IV.

METODOS GENERALES PARA LA OBTENCIÓN INDUSTRIAL DE ENZIMAS

 
1. Durante siglos las enzimas fueron utilizadas, formando parte de células o extractos
crudos de materiales vegetales, animales y microbianos. Así sucedió en forma
totalmente empírica, sin conocerse su modo de acción, ni el porqué de su actividad
catalítica en la industria de la fermentación como en la cerveza, vino, pan y queso. Aún
suele emplearse una enzima útil producida por una bacteria, una levadura o un trozo
de tejido, sin siquiera extraerla de las células. Por ejemplo, el Acetobacter aceti puede
servir para oxidar el alcohol y convertirlo en ácido acético sin purificar antes la oxidasa
del alcohol. La levadura fermenta el azúcar y lo convierte en alcohol sin que se efectúe
la extracción del complejo cimasa; las muchas otras enzimas que contiene la levadura
no estorban la reacción, a causa de que tienen otras actividades especificas.
1.1. El desarrollo de fuentes para producir enzimas de uso en la industria alimentaría,
de métodos de aislamiento y purificación y el diseño de reactores enzimáticos, que
permiten su aplicación en diversos procesos, ha evolucionado en forma considerable y
ha dado origen a un área interdisciplinaria conocida hoy día como "ingeniería
enzimática", como nuevo enfoque de la biotecnología (13, 15).
Hoy se ha logrado obtener enzimas más puras, que tienen las siguientes ventajas
sobre los productos de fermentación:
- acción más especifica en su función catalítica;
- actividad predecible y controlable, y
- es posible utilizar concentraciones más elevadas del substrato.
1.2. Las principales fuentes de enzimas usadas en la industria de alimentos son de
diferente origen:
a) Vegetal: Lipasas y pectinoesterasa se elaboran a partir de soya, ricino y frutas
cítricas; del germen de trigo se extrae la alfa-amilasa. Las proteasas se obtienen de la
papaya, del higo, de la piña y la peroxidasa, del rábano picante;
b) Animal: La renina, pepsina, tripsina, quimotripsina, catalasa y lipasa pancreática
son de origen animal;
c) Microbiano: Las enzimas de los hongos: Aspergillus flavus, orycae y niger y del
Bacillus subtilis han demostrado ser de gran uso en la industria alimentaría.
2. ELABORACIÓN DE ENZIMAS (19).
2.1. Elaboración de enzimas de origen animal o vegetal.
Si se trata de enzimas de origen animal la simple trituración de algunos tejidos
especializados, como el páncreas o el hígado, permite formar una papilla, la cual se
extrae a continuación con un solvente adecuado como agua, acetona fría
(-20°C ), glicerina o una solución salina. En forma parecida se procede con los tejidos
vegetales, previamente sometidos a trituración o disrupción (rotura). También puede
partirse de los jugos de expresión de los respectivos tejidos, cuya estructura celular se
destruye por autolisis, plasmolisis (18) o por congelación, la cual revienta las paredes
celulares.
2.2. Elaboración de enzimas de origen microbiano (16,17).
Actualmente la tendencia industrial es el reemplazo de muchas enzimas provenientes
de tejidos por aquellas que resultan de la aplicación de cultivos de microorganismos
seleccionados, que generan la enzima especifica. La producción de enzimas por
microorganismos tiene la ventaja de su costo, generalmente menor, y por realizarse en
un periodo relativamente breve: Por ejemplo, 1 a 5 días en el caso de una
fermentación discontinua por lotes ("batch"). Además, se puede incrementar el
rendimiento de una enzima especifica por un determinado organismo, recurriendo a
modificar sus condiciones ambientales, o bien, a formar por vía genética cepas
mutantes, en las cuales la producción de la enzima puede ser varias veces superior
que en la cepa original (15,74).
De este modo procesos de selección, adaptación y mutación han mejorado
considerablemente la producción de enzimas a partir de microorganismos.
Las enzimas elaboradas industrialmente son por lo general del tipo degradativo y
extracelular, es decir, que son excretadas al medio por el microorganismo que las
genera; pues entonces no precisan de la ruptura de las células microbianas para su
extracción como es necesario en las enzimas intracelulares de biosíntesis.
2.3. La elaboración de enzimas de origen microbiano comprende diferentes
etapas:
2.3.1. Selección de microorganismos: Se empieza generalmente por un cultivo de
enriquecimiento de la cepa seleccionada. Cultivos originales pueden obtenerse de la
firma American Tipe Culture Collection (ATCC), del Northern Utilization Research
Branch o de otro organismo o instituto reconocido.
2.3.2. Cultivo: Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan
utilizarse como medio de cultivo varían naturalmente según la enzima por elaborar y
pueden ser de los siguientes orígenes (10)
a) Materias azucaradas o amiláceas, como melaza, jarabe de glucosa, almidones y
afrechos de trigo, arroz o maíz;
b) Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de pescado, caseína,
gelatina y afrechos de extracción de semillas oleaginosas;
c) Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea;
d) Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como, extractos y autolizados
de levadura, sales minerales con inclusión de elementos trazas y eventualmente
vitaminas.
Fuera de la composición del medio constituyen parámetros importantes que deben
controlarse en el cultivo, las condiciones óptimas del caso, en cuanto a temperatura,
pH, aereación (para suministrar el oxígeno necesario y evitar exceso de calor de
reacción), y velocidad de agitación.
En lo que se refiere a los reactores para realizar la fermentación se distingue entre los
cultivos en superficie de medios líquidos o semisólidos, usándose ya sea sartenes o
tambores rotatorios, y cultivos en profundidad, actualmente más usados, mediante
tanques agitados, de lecho fijo o de lecho fluidizado (partículas suspendidas y
agitadas, lo que facilita su mezcla y circulación) (10, 17).
2.3.3. Terminada la incubación del proceso fermentativo se separa la biomasa junto
con el resto de las células y los componentes sólidos del medio de cultivo por filtración
o centrifugación. El liquido resultante, generalmente aún bastante heterogéneo, puede
utilizarse directamente como preparado enzimático; Pero, generalmente, se somete a
una purificación y/o aislamiento posteriores, que comprenden diferentes fases y que
pueden aplicarse igualmente en las enzimas de origen vegetal o animal.
3. PURIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE ENZIMAS.
 
3.1. Sin perjuicio que un preparado enzimático puede consistir en el mismo extracto o
caldo fermentado que sólo se somete a una clarificación y concentración (preparado
liquido) o desecación (preparado sólido) se recurre también a métodos de aislamiento
y purificación de enzimas en gran escala, lo cual se logra principalmente por los
siguientes procesos:
3.2. Adsorción selectiva con hidróxidos de hierro o aluminio coloidales, a cierto pH,
pues no todas las proteínas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida
se lava con agua o solución salina y luego sé eluye a pH diferente, generalmente
alcalino mediante otra solución salina, por ejemplo, de fosfato.
3.3. Por precipitación, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad
hasta el punto en que precipitan. Esto se logra por adición de sales a cierto pH y a
elevada concentración iónica o por solventes orgánicos (alcohol, acetona, isopropanol)
a baja temperatura. La sal más usada es el sulfato de amonio por su alta solubilidad,
bajo costo, alta atoxicidad para la enzima y por no afectar mayormente la viscosidad
de la solución.
3.4. Diálisis por gradientes de concentración a través de membranas semipermeables.
3.5. Ultrafiltración por aspiración o presión a través de membranas de porosidad fina
como tamiz molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas,
pues no hay cambio de fases, ni altos gradientes de temperatura (15).
3.6. Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidón, agar o dextrano.
3.7. Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina, como
en columna con intercambiadores iónicos, geles o tamices moleculares.
Combinando estos procedimientos con otros a base de electroforesis de alta tensión,
cataforesis y electrodiálisis se logran actualmente separaciones de mezclas complejas
de enzimas.
4. El control de todas estas etapas en su forma más rigurosa, es necesario para
asegurar el máximo de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de los
productos enzimáticos obtenidos.
5. ENZIMAS INMOVILIZADAS (1, 20, 21).
El enorme número de reacciones catalizadas por enzimas y la especificidad de las
enzimas individuales significa que éstas son potencialmente de gran valor industrial.
Sin embargo, su costo se agudiza al aplicarlas como reactivos en forma soluble, pues
se produce su pérdida, una vez utilizadas. Aunque la enzima por regenerarse en el
proceso podría usarse muchas veces, su separación a partir de la mezcla de reacción
no es económicamente factible. De allí que ha significado un avance importante la
posibilidad de inmovilizar las enzimas sobre soportes inertes, reteniendo así gran parte
de su actividad catalítica original. Como las reacciones enzimáticas se desarrollan en
medio acuoso, la matriz del soporte debe ser insoluble en agua, pero tan hidrófila que
garantice un buen contacto con el medio de la reacción.
Su aplicación se basa en sus interesantes propiedades:
a) Son térmicamente más estables que las enzimas nativas y más resistentes a la
autolisis;
b) Al final de una reacción catalizada enzimáticamente, la enzima enlazada puede
separarse por simple centrifugación o filtración, sin necesidad de agregar un reactivo
de inactivación o precipitación;
c) Una vez recuperada, la enzima enlazada puede volver a usarse las veces que se
desea, sin pérdida sustancial de actividad después de un simple lavado con soluciones
tampones acuosas y permitiendo realizar así procesos enzimáticos continuos.
Por lo tanto, se usan también para aislar y purificar enzimas, al separarlas de
inhibidores específicos.
5.1. Los métodos para la inmovilización de enzimas comprenden las siguientes
técnicas (l, 20)
a) Por adsorción de la proteína enzimática por la superficie de una matriz de soporte
como silicagel, carbón, aluminio, vidrio poroso o poliaminas. La unión es relativamente
débil, pudiendo destruirse por cambios en el pH, la temperatura o la concentración
iónica; pero puede estabilizarse si la enzima ya adsorbida se somete a un entramado
con glutaraldehído (véase bajo d) como lo es un soporte de resina a base de fenol y
formaldehído luego entramada con aldehído glutárico (72).
b) Por enlace iónico en que la molécula de la enzima, cargada electrostáticamente es
de carácter polianiónico o policatiónico. También aquí la unión es relativamente débil,
pues la carga de la proteína enzimática es pequeña en relación a su masa; sin
embargo, puede intensificarse al asociarla a una adsorción.
c) Por enlace covalente entre la enzima y el soporte insoluble a través de los
diferentes grupos funcionales, capaces de reaccionar, de las enzimas, como , -
COOH, -SH, y -OH. Portadores pueden ser sustancias inorgánicas, como silicagel,
caolín, apatita, vidrio poroso, aluminio, hierro; orgánicas, como celulosa, almidón,
dextrano, colágeno, agar y, especialmente, polímeros como de la carboximetil-
celulosa, succinil-amino-hexil-celulosa, anhídrido maleico entramado, poliamidas,
poliuretanos y poliacrilaminas.
Este enlace es bastante estable y puede realizarse a veces en forma directa con el
soporte, después de una eventual modificación de grupos funcionales, capaces de
reaccionar con la enzima, o bien se intercala todavía entre la enzima y el portador una
molécula intermedia ("spacer") para que la enzima mantenga mayor movilidad y con
ello una mayor actividad catalítica.
Así, en el caso de la carboximetil-celulosa transformada en su azida para su pre-
activación, forma unión covalente por un enlace amida entre el soporte y el grupo
epsilon de la lisina contenida en el polipéptido de la enzima o el grupo amino libre de
un aminoácido terminal. En el caso del anhídrido maleico entramado, la unión
covalente de la enzima se produce por aminolisis del grupo anhídrido sin
preactivación.
d) Por entramado transversal (cross-linking), una forma especial de enlace covalente
en que las moléculas enzimáticas se enlazan entre si mediante reactivos bi- o
polifuncionales, como el dialdehído glutárico, di-isotiocianato o ácido disulfónico. Su
inconveniente es el difícil contacto del substrato con la molécula enzimática, situada en
el interior del polímero macromolecular resultante.
También suele asociarse una adsorción con un enlace covalente y un entramado.
e) Por recubrimiento en que las enzimas mismas no se inmovilizan, sino que se limita
su espacio de reacción, recubriéndolas con una membrana polímera, natural o
sintética, que sea semipermeable; es decir, permeable para el substrato y el producto
de la reacción, pero impermeable para las moléculas enzimáticas. El recubrimiento
puede suceder por una envoltura con una matriz, por ejemplo, de , una separación
por ultrafiltro o por una inclusión de la enzima en microcápsulas, permeables al
substrato, de bajo peso molecular (73).
Factores como diámetro de poro del soporte de adsorción y carga del soporte y del
substrato son parámetros que influyen, según el procedimiento elegido, en la cinética
de las enzimas inmovilizadas.
5.2. La enzima así inmovilizada presenta las ventajas de un catalizador sólido y es
separada fácilmente de la mezcla de reacción. En algunos casos, especialmente
cuando la matriz de soporte es de carácter iónico, las propiedades de la enzima
inmovilizada pueden ser diferentes de aquellas que presenta la forma soluble. No cabe
duda que estas técnicas de inmovilización de enzimas, iniciadas a comienzos de la
década del 60, conducirán a exitosos procesos industriales en el campo de la catálisis
industrial por enzimas. Una de las posibilidades más prometedoras en esta área es la
de crear sistemas multienzimáticos inmovilizados al unir más de un tipo de enzima en
la matriz, como glucoamilasa y glucosa-isomerasa para transformar almidón en
fructosa. Es interesante hacer notar, al respecto, que en la naturaleza las
endoenzimas, es decir aquellas que operan dentro de las células, están habitualmente
inmovilizadas por fijación sobre membranas o sobre partículas sólidas en suspensión
(20).
La lactasa fúngica para desdoblar la lactosa de leche y suero y la glucosa isomerasa
para la obtención de fructosa, son buenos ejemplos del empleo actual de enzimas
inmovilizadas en tecnología de alimentos.