La Citometría de Flujo

La citometría de flujo es una técnica de amplia utilización en investigación
biomédica, pero que también tiene un uso importante en la práctica del diagnóstico
clínico. Dado que la citometría está naturalmente preparada para estudiar
partículas en suspensión en un medio líquido, tejidos humanos como la sangre, la
médula ósea, el líquido cefalorraquídeo, o producidos en procesos patológicos
(derrame pleural, derrame sinovial) o en el curso de técnicas diagnósticas (lavado
broncoalveolar, por ejemplo), son muestras biológicas especialmente preparadas
para la aplicación de técnicas de citometría de flujo. No es de extrañar pues que
las especialidades de Hematología y de Inmunología sean las que han
contemplado mayor aplicación de esta tecnología en sus actividades rutinarias de
diagnóstico y seguimiento de los pacientes. En este artículo vamos a repasar
someramente las aplicaciones principales de la citometría a la práctica de la
pediatría, lógicamente a las enfermedades hematológicas e inmunitarias de los
niños.
Principios de la citometría1,2
Existen varios componentes básicos en cualquier citómetro de flujo. Una
suspensión de células es inyectada en un líquido capaz de ordenar el flujo de
células de manera individual y a gran velocidad. Dicho flujo pasa por un punto en
el que incide la luz de al menos un láser, aunque los citómetros actuales cuentan
generalmente con 2 o más fuentes de luz. Desde este punto, la luz incidente se
transforma en emisiones a diferentes longitudes de onda (diferentes
fluorescencias), algunas de las cuales son recogidas por detectores que amplifican
las señales y las transforman a formato digital. Los citómetros actuales están
preparados para manejar simultáneamente entre 6 y 10 detectores. Toda esta

información es integrada en un ordenador, capaz de almacenarla para su análisis
posterior.
La citometría puede estudiar partículas en suspensión, en nuestro caso, células.
De cada una de ellas es capaz de identificar una serie parámetros intrínsecos,
derivados del tamaño y la complejidad de la partícula (se refiere a características
de su envuelta y de su contenido), y parámetros extrínsecos, derivados del
marcaje de las partículas con sustancias que emiten fluorescencia. En el caso que
nos ocupa, estas sustancias son anticuerpos que reconocen algún marcador y que
están provistos de un fluoróforo, molécula capaz de absorber y emitir
fluorescencia.
Dado que se pueden medir múltiples parámetros por cada célula (fig. 1), la
población total estudiada puede dividirse en subgrupos cada vez menores, según
las características de interés. La información que se genera en el análisis de los
datos, bien de la población total o bien de las diferentes subpoblaciones, se
presenta de manera estadística. Lo más frecuente es el porcentaje de células que
cumplen algún criterio (p. ej., el porcentaje de linfocitos T, aquellos que son
positivos para el marcador CD3). Este tipo de información se obtiene cuando
dentro de la muestra existen células que son positivas para un marcador y células
que son negativas para el mismo. Existe otra situación en la que lo que sucede es
un cambio continuo en la expresión de un marcador, existen células que lo
expresan con poca intensidad mientras otras lo hacen con intensidad elevada. En
este caso se prefiere utilizar el parámetro que es la intensidad media de
fluorescencia y se habla de poblaciones que son débilmente positivas o que son
intensamente positivas.
Ensayos funcionales celulares: colorantes y
reactivos
Analice simultáneamente múltiples proteínas, expresión génica y funciones celulares
como oxidación, viabilidad, ciclo celular, apoptosis y proliferación de una célula individual
con ensayos de citometría de flujo fluorescente, reactivos y anticuerpos. Esta tecnología
permite obtener una cantidad de datos estadísticamente relevante al combinar
información de celdas individuales para obtener información sobre una muestra
heterogénea. Ofrecemos reactivos y ensayos de citometría de flujo que abarcan una
amplia gama de aplicaciones y áreas de investigación, que incluyen ensayos de función y
salud celular, así como ensayos de detección de ARN.
Ensayos de citometría de flujo y selección de

reactivos
Ensayos de viabilidad celular

Distinguir las células muertas y eliminar los artefactos
en su ensayo es un paso fundamental para ayudar a
garantizar resultados precisos.
 Ensayos de viabilidad fijables

 Ensayos de viabilidad no reparables
 Ensayos de viabilidad y vitalidad bacteriana
 Ensayos de viabilidad y vitalidad de levadura
Ensayos de ARN
Detección simultánea de ARN y proteínas mediante citometría de

flujo utilizEnsayo de ARN PrimeFlow
 ando el ensayo PrimeFlow RNA. Combine el ensayo

Ensayos de proliferación celular
La medición de la proliferación celular es un método fundamental
para evaluar la salud celular y la división celular.
 Ensayos de medición de síntesis de ADN

 Ensayos de dilución de tinte para la proliferación celular
Ensayos de ciclo celular
Ofrecemos una serie de reactivos fluorescentes diseñados

para un análisis preciso del ciclo celular en poblaciones de
células vivas o fijas. Ensayos de ciclo celular vivo
 Ensayos de ciclo celular fijo

Ensayos de metabolismo y estrés oxidativo
Mida el estrés oxidativo generalizado en células con sondas
fluorogénicas, utilizando microscopía de fluorescencia
convencional, detección de alto contenido, fluorometría de
microplacas o citometría de flujo.
 Ensayos de estrés oxidativo de células vivas para citometría

de flujo
 Sondas generales de estrés oxidativo
Ensayos de microbiología
Evalúe los procesos metabólicos clave y controle el
crecimiento, la proliferación y la vitalidad de bacterias /
levaduras.
 Ensayos de recuento y enumeración de

bacterias
 Ensayos de viabilidad y vitalidad bacteriana
 Ensayos de viabilidad y vitalidad de levadura
Senectud
Detección fluorescente de hidrólisis de β-galactosidasa por citometría de flujo.
 Kit de detección CellEvent Senescence Green
Ensayos de apoptosis
Las cascadas de muerte celular son complejas y dinámicas, lo que subraya la importancia
de un enfoque multiparamétrico para la detección de apoptosis.
 Ensayos de membrana plasmática, tinción de anexina V

 Ensayos de función de las mitocondrias
 Ensayos JC-1
 Ensayos de caspasa
 Ensayos de apoptosis nuclear
APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO A LA INVESTIGACIÓN BÁSICA
Son innumerables las aplicaciones de la citometría de flujo a la investigación básica, desde campos
como la microbiología, hematología, inmunología, citología, patología, biología celular y molecular,
entre otros. Sin embargo, es posible intentar clasificar dichas aplicaciones según el área específica
en la que es posible utilizar la citometría de flujo como herramienta de investigación (Tabla III). La
citometría de flujo ha sido utilizada en el monitoreo del contenido de ADN 15 , expresión fenotípica,
transporte de drogas, flujo de calcio 16 , proliferación y apoptosis 17 . Virtualmente es posible marcar
cualquier molécula que sea de interés siempre que se disponga de un anticuerpo acoplado a un
fluorocromo que pueda ser detectado por el citómetro de flujo, esto hace posible que las
aplicaciones del citómetro de flujo se adapten prácticamente a cualquier necesidad de
investigación. Actualmente, la relación entre la aplicación básica y clínica es cada vez más
estrecha dando la oportunidad a su vez a la aplicación diagnóstica, pronóstica y de tratamiento en
múltiples enfermedades.
CITOMETRÍA DE FLUJO Y LA INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES PULMna

de las aplicaciones nuevas más interesantes es en la evaluación de pacientes con
enfermedades inmunológicas del pulmón 19 . Una muestra típica es aquella que es
recolectada a partir de lavados bronquioalveolares (LBA), cuya utilidad diagnóstica
ha quedado ampliamente demostrada 20-25 . Cuando el lavado es realizado en
pulmones normales, la célula presente más predominante es el macrófago, el cual
está en un porcentaje de aproximadamente 90% o más de celularidad. Los
linfocitos usualmente representan menos del 10% de la población celular, los
granulocitos representan la población celular minoritaria con el 1-2% 26. En
fumadores, el porcentaje de linfocitos es aún menor 27 . En muchos pacientes con
enfermedades pulmonares inmunológicas, el LBA puede estar acompañado por un
incremento en linfocitos o eosinófilos. Cuando las células que están
incrementadas son los linfocitos, resulta importante saber qué subpoblación se
encuentra elevada. La citometría de flujo es ideal para esta evaluación. La
proporción relativa de linfocitos, macrófagos y granulocitos se determina
fácilmente a partir de gráficas de tamaño (Forward scatter FSC) contra
complejidad celular (Side scatter SSC). Los estudios de fluorescencia empleando
diferentes fluorocromos permiten determinar fácilmente la composición de
subconjuntos de linfocitos (CD4+ y CD8+). De esta manera, es posible ensayar
hasta siete colores, con citómetros modernos, que representan siete marcadores
diferentes sobre poblaciones celulares, requiriéndose sólo una pequeña cantidad
de muestra (250,000 células en 50uL) a partir de un LBA.
Por ejemplo, un incremento en el número de células inflamatorias en un LBA

sugiere una alveolitis 28 . El tipo de células en el lavado puede correlacionar con el
tipo de inflamación visto en las paredes alveolares de la biopsia. Aunque esas
correlaciones no son diagnósticas, pueden ayudar en el diagnóstico cuando son
combinadas con otros datos.
CITOMETRÍA DE FLUJO Y VIH
El monitoreo de subpoblaciones linfocitarias en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA),

fundamentalmente la cuantificación en sangre periférica de las células CD4+ y los linfocitos CD8+
aporta un valor diagnóstico y pronóstico en esta patología 57 . En la actualidad, representa una
técnica de rutina en muchos laboratorios, ante la necesidad de establecer controles periódicos del
número de células CD4+ en estos pacientes 58 . El antígeno CD4 es el receptor para el VIH.
Cuando éste infecta humanos, las células que con más frecuencia infecta son las CD4+, que se
multiplican para combatir infecciones y producir más copias del VIH. El número absoluto de
linfocitos T CD4+ es el parámetro celular asociado más estrechamente a la progresión de la
enfermedad causada por el VIH y al pronóstico del paciente 59 . La relación entre los linfocitos T
CD4+ y CD8+ (CD4/CD8), se conoce como la relación cooperador/supresor. En personas sanas
esta relación se encuentra entre 0.9 y 1.9, lo que significa que hay una a dos células CD4 por cada
célula CD8 60 . A partir de 1992, en los países desarrollados, se ha establecido una serie de
lineamientos para la realización correcta del conteo de células CD4/CD8. Se propone el uso de
citometría de flujo y un panel de 12 anticuerpos monoclonales combinados: CD45/CD14 (para
enmarcar una ventana); CD3/CD4 (para medir linfocitos T cooperadores); CD3/CD8 (para medir
linfocitos T supresores); CD3/CD19 (para separar la población de linfocitos T y B); CD3/CD56 (para
separar las células NK); y, el control de anticuerpos de isotipo. Asimismo, en México se han
publicado trabajos donde se sugiere la conveniencia de utilizar un panel semejante para el conteo
de células CD4+, considerando un mínimo de seis anticuerpos
LA CITOMETRÍA DE FLUJO A LA VANGUARDIA EN EL INER: FACSAria

Actualmente se cuenta ya con el citómetro de flujo que ha revolucionado la era moderna de la
citometría, el FACSAria de Beckton Dickinson. Gracias a la fundación Gonzalo Río Arronte, IAP, el
INER adquirió el primer FACSAria que llega a nuestro país y, el primero también en América Latina
y que se pone al servicio del Instituto en el área de investigación básica. Se trata de un separador
celular de alta velocidad y desempeño, capaz de medir hasta 11 parámetros de manera
simultánea. Este instrumento cuenta con alineación automática de láser y una nueva plataforma de
análisis en sistema Windows. Cuenta con un sistema de limpieza automático entre muestras, así
como limpieza general del instrumento. Gracias a su sistema totalmente digital es capaz de adquirir
70,000 eventos (células o partículas) por segundo y es posible separar 25,000 células con una
pureza al menos del 98%.
Las aplicaciones en investigación básica del FACSAria son innumerables, van desde la
caracterización fenotípica de siete colores, hasta análisis de parámetros intracelulares, análisis de
cromosomas, organelos celulares, apoptosis, estudios funcionales, así como separación celular
altamente específica con fines de clonación. Así, el INER se encuentra ya a la vanguardia en
citometría de flujo a nivel mundial y con la capacidad científica para desarrollar investigación básica
en enfermedades pulmonares con calidad internacional.
Bibliografía
https://www.elsevier.es/es-revista-anales-pediatria-continuada-51-articulo-citometria-flujo-
que-puede-aportar-S1696281812700999
https://www.thermofisher.com/ve/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-
cytometry-assays-reagents.html
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-
75852004000100007#:~:text=La%20citometr%C3%ADa%20de%20flujo%20es%20una%20t
%C3%A9cnica%20que%20

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clínico. Dado que la citometría está naturalmente preparada para estudiar

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preparados para manejar simultáneamente entre 6 y 10 detectores. Toda esta

La citometría puede estudiar partículas en suspensión, en nuestro caso, células.

De cada una de ellas es capaz de identificar una serie parámetros intrínsecos,

derivados del tamaño y la complejidad de la partícula (se refiere a características

de su envuelta y de su contenido), y parámetros extrínsecos, derivados del

están provistos de un fluoróforo, molécula capaz de absorber y emitir

las características de interés. La información que se genera en el análisis de los

datos, bien de la población total o bien de las diferentes subpoblaciones, se

presenta de manera estadística. Lo más frecuente es el porcentaje de células que

positivos para el marcador CD3). Este tipo de información se obtiene cuando

un cambio continuo en la expresión de un marcador, existen células que lo

este caso se prefiere utilizar el parámetro que es la intensidad media de

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