Evaluación de la actividad de la xilanasa obtenida de Aspergillus niger

inoculado en raquis de maíz como sustrato sólido.

Bósquez Anthony1, Enríquez Pavel1, Llano Mateo1, Avalos Rodrigo1, Granda Silvana1

adbosquez@espe.edu.ec, cpenriquez@espe.edu.ec, msllano@espe.edu.ec, ravalos@espe.edu.ec,

slgranda@espe.edu.ec.
1
Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura, Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las
Fuerzas Armadas ESPE, Sangolquí-Ecuador.

RESUMEN

El presente estudio se realizó en los laboratorios de la Universidad de las Fuerzas Armadas “ESPE” con la
finalidad de obtener un extracto rico en xilanasa y sus purificados obtenido a partir del hongo Aspergillus
niger cultivado sobre un sustrato sólido de raquis de maíz. Se planteó evaluar las características del sustrato
para el desarrollo del hongo con la correspondiente actividad enzimática de la xilanasa y determinar las
constantes cinéticas para el extracto crudo y purificado. Para realizar la extracción y purificación enzimática
se utilizaron diversas técnicas de centrifugación y filtración. El análisis de la actividad enzimática de la
xilanasa se realizó a partir de diversidad de reactivos, los cuáles se detallarán en el transcurso de todo el
estudio. Para los cálculos de las constantes cinéticas del extracto sin purificar y purificado se utilizó el método
de linealización de Lineawever-Burk obteniéndose como resultados de velocidad máxima y Km para el
extracto crudo, el purificado con milipore y purificado por sulfato de amonio respectivamente los siguientes
valores: 0,014 µmol/min y 0,047 µM; 0,012 µmol/min y 0,049 µM; 0,072 µmol/min y 0,0142 µM. Se concluyó que es
viable obtener xilanasa utilizando Aspergillus niger, obteniéndose una mayor actividad específica en el
extracto purificado.
Palabras clave: Xilanasa, extracción, purificación, inmovilización, Birchwood Xilano.

ABSTRACT

The present study was carried out in the laboratories of the University of the Armed Forces "ESPE" in order to
obtain a purified extract of xylanase obtained from the fungus Aspergillus niger cultivated on a solid substrate
of corn rachis. It was proposed to evaluate the characteristics of the substrate for the development of the
fungus with the corresponding enzymatic activity of the xylanase and to determine the kinetic constants for
the crude and purified extract. To perform the extraction and enzymatic purification, various centrifugation
and filtration techniques were used. The analysis of the enzymatic activity of xylanase was carried out from a
variety of reagents, which will be detailed throughout the entire study. For the calculations of the kinetic
constants of the unpurified and purified extract, the Lineawever-Burk linearization method was used,
obtaining as results of maximum velocity and Km for the crude extract, the one purified with milipore and
purified by ammonium sulfate respectively, the following values: 0.014 μmol / min and 0.047 μM; 0.012
μmol / min and 0.049 μM; 0.072 μmol / min and 0.0142 μM. It was concluded that it is feasible to obtain
xylanase using Aspergillus niger, obtaining a higher specific activity in the purified extract.
Keywords: Xylanase, extraction, purification, immobilization, Birchwood Xylan.

I. INTRODUCCIÓN
Aspergillus niger
Aspergillus niger es un hongo filamentoso, saprofito formado por hifas hialinas septadas que pueden tener
reproducción sexual con formación de ascosporas en el interior de las ascas, también pueden reproducirse
asexualmente por la formación de conidios. Aspergillus niger fue descubierto por el biólogo italiano Pier
Antonio Micheli describiendo a Aspergillus niger como un moho negro de varios vegetales como en la

1
lechuga, tomate, acelga y limón [ CITATION Rey13 \l 12298 ]. En su morfología se destaca cabezas conidiales
de tonos negro, son globosas, radiadas o divididas formando columnas de cadenas de conidios irregulares o
bien definidos. Es un hongo dañino para la salud en humanos y animales produciendo aspergilosis que
provoca alteraciones pulmonares, apareciendo en mayor cantidad en horticultores, ya que inhalan el polvo con
más facilidad [ CITATION Lóp06 \l 12298 ]. El Aspergillus niger es utilizado para la obtención de enzimas a
nivel industrial, como la α-Amilasa, amiloglucosidasa, catalasa, celulasa, α-Galactosidasa, β-Galactosidasa, β-
Gluconasa, glucoamilasa, glucosa aerodeshidrogenasa, glucosa oxidasa, αGlucosidasa, α-D-Glucosidasa, β-
Glucosidasa, hemicelulasa, hesperidinasa, invertasa, lipasa, pectinasa, pitasa, proteasa y tanasa [ CITATION
Sáe12 \l 12298 ].
La Fermentación en estado sólido
Se define como un proceso fermentativo desarrollado para la producción de enzimas, metabolitos y esporas.
Para este proceso se utiliza un sustrato inerte como soporte sólido (residuos agrícolas), el cual debe poseer la
humedad necesaria para estimular el crecimiento y el metabolismo del microorganismo, utilizando una fuente
de nitrógeno y nutrientes, bajo control de pH, temperatura, humedad y aireación; estos cultivos se asemejan
mucho al hábitat natural de los microorganismos, por lo cual aumentan su actividad [ CITATION Pan02 \l
3082 ][ CITATION Sin09 \l 3082 ].

Condiciones para el desarrollo de Aspergillus niger:

1) Humedad y Agua disponible: La cantidad de agua existente en el ambiente y en los sustratos es uno de los
factores más importantes para el desarrollo de los hongos y para la producción de micotoxinas.
2) Temperatura: La temperatura óptima para el desarrollo se encuentra entre 25ºC y un límite máximo de 45º
C, sin embargo Aspergillus niger soporta hasta 55º C.
3) pH: Todos los hongos toleran un gran intervalo de pH de 2,5 a 7,5 soportando mejor el medio ácido.
4) Composición del sustrato: Todos los hongos no son exigentes, ellos se nutren de micro y macro elementos
existentes en el sustrato donde se desarrollan. El hierro y el zinc son los elementos más importantes para su
desarrollo fúngico.
Xilanasa y sus aplicaciones:
La Xilanasa es una enzima derivada de una fuente fúngica. Esta enzima es útil en la hidrolisis de D-xilano y
D-xilosa, la hemicelulosa, esta conformada de xilanos, uno de los componentes principales de la mayoría de
las paredes celulares de las plantas [ CITATION Ame19 \l 12298 ]. Las Xilanasas hidrolizan este componente y
son por esto útiles para una variedad de aplicaciones, incluyendo la reducción de la viscosidad de trigo,
cebada, mazorcas de maíz y otros tobas y alimentos difíciles de digerir. Las Xilanasas están disponibles en un
polvo granular o una preparación de enzimas liquidas diseñadas para una variedad aplicaciones como la
solubilización de fibras [ CITATION Sei12 \l 12298 ]. Este producto tiene un gran rango de pH actividad y no
requiere cambio del pH a un pH acídico para una actividad óptima. Las Xilanasas en polvo son no-OMG, no
peligroso, son enzimas de grado industrial y grado alimentario animal, como una fuente concentrada de
enzimas que degradan la celulosa para uso como aditivo de alimento animal, en aplicaciones industriales,
aplicaciones sanitarias como degradación de papeles de desechos, y una variedad de aplicaciones en el
procesamiento de textiles [ CITATION Dev14 \l 12298 ]. Otras aplicaciones incluyen detergentes y compuestos
para limpieza industrial. Ahora este producto es usado para pasar por lejía biológica en aplicaciones de pulpa
de madera en molinos de papel para reducir emisiones de dióxido de azufre.

Método de Linealización de Lineawever-Burk:

La representación gráfica de Lineweaver-Burk, se realiza graficando 1/ V o contra 1/[ S ], permite identificar los
parámetros Km y Vmax, el punto de corte con al eje de las ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax y
el corte con el eje de las abscisas es igual a -1/Km [CITATION Leh01 \l 12298 ].

2
II. OBJETIVOS

Objetivo General
Evaluar la actividad de la xilanasa obtenida de Aspergillus niger inoculado en raquis de maíz como sustrato.
Objetivos Específicos
 Cultivar Aspergillus niger en raquis de maíz para la obtención de enzimas xilanasas.
 Cuantificar la actividad enzimática del extracto crudo y purificado de xilanasas por millipore y
precipitación por sulfato de amonio, obtenidas de cultivos de Aspergillus niger inoculados en raquis
de maíz.
 Determinar las constantes cinéticas del extracto crudo, purificado e inmovilizado de enzimas xilanasas
obtenidas de Aspergillus niger inoculados en raquis de maíz.

III. MÉTODO

2.1 Inoculación del hongo en Caldo Nutriente

El proceso de inoculación del medio de cultivo Caldo Nutriente con el hongo Aspergillus niger se realizó en
un ambiente estéril con la ayuda de 5 mecheros alrededor del área de trabajo. Consistió en realizar un corte
cuadrangular con la ayuda de un bisturí esteril de un medio de cultivo PDA previamente inoculado y con el
hongo ya en etapa de esporulación. Este corte fue colocado dentro del matraz con el Caldo Nutriente y se le
añadió 1,3 mL de tween 80 al 1% para que no se produzca un encapsulamiento de las esporas. Luego se selló
con parafilm nuevamente el matraz con el Caldo Nutriente ya inoculado y se lo cubrió con papel aluminio
para dejarlo en agitación a 170 rpm durante tres días a una temperatura de 37 °C.
2.2 Preparación del sustrato a base de raquis de maíz
Se obtuvo raquis de maíz seco del cantón Quinindé de la provincia de Esmeraldas, en el sector La Primavera y
se molió hasta tener un tamaño aproximado de 1 a 2 mm. Luego se colocó 14 g de este sustrato molido en 14
frascos de 10 cm de altura y 5 cm de diámetro, para proceder a esterilizar estos frascos en el autoclave a 120
°C y 15 psi por 15 minutos. Al finalizar el proceso de esterilización se dispuso los frascos en la incubadora
previmente elaborada, la cual se desinfectó en su totalidad utilizando sablón.
2.3 Inoculación del sustrato de raquis de maíz con el hongo Aspergillus niger
Se realizó un proceso individual el cual se repitió para cada frasco (con 14 g de sustrato estéril c/u) y consistió
en tomar un frasco de la incubadora y llevarlo a un ambiente estéril. Allí, se abrió el matraz con el cultivo de
Aspergillus niger y con una micropipeta estéril se tomó 7 mL de Caldo Nutriente el cual se dispuso en el
frasco. Se cerró el frasco y se lo devolvió a la incubadora manteniendo una temperatura de 37 °C.
2.4 Obtención del extracto crudo de enzimas

Se pesó 4 g del sustrato con el hongo Apergillus niger el cual se colocó en un Falcon de 50 mL. Se adicionó la
solución estéril de Tritón X-100 al 1% en razón de 5:1 con respecto al peso de la muestra y se agitó durante 5
minutos para realizar un lavado del sustrato sólido formando una mezcla en la cual se encuentra contenida la
enzima. Luego, se dejó reposar para que se de una sedimentación de los desechos sólidos grandes y se extrajo
el sobrenadante de la suspensión con la ayuda de una jeringa de 5 mL. El sobrenadante se colocó en un
Falcon de 50 mL el cual se sometió a centrifugación a 3500 rpm durante 30 min, obteniendo así los extractos
crudos.

2.5 Preparación de la curva de calibración

3
Para la preparación de la curva de calibración se etiquetaron 6 tubos a diferentes concentraciones de xilosa
indicadas en la Tabla 1. Se realizó una solución madre de 5 ml de Xilosa en relación 5:5 (mg/mL). El tubo que
sirvió de blanco contenía 1,5 mL de agua destilada, el tubo 1 se le agregaron 0,15 mL de la solución madre y
se completó a un volumen de 1,5 mL. Consecutivamente al tubo dos se le agregó 0,3 mL de la solución madre
y se completó a un volumen de 1,5 mL. Al tubo tres se le agregó 0,45 ml de solución madre y se completó a
un volumen de 1,5 ml. El tubo cuatro y cinco siguieron el tratamiento descrito en la Tabla 1.
Tabla 1. Preparación de la curva de calibración
Xilosa(mg/mL) Vol (ml) H2O
Tubo Xilosa
(1mg/mL) (mL)
Blanco 0 0 1,5
1 0,1 0,15 1,35
2 0,2 0,3 1,2
3 0,3 0,45 1,05

4 0,5 0,75 0,75

5 0,75 1,3 0,37

Posteriormente a cada tubo se le agregó 1,5 mL de DNS, se hirvieron las muestras a baño María durante 5
minutos a 50 °C y se dejó enfriar durante 10 minutos en agua helada. Se midió la absorbancia de cada muestra
a una longitud de onda de 546 nm y con los datos obtenidos se construyó la curva de calibración.

2.6 Determinación de la actividad enzimática del extracto crudo

Se rotularon 6 tubos, como se muestra en la Tabla 2 y se le agregó 1 mL de solución de Birchwood xilano al

0,5% p/v en buffer de citrato 0,05 M y pH de 5,3 a diferentes concentraciones a cada tubo, posteriormente se
agregó 0,5 ml de extracto crudo y se incubaron las muestras a 50 °C durante 10 minutos para que se forme
xilosa. Se agregó 1,5 mL de reactivo de Miller a cada uno de los tubos y se calentó la muestra a Baño María
por cinco minutos y se dejó enfriar en agua helada durante 45 minutos. Finalmente se midió la absorbancia a
una longitud de onda de 560 nm.
Tabla 2. Ensayo de la actividad enzimática xilanasa del extracto crudo.
Birchwood Extracto Crudo DNS
Tubo Xilano(mg/mL) mL
(mL)
Blanco 0 0,5 1,5
1 0,1 0,5 1,5
2 0,3 0,5 1,5
3 0,5 0,5 1,5

4 0,7 0,5 1,5

5 0,8 0,5 1,5

2.6 Purificación del extracto enzimático por millipore

Se realizó la purificación por medio de los sistemas de ultrafiltración millipore de 0.45 µm y seguido de
millipore 0.22 µm; para ello se colocaron 5 mL de extracto enzimático en una jeringa la cual se anexó al
sistema millipore para proceder a realizar la ultrafiltración, se recogieron aproximadamente 3 mL de extracto
purificado.

2.8 Purificación del extracto enzimático por precipitacion por sulfato de amonio

4
Para la purificación por sulfato de amonio se midió una cantidad de extracto enzimático purificado y se
mezcló con igual cantidad de solución de sulfato de amonio al 55%. Luego, se colocó la solución en cajas
Petri por 48 horas, con lo cual se evidenció la formación de cristales.

2.9 Determinación de la actividad enzimática del extracto purificado por millipore y sulfato de amonio.

Se rotularon 6 tubos, como se muestra en la Tabla 3 y se le agregó 1 mL de solución de Birchwood xilano al

0,5% p/v en buffer de citrato 0,05 M y pH de 5,3 a diferentes concentraciones a cada tubo, posteriormente se
agregó 0,5 mL de extracto purificado por millipore y se incubaron las muestras a 50 °C durante 10 minutos
para que se forme xilosa. Se agregó 1,5 mL de reactivo de Miller a cada uno de los tubos y se calentó la
muestra a Baño María por cinco minutos y se dejó enfriar en agua helada durante 45 minutos. Finalmente se
midió la absorbancia a una longitud de onda de 546 nm.
Birchwood Extracto DNS
Tubo Xilano(mg/mL) purificado
mL (mL)
Blanco 0 0,5 1,5
1 0,1 0,5 1,5
2 0,3 0,5 1,5
3 0,5 0,5 1,5

4 0,7 0,5 1,5

5 0,8 0,5 1,5
Tabla 3. Ensayo de la actividad enzimática xilanasa extracto purificado por Millipore.

Para la determinación de la actividad enzimática del extracto purificado por precipitación con sulfato de
amonio, se procedió a pesar los cristales de sulfato de amonio formados y se estableció una relación de 2.5:1,
en cuanto a cantidad de buffer de lisis Tritón X-100 al 1% vs peso de los cristales de sulfato de amonio. Es así
que, 1,48 g de cristales de sulfato de amonio se mezclaron en 3,7 mL de buffer de lisis Tritón X-100 al 1%.
Luego, se rotularon 6 tubos como se muestra en la Tabla 4 y se le agregó 1 mL de solución de Birchwood
xilano al 0,5% p/v en buffer de citrato 0,05 M y pH de 5,3 a diferentes concentraciones a cada tubo,
posteriormente se agregó 0,5 mL de la solución de sulfato de amonio con el buffer Triton X-100 al 1% y se
incubaron las muestras a 50 °C durante 10 minutos para que se forme xilosa. Se agregó 1,5 mL de reactivo de
Miller a cada uno de los tubos y se calentó la muestra a Baño María por cinco minutos y se dejó enfriar en
agua helada durante 45 minutos. Finalmente se midió la absorbancia a una longitud de onda de 546 nm.
Birchwood Solución de DNS
Tubo Xilano(mg/mL) Sulfato de
Amonio (mL)
mL
Blanco 0 0,5 1,5
1 0,1 0,5 1,5
2 0,3 0,5 1,5
3 0,5 0,5 1,5

4 0,7 0,5 1,5

5 0,8 0,5 1,5
Tabla 4. Ensayo de la actividad enzimática xilanasa extracto purificado por sulfato de amonio.

2.10 Inmovilización de xilanasa.

Para la inmovilización de xilanasa se implementó un método de retención física de atrapamiento en matrices

de polímero utilizando alginato como el polisacárido natural. Se mezcló 25 mL de extracto enzimático
purificado por milipore con 25 mL de alginato de sodio y esta solución se la colocó en una bureta para que

5
gotee sobre la solución de CaCl 2 y así se formen las perlas. A continuación, las perlas formadas se
almacenaron en CaCl2 durante 48 h a 4 C para su endurecimiento. Después, las perlas se filtraron y se lavaron
con agua destilada.

Para su activación, se las colocó en una solución de glutaraldehído al 2% p/v y buffer citrato con agitación
durante 90 min. Finalmente, se las almacenó en la misma solución durante 24 h a 4 C quedando listas para su
uso.

2.11 Determinación de la actividad enzimática del inmovilizado

Se implementaron dos métodos para determinar la actividad enzimática del inmovilizado. Para el primer
método se rotularon 6 tubos, como se muestra en la Tabla 5 y se le agregó 1 mL de solución de Birchwood
xilano al 0,5% p/v en buffer de citrato 0,05 M y pH de 5,3 a diferentes concentraciones a cada tubo,
posteriormente se agregó una perla de alginato de sodio con la enzima y se incubaron las muestras a 50 °C
durante 10 minutos para que se forme xilosa. Se agregó 1,5 mL de reactivo de Miller a cada uno de los tubos y
se calentó la muestra a Baño María por cinco minutos y se dejó enfriar en agua helada durante 45 minutos.
Finalmente se midió la absorbancia a una longitud de onda de 546 nm.
Tabla 5. Ensayo de la actividad enzimática xilanasa inmovilizada sin disrupción.
Birchwood # de perlas de DNS
Tubo Xilano(mg/mL) Alginato de
Sodio (mL)
Blanco 0 1 1,5
1 0,1 1 1,5
2 0,3 1 1,5
3 0,5 1 1,5

4 0,7 1 1,5
5 0,8 1 1,5

Para el segundo método se provocó una disrupción de las perlas con la enzima inmovilizada a razón de 10:1,
es decir, se colocaron 10 perlas de alginato de sodio de 0,1 g cada una en 1 mL de buffer de lisis Triton X-100
al 1% y se las aplastó hasta tener una mezcla homogenea de concentracion 1 mg/mL. Luego, se rotularon 6
tubos, como se muestra en la Tabla 6 y se le agregó 1 mL de solución de Birchwood xilano al 0,5% p/v en
buffer de citrato 0,05 M y pH de 5,3 a diferentes concentraciones a cada tubo, posteriormente se agregó 0,5
mL de la solución de perlas homogenizada y se incubaron las muestras a 50 °C durante 10 minutos para que
se forme xilosa. Se agregó 1,5 mL de reactivo de Miller a cada uno de los tubos y se calentó la muestra a Baño
María por cinco minutos y se dejó enfriar en agua helada durante 45 minutos. Finalmente se midió la
absorbancia a una longitud de onda de 546 nm.
Tabla 6. Ensayo de la actividad enzimática xilanasa inmovilizada con disrupción.
Birchwood Solución de DNS
Tubo Xilano(mg/ml) Perlas
(1mg/mL) (mL)
(mL)
Blanco 0 0,5 1,5
1 0,1 0,5 1,5
2 0,3 0,5 1,5
3 0,5 0,5 1,5

4 0,7 0,5 1,5

5 0,8 0,5 1,5

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6
Curva de calibración xilosa.

A partir de la metodología desarrollada y descrita en el punto 2.5, se obtuvieron seis valores de absorbancias
de xilosa a diferentes concentraciones (Tabla 7), con los cuales por medio del programa Excel se determinó la
regresión lineal y su coeficiente de correlación ilustrados en la Figura 1.
Tabla 7. Absorbancias de xilosa para la curva de calibración.

Xilosa Abs
(mg/ml) (546nm)
0 0
0,1 0,017
0,2 0,087
0,3 0,13
0,5 0,23
0,75 0,453

Figura 1. Curva de calibración de xilosa. Curva de calibración xilosa

Actividad enzimática xilanasa 0.5

En base a la ecuación y=0,6022 x−0,0329 obtenida de 0.4

f(x) = 0.6 x − 0.03
Abs(546nm)

0.3 R² = 0.97
la curva de calibración y despejando x se obtiene
0.2
y +0,0329
x= 0.1
0,6022
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Dónde:
Xilosa (mg/ml)
X: Concentración de xilosa [mg/mL]
Y: Absorbancias obtenidas del extracto crudo
Calculamos así las distintas concentraciones de xilosa a cada medida de absorbancia de extracto crudo
ilustradas en la Tabla 8.
Tabla 8. Absorbancias de extracto crudo.

Xilano Abs
(mg/ml) (546nm)
0 0
0,1 0,004
0,3 0,03
0,5 0,021
0,7 0,009
0,8 0,015

7
Cálculo de la actividad enzimática xilanasa por gramo de sustrato

UI [ X ]∗V 1∗Fd
=
g V 2∗Fe∗t
Dónde:
[X]: concentración de xilosa producida
V1: volumen de ensayo
Fd: factor de dilución
V2: volumen de extracto crudo enzimático
Fe: factor de extracción
t: tiempo de ensayo
Ejemplo de cálculo

UI ( 0,05463 )∗(1,5 ml)∗( 0,1)

=
g 1
(0,5 ml)∗( )∗(10 min)
5
UI
=8,1945 x 10−3
g

Xilano UI
(mg/mL g
)
0 0,0082
0,1 0,0091
0,3 0,0156
0,5 0,0134
0,7 0,0104
0,8 0,0119
Tabla 9. Actividad enzimática del extracto crudo por gramo de sustrato.

Elaboración de la curva de Michaelis-Menten

8
Al obtener la actividad enzimática xilanasa y multiplicarla por gramo de sustrato obtenemos la velocidad de
reacción a diferentes concentraciones de Xilano. Con estos valores se realizó la curva de Michaelis-Menten
representada en la Figura 2, despreciando el primer y último valor.

Curva de Michaelis-Menten
0.1
0.09
0.08
Velocidad (umol/min)

0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Sustrato [mg/mL]

Figura 2. Gráficas de Michaelis-Menten para Extracto Crudo (Azul), Primera Purificación (Naranja), Segunda
Purificación (Gris) y Purificación por Precipitación por Sulfato de Amonio (Amarilla).

Determinación de las constantes cinéticas del extracto crudo

A partir de la linealización de Lineweaver-Burk
Lineweaver-Burk representada en la Figura 3. Se determinaron los
120
parámetros cinéticos.
100 f(x) = 3.44 x + 73.82
R² = 0.89
V (umol/min)

80 Figura 3. Linealización de Lineaweaver-Burk del extracto

60 crudo.
40 El valor de la velocidad máxima obtenido a partir de
20 la ecuación y=3,4447 x +73,818
0
0 2 4 6 8 10 12
de la linealización fue
1/[s] (μM)
Vmax=0,014 µmol / min

Y el valor de Km obtenido

Km=0,047 µM
Las constantes cinéticas de un estudio sobre las mejores condiciones para la extracción y medida de actividad
de xilanasas en sustrato de corteza de pitajaya, dieron como resultado valores de Km de 0,073 M y Vmax de
0,011 mol/min[ CITATION Due08 \l 1033 ]. Estos valores se muestran distantes de los obtenidos al inocular
Aspergillus niger en sustrato de raquis de maiz cuyos valores para el Km y Vmax fueron 0,014 M y 0,014
mol/min respectivamente; sin embargo se puede apreciar que en sustrato de raquis de maíz el Km es menor
que en sustrato de pitajaya, por lo cual se deduce una mayor afinidad de la enzima por el primer sustrato. De
igual manera, la Vmax en sustrato de raquis de maíz es mayor que en sustrato de pitajaya, esto nos indica que
la enzima transforma el sustrato en producto con mayor rapidez en el raquis de maíz que en la pitajaya.

9
Determinación de las constantes cinéticas de la primera purificación de extracto.
Por medio de la purificación del extracto crudo siguiendo la metodología explicada con anterioridad, se
obtuvieron diferentes valores de absorbancia que se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10. Absorbancias del extracto enzimático purificado.

Xilano Abs
(mg/mL (546nm)
)
0 0
0,1 0,004
0,3 0,047
0,5 0,014
0,7 0,018
0,8 0,031

Siguiendo el proceso descrito para el Cálculo de la actividad enzimática xilanasa por gramo de sustrato, se
procedió a calcular los valores de la actividad enzimática del extracto purificado, los cuales se muestran a
continuación en la Tabla 11.

Tabla 11. Actividad enzimática del extracto purificado por gramo de sustrato.

Xilano UI
(mg/mL g
)
0 0,0082
0,1 0,0092
0,3 0,0199
0,5 0,0117
0,7 0,0127
0,8 0,0159

10
Con los valores de velocidad obtenidos, se realizó la linealización de Lineweaver-Burk. Para la obtención de
las constantes cinéticas. Por falta de fidelidad, se despreció el valor de velocidad correspondiente a la
concentración de 0,3 mg/ml de Xilano, obteniéndose la siguiente gráfica.

Lineweaver-Burk
120
100 f(x) = 3.08 x + 78.08
R² = 0.96
V (umol/min)

80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12
1/[s] (μM)

Figura 4. Linealización de Lineaweaver-Burk de la primera purificación de extracto.

El valor de la velocidad máxima del primer purificado con milipore 0.45 µm obtenido a partir de la ecuación
y=3,0779 x +78,083
de la linealización fue

Vmax=0,012 µmol/min
Y el valor de Km obtenido

Km=0,039 µM
Determinación de las constantes cinéticas de la segunda purificación de extracto.
En la Tabla 12 se muestran los valores de absorbancia obtenidos para la segunda purificación de extracto
Tabla 12. Absorbancias de la segunda purificación de extracto enzimático.

Xilano Abs
(mg/mL (546nm)
)
0 0,237
0,1 0,261
0,3 0,289
0,5 0,292
0,7 0,324
0,8 0,309

11
 Siguiendo el proceso descrito para el Cálculo de la actividad enzimática xilanasa por gramo de sustrato, se
procedió a calcular los valores de la actividad enzimática de la segunda purificación de extracto los cuales se
muestran a continuación en la Tabla 13.
Tabla 13. Actividad enzimática de la segunda purificación de extracto por gramo de sustrato.

Xilano UI
(mg/mL g
)
0 0,067
0,1 0,073
0,3 0,080
0,5 0,081
0,7 0,089
0,8 0,085

Con los valores de velocidad obtenidos, se realizó la linealización de Lineweaver-Burk. Para la obtención de
las constantes cinéticas, obteniéndose la siguiente gráfica.

Lineweaver-Burk
16
14
12 f(x) = 0.23 x + 11.48
V (umol/min)

R² = 0.83
10
8
6
4
2
0
0 2 4 6 8 10 12
1/[s] (μM)

Figura 4. Linealización de Lineaweaver-Burk de la segunda purifiación de extracto.

El valor de la velocidad máxima del segundo purificado con milipore 0.45 µm obtenido a partir de la ecuación
y=0,2259 x +11,48

de la linealización fue

Vmax=0,087 µmol /min

Y el valor de Km obtenido

Km=0,0196 µM

12
Las constantes cinéticas del segundo purificado por milipore muestran un Km de 0,0196 µM , el cual es
menor que el km del primer purificado (0,039 µM ), lo cual significa que ha aumentado la afinidad de la
enzima por el sustrato. Sin embargo, la velocidad máxima aumenta, lo cual nos indica que la enzima es más
eficiente en transformar el sustrato en producto.
Purificación del extracto enzimático de xilanasas por precipitación por sulfato de amonio
Siguiendo el método de la sección 2.13, se obtuvieron 1,48 g de cristales los cuales se diluyeron en 3,7 mL de
Triton X-100 al 1%.

Figura 5. Cristales por el método de purificación de precipitación por sulfato de amonio.

Determinación de las constantes cinéticas de la purificación por sulfato de amonio.

En la Tabla 14 se muestran los valores de absorbancia obtenidos para la purificación de extracto por sulfato de
amonio.

Tabla 14. Absorbancias de la purificación de extracto enzimático por sulfato de amonio.

Xilano Abs
(mg/mL (546nm)
)
0 0,241
0,1 0,219
0,3 0,228
0,5 0,239
0,7 0,252
0,8 0,253

13
 Siguiendo el proceso descrito para el Cálculo de la actividad enzimática xilanasa por gramo de sustrato, se
procedió a calcular los valores de la actividad enzimática de la segunda purificación de extracto los cuales se
muestran a continuación en la Tabla 15.
Tabla 15. Actividad enzimática de la purificación de extracto por sulfato de amonio.

Xilano UI
(mg/mL) g
0 0,068
0,1 0,062
0,3 0,065
0,5 0,068
0,7 0,071
0,8 0,071

Con los valores de velocidad obtenidos, se realizó la linealización de Lineweaver-Burk. Para la obtención de
las constantes cinéticas, obteniéndose la siguiente gráfica.

Lineweaver-Burk
17
V (umol/min)

16
f(x) = 0.2 x + 13.98
15 R² = 0.91
14
13
0 2 4 6 8 10 12
1/[s] (μM)

Figura 6. Linealización de Lineaweaver-Burk purifiación de extracto por sulfato de amonio.

El valor de la velocidad máxima del segundo purificado con millipore 0.45 µm obtenido a partir de la
ecuación y=0,2259 x +11,48

de la linealización fue

Vmax=0,0 87 µmol /min

Y el valor de Km obtenido

Km=0,01 96 µM
El valor de la velocidad máxima del purificado por precipitación por Sulfato de Amonio, obtenido a partir de
la ecuación y=0 ,1988 x +13,98

14
de la linealización fue

Vmax=0,071 µmol/min
Y el valor de Km obtenido

Km=0,01 4 µM
Los cálculos de las constantes cinéticas para cada etapa de purificación se encuentran detallados en el Anexo
2.
En la Tabla 16 se muestra la velocidad máxima y la constante de Michaelis obtenida para el extracto crudo y
los extractos purificados.
Tabla 16. Parámetros cinéticos del extracto crudo y purificado.

Parámetros
Extract cinéticos
o Km Vmáx AE GP
(M) (µmol/min) (µmol/min/mg)

Crudo 0,047 0,014 0,000014 1

1 er 0,039 0,012 0,000012 0,86
Purificado
2do 0,0196 0,087 0.000087 6,21
Purificado
milipore
2do 0,0142 0,072 0,000072 5,14
Purificado
sulfato de
amonio

Según Castro, los valores en los que km pueden oscilar son 10 -3 a 10-6 M. Comparando los datos obtenidos de
km con la participación del método de precipitación con sulfato de amonio que fue de 0,0142 M se puede
decir que, al ser un valor de Km bajo, la enzima tiene mayor afinidad por el sustrato, que la afinidad que
presenta por el sustrato en la purificación por milipore ya que aquí el Km es 0,0196 M.
El otro parámetro cinético a estudiar fue la velocidad máxima que es considerada como la actividad
enzimática. Según Voet [CITATION Voe04 \l 12298 ] mientras mayor sea la velocidad máxima la hipérbola de
michaelis y menten se tendrá en una línea horizontal que determinará un orden de reacción 0. La velocidad
máxima obtenida por el purificado por sulfato de amonio fue de 0.072 mol/min, lo que nos indica una
velocidad relativamente menor en comparación con la purificación por milipore que fue de 0,087 mol/min,
por lo cual demuestra que la purificación por millipore es mucho más efectiva que la purificación por sulfato
de amonio.
De todas las etapas de purificación, la primera resulta ser la menos efectiva al presentar el menor grado de
purificación con un valor de 0,86 (ver tabla 16). El grado de purificación más alto se obtuvo en la segunda
etapa por milipore con un valor más alto que el obtenido por precipitación por sulfato de amonio con valores
de 6,21 y 5,14 respectivamente.
Comparando diferentes métodos de purifiación tenemos que el grado de purificación por milipore obtenido en
la primera etapa con un valor de 0,86 es considerablemente menor al grado de purificación por cromatografía
de interacción hidrofóbica con un valor de 2,26. De igual manera los valores de la segunda etapa de
purificación por milipore 6,21 y por sulfato de amonio 5,14 son menores al valor del grado de purificación
obtenido por cromatografía de intercambio iónico con un valor de 16,6[ CITATION Jav14 \l 12298 ]. La causa
de la variación en estos valores está relacionada con el método de purificación y el organismo del cual
proviene la enzima.
Inmovilización de extracto rico en xilanasas

15
Las perlas de alginato de sodio con la enzima xilanasa en su interior fueron sometidas a la prueba de Bradford
para comprobar que la proteína está presente.

Figura 7. Perlas de alginato de sodio con xilanasas inactivas.

Figura 8. Filtrado de las perlas de alginato de sodio con xilanasas inactivas.

Figura 9. Perlas de alginato de sodio con xilanasas activadas.

Figura 10. Perlas de alginato de sodio sometidas al ensayo de Bradford.

Al aplicar el reactivo de Bradfor sobre las perlas de alginato de sodio con xilanasas inmovilizadas, el reactivo
tomó una coloración azul lo cual comprueba que existen proteínas y de la misma forma comprueba una
correcta inmovilización de xilanasas.

16
Determinación de la actividad de las enzimas xilanasas inmovilizadas.
Posterior a la activación de las perlas con glutaraldehído se procedió a medir la actividad catalítica del
inmovilizado, siguiendo el procedimiento descrito para el extracto purificado. Se obtuvieron diferentes valores
de absorbancia que se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17. Absorbancias del inmovilizado.

Xilano Abs
(mg/mL (546nm)
)
0 0
0,1 -0,052
0,3 -0,023
0,5 -0,027
0,7 -0,030
0,8 -0,002

Se realizó la prueba por duplicado para corroborar los valores de absorbancia negativos obtenidos. Estos
resultados son concluyentes para afirmar que el método aplicado para determinar la actividad del extracto
crudo y purificado no puede aplicarse a las enzimas inmovilizadas, ya que según Cortez et al., las perlas
inmovilizadas deben ser tratadas con buffer fosfato (0.1 M pH 5.8 - 8.5) y citral para dar inicio a la reacción
enzimática, manteniendo en un shaker a 150 rpm durante 24h y tomando muestras cada 1.5 h para la
cuantificación de consumo de citral [CITATION Cor16 \l 3082 ]. A diferencia de la presente investigación, se
utilizó buffer citrato y diferentes concentraciones de birdchwood xilano para la determinación de los
parámetros cinéticos. Sin embargo, con estos valores negativos de absorbancia se calculó la actividad
enzimática del inmovilizado presentados en la Tabla 18 y se realizó la linealización de Lineweaver-Burk
ilustrada en la Figura 11, esto debido a que la velocidad de una reacción puede medirse tanto como la
aparición de producto en función del tiempo o como la desaparición de sustrato en función del tiempo por
−d s d p
medio de la relación = =V o [ CITATION Nuñ01 \l 3082 ].
dt dt

Tabla 18. Actividad xilanasa del inmovilizado.

Xilano UI
(mg/mL) g
0 0,068
0,1 0,063
0,3 0,065
0,5 0,068
0,7 0,071
0,8 0,071

17
 Lineweaver-Burk
1600
1400
1200
V (umol/min)

1000
800 f(x) = − 146.72 x + 1179.85
600 R² = 0.77
400
200
0
-200 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
-400
1/[s] (μM)

Figura 11. Linealización de Lineaweaver-Burk inmovilizado de xilanasas.

El valor de la velocidad máxima obtenido a partir de la ecuación y=−146,72 x +1179,9

de la linealización fue

Vmax=8,475 x 10−4 µmol/min

El valor de Km obtenido fue negativo

Km=0,124 µM
El valor de Km mas alto obtenido en la investigación es de 0,124 M, lo cual expresa que un extracto rico en
xilanasas inmovilizado presenta una menor afinidad de la enzima por el sustrato. De igual forma, el valor de
Vmax de 8,475 x 10−4 µmol /min al ser el menor de todo el estudio, demuestra que la actividad enzimática
disminuye cuando una enzima es sometida a un proceso de inmovilización, sin embargo, su estabilidad
aumenta [ CITATION Sác \l 1033 ].

V. CONCLUSIONES
 Se cultivó Aspergillus niger en 12 muestras utilizando como sustrato raquis de maíz.
 Se cuantificó la actividad xilanasa a diferentes concentraciones de xilosa 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 y 0,8
mg/ml, del extracto crudo y purificado por millipore y por precipitación con sulfato de amonio.
 La velocidad máxima y Km para el extracto crudo, el purificado con milipore y purificado por sulfato
de amonio fueron respectivamente: 0,014 µmol/min y 0,047 µM; 0,012 µmol/min y 0,039 µM; 0,072 µmol/min
y 0,0142 µM.

VI. GLOSARIO

Absorbancia: cantidad de intensidad de luz que absorbe la muestra[ CITATION FAN18 \l 3082 ].

Buffer: aquellas disoluciones cuya concentración de protones apenas varía al añadir ácidos o bases
fuertes[ CITATION Uni17 \l 3082 ].

18
 Centrifugación: técnica de sedimentación, acelerada gracias al uso de fuerza centrífuga. Se aplica al análisis
o a la separación de mezclas de partículas, células, orgánulos o moléculas[ CITATION BIO19 \l 3082 ].

Raquis: eje de la inflorescencia en espiga del trigo y otros cereales[ CITATION wik17 \l 3082 ].

Saprófito: dicho de una planta o de un microorganismo: Que se alimenta de materias orgánicas en

descomposición[ CITATION RAE19 \l 3082 ].

Sustrato: sustancia sobre la que actúa una enzima[ CITATION RAE191 \l 3082 ].

VII. REFERENCIAS

[1] I. Reyes, M. Gonzáles y F. López, «UN ANALISIS DEL METABOLISMO DE Aspergillus niger CRECIENDO
SOBRE UN SUSTRATO SÒLIDO,» Revista Mexicana de Ingenierìa Quìmica, vol. XII, nº 1, pp. 5-6, 2013.

[2] C. Z. A. López, S. Herrera, A. Ruiz y V. Medina, «PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO CON Aspergillus
niger A PARTIR DE SUERO DE LECHE,» Facultad de minas Universidad Nacional de COLOMBIA, vol.
150, nº V, pp. 39-57, 2006.

[3] A. Sáez, L. Flores y A. Cadavid, «Caracterización de una cepa nativa de Aspergillus niger y Evaluación
de la Producción,» Revista Universal EAFIT, vol. I, nº 128, 2012.

[4] P. A., «Solid-state fermentation,» Biochemical Engineering Journal, vol. 13, pp. 81-84, 2002.

[5] R. R. P. A. K. S. C. R. &. P. A. Singhania, «Recent advances in solid-state fermentation,» Biochemical

Engineering Journal, vol. 1, nº 44, pp. 13-18, 2009.

[6] A. Byosistems, «American Byosistems,» American Byosistems Inc., 21 Febrero 2019. [En línea].
Available: https://www.americanbiosystems.com/productos/enzymes/xilanasa/?lang=es. [Último
acceso: 30 Junio 2019].

[7] E. Seijas, «Avicultura,» Engormix, 22 Abril 2012. [En línea]. Available:

https://www.engormix.com/avicultura/articulos/aditivos-funcionales-enzima-xilanasa-t29455.htm.
[Último acceso: 30 Junio 2019].

[8] J. Devia, «ESTUDIO DEL EFECTO DE XILANASAS FÚNGICAS EN LA DEGRADACIÓN DE SUSTRATOS

LIGNOCELULÓSICOS,» UNIVERSIDAD DE CHILE, FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS,
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA, Chile, 2014.

[9] A. Lehninger, D. Nelson y M. Cox, LEHNINGER: PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA, España: OMEGA, 2014.

[10] Y. Dueñas, C. Narváez y P. Restrepo, «Búsqueda de las mejores condicionas para la extracción y
medida de actividad de celulasa y xilanasa extraídas de la corteza de pitaya amarilla (Acanthocereus
pitajaya),» Scielo, vol. 13, nº 1, pp. 217-228, 2008.

[11] Voet y Voet, Bioquimica, Madrid: Reverte, 2004.

[12] J. Devia, «ESTUDIO DEL EFECTO DE XILANASAS FÚNGICAS EN LA,» Universidad de Chile, Santiago de
Chile, 2014.

[13] M. Cortez, A. Ardilas, J. Salgado, R. Hernández y J. Hernández, «Actividad enzimática de xilanasa

inmovilizada en perlas de alginato de sodio en la hidrogenación de citral en medio líquido,»

19
 Multidisciplinary Scientific Journal, vol. 26, nº 1, pp. 48-55, 2016.

[14] N. Castro, Enzimologia, Riobamba: Pirámide, 2001.

[15] J. Sáchez, Inmovilización de Enzimas, Madrid: Universidad Complutense.

[16] FANDOM, 16 Enero 2018. [En línea]. Available: https://quimica.fandom.com/wiki/Absorbancia.

[Último acceso: 16 Julio 2019].

[17] Universidad del País Vasco, 7 Febrero 2017. [En línea]. Available:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/buffers/buffer.htm. [Último acceso: 16 Julio 2019].

[18] BIOMODEL, [En línea]. Available: http://biomodel.uah.es/tecnicas/centrif/inicio.htm. [Último acceso:

16 Julio 2019].

[19] wiktionary, 6 Mayo 2017. [En línea]. Available: https://es.wiktionary.org/wiki/raquis. [Último acceso:
16 Julio 2019].

[20] RAE, «Real Academia de la Lengua,» [En línea]. Available: https://dle.rae.es/?id=XHLOFyz. [Último
acceso: 16 Julio 2019].

[21] RAE, «Real Academia de la Lengua,» [En línea]. Available: https://dle.rae.es/?id=YqFgJ9V. [Último
acceso: 16 Julio 2019].

Anexos
Anexo 1. Preparación de soluciones.
1.1 Preparación del medio PDA para el crecimiento de la cepa de Aspergillus niger
El proceso inició al pesar 1,95 g del reactivo PDA (Agar Papa Dextrosa), el cual se disolvió en 50 mL de agua
destilada, se calentó con agitación constante por 30 minutos hasta su ebullición en una plancha de
calentamiento de la marca Termofisher y fue esterilizado en autoclave a 120 °C y 15 psi por 15 minutos.
Posteriormente, se encendieron mecheros para crear un ambiente estéril y se dispensó el medio de cultivo en
proporciones iguales en 2 cajas Petri plásticas. Se dejó enfriar el PDA y se agregó 1 mL de ácido láctico para
evitar contaminación.
1.2 Inoculación del medio de cultivo PDA con el hongo Aspergillus niger
Se realizó en un ambiente estéril con la ayuda de 5 mecheros al rededor del área de trabajo. Consistió en
realizar un corte cuadrangular con la ayuda de un bisturí esteril de un medio de cultivo PDA de una cepa ya
existente del hongo y ubicarlo en el centro de la caja Petri del medio de cultivo PDA previemente elaborado.
Se selló la caja Petri con parafilm y se la incubó a 37 °C.
1.3 Preparación del Caldo Nutriente

20
Se pesó 2,2 g de reactivo Caldo Nutriente, el cual se mezcló con 250 mL de agua destilada en un matraz de
500 mL. Se colocó el matraz con la mezcla en una plancha de calentamiento de la marca Termofisher y con la
ayuda de una varilla de agitación se procedió a disolver todo el reactivo Caldo Nutriente en el agua destilada
hasta tener una mezcla homogenea sin grumos y se procedió a esterilizar el medio Caldo Nutriente en el
autoclave a 120 °C y 15 psi por 15 minutos.

1.4 Preparación del Tween 80 al 1%

Para preparar 10 mL de tween 80 al 1% se tomó 100 L del reactivo de tween 80 y se lo disolvió en 9,9 mL
de agua destilada previamente calentada en una plancha de calentamiento Termofisher, para lograr que el
reactivo tween 80 pueda disolverse y homogenizarse por completo, completando así 10 mL del reactivo.
1.5 Inoculación del medio de cultivo Caldo Nutriente con el hongo Aspergillus niger
Se realizó en un ambiente estéril. Consistió en realizar un corte cuadrangular con la ayuda de un bisturí esteril
de un medio de cultivo PDA previamente inoculado y con el hongo ya en etapa de esporulación. Este corte
fue colocado dentro del matraz con el Caldo Nutriente y se le añadió 1,3 mL de tween 80 al 1% para que no se
produzca un encapsulamiento de las esporas. Luego se selló con parafilm nuevamente el matraz con el Caldo
Nutriente ya inoculado y se lo cubrió en papel aluminio para dejarlo en agitación a 170 rpm durante tres días a
una temperatura de 37 °C.
1.6 Preparación del sustrato a base de raquis de maíz
Se obtuvo raquis de maíz seco del cantón Quinindé de la provincia de Esmeraldas, en el sector La Primavera y
se molió hasta tener un tamaño aproximado de 1 a 2 mm. Luego se colocó 14 g de este sustrato molido en 14
frascos de 10 cm de altura y 5 cm de diámetro, para proceder a esterilizar estos frascos en el autoclave a 120
°C y 15 psi por 15 minutos. Al finalizar el proceso de esterilización se dispuso los frascos en la incubadora
previmente elaborada, la cual se desinfectó en su totalidad utilizando sablón
1.7 Preparación del buffer Tritón X-100 al 1%
Se procedió a preparar el buffer de lisis Tritón X-100 al 1% mediante una dilusión de 5 mL de Triton X-100 al
100% en 500 mL de agua destilada para posteriormente autoclavar el buffer.

1.8 Preparación del reactivo de Miller

Se disolvieron 0,8 g de NaOH en agua destilada, luego se adicionaron 15 g de tartrato de sodio y potasio
tetrahidratado y 0,5 g de DNS (ácido 3,5-dinitrosalisílico). Se aforó la mezcla a 50 mL con agua destilada y se
almacena en un frasco ámbar a 4 °C.
1.9 Preparación de buffer citrato 0,05 M y pH=5,3
Se pesaron 0,802 g de Citrato de sodio dihidratado y 0,283 g de ácido cítrico y se disolvieron en 40 mL de
agua destilada, se ajustó el pH con hidróxido de sodio hasta alcanzar un valor de 5,3 y se aforó la solución a
50 mL.

1.10 Preparación de la solución de alginato de sodio

Se pesó 0,5 g de alginato de sodio y se disolvió en 25 mL de agua destilada a una temperatura de 37 C
1.11 Preparación de la solución de cloruro de calcio (CaCl2)
Se disolvieron 2,5 g de CaCl2 en 250 mL de agua destilada.
Anexo 2. Cálculo de las constantes cinéticas de cada etapa de purificación.
2.1 Cálculo de los parámetros cinéticos del extracto crudo

21
 1 km
= (
vo vmax )( [1s ] )+ vmax
1

y=mx+b
y=3,4447 x +73,818
Condición X=0
1
y=
vmax
1
=73,818
vmax
vmax=0,0135 umol /min
Condición y=0
−1
x=
Km
−3,4447
0= +73,818
km
Km=0,047 uM

2.2 Cálculo de los parámetros cinéticos del primer purificado

1 km
= (
vo vmax )( [1s ] )+ vmax
1

y=mx+b
y=3,0779 x +78,083
Condición X=0
1
y=
vmax
1
=78,083
vmax
vmax=0,012 umol /min

Condición y=0

22
 −1
x=
Km
−3,0779
0= +78,083
km
Km=0,039 uM
2.3 Calculo de los parámetros cinéticos del segundo purificado por milipore

1 km
= (
vo vmax )( [1s ] )+ vmax
1

y=mx+b
y=0,2259 x +11,48
Condición X=0
1
y=
vmax
1
=11,48
vmax
vmax=0,087 umol /min
Condición y=0
−1
x=
Km
−0,2259
0= +11,48
km
Km=0,0196 uM

2.4 Cálculo de los parámetros cinéticos de la segunda purificación por precipitación con sulfato de amonio

1 km
= (
vo vmax )( [1s ] )+ vmax
1

y=0,1988 x +13,98
Condición X=0
1
y=
vmax

23
 1
=13,98
vmax
vmax=0,071 umol /min

Condición y=0
−1
x=
Km
0=−0,1988+13,98
Km=0,014 uM

24