El documento describe los procedimientos para realizar una electroforesis de ácidos nucleicos en un gel de agarosa. Explica cómo preparar el gel de agarosa al 2% y la solución TBE, y los pasos para cargar las muestras de ADN en el gel y aplicar la corriente eléctrica para separar los fragmentos de ADN por tamaño. Finalmente, analiza los resultados obtenidos y las conclusiones de la técnica.
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El documento describe los procedimientos para realizar una electroforesis de ácidos nucleicos en un gel de agarosa. Explica cómo preparar el gel de agarosa al 2% y la solución TBE, y los pasos para cargar las muestras de ADN en el gel y aplicar la corriente eléctrica para separar los fragmentos de ADN por tamaño. Finalmente, analiza los resultados obtenidos y las conclusiones de la técnica.
El documento describe los procedimientos para realizar una electroforesis de ácidos nucleicos en un gel de agarosa. Explica cómo preparar el gel de agarosa al 2% y la solución TBE, y los pasos para cargar las muestras de ADN en el gel y aplicar la corriente eléctrica para separar los fragmentos de ADN por tamaño. Finalmente, analiza los resultados obtenidos y las conclusiones de la técnica.
El documento describe los procedimientos para realizar una electroforesis de ácidos nucleicos en un gel de agarosa. Explica cómo preparar el gel de agarosa al 2% y la solución TBE, y los pasos para cargar las muestras de ADN en el gel y aplicar la corriente eléctrica para separar los fragmentos de ADN por tamaño. Finalmente, analiza los resultados obtenidos y las conclusiones de la técnica.
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UNIVERSIDAD
NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD: TECNOLOGIA MEDICA ESCUELA PROFESIONAL: LABORATORIO Y ANATOMIA PATOLOGICA
INFORME DE ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
ASIGNATURA: Biología Molecular
OBJETIVOS 1. Familiarizarse con métodos de separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en geles de agarosa. 2. Determinación de los tamaños moleculares mediante electroforesis en gel de agarosa, haciendo una recta patrón con fragmentos de DNA de peso molecular conocido. 3. La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño. 4. Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel. 5. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de ADN pueden verse como bandas, las cuales representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño. 6. Establecer los procedimientos de la técnica de electroforesis de ADN y proteínas para ser difundidas en la red de laboratorios. 7. Poder identificar que cantidad de pureza se encuentra en el ADN. INTRODUCCIÓN
La Electroforesis es una técnica que permite separar compuestos cargados
eléctricamente, como las mezclas de proteínas o ácidos nucleicos, en función de su distinta movilidad en un campo eléctrico homogéneo. Existen muchos tipos de electroforesis, que se engloban en dos categorías fundamentales: Electroforesis de frente móvil. Electroforesis de zona. Actualmente, sólo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual la muestra se desplaza sobre un soporte sólido, como papel de filtro, celulosa o gel (agarosa, acrilamida…) y los componentes de la muestra migran en forma de pequeñas bandas, también llamadas zonas. En la Electroforesis en gel además de la poliacrilamida la agarosa puede ser utilizada como soporte para la corrida electroforética. Una ventaja que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además permite el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. MARCO TEORICO
Es una técnica sencilla usada en los laboratorios por los científicos para separar moléculas biológicas especialmente la del ADN en un campo eléctrico a través de una matriz porosa (gel). Su separación se basa en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico. Los geles son estructuralmente intermedios entre sólidos y líquidos. Los poros se definen por la resistencia que el gel imparte al movimiento de partículas cargadas. Esta resistencia varia con el tamaño y forma de las macromoléculas. Durante la electroforesis las moléculas se mueven a través de los poros llenos de buffer aquí las moléculas de ácido nucleico pueden ser separadas según su tamaño. Las moléculas que deben ser clasificadas se dispensan en un pozo o cámara en el material de gel. El gel se coloca en una cámara de electroforesis, que luego se conecta a una fuente de alimentación(electrodos). Cuando se aplica corriente eléctrica, las moléculas grandes se mueven más lentamente a través del gel, mientras que las moléculas más pequeñas se mueven más rápidamente. Después que la electroforesis se ha completado, las moléculas en el gel se pueden teñir con colorante para hacerlos visibles. El ADN puede ser visualizado utilizando bromuro de etidio, que, cuando se intercalan en el ADN, es fluorescente bajo luz ultravioleta. MATERIALES
2 beaker 50 ml 2 beaker 100ml 2 beaker 200ml 1 probeta 500 ml 2 probeta 100ml 2 espatulas 1 micropipeta 2- 20ul 1 micropipeta 5-50 ul Tips Agar agarosa para electroforesis Coral Load Pipeta graduada Muestra de ADN PROCEDIMIENTO PREPARACIÓN DEL TBE Para ello utilizaremos un TBE al 10x de concentración y lo diluiremos hasta que llegue a una concentración de 0.25x en 500ml.
C1 x V1 = C2 x V2 10 x V1 = 0.25 x 500 ml V1 = 12.5 Se debe tomar 12.5 ml de TBE con 487.5 ml de H2O destilada. Para este procedimiento utilizamos una probeta, pipeta y un vaso de precipitado para medir las cantidades exactas.
El TBE se utilizará después para dar las condiciones al gel y no alterarlo con la electricidad que se usa
PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA AL 2%
Necesitamos preparar el gel de agarosa que servirá de base para realizar la electroforesis. Para ello usaremos cierta cantidad de gel al 2% en 50 ml. 2% en 50 ml. 1g se debe utilizar y completar 50 ml de agua destilada.
Al crear el gel, se debe calentar a 100°C y luego enfriar para ser usado. Luego de ello se coloca en el equipo de electroforesis rellenando con TBE hasta cubrir el límite. Teniendo listo el gel y las condiciones, se coloca el buffer patrón en el primer carril y luego se colocan las muestras en los carriles siguientes. Al crear el gel, se debe calentar a 100°C y luego enfriar para ser usado. Luego de ello se coloca en el equipo de electroforesis rellenando con TBE hasta cubrir el límite. Teniendo listo el gel y las condiciones, se coloca el buffer patrón en el primer carril y luego se colocan las muestras en los carriles siguientes.
CARGA DE MUESTRA Respecto a la carga de muestras utilizamos: A) Buffer patrón: 5µL B) Buffer de corrida: 5µL C) Muestra: 10 µL
El buffer patrón de color
verde (xilene cianol) será colocado en el primer pocillo A la muestra de ADN que se encuentra en el microtubo se le agregara 5µL del buffer de corrida, coral load, 10X
Ya teniendo el microtubo con la
muestra de ADN y el buffer de corrida; procedemos a extraer 5 µL de la solución con una micropipeta. Colocamos el respectivo tip, en este caso se utilizó el amarillo.
Una vez colocado el tip y ya marcados los 5 µL en la micropipeta,
homogenizamos extrayendo y botando la solución. Finalmente extraeremos solo 5 µL que serán utilizados en la cámara de electroforesis.
REALIZACIÓN DE ELECTROFORESIS
Ya con la solución en la micropipeta, llevamos está a la cámara de
electroforesis donde ubicaremos el segundo pocillo aquí depositaremos la solución con sumo cuidado para que la corrida se realice de manera óptima. Para la realización de la electroforesis ya se tiene que tiene preparada la cámara de electroforesis (valga la redundancia), y ya con las muestras colocadas en cada pocillo procedemos a colocar los cables de electrodos de la cámara a la fuente de poder.
Rojo: Carga positiva
Negro: Carga negativa Pasados los 5 minutos podremos ver como la banda se mueve a través del gel aquí se someten a un campo eléctrico y son atraídas a su polo opuesto; cabe recalcar que los pocillos se encuentran cerca al electrodo de carga negativa (el electrodo de color negro) y esto porque al colocar la solución con DNA, este migrara al polo opuesto, en este caso al polo positivo para que podamos apreciar cómo se traslada.
La forma en la que se trasladara la muestra será de derecha a izquierda CONCLUSIONES
1. La electroforesis es una técnica utilizada para separar fragmento de
ácidos nucleicos, lo cual depende del peso molecular de este y por lo cual nos permite purificar moléculas como el ADN. 2. Se explicó los procedimientos para realizar una buena corrida electroforética y las condiciones en las que se deben de realizar como el voltaje de 70-10v, soluciones buffer para estabilizar el pH y la preparación del gel de agarosa para ácidos nucleicos. 3. La preparación de soluciones a diferentes concentraciones es fundamental, para poder realizar un procedimiento correcto. Esto incluye utilizar el diluyente y concentración adecuada. 4. Es importante siempre actuar con la bioseguridad correspondiente, debido a sustancias no comunes. Siempre utilizar una, guantes, mascarilla, gorro y en lo posible gafas. En el procedimiento de electroforesis. 5. Se pudo definir y explicar los fundamentos de cada uno de los procedimientos hasta cargar los carriles, a su vez conocer los materiales y equipos necesarios para realizar una buena práctica. DISCUCIONES
1. No podemos dar lectura a la corrida electroforética, ya que para obtener
una imagen necesitamos de la luz UV y no poseemos equipos con sofisticada tecnología. 2. Al presentar una mala técnica por parte del operado puede dar resultados falsos o resultados no esperados. 3. La falta de bioseguridad en el laboratorio no permite que podamos realizar una práctica completa, ya que trabajamos con sustancias mutagénicas como el bromuro de etidio. 4. Los compañeros debemos de ver los resultados y comparar la corrida electroforética y así observar y poder discutir los resultados, con los que se esperaba obtener. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
-Carvajal, J. D., Castillo, E. A., Lagos, D. A., Mora, Y. F., & Tonguino, N. M. (2013, 31 mayo). Electroforesis en gel agarosa para determinar calidad y cantidad de ADN. Recuperado 7 octubre, 2018 https://www.academia.edu/5188296/electroforesis
-Padilla Peña, C. A. P. P., Diez Dapena, J. D. D., Martinez Galisteo, E.
M. G., & Bárcena Ruiz, J. B. R. (2015, 2 diciembre). Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico. Recuperado 7 octubre, 2018 http://www.lavanguardia.com/politica/20161202/412333125505/urkullu- someter-estatuto-consulta-legal.html -Karp, G. Gimenez, M. Sagastegui, J. Zuñiga A. (2014). Biologia molecular y celular- Electroforesis (séptima edición). Recuperado 7 octubre, 2018 http://asociaciones.uca.es/genetica-vid/practicas/electroforesis.pdf http://www.edvotek.com/site/pdf/101sp.pdf
