MANUAL DE LABORATORIO

QUÍMICA DE LOS ALIMENTOS

Código: MLQA
Versión: 3
Página: 1 de 6 Práctica 8: Pardeamiento Enzimático: Cinética de la
Copia número: 1 Polifenoloxidasa
Reemplaza a: Versión 2

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Javier Garrido, MSc. Lucía Ramírez C, Ph.D. César Zambrano, Ph.D.
(Profesor de Ingeniería en (Coordinadora de Ingeniería (Decano del Colegio de
Alimentos) en Alimentos) Ciencias e Ingenierías)

Gabriel Reyes, Ing.

(Profesor de Ingeniería en
Alimentos)
Fecha: 15/04/2020 Fecha: 01/04/2020 Fecha: 03/04/2020

1. OBJETIVO .............................................................................................................................. 2
2. FUNDAMENTO ..................................................................................................................... 2
3. MATERIALES Y EQUIPOS ................................................................................................... 2
4. REACTIVOS........................................................................................................................... 2
5. PROCEDIMIENTO ................................................................................................................. 3
6. PROBLEMAS. ........................................................................................................................ 4
7. PREGUNTAS.......................................................................................................................... 5
8. REFERENCIAS. ..................................................................................................................... 5
9. LECTURAS SUGERIDAS. .....................................................................................................5
10. APÉNDICES ........................................................................................................................... 6

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1. OBJETIVO
 Revisar conceptos básicos sobre la cinética enzimática.
 Ganar experiencia en la preparación de un extracto enzimático crudo.
 Realizar un ensayo sobre enzimas.
 Estudiar la cinética de la polifenoloxidasa.

2. FUNDAMENTO
El pardeamiento que se desarrolla cuando se exponen al aire superficies cortadas o
golpeadas de frutas, vegetales y mariscos se denomina pardeamiento enzimático porque las
reacciones iniciales implicadas son catalizadas por enzimas. La enzima responsable del
pardeamiento tiene varios nombres como fenolasa, fenoloxidasa, tirosinasa,
polifenoloxidasa, y catecolasa. Esta enzima se encuentra presente en plantas y animales, y
usualmente se llama polifenoloxidasa y tirosinasa en cada caso, respectivamente.

3. MATERIALES Y EQUIPOS
 Espectrofotómetro visible  Elrlenmeyer, 125 mL
 Celdas para espectrofotómetro  Vasos de precipitación, 100 y 600
 Pipetas, 2 y 5 mL mL
 Micropipeta, 250 y 1000 µL  Probetas, 50 mL
 Tubos de ensayo  Papel toalla
 Parafilm  Forceps
 Licuadoras pequeñas  Plancha de calentamiento
 Papel Filtro Whatman No. 1
 Cuchillo
 Hielera

4. REACTIVOS
 Papas pequeñas (almacenadas en refrigeración durante la noche anterior)
 Hielo (dentro de la hielera)
 Buffer A: buffer de fosfato de sodio 0.1 M, pH 6.8, que contenga NaF 0.1 M (preparada
por asistente de laboratorio)
 Buffer B: buffer de fosfato de sodio 0.1 M, pH 6.8 (preparado por asistente de
laboratorio)
 Solución de sulfito: 0.5 % (w/w) NaHSO3 en buffer de fosfato de sodio 0.1 M, pH 6.8
 Dopa: 4 mg/mL en buffer B. Debe prepararse ese momento por el asistente de
laboratorio. Nota: Es difícil disolver Dopa en buffer de pH 6.8. Para facilitar la
preparación, disolver 400 mg de Dopa en 10 mL de HCl 0.1 N, añadir 80 mL de buffer
B, ajustar el pH a 6.8 con KOH 1.0 N, diluir a 100 mL con Buffer B.

 Puede ser necesario calentar levemente para una dilución efectiva en HCl 0.1 N.
Calentar en plancha de calentamiento con agitación sólo hasta que se disuelva Dopa.

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5. PROCEDIMIENTO
Nota: Este procedimiento es una adaptación de un método descrito por Boyer.

Tabla N.1: “Volúmenes de buffer, sustrato y extracto de enzima para análisis de

polifenoloxidasa (PPO por sus siglas en inglés).

Número de tuboa
Reactivo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Buffer
2.5 2.4 2.35 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 0.8 0.7 0.6 -
Bb, mL
Sulfitoc,
- - - - - - - - - - - 2.0
mL
Dopad,
- 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 2.0 2.0 2.0 0.5
mL
Extracto
de
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5
enzima,
mL

a
Volumen total en cada tubo debe ser igual a 3.0 mL
b
Buffer de fosfato 0.1 M, pH 6.8
c
NaHSO3 en buffer B, 0.5 % (w/w)
d
4 mg dopa/mL de buffer B, pH 6.8

5. 1 Preparación de un Extracto Enzimático Crudo.

5.1.1 Pelar una papa cruda que se almacenó en refrigeración y cortar en pedazos pequeños.
5.1.2 Rápidamente pesar 10 g de papa y mezclar con 50 mL de buffer A frío.
5.1.3 Licuar la mezcla por 1 minuto.
5.1.4 Filtrar la mezcla con papel filtro Whatman No. 1 en un erlenmeyer de 125 mL, que se ha
apoyado en la hielera con hielos para enfriar; mantener en hielo hasta su uso.

5. 2 Análisis de Enzima.

5.2.1 Transferir los volúmenes de buffer B, solución de Sulfito y Dopa descritos en la tabla N. 1 a
los tubos de ensayo correctamente numerados del 1 al 12, tomando en cuenta de pipetear los
volúmenes con exactitud.
5.2.2 Programar la longitud de onda en el espectrofotómetro a 475 nm y encerar el equipo contra
agua destilada. Encerar después de cada ensayo.
5.2.3 Cuando todo esté listo, iniciar la reacción añadiendo el extracto de enzima. Mezclar bien y
registrar las absorbancias inmediatamente. Para esto, una persona debe realizar y registrar
las lecturas, mientras que otra persona mira el reloj e indica cuándo deben realizarse las
lecturas. La toma de las lecturas debe realizarse en intervalos de 15 segundos por 2 minutos
para cada tubo. Registrar todas las lecturas.

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5.3 Tratamiento de los datos.

5.3.1 Realizar un gráfico de absorbancia versus tiempo para cada tubo. Estimar la tasa de reacción
en cada tubo de la parte lineal de la curva absorbancia versus tiempo.
5.3.2 Determinar las velocidades de reacción para los tubos 2-8. Expresar la velocidad de la
reacción como milimoles de IQ (indol-5,6-quinona) por litro por minuto.
5.3.3 Construir un gráfico de velocidad versus [S] (concentración del sustrato) para los tubos 2-8.
5.3.4 Construir un gráfico Lineweaver –Burk con los datos de los tubos 2-8. Determinar KM y
Vmax para la enzima. En el gráfico Lineweaver –Burk se presenta 1/V versus 1/[S].
5.3.5 Determinar la actividad enzimática (tasa) para los tubos 9-11. Graficar la actividad versus el
volumen usado de extracto de enzima. ¿Es el gráfico lineal? ¿Si es así, es esto lo que se
esperaba? ¿Por qué? Si no es lineal, ¿cuál puede ser una explicación plausible?
5.3.6 Comparar la actividad del tubo 12 con la del tubo 7. ¿Son diferentes? ¿Por qué?

5.4 Apuntes requeridos.

5.4.1 Un gráfico de absorbancia versus tiempo de cada tubo.

5.4.2 Una tabla mostrando todos los datos del análisis de la polifenoloxidasa. Para cada tubo, se
debe registrar la tasa, velocidad, 1/V, [S] y 1/[S]. Asegúrese de incluir unidades para cada
variable.
5.4.3 Un gráfico de la velocidad versus [S] para los datos de la polifenoloxidasa.
5.4.4 Un gráfico Lineweaver-Burk para los datos de la polifenoloxidasa.
5.4.5 Cálculos para Vmax y KM para la polifenoloxidasa.
5.4.6 Un gráfico de la velocidad de la enzima versus el volumen de extracto de enzima para los
datos de la polifenoloxidasa.

6. PROBLEMAS.
6.1 Un extracto crudo de polifenoloxidasa se preparó licuando una papa pequeña con buffer. La
actividad del extracto fue analizada según el protocolo descrito anteriormente. Dopa (2.0
mmol/L en la última mezcla del ensayo) se utilizó como sustrato. Se obtuvieron los
siguientes valores de absorbancia a 475 nm:

Tabla N. 2: “Datos de absorbancia del análisis de polifenoloxidasa (PPO) en extracto de papa

usando Dopa como Sustrato”.
Tiempo, min 0 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 1.75 2.0
Absorbancia,
0 0.1 0.2 0.3 0.39 0.47 0.54 0.60 0.65
475 nm

a. Determinar la tasa inicial de la reacción. Respuesta: 0.4 unidades de absorbancia/min

b. Calcular la velocidad de la reacción. Respuesta: 0.08 mmol.L-1.min-1

6.2 Una serie de ensayos usando concentraciones diferentes de sustrato se realizaron con el
extracto de papa descrito en el Problema 6.1. Se obtuvieron los siguientes datos. Llenar las
celdas vacías.
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Tabla N. 3: “Velocidad de la reacción de oxidación de Dopa por PPO con diferentes

concentraciones de sustrato”.
V, mmol.L-1.min- 1/V,
[S], mmol.L-1 1/[S], L.mmol-1 1
L.min.mmol-1
1.0 0.050
1.5 0.069
2.0 0.085
2.5 0.099
3.0 0.111
3.5 0.125
4.0 0.132

a. Construir un gráfico de la velocidad versus la concentración del sustrato. ¿Es lineal? ¿Por
qué si o no?
b. Construir un gráfico Lineweaver-Burk para los datos, Determinar KM y Vmax para el
extracto. Respuesta: KM= 5.0 mmol/L; Vmax= 0.3 mmol.L-1.min-1.
c. Los valores de KM y Vmax a veces varían considerablemente entre extractos de papas.
¿Cuál puede ser la explicación? Pista: la eficiencia la extracción de la enzima varía con el
tiempo de licuado, la temperatura, la proporción entre papa y buffer.

7. PREGUNTAS.
7.1 ¿Es el gráfico de Lineweaver-Burk lineal? Si no, ¿cuál es su explicación?
7.2 ¿Qué indica el valor de KM obtenido?
7.3 ¿Es el bisulfito un inhibidor efectivo?
7.4 ¿Afecta la concentración de la enzima a la velocidad? Afectaría a KM y Vmax ¿cómo fueron
determinados en este laboratorio?

8. REFERENCIAS.
1. Sapers, G. M. Food Techol. 1993, 47, 75-84.
2. Boyer, R. F.J. Chem. Ed. 1977, 54, 858.

9. LECTURAS SUGERIDAS.
Iyengar, R.; McEvily, A J. Trend Food Sci. Technol.1992, 3(3), 60-64.
Martínez, M. V.; Whitaker, J. R. trends Food Sci. Technol. 1995, 6(6), 195-200.
Richardson, T.; Hyslop, D. B. En Food Chemistry, 2nd ed.; Fennema O. R, Ed.; Marcel Dekker:
New York, 1985; 371-476.
Stryer, L. Biochemistry. 3rd ed.; Freeman: New York, 1988.
Wharton, D. C.; McCarty, R. E. Experiments and Methods in Biochemistry. MacMillan: New York,
1972.
Whitaker, J. R. In Food Chemistry, 3rd ed.; Fennema, O. R., Ed.; Marcel Dekker: New york, 1996;
pp.431-53

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10. APÉNDICES
10.1 Histórico de las revisiones

Emisión No Fecha Descripción

1 27-05-2008 Nuevo
2 22-08-2016 Actualización del documento (Versión 1)
3 23-08-2017 Actualización del documento (Versión 2)
4 15-04-2020 Actualización del documento (Versión 3)

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