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Universidad Nacional de Colombia , Vaneza, Benavides, Laura. Extracción preparativa de ADN a partir de timo de ternera.

Extracción preparativa de AND a El objetivo de este laboratorio es extraer lo mejor

posible un segmento de ADN del timo de un feto
partir de timo de ternera. de ternera haciendo uso de diversas técnicas para
Criollo, Vaneza., Benavides, Laura. poder
vycriollon@unal.edu.co
ldbenavidesr@unal.edu.co
Universidad Nacional de Colombia
observar de forma más detallada la estructura de
las fibras de ADN con alto peso molecular.

PRIMERA PARTE: CONCENTRACIÓN Y PUREZA

Resumen—En la práctica de laboratorio se realiza para
observar macroscópicamente las moléculas de ADN de alto
peso molecular, el ADN obtenido se utiliza para generar el II. MÉTODOS Y RECURSOS UTILIZADOS.
espectro de absorción, lo cual permite cuantificar la presencia
de ARN y proteínas.
El ADN: es una larga cadena polimérica de
nucleótidos (ácido desoxirribonucleico), se
Índice de Términos— timo de ternera, ADN, espectro
de absorción, moléculas, desproteinización, efecto
conforma por una de las bases nitrogenadas
hipercrómico, porcentaje de error. (adenina, guanina,

I. INTRODUCCIÓN
El ADN es un ácido nucleico en el cual se citosina y timina), un azúcar pentosa y grupo
encuentran todas las instrucciones y funciones de fosfato, las bases nitrogenadas son de carácter
los organismos, por ende, es muy importante hacer básico y contienen nitrógeno.
un estudio exhaustivo de su forma, su composición La adenina y la guanina son clasificadas como bases
y su estructura. púricas, ya que se encuentran formadas por una
estructura de dos anillos, la citosina y timina son
Desde el año 1865 hasta la actualidad se ha venido bases nitrogenadas pirimidínicas formadas por un
estudiando que es lo que hay dentro del núcleo, la solo anillo. [3]
estructura del ADN y cuál es su importancia en los
organismos vivos, sin embargo, la estructura de La unión de un nitrógeno 1’ de alguna de las bases
doble hélice del ADN, que los investigadores James nitrogenadas con el carbono 1’ de una pentosa
Watson y Francis Crick propusieron en el año 1953 mediante un enlace N-glucosídico forma un
proporcionó respuestas a muchas preguntas que se nucleósido, en el momento cuando un nucleósido
tenían sobre la herencia. Predijo la auto replicación se une con un grupo fosfato a través de un grupo
del material genético y la idea de que la hidroxilo del carbono 5’, a través de un enlace éster
información genética estaba contenida en la fosfórico (formación de un nucleótido). [4]
secuencia de las bases que conforman el ADN. [1]
Los nucleótidos se unen entre sí por medio de un
En la actualidad, el estudio de la variación genética radical fosfato situado en el carbono 5’ de un
entre individuos, poblaciones y especies para nucleótido y un radical hidroxilo del carbono 3’ del
explicar patrones y procesos evolutivos es de suma siguiente nucleótido, se unen por un enlace
importancia y se aborda mediante el análisis fosfodiester que se forman en sentido 5’ -> 3’,
segmentos de ADN con o sin función conocida que también se forman puentes de hidrogeno entre las
permiten distinguir individuos. [2] bases nitrogenadas con la cadena complementaria
de ADN. [3]
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Estructura del ADN: ● Disolución tampón 2xSSC (NaCl 300 mM,

Se trata de una cadena larga sin ramificaciones, citrato sódico 30mM, PH 7.0 EDTA
compuesta por cuatro tipos de nucleótidos, en el 20mM).
ADN se pueden observar tres niveles estructurales: ● NaCl 2.5 M. SDS 4%.
● Cloroformo-isoamílico 24:1 (v/v).
Estructura primaria del ADN: se trata de la ● Tampón Te (Tris-HCL 10 mM, EDTA
secuencia de una sola hebra de ADN, donde se 1mM, PH 8.0) esterilizado y autoclavado
(20min a 121°C).
observa la secuencia de pentosas, grupos fosfato y
● Etanol absoluto (>95%) a -20°C, acetona a
bases nitrogenadas (molécula lineal), dicha
20°C.
secuencia permite almacenar la información ● Centrifugadora.
genética (mensaje biológico). [3] ● Pipetas de vidrio.
● Pipetas Pasteur.
Estructura secundaria del ADN: se puede la ● Beakers (vaso de precipitado).
composición del ADN por dos hebras, con las bases ● Varillas (para homogenizar).
nitrogenadas situadas en la zona interior de la ● Pipeteador.
hélice, formando puentes de hidrogeno (entre A y ● Gasa.
T se forman dos puentes de hidrogeno, entre G y C
se forman tres puentes de hidrogeno), el grupo de PROCEDIMIENTO
las pentosas y el grupo fosfato se encuentra
ubicados en la parte exterior de la hélice. [3] ● Obtención del timo de ternera, en un vaso
de precipitado, añadir 20 ml de tampón
Estructura terciaria del ADN: la hebra se encuentra 1xSSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM,
retorcida sobre si misma (formando una especie de PH 7.0) por cada gramo de timo de ternera.
supe hélice), este fenómeno se da por la acción de
las enzimas topoisomerasas-II, este enrollamiento ● Homogenizar durante 1-2 minutos, en este
ayuda a darle más estabilidad a la molécula y a caso se hace uso de una licuadora, tener en
reducir su longitud. [3] cuenta que este procedimiento se debe
hacer lentamente, ya que la muestra se
puede dañar por la rapidez de la licuadora
Timo: El timo es una glándula, se encuentra bien al homogenizar el timo y el calor que le
desarrollado durante los últimos periodos fetales y transfiere a la muestra, por lo tanto se
algunos meses después del nacimiento, luego este realiza un enfriamiento continuo.
tejido disminuye, dando como resultado un tenue
residuo o desaparece por completo. ● Se procede a filtrar el homogenizado a
El timo en bovinos es de color pálido, presenta dos través de una gasa, los residuos retenidos
lóbulos los cuales se encuentran situados a lo largo en la gasa se pueden desechar.
de la tráquea y el esófago. El timo rige el
crecimiento y el sistema inmunológico del animal, ● Posteriormente centrifugar a 1000g durante
es imprescindible en la etapa de desarrollo. [5] 15 minutos.

● Al terminar de centrifugar se puede

III. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO descartar el sobrenadante.

MATERIALES ● Re suspender el sedimento en 8ml de EDTA

20mM por gramo de timo.
● Timo de ternera.
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● Añadir 8ml de una disolución de NaCl 2,5 Fig. 2: Fase acuosa en Etanol
M, SDS 4% (p/v) por gramo de timo.
● El ADN precipita y se debe enrollar en la
● Poner la muestra en un “recipiente” el cual varilla.
se tapa para proceder agitar durante un
periodo de 30-60 minutos.

● Dejar reposar la muestra durante toda la

noche (una semana).

● Centrifugar a 1000g durante 15 minutos, si

se observa que los grumos no se
sedimentan bien ya que la viscosidad de la
suspensión es muy elevada, centrifugar por
un periodo de tiempo adicional de 3-5 Fig. 2: Segmento de ADN enrollado en la varilla.
minutos.
● Lavar el ADN con etanol frío y después en
● Recuperar el sobrenadante, añadirle un acetona o etanol al 70%.
volumen igual de cloroformo-alcohol
isoamílico (24:1, v/v). ● Secar agitando la varilla al aire durante 10-
15 minutos.
● Agitar la muestra durante 10-15 minutos
para mezclar las fases. ● Recoger el ADN en un tubo, añadirle 10 ml
de tampón TE o 0.1 xSSC y dejar disolver a
● Centrifugar a 3000xg durante 5 minutos. temperatura ambiente.

● Recuperar el sobrenadante (fase superior) SEGUNDA PARTE: ANÁLISIS

con una pipeta Pasteur, tener cuidado para ESPECTROFOTOMÉTRICO
no sacarla interface proteica.
IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO.
● En un vaso de precipitados, añadir
lentamente a la fase acuosa finalmente MATERIALES
obtenida 2.5 volúmenes de etanol al 95%
(frio a -20°C), agitando con una varilla de ● Disolución tampón 2xSSC (NaCl 300 mM,
vidrio. citrato sódico 30 mM, pH 7.0±0.2).
Disolución tampón TE (Tris-HCl 10 mM,
EDTA 1 mM, pH 7-8) Disolución de NaOH
5-10 N. Baño de agua a 90-95oC.

● Espectrofotómetro. Tubos eppendorf,

pipetas.

PROCEDIMIENTO

● Preparar diluciones (1/10 y 1/100) del DNA

tampón 0.1xSSC o TE [si el DNA no se ha
disuelto completamente, coger una alícuota
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y centrifugarla 2 min. a 12000 rpm en un DIFERENCIAS FUNCIONALES

tubo eppendorf; utilizar el sobrenadante para
preparar las diluciones]. la principal diferencia es que el ADN tiene como
función almacenar y transferir la información
● Realizar el espectro de absorbancia entre genética y el ARN interpreta esa información para
320 y 220 nm, hacer el blanco del aparato sintetizar las proteínas.
con el tampón.
● Realice la estructura de un segmento de
● A una disolución igual a las anteriores DNA y uno de RNA de al menos cuatro
añadir unas gotas (por ejemplo 0.02 ml) de nucleótidos.
disolución de NaOH 5-10 N y repetir el
espectro 320-220 nm. ADN:

● Preparar disoluciones de DNA iguales a las

anteriores, calentarlas a 90-95 °C durante
unos minutos y repetir el espectro a 320-220
nm.

V. EXPLICACIÓN DEL FENÓMENO

PRIMERA PARTE: CONCENTRACIÓN Y PUREZA

En esta primera parte del laboratorio se extrajo tejido de

timo de ternera, después se procedió a homogenizar,
Fig. 3: Cadena de ADN de cuatro nucleótidos.
filtrar y centrifugar la muestra para posteriormente
someterla a una serie de tratamientos de agitación,
reposo y adición de algunos reactivos para poder ARN:
desproteinizar la muestra y tener como resultado un
pequeño segmento de ADN

PERGUNTAS
● ¿Cuál es la composición del DNA?
El ADN está constituido por nucleótidos, que a su
vez están compuestos por una base nitrogenada,
un grupo fosfato y un azúcar pentosa.
● ¿Qué diferencias estructurales y funcionales
existen entre DNA y RNA?
DIFERENCIAS ESTRUCTURALES
- El ADN posee una cadena doble y el ARN una
simple.
- Hay una variación en una de las bases Fig. 4: Cadena de ARN de cuatro nucleótidos.
nitrogenadas; el ADN tiene timina y el ARN uracilo.
- El tipo de azúcar pentosa; el ADN tiene
desoxirribosa y el ARN ribosa
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● Si un DNA tiene un 20% de timina, ¿cuáles |50−53,35|

%E= ∗100=6.7 % (3)
serán los porcentajes de A, T y C? 50

puesto que la proporción de adenina debe ser igual

a la de timina y la de citosina debe ser igual a la de MUESTRA 2
guanina; los porcentajes deben se adenina 20%, ● Porcentaje de error antes de desnaturalizar:
citosina 30% y guanina 30%. |1.8−5405.4199|
%E= ∗100=3002.011 %
1.8
SEGUNDA PARTE: ANÁLISIS
ESPECTROFOTOMÉTRICO ● Porcentaje de error después de naturalizar:
A260=0.7179.
Posterior a la extracción del ADN del timo de A280=0.8522
ternera se procede a hacer un análisis
espectrofotométrico, el cual consiste en analizar la |2.2−0.8424|
%E= ∗100=61.70 %
absorción de la muestra, con el fin de comprender 2.2
mejor su composición, puesto que cuando el ADN
se desnaturaliza las cadenas se desenlazan ● Porcentaje de error para la concentración de
quedando dos cadenas individuales y esto aumenta la muestra:
la capacidad de absorción.
|50−34.27|
%E= ∗100=31.46 %
Posterior a este procedimiento se analiza el ADN y 50
se calcula el porcentaje de error de la muestra para
la relación A260/280A, antes y después de
desnaturalizar, en este caso el error global fue alto, VI. CONCLUSIONES
por esta razón se eligieron dos muestras para - El método hipercromático puede ser
analizar: muy útil para comprender mejor la
composición de las muestras.
MUESTRA 1
● Porcentaje de error antes de desnaturalizar: - El porcentaje de error de algunas de las
A260=0.2476. muestras fue alto se debe suponer que
A280=0.3874. esto es debido a fallas técnicas del
aparato.
|1.8−0.6391|
%E= ∗100=64.49 % (1) - es muy importante realizar este tipo de
1.8
procedimientos debido a que se puede
información valiosa sobre las especies
● Porcentaje de error después de naturalizar:
A260=1.0713.
A280=0.3985.

|2.2−2.6883| REFERENCIAS
%E= ∗100=22.19 % (2)
2.2
[1] “El ADN, los genes y el código genético”
● Porcentaje de error para la concentración de [Online]. Available:
la muestra: https://www.chilebio.cl/el-adn-los-genes-y-
el-codigo-genetico/ [Accessed: 13-Feb-
2019].
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Universidad Nacional de Colombia , Vaneza, Benavides, Laura. Extracción preparativa de ADN a partir de timo de ternera.

[2] “Extracción y purificación de ADN” [Online].

Available:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/li
bros/710/extraccion.pdf [Accessed: 13-Feb-
2019].

[3] “El ADN, portador del mensaje genético -

hiru.” [Online]. Available:
https://www.hiru.eus/es/biologia/el-adn-
portador-del-mensaje-genetico. [Accessed:
10-Feb-2019].

[4] “Ácido desoxirribonucleico (ADN) - National

Human Genome Research Institute
(NHGRI).” [Online]. Available:
https://www.genome.gov/27562614/cido-
desoxirribonucleico-adn/. [Accessed: 10-Feb-
2019].

[5] “El timo en los animales - Sistema

respiratorio de los animales.” [Online].
Available: https://mundo-
pecuario.com/tema205/sistema_respiratori
o_animales/timo_animales-1393.html.
[Accessed: 10-Feb-2019].