguientes: oxígeno

83
S. GÓMEZ-FDEZ, J. GARCÍA, J. M. TORRES, E. GONZALEZ-ROMERO

total con un oxímetro OXI 135i/SET WTW y CELL OX 325; de pH con un pH-
metro 744 Metrohm, que consta de un electrodo selectivo de iones, ESI, de
membrana de vidrio para H+, cuya calibración se lleva a cabo con patrones
Metrohm de pH 4 y 7 y el electrodo se conserva en una disolución de KCl 3,5M;
de conductividad mediante el uso de un conductimetro Crison CM35, con
electrodo de medida constituido por dos placas de platino y patrones de
calibración Crison de 147,1413μs y 12,88 ms y, por último, de turbidez con un
turbidímetro 2100p TURBIDIMETER 46500-00 HACH que dispone de
disoluciones de Formazin, con una turbidez de ≤0,1NTU, 20 NTU, 100NTU y
1000NTU para su calibración y de tres patrones secundarios de Gelex, con
turbidez entre 0-10NTU, 0-100NTU y 0-1000NTU, que sirven para comprobar
que el calibrado se ha realizado correctamente y que las medidas son fiables. Para
evaluar el estado de los cultivos y su evolución, se llevó a cabo el contaje del
número de células con un microscopio óptico Nikon modelo SE usando una
cámara de Neubaüer. En ella se colocan 10 μL de una alícuota de una mezcla de
900 μL del cultivo y 100 μL de Lugol.
Análisis de Fluoruros por Potenciometría con ESI: la concentración de
fluoruros en aguas se mide usando el pH/ion metro 692 Metrohm, con un ESI de
membrana cristalina para F-. Para la calibración se utilizan disoluciones de NaF en
un intervalo de concentraciones comprendido entre 0,2 y 2ppm en fluoruro
(elaboradas a partir de una disolución patrón de 1000 ppm), además del medio
necesario para la medida, que será la disolución tampón TISAB, constituida por
NaCl 1M, AcOH 0,25M, NaAcO 0,75M y citrato de sodio 0,001M, que
proporciona un pH de 5 y una fuerza iónica constante de 1,75 M.

Imagen de Fotobiorreactores con cultivos de microalgas (Dpto. Física Aplicada de la UVIGO)

Fitorremediación: los cultivos de microalgas Chlorella vulgaris fueron

proporcionados por el departamento de Física Aplicada y el crecimiento de los
cultivos se tuvo lugar en un fotobiorreactor (Imagen) bajo unas condiciones
concretas de luz, pH y temperatura. El alimento suministrado para su crecimiento
consta de micronutrientes (citrato férrico, Na2-EDTA, Na2MoO4·2H2O,
MnCl2·4H2O, ZnCl2, CuSO4·5H2O, CoCl2·6H2O, B, SeO2) y vitaminas (biotina o
B8, cianocobalamina o B12 y tiamina o B1), junto con el medio de cultivo
(Ca(NO3)2, MgSO4, y KH2PO4) (Tabla 2).

84
 FITORREMEDIACIÓN EN AGUAS DULCES CONTAMINADAS

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En los apartados siguientes, se hace una descripción de los resultados obtenidos,

comenzado con la caracterización de la matriz, aguas dulces y saladas, el control
de cultivos de microalgas, la puesta a punto del método potenciométrico para el
análisis de fluoruros, que conlleva las operaciones de muestreo, tratamiento de
muestra, calibración y medida de la concentración del contaminante, y, por
último, seguimiento del ion fluoruro en el proceso de fitorremediación con
microalgas por el método optimizado.

CARACTERIZACIÓN DE LA MATRIZ: AGUAS DULCES Y SALADAS

Se caracterizaron las matrices (agua MilliQ, destilada, agua dulce de grifo y de

manantial, agua de mar) a través de parámetros físicos como densidad, viscosidad
y tensión superficial (Tabla 2). Los resultados obtenidos se encontraron dentro de
lo esperado [10]. Las diferencias más significativas se localizaron entre las aguas
de mar y MilliQ, en cuanto a la densidad y tensión superficial, produciéndose un
ligero aumento en ambas propiedades a consecuencia de la salinidad de las
muestras de agua de mar.

Este mismo efecto se observa cuando se comparan las muestras de agua destilada,
sin o con la presencia de sales procedentes del medio del cultivo y micronutrientes
añadidos. En cuanto a la viscosidad las diferencias no son significativas.

Tabla 2. Valores de las propiedades físicas de las aguas a 25oC. Desviación de las sondas de
Temperatura 0,02ºC

Por otro lado, se han realizado medidas de conductividad eléctrica, turbidez,

cantidad total de oxígeno y pH (Figura 1), como parámetros indicadores de la
calidad a seguir en las muestras de agua.

85
S. GÓMEZ-FDEZ, J. GARCÍA, J. M. TORRES, E. GONZALEZ-ROMERO

Figura 1. Comparativa entre conductividad, pH, oxígeno y turbidez de las distintas muestras de
agua. Siendo a: agua ultrapura almacenada; b: agua ultrapura reciente; c: agua destilada; d: agua
destilada con medio no autoclavada; e: agua destilada con medio autoclavada; f: agua de grifo; g:
agua de mar; h: agua de mar no autoclavada; i: agua de mar con medio no autoclavada; j: agua de
mar con medio autoclavada

El agua de mar, como era de esperar, por la presencia de sales en disolución,

presenta un pH (7,5±0,1) y una conductividad eléctrica (23,1±0,3) mS/cm) superior
al agua dulce (Figura 2), y ambas superan al agua MilliQ [pH 5,7±0,1 y
conductividad (0,002±0,001) mS/cm]. A su vez, el agua dulce, en presencia de
medio de cultivo de microalgas, tiene mayor conductividad eléctrica debido al
aumento de la concentración de los iones aportados. En cuanto a la cantidad de
oxígeno disuelto, cuyo nivel normal es de 9 mg/L en muestras en contacto directo
con la atmósfera [10], todas las muestras de agua que se analizaron presentan
valores que oscilan entre 8 y 10 mg/L, aproximadamente, dato que confirma la
ausencia de materia orgánica o bacterias en estas muestras analizadas. Por otra
parte, se observa que, en el agua de mar, los valores de oxígeno, (8,1±0,1)mg/L,
son un poco inferiores a causa de la influencia de la salinidad en su solubilidad.

En cuanto a la turbidez, el agua de grifo presenta un valor de 1 NTU, inferior al

límite legal de 5 NTU para aguas potables [10], aunque confirma la presencia de
materia insoluble, en suspensión o dispersión coloidal, cuyo origen puede estar en
la remoción de tierras y su paso por las tuberías de la traída que hace que se
produzca el arrastre de material particulado. El mayor valor de turbidez se
encuentra en el agua de mar con medio autoclavada, cuyas sales en disolución han
precipitado durante el proceso de autoclavado, a causa de la presencia de aniones
en la muestra (cloruros, carbonatos, bicarbonatos, etc.) y las condiciones de
presión y temperatura a las que se someten con la esterilización.

La evolución con el tiempo de las muestras de agua, esto es, su estabilidad, se

sigue con la construcción de gráficos de control de Shewart [12]. En la figura 2, se
muestran los gráficos de control de tres parámetros de calidad para el agua de

86
 FITORREMEDIACIÓN EN AGUAS DULCES CONTAMINADAS

grifo, pues el valor de la turbidez se mantiene constante en 1NTU, durante todo el

periodo en estudio.

Figura 2. Gráficos de control del agua de grifo reciente. Valor de Turbidez: 1 NTU

Cada punto de los gráficos constituye la media, ‫ݔ‬ҧǡ de cinco valores de medidas,
realizadas el mismo día, con su correspondiente desviación estándar, V. La línea
azul marca la media de todos estos puntos, las líneas verdes se corresponden con
‫ݔ‬ҧ±σ, las amarillas o líneas de aviso con ‫ݔ‬ҧ±2σ, y las rojas o líneas de acción con
‫ݔ‬ҧ±3σ.

En definitiva, las propiedades físicas y los parámetros indicadores de la calidad de

las muestras de aguas analizadas se mantienen estables a lo largo del estudio, no
encontrando diferencias significativas entre las muestras recientes y las
almacenadas durante un periodo de tres meses, ya sea en condiciones estériles o
no. Esto va a permitir su uso en los siguientes experimentos que se lleven a cabo
con cultivos de microalgas, al mismo tiempo que facilita la información de que,
cualquier variación de los resultados no será consecuencia de un deterioro de las
muestras de agua o de la inestabilidad de las mismas.

CONTROL DE CULTIVOS DE MICROALGAS

Para tener en cuenta todas las variables a la hora de evaluar los resultados en los
que estén implicados los cultivos de microalgas, se ha estudiado el crecimiento
del cultivo en el fotobiorreactor, evaluando los mismos parámetros físico-
químicos (conductividad eléctrica, turbidez, cantidad de oxígeno disuelto y pH)
que en las muestras de agua (dulce y salada), así como el tipo de recipiente de
almacenamiento (vidrio y plástico). En la Figura 3 puede observarse que, las
propiedades muestran una tendencia al cambio en el primer día, coincidente con el

87
S. GÓMEZ-FDEZ, J. GARCÍA, J. M. TORRES, E. GONZALEZ-ROMERO

tiempo en el que los cultivos de microalgas sufren un crecimiento exponencial

[13] y, a partir del tercer día, el crecimiento deja de ser tan pronunciado y las
propiedades tienden a un valor constante, excepto en la conductividad, cuyo
cambio está asociado también al cambio en los valores de pH y, por tanto, a la
abundancia de los iones en disolución, a través de las constantes ácido-base de las
especies disueltas. Una vez estabilizado el crecimiento del cultivo en el
fotobiorreactor, todos los parámetros se mantienen constantes durante el periodo
estudiado.

Figura 3. Evolución con el tiempo de todas las propiedades físico-(bio)químicas del cultivo de
microalgas en agua de grifo medidas inmediatamente después del muestreo, directamente, del
fotobiorreactor.

En el siguiente estudio, se realiza el muestreo de los fotobiorreactores y las

muestras se mantuvieron almacenadas en dos tipos de materiales: vídrio y
plástico, sin control alguno en las condiciones experimentales de crecimiento de
las microalgas (Figura 4). Se puede observar que, en los recipientes de vidrio
(vidrio sodocálcico tipo III, según farmacopea US), el cambio de las propiedades
es más acusado que en los recipientes de plástico (compuestos por poliestireno),
como consecuencia de las propiedades intercambiadoras de los mismos. Por ello,
es recomendable la conservación de los cultivos en recipientes de plástico, ya que
las propiedades se mantienen mucho más estables.

Figura 4. Comparación del pH, conductividad y turbidez de cultivos en agua de grifo en función
del tipo de material del recipiente de almacenamiento: plástico (línea azul) y vidrio (línea naranja).

Asimismo, el crecimiento de los cultivos de microalgas afecta de forma

considerable a las propiedades físico-(bio)químicas del medio. La manera más

88
 FITORREMEDIACIÓN EN AGUAS DULCES CONTAMINADAS

común de evaluar el crecimiento es a través del contaje de células. Sin embargo,

el procedimiento es bastante tedioso y lleva tiempo. Es por ello que, observando
la turbidez (método más rápido y sencillo), podemos obtener las mismas
conclusiones que con un contaje de células. La Figura 5 muestra la comparativa
de ambos experimentos, donde se puede apreciar que la evolución de la curva es
muy similar en ambos casos, aunque la técnica del contaje es menos preciso,
obteniendo valores más dispersos que con la medida de la turbidez.

Figura 5. Evolución de turbidez y número de células del cultivo en agua de grifo con el tiempo en
muestras medidas inmediatamente después de ser cogidas del fotobiorreactor. En el interior,
turbidímetro y cámara de recuento Neubagüer
(http://insilico.ehu.es/camara_contaje/neubauer_improved.php)

En consecuencia, el patrón exponencial, casi idéntico, obtenido por las dos

técnicas, hace posible deducir una ecuación matemática que relacione ambas
propiedades. La obtención de dicha relación matemática, de forma simple,
facilitará el trabajo y ahorrará mucho tiempo a la hora de obtener datos
experimentales del crecimiento de las microalgas.

ANÁLISIS DE IÓN FLUORURO POR POTENCIOMETRÍA CON ESI

Se realizaron varios calibrados de fluoruro con el fin de determinar, por un lado,

la importancia del electrólito de medida en la obtención de datos experimentales
por potenciometría con ESI de fluoruro, y por otro, evaluar el efecto matriz que
podrían provocar la presencia de microalgas en las muestras o el cambio en el tipo
de agua a analizar. La Figura 6 muestra el calibrado y los parámetros analíticos
del método.

Una vez caracterizada la matriz, se procede a la determinación de la concentración

de fluoruros por el método de adición estándar para el agua de grifo e
interpolación en el calibrado para las aguas de manantial y de mar, con el fin de
estimar dicho valor. La concentración encontrada de ion fluoruro en aguas dulces
es de (19±1) ppb y de (0,140±0,004) ppm para el agua de grifo y manantial,
respectivamente, mientras que el valor es superior para el agua de mar, siendo de
(0,76±0,05) ppm, encontrándose todos los valores por debajo de los límites
legales de 1 ppm en aguas elaboradas y envasadas para el consumo humano [10].

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S. GÓMEZ-FDEZ, J. GARCÍA, J. M. TORRES, E. GONZALEZ-ROMERO

Figura 6. Calibrado potenciométrico de F- con disoluciones patrón de NaF y parámetros analíticos

del método potenciométrico propuesto, mediante la medida de iones fluoruro con electrodo
selectivo de iones (ESI).

Los resultados muestran que, en las medidas potenciométricas del ion fluoruro es
fundamental la fuerza iónica del medio. Para mantenerla constante se utiliza como
electrólito de medida el TISAB, de manera que, cualquier cambio en su
preparación va a suponer una variabilidad de este parámetro, lo que se traducirá
en un cambio en el valor de la pendiente. Para cuantificar el efecto, se prepararon
cinco disoluciones de TISAB por diferentes operarios, obteniendo como resultado
un valor medio de la sensibilidad de (-26,7±0,5) mV/ppm, de tal forma que,
cualquier valor obtenido en la pendiente del calibrado que exceda, o esté por
debajo de ese valor indicado, será consecuencia del efecto matriz provocado por
las especies presentes en la muestra.

FITORREMEDIACIÓN: ACCIÓN DE LAS MICROALGAS SOBRE EL

ION FLUORURO

Previamente a la determinación de la concentración de fluoruros en las muestras

de agua de grifo en presencia de microalgas, se realiza un calibrado en este medio,
para ver como afectan las microalgas a la señal potenciométrica del fluoruro. Se
ha encontrado que el valor de la pendiente del calibrado disminuye en un 18%,
afectando a la sensibilidad del método y confirmando con ello la presencia de
efecto matriz (Figura 7). Por lo tanto, se hace necesario el seguimiento del ion
fluoruro en el proceso de fitoremediación, utilizando este calibrado y aplicando la
técnica de adición estándar, cuando sea necesario.

Figura 7. Calibrado con disoluciones patrón de NaF

90
 FITORREMEDIACIÓN EN AGUAS DULCES CONTAMINADAS

La utilización de un cultivo de microalgas ha sido la base para llevar a cabo la

reducción de la concentración del ion fluoruro en muestras que están
contaminadas con dicho ion (Figura 8). Se han puesto distintas muestras del
cultivo con una concentración de fluoruro del orden de 1ppm, midiéndose cada
una de ellas en días distintos. De la misma forma, se dejan tres muestras iguales
del cultivo con la misma concentración de fluoruro y con el electrólito de medida
(TISAB), siguiendo su evolución a lo largo del tiempo. En las muestras que
siempre han contenido el TISAB, el pH se mantuvo constante con un valor de 5
(los valores de conductividad no se siguieron). El oxígeno sigue el mismo patrón
que en ausencia de microalgas (Figura 2) y se mantuvo dentro de los límites
normales (entre 7 mg/L y 9 mg/L). Por el contrario, la turbidez ha ido creciendo
de manera gradual, empezando en 68NTU (blanco) y terminando en 211NTU
(última medida) (Figura 5). Al mismo tiempo, en la medida de la concentración de
ion fluoruro con ISE (Figura 8E) en las muestras recogidas del fotobiorreactor
(Figura 8A), se observa una disminución paulatina de la concentración de ion
fluoruro con el tiempo (Figura 8F), de 1 ppm a 0,74 ppm (disminución del 26%)
en el medio con TISAB (Figura 8C y 8D izquierda).

Figura 8. Fitorremediaón con microalgas. A.- fotobiorreactores con cultivos de microalgas B.-
composición del electrólito para las medidas potenciométricas, C.- Cultivos con fluoruros a tiempo
inicial en presencia de TISAB, D.- Cultivos con fluoruros a tiempo final (1 mes) en presencia de
TISAB (izda.) y sin TISAB (dcha.), E.- Electrodo Selectivo de iones fluoruro (ESI) y F.-
Evolución de una concentración conocida de fluoruros con el tiempo para cultivos de microalgas
en agua de grifo con electrólito de medida o TISAB.

En cuanto al estado del cultivo, si el medio no contiene el TISAB, se comprueba

que, a partir del segundo día, el aspecto físico de las microalgas se modifica
sustancialmente. El color verde pasa a ser blanco y aparece multitud de material
en suspensión (Figura 8D derecha). Además, en las muestras sin TISAB, la
variabilidad de los parámetros indicadores es distinta (a excepción del oxígeno):
el pH va creciendo paulatinamente desde un valor de 5 a valores de 7,7; la
turbidez, a partir de la segunda muestra (quinto día) aumenta bruscamente a
1000NTU; la conductividad, por su parte, sigue un patrón muy similar al de la
Figura 3. De todo ello, se deduce que se produce la muerte del cultivo a
consecuencia de la presencia del ion fluoruro y de la modificación de los
parámetros ambientales, siendo el más crítico el pH.
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S. GÓMEZ-FDEZ, J. GARCÍA, J. M. TORRES, E. GONZALEZ-ROMERO

CONCLUSIONES

Después del seguimiento de varios parámetros relevantes, que indican la calidad

del agua a lo largo del tiempo, en muestras con diferentes características, se ha
comprobado que las diferencias más significativas están, como cabría esperar,
entre las aguas de mar y las aguas dulces, siendo la causa principal la elevada
concentración de sales disueltas que contiene el agua de mar. La información más
importante a destacar es, que las muestras no sufren deterioro alguno con el
tiempo, de manera que, en cualquier análisis posterior, puede descartarse como
fuente de error. En la determinación de contaminantes, se estima que el valor de
concentración de iones fluoruro presente en el agua de grifo analizada está muy
por debajo de los límites legales (1 ppm), siendo éste valor de (19±1) ppb. Las
aguas de manantial y salada presentan un contenido de iones fluoruro de 7,4 y 40
veces superior al agua de grifo, respectivamente, aunque todos los valores están
por debajo de los límites permitidos.

En el estudio de los cultivos con microalgas, se ha observado la importancia del

crecimiento en las mismas y como afecta éste a los parámetros indicadores de la
calidad del agua. Además, se ha comprobado que, en las muestras analizadas,
existe efecto matriz, por lo que el análisis de los contaminantes en dichas muestras
tiene que llevarse a cabo por la técnica de la adición estándar.

Esquema 2. Resumen de las conclusiones más relevantes, alcanzadas en la puesta a punto del
método de análisis y seguimiento del proceso de fitorremediación de ion fluoruro, en aguas dulces
por potenciometría con electrodo selectivo de iones (ESI).

El método de fitorremediación aplicado en este trabajo se ha abordado con éxito y

ha proporcionado resultados muy prometedores. El uso de microalgas, en concreto
Chlorella vulgaris, para la reducción de iones fluoruro, ha conseguido disminuir
los niveles de fluoruro en un 26% en un período de 30 días, siempre y cuando, el
cultivo de microalgas contaminado se mantenga en unas condiciones ambientales
de pH, temperatura, luz y conductividad eléctrica adecuadas.

Por tanto, se puede concluir que la especie Chlorella vulgaris cuenta con una gran
capacidad para acumular iones fluoruro, aunque esta característica puede estar
condicionada por factores como la densidad de las células, el tratamiento previo
de las mismas o el pH del medio.

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 FITORREMEDIACIÓN EN AGUAS DULCES CONTAMINADAS

LÍNEA FUTURA DE INVESTIGACIÓN

Este trabajo ha sido realizado en colaboración entre el grupo FA2 del

Departamento de Física Aplicada y el grupo QA3 Electroanálisis y Biosensores
del Departamento de Química Analítica y Alimentaria, ambos pertenecientes a la
Universidad de Vigo, dando comienzo a una nueva línea de investigación en la
que se usarán técnicas Electroanalíticas y (Bio)sensores, Físicas y distintos
cultivos de Microalgas para la fitorremediación de aguas contaminadas.
Asimismo, la biomasa generada se caracterizará y se revalorizará.

Agradecimientos. Al personal técnico; Dña. Mª Perfecta Salgado, D. José Lamas y

Dña. Margarita Turnes, de las áreas de Física Aplicada, Química Analítica y
Química Física de la UVIGO, respectivamente, por su ayuda y apoyo técnico.
Financiación recibida por la Xunta de Galicia (BIOAUGA-R2014/030),
MINECO (CTQ2011-28157BQU, PRI-AIBPT-2011-1096), Empresa FRINOVA
(ALEGRIA-INNTERCONECTA) y UE (EnerBioAlgae-SUDOE SOE2//P2/E374)

Referencias
[1] European Environment Agency (EEA), Hazardous substances in Europe's fresh and marine waters:
An overview EEA Technical report , 8 (2011)
[2] BOE 22 de enero, Real Decreto 60/2011, de 21 de enero, sobre las normas de calidad ambiental en
el ámbito de la política de aguas, (2011)
[3] Subashchandrabose SR, Ramakrishnan B, Megharaj M, Venkateswarlu K, Naidu R. Mixotrophic
cyanobacteria and microalgae as distinctive biological agents for organic pollutant degradation. Environ
Int. 51, 59-72 (2013)
[4] Christenson L, Sims R. Production and harvesting of microalgae for wastewater treatment, biofuels,
and bioproducts. Biotechnol Adv., 29(6), 686-702 (2011)
[5] Park JBK, Craggs RJ. Wastewater treatment and algal production in high rate algal ponds with
carbon dioxide addition. Water Sci Technol 61(3), 633-639 (2010)
[6] Environmental Protection Agency (EPA), National Primary and Secundary Drinking Water
Regulations, 816-F-09-004 (2009)
[7] Rappoport, J., La relación secreta entre el flúor, la higiene dental y la Bomba Atómica 2014,
(http://fluoridealert.org/articles/wastenot414/), basado en el artículo de Griffiths J., Bryson, C., Fluoride,
Teeth and the Atomic Bomb, Christian Science Monitor Newspaper, (1997)
[8] Bienestar y Salud (2011) http://es.sott.net/article/2776-EEUU-reduce-el-limite-de-fluor-agregado
[9] BOE 20 de junio, REAL DECRETO 995/2000, de 2 de junio, por el que se fijan objetivos de
calidad para determinadas sustancias contaminantes y se modifica el Reglamento de Dominio Público
Hidráulico, aprobado por el Real Decreto 849/1986, de 11 de abril, 2000
[10] BOE 20 de enero, Real Decreto 1799/2010, de 30 de diciembre, por el que se regula el proceso de
elaboración y comercialización de aguas preparadas envasadas para el consumo humano (2011)
[11] Rodier, J. Análisis de Aguas. 9 Edición. Omega, Barcelona, 2009
[12] Miller J.N., Miller J.C., Estadística y quimiometría para Química Analítica, Prentice Hall, 2000
[13]Rodas-Gaitán, H.A.; Rodríguez-Fuentes, H.*, Flores-Mendiola, G.; Vidales-Contreras, J.A.,
Aranda-Ruiz, J. y Luna-Maldonado, A.I. Rev. Fitotec. Mex. 35 (Núm. Especial 5) 83-86 (2012)

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