Práctica N° 5

Métodos de Coloración

Las bacterias pueden ser coloreadas con el objeto de hacerlas más fácilmente
visibles, para mostrar ciertas estructuras celulares o para la identificación
preliminar de las mismas dependiendo de su reacción frente a algunos
procedimientos diferenciales de tinción.
Los colorantes, son sustancias solubles capaces de fijarse, de manera estable,
sobre un substrato para teñirlo o colorearlo; éstos, son absorbidos de distintos
modos por los componentes de la célula, en función de su composición química.
En general, se usan para una misma preparación de diferentes colorantes con
el fin de que cada parte se distinga nítidamente de la otra, es decir, dependiendo
de la sustancia o material sobre la cual actúa, ejemplo: los colorantes ácidos se
emplean para teñir material básico como el citoplasma y los colorantes básicos, se
utilizan para teñir material acido como núcleo, gránulos, etc.

Estructuras bacterianas

1. Esporas: Son cuerpos esféricos u ovalados, sumamente refringentes, muy

resistentes a las altas temperaturas, desecación o sustancias químicas
toxicas, radiaciones ionizantes y de luz ultravioleta y a los colorantes
usados en bacteriología. Estas estructuras están presentes en algunas
especies bacterianas exclusivamente las bacilares, limitándose casi a la
especies de la familia Bacillaceae, que comprenden dos géneros Bacillus y
Clostridium. Las pueden estar en el interior de las bacterias (endosporas) o
permanecer libres, estos últimos _constituyen la forma de resistencia de las
bacterias. Las endosporas en ocasiones, no deforman el soma bacteriano
ya que su diámetro es inferior al eje menor de la bacteria, ejemplo de esto
lo representa el género Bacillus; otras veces si lo hacen, como sucede en
Clostridium; su posición en la bacteria es irregular y se localizan algunas
veces al centro de la célula vegetativa (central), entre el centro y el
 extremo de la célula (sub-terminal) o también en el extremo de la célula
(terminal).
2. Cápsula: Es una capa gelatinosa presente en algunas bacterias, tanto Gram
positivas como Gram negativas. Está constituida por polímeros orgánicos
sintetizados por la propia bacteria, los cuales segregan y se depositan por
la pared celular bacteriana. La visualización de esta estructura depende
fundamentalmente de su espesor. En ocasiones, su grosor permite
observarla fácilmente, otras veces, al tratarse de una estructura
extraordinariamente fina, resulta más difícil y es necesario recurrir a
métodos químicos e inmunológicos para detectarla. El grosor de 0,2 a 1 o
más y a veces puede doblar el volumen bacteriano. La cápsula no siempre
rodea una célula bacteriana única, como sucede con Klebsiella pneumoniae,
sino que también puede englobar más de una bacteria, bien en parejas
como en Streptococcus pneumoniae o en cadenas como en Bacillus o
células situadas en distintos planos como Leuconostoc.
3. Flagelos: Son filamentos largos, ondulados sinuosos, flexibles no
ramificados y muy frágiles son órganos locomotores, responsables de la
movilidad bacteriana. Frecuentes en bacilos y vibriones, su presencia es
excepcional en los cocos. Los flagelos son estructuras tan delgadas (10 a
20 mm) que nunca podrán ser observadas directamente con el microscopio
óptico si no se emplean técnicas especiales de coloración, como la de
Pepler. Los flagelos también pueden observarse con el microscopio
electrónico por medio del sombreado.

Tecnicas de coloración.

1. En 1884 Hans Christian Gram, un médico Danés, desarrolló la tinción que

se lleva su nombre. La Tinción de Gram es un método de tinción diferencial
que colorea las bacterias, en el caso de las Gram-positivas de púrpura y las
Gram Negativa los colorea de color rosa. Staphylococcus aureus, una
 bacteria común que causa envenenamiento por las comidas, es el Gram-
positiva, mientras que E. coli Escherichia es Gram-negativa.
2. La tinción Ziehl-Nielsen, desarrollada por Franz Ziehl y Friedrick Nielsen,
emplea un tinte rojo que se fija al material ceroso de las paredes celulares
de bacterias como Mycobacterium tuberculosis (la bacteria que causa la
tuberculosis), y Mycobacterium leprae (causa la lepra). Los
microorganismos que retienen la tinción Ziehl-Nielsen se denominan acido-
alcohol-resistentes, mientras que aquéllos que no lo retienen se denominan
no resistentes y se colorean azules (colorante secundario de contraste).
3. La tinción negativa se usa para manchar el fondo
del montaje donde se observa el microorganismo,
mientras el microorganismo para aparece claro
(como el negativo de una fotografía). Puede
emplearse una tinción secundaria para colorear las
estructuras específicas dentro del microorganismo. Por ejemplo, la
Nigrosina o la tinta de India como una mancha negativa y el azul del
metileno se usa como tinción positiva (colorante de contraste).
4. La tinción Schaeffer-Fulton es una tinción especial
usada al colorear y hacer visibles las endosporas.
Las endosporas son una parte inactiva de la célula
bacteriana que protege las bacterias del ambiente
externo de la célula.

Objetivos de la práctica:

 Preparar extendidos bacterianos a partir de cultivos líquidos y sólidos.

 Dominar técnicas de coloración que se emplean habitualmente en
microbiología.
 Utilizar métodos de coloración específicos para poner de manifiesto
estructuras bacterianas externas e internas.
 Reconocer algunas características de coloración de los microorganismos.
Materiales

 Bacterias en crecimiento.
 Láminas o portaobjeto.
 Asas y agujas de platino.
 Cristal Violeta.
 Nigrosina al 10%.
 Sulfato de cobre al 20%.
 Safranina 0.25%.
 Azul de metileno al 16%.
 Verde malaquita al 5%.
 Carbolfucsina.
 Lugol.
 Alcohol.
 Ácido clorhídrico al 3%.

Metodología:
a. Preparación de extendidos (frotis). Los extendidos de bacterias
procedentes de cultivo en medio solido se hacen sobre portaobjetos de
vidrio, totalmente limpios y libres de grasas.
1. Marque el portaobjetos con el número correspondiente al cultivo a
utilizar.
2. Coloque con un asa de platino o con un aplicador de madera una

gota de solución fisiológica o de agua destilada, en el centro del

portaobjeto.
3. Esterilice el asa de platino y déjela enfriar.
 4. Tome el asa como si fuera un lápiz y tome una pequeña porción de
colonia bacteriana que se va a examinar.
5. Coloque, en la gota de agua que se encuentra sobre el portaobjeto, la
pequeña porción que Ud. tomo de la colonia y con el asa haga una
emulsión luego, extienda por la superficie del portaobjeto.
6. Trate de hacer extensiones finas, incluso tan delgadas que casi no se

vean al secarse, de esa forma, las bacterias quedaran bien esparcidas

para poder ser observadas al microscopio.
7. Esterilice el asa.
8. Deje que la preparación se seque al aire y, luego, fíjela por el calor

pasándola varias veces a través de la llama del mechero; esto

permite que las bacterias queden firmemente adheridas al
portaobjeto.

Nota: Los frotis a partir de cultivos en medios líquidos, se realizan siguiendo el

mismo procedimiento para cultivos en medios sólidos, excepto que no se
precisa la dilución con la gota de suero fisiológico ó agua y se realizan utilizando
un asa de platino.

b. Tinción simple. Este método de coloración solo permite dar una

orientación sobre la morfología, cantidad y modo de agrupación
microbiana. Se emplea un solo colorante.

1. Prepare un frotis de un cultivo polimicrobiano.

2. Coloque el frotis fijado por el calor, sobre la rejilla de la bandeja de
coloración y coloque el número de gotas del colorante, necesarias
para cubrir el frotis.
3. Deje actuar el colorante el tiempo preciso (1 minuto).
4. Lave con agua destilada y escurra dejando la lámina en forma
inclinada hasta que esté totalmente seca.
5. Realice y registre sus observaciones.
c. Tinción diferencial. Este método permite distinguir estructuras internas o
diferenciales un tipo de bacteria de otro. Pueden utilizarse dos colorantes.
En la preparación final, algunas estructuras bacterianas toman un color y el
resto de la célula otro.

i. Tinción de Gram.

1. Prepare el frotis en la forma habitual y fíjelo por calor.

2. Cubra la preparación con cristal violeta y déjelo actuar
durante 30 segundos
3. Lave rápidamente con agua destilada (para eliminar el
exceso de violeta)
4. Aplique Lugol (mordiente) o solución de Yodo y deje actuar
durante dos minutos.
5. Lave con agua destilada.
6. Decolore con alcohol durante 10 segundos
7. Lave con agua destilada.
8. Cubra el frotis con safranina durante 1 minuto
9. Lave rápidamente con agua destilada.
10. Deje secar la lámina en posición inclinada sobre papel filtro.

Nota: Este método decoloración debe realizarse con cultivos jóvenes, ya

que algunas bacterias cambian su reacción de Gram a medida que el
cultivo envejece.
Tinción de Gram
ii. Tinción Ziehl-Neelsen. El método de Ziehl Neelsen consiste,
en primer lugar, en teñir los organismos con colorantes
concentrados y en caliente. Una vez teñidas, las células resisten
la decoloración por acido y alcohol, son por tanto acido fuerte
diluido en alcohol y a la preparación se le da una coloración de
contraste con una solución acuosa de azul de metileno. Las
bacterias acido-alcohol resistente se tiñen de rojo.

1. Prepare el frotis de un cultivo de los miembros del género

Mycobacterium y fíjelo por calor.
2. Coloque la preparación fijada por el calor, sobre una rejilla
en la bandeja de coloración, cúbrala con fucsina fenicada de
Ziehl Neelsen y caliente por debajo de la lámina con la llama
de un machero. Reparación caliente y añada más colorante
si es preciso. Caliente nuevamente sin dejar que el colorante
llegue a hervir, tenga cuidado de que la preparación no
quede seca.
3. Lave bien con agua corriente para eliminar el exceso de
colorante.
4. Decolora con HCl al 3%, por 5 min. O hasta que las partes
más finas de la preparación aparezcan decoloradas.
5. Lave bien con agua corriente.
6. Haga una coloración de contraste con azul de metileno de
Loeffler, durante 5 min. Se puede usar también una solución
acuosa de azul de metileno al 1% por 5 min.
7. Lave con agua destilada y escurra dejando la lámina en
posición inclinada hasta que esté totalmente seca.
8. Realice y registre sus observaciones.
d. Tinción Negativa. Este es un método muy sencillo y muy eficaz para
poner de manifiesto la forma de las células bacterianas en un frotis. Para
ello, se utilizan los colorantes ácidos como la Nigrosina y la tinta china.

1. Prepare un extendido bacteriano muy fino, de la forma habitual,

utilizando portaobjetos limpios y desgrasados.
2. Coloque en un extremo del portaobjeto, una gota muy pequeña de
solución de Nigrosina al 10%.
3. Tome otro portaobjetos y coloque sobre el primero formando un
Angulo de 30° y tocando la gota Nigrosina. Luego pase resbalando
por toda la superficie arrastrando la gota de Nigrosina, de forma que
se extienda por toda la superficie del portaobjeto. De esta manera el
extendido queda cubierto de una fina película del colorante.
4. Deje secar el colorante.
5. Realice y registre sus observaciones.
e. Tinción de endosporas (Schaeffer y Fulton)
1. Prepare en extendido en la forma habitual y séquelo al aire
(temperatura ambiente). No lo fije por calor.
2. Coloquen el portaobjeto con el extendido hacia arriba sobre un
beaker.
3. Cubra el frotis con una solución de verde malaquita al 5% cuando
se forme, en la parte inferior de un portaobjeto, el agua de
condensación en forma de grandes gotas.
4. Deje actuar el colorante durante 5 minutos.
5. Retire el portaobjeto del beaker con una pinza y enjuague, muy
suavemente, con agua destilada.
6. Coloque el portaobjeto sobre la bandeja de coloración y cubra el
frotis con una solución acuosa de fucsina fenicada al 0.05% durante
1 minuto.
7. Lave muy suavemente con agua destilada y deje secar al aire en
posición inclinada.
8. Lleve a observación. Con este método, las esporas se colorean de
verde y el cuerpo bacilar de rojo.
 Tinción de endosporas

Preguntas a investigar:
1. ¿Cuál es el propósito de realizar frotis con calor?
2. ¿Qué otro método de fijación se pueden emplear?
3. ¿Cuáles son las características que debe tener un frotis bacteriano de
buena calidad?
4. ¿Qué importancia tiene la técnica de coloración de Gram en la
identificación de las bacterias?
5. ¿Cuál es el paso crítico en la técnica de Gram? ¿Por qué?
6. Mencione tres organismos Gram positivos y tres Gram negativos.
7. ¿Por qué la cápsula se observa siempre sin teñir?
8. ¿Cuál es la función de las endosporas?
9. ¿Cuáles son microorganismos acido-alcohol-resistente?
10. Enumere y explique las razones por las cuáles las bacterias pueden
producir esporas.
11. ¿Qué diferencia existe entre esporas, endosporas y exosporas?
12. Explique algunos de los agentes físicos que pueden inducir la formación
de endosporas en las bacterias.
Bibliografía consultada

BETSY T.; KEOGH, J. Microbiology demystified. McGraw-Hill. USA. 2005. DOI:

10.1036/0071446508

CARPENTER, PHILIP L. Microbiología , McGRAW-HILL. MADRID, España 4° edición.

PRESCOTT, L.; HARLEY, J.; KLEIN, D. Agud Aparicio, José Luis (Traductor);
Gamazo de la Rasilla, Carlos (Revisor) Microbiología, Mc Graw-Hill, Madrid,
España.

PRESCOTT, L.; HARLEY, J. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, 5ta edición.

The McGraw−Hill Companies.