PROTOCOLO DE VALIDACION PARA CODIGO: P-CC-1111

LA VALORACION DE GENTAMICINA
EN BETADERM CREMA G.C VERSION: 01
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2020-10-08 Página 6 de
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Fecha de última revisión 11
Rodriguez
2020-10-08

1. OBJETIVO
Establecer la evidencia documentada y seguridad de que el método microbiológico
cilindro-placa para la cuantificación de Gentamicina Sulfato nos proporcionara
resultados confiables; los cuales permitirán tomar decisiones una vez que se emitan los
resultados analíticos de los diferentes lotes que se fabriquen.

2. ALCANCE
Esta metodología tiene como finalidad primordial cuantificar la concentración de
Gentamicina sulfato en cada uno de los lotes de Betaderm Crema G.C, así mismo
comprobar la eficacia del método cilindro-placa empleado para suministrar datos
confiables y reproducibles.

3. RESPONSABILIDAD
El encargado del área de microbiología es el encargado de redactar el protocolo de
validación, llevar cabo la realización del proceso de validación, la verificación y
redacción de los documentos emitidos.

Este protocolo debe ser aprobado y examinado por Garantía de la Calidad, quien a su
vez debe aprobar los datos, conclusiones y en el caso de ser aplicable un programa de
revalidación.

4. DOCUMENTOS RELACIONADOS
Procedimiento de valoración microbiológica de antibióticos (P-CC-946)
Procedimiento de valoración microbiológica de gentamicina en Betaderm G.C. ( P-CC-
1032)
Procedimiento para la preparación y mantenimiento de cepas de referencia (P-CC-
1037)

5. DESCRIPCION DEL PROCESO:

La valoración microbiológica de antibióticos, consiste en un bioensayo donde se
emplean microorganismos unicelulares, en este caso cepas bacterianas susceptibles al
antibiótico a evaluar, para demostrar la actividad de la sustancia en condiciones
convenientes, por su efecto inhibitorio sobre los microorganismos .

Se cuantifica la potencia o actividad del antibiótico, comparando en idénticas

condiciones de ensayo, la inhibición de la multiplicación de microorganismos sensibles
producida por concentraciones conocidas de una sustancia de referencia o patrón,
frente a la inhibición producida por la muestra que contiene el antibiótico que se está
valorando.
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Se utilizan estándares de referencia de medicamentos de alta pureza que se comparan

contra la potencia de la preparación de prueba, con el fin de minimizar las fuentes de
error resultante de la variación biológica durante los análisis, y obteniendo así un valor
de potencia relativo del estándar empleado.
De esta manera se determina la verdadera actividad antimicrobiana del producto,
permitiendo detectar cambios sutiles que no son demostrables por métodos químicos.

6. VALORACION CILINDRO-PLACA: Esta técnica es la más utilizada dada su

exactitud y sensibilidad; se fundamenta en la difusión del antibiótico desde un cilindro
vertical a través de una capa de agar solidificada en una placa de petri hasta inhibir
totalmente el crecimiento del microorganismo añadido en el medio de cultivo, en un
área circular o zona de inhibición entorno al cilindro que contiene una solución del
antibiótico. Las distintas respuestas obtenidas es decir los diámetros de los halos de
inhibición son proporcionales a las dosis de antibiótico utilizadas.

Una vez estandarizada la suspensión del microorganismo de ensayo, esta se inocula en

el medio de cultivo adecuado, previamente fundido y enfriado a una temperatura
compatible con la viabilidad microbiana (42°C- 45°C). Luego de homogenizarlo por
agitación, se sirven volúmenes medidos del medio en cajas de petri de vidrio de 100mm
x 20 mm que contienen una capa base de medio sin inocular ya gelificado. Una vez
gelificado el medio inoculado, se insertan los cilindros para dispensar las soluciones del
patrón y la muestra. Estos dispositivos en este caso corresponden a cilindros de acero
inoxidable de 8 mm de diámetro externo y 6 mm de diámetro interno.

La cantidad de discos de acero inoxidable por placa, de soluciones patrón y de la

muestra y la distribución de cada uno dependerán del diseño del ensayo microbiológico.
Las placas finalmente se llevan a incubar en las condiciones establecidas según el
microorganismo empleado. Después del periodo de incubación durante el cual el
antibiótico difunde y crea un gradiente de concentración alcanzando la concentración
inhibitoria mínima a cierta distancia, se registra el diámetro de los halos de inhibición
que se observan alrededor de cada disco.

El tamaño de dicha zona queda determinado por la sensibilidad del microorganismo, su

estado fisiológico, y número de células viables; el tipo de medio de cultivo incluyendo el
espesor del medio en la placa, las condiciones de incubación, especialmente la
temperatura, la velocidad de difusión de la sustancia y su concentración.
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Debido a que estos factores pueden modificar la magnitud de la respuesta para una
misma concentración de la sustancia a evaluar, es indispensable controlarlos para
garantizar la reproducibilidad de la técnica, por ello se realiza la estandarización del
inóculo y se establecen condiciones específicas de incubación, y volúmenes del medio
a emplear.

7. VALIDACION DE METODOS ANALITICOS

La totalidad de la metodología analítica usada para análisis debe ser apropiada para el
uso al que están propuestos, lo cual se evidencia por medio de la validación o
verificación en caso de métodos farmacopeico.

En la validación de los métodos analíticos debe tenerse en consideración las siguientes

categorías:

1. Categoría I: Pruebas cuantitativas del contenido del principio activo, son

procedimientos químicos o microbiológicos que miden el analito presente en una
muestra determinada.
2. Categoría II: Pruebas para la determinación del contenido de impurezas o de valores
límites para el control de impurezas.
3. Categoría III: Son pruebas fisicoquímicas que miden características propias del
desempeño del medicamento. Las características de la validación son diferentes a las
de las otras pruebas, aunque las pueden incluir.
4. Categoría IV: Pruebas de identificación. Aquellas que se realizan para asegurarla
identidad de un analito en una muestra.
5. Pruebas microbiológicas: Aquellas que se ejecutan para garantizar la calidad
microbiana del medicamento.
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8. PARAMETROS DE VALIDACION

Exactitud: Manifiesta la cercanía entre el valor que es aceptado comúnmente como

valor verdadero, nominal, teórico o un valor de referencia respecto al valor obtenido
experimentalmente.

Precisión: Aptitud de un método para suministrar resultados próximos entre sí. Grado
de dispersión de los resultados analíticos, respecto a su valor medio. Se puede estudiar
a dos niveles.

Repetibilidad: Evalúa la precisión del método efectuando una serie de análisis sobre la
misma muestra en las mismas condiciones operativas (aparatos, reactivos, analista) en
un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto.
Precisión intermedia: Evalúa la precisión del método frente a variaciones internas del
laboratorio (Analista, día, instrumento).

Selectividad: Aptitud de un método analítico para medir y/o determinar

simultáneamente o independientemente los analitos de interés, de manera inequívoca,
en presencia de otras sustancias que pueden estar presentes en la muestra
repetidamente, el término especificidad se emplea como sinónimo de selectividad.

Linealidad: Aptitud del método para suministrar resultados que son directamente (o por
medio de transformaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del analito
en la muestra dentro de un determinado rango. Para validación de una valoración de
antibióticos consisten en:

1. Mostrar que la recta de regresión construida con el logaritmo de la dosis de

antibiótico patrón y la respuesta cumple con los parámetros de regresión lineal y
análisis de varianza.
2. Evidenciar que las dos rectas (Patrón y problema) cumplen con el test de
coincidencia.

Rango: Es una expresión de los valores mínimos y máximos de analito que han
demostrado ser determinados en el producto. El rango especificado es normalmente
derivado de estudios de linealidad.
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9. MICROORGANISMO DE PRUEBA
Los microorganismos de ensayo codificados en las farmacopeas pueden ser bacterias y
hongos, preferentemente no patógenos. El microorganismo de ensayo para cada
antibiótico se lista en una tabla para la valoración en cilindro-placa. Los
microorganismos de prueba se especifican mediante su codificación en la colección de
cultivos tipo de los Estados Unidos o ATCC.

Composición
Condiciones de incubación sugerida del medio
Organismo de Numero Medio Temp. Tiempo Medio Cantidad
Antibiótico prueba ATCC mL/100mL

Gentamicina Staphylococcus 12228 1 32-35 24 h 11 0.03

epidermidis
ºC

10. MATERIALES Y METODOS

I. INFORMACION GENERAL DEL PRODUCTO

NOMBRE DEL PRODUCTO BETADERM G.C.
PRINCIPIO ACTIVO GENTAMICINA
CONCENTRACIÓN: 0.10 %
FORMA FARMACÉUTICA CREMA FECHA 06-10-2016
PESO PROMEDIO

II. EQUIPOS, MATERIALES, CRISTALERIA Y REACTIVOS

CEPA: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
EQUIPOS
NOMBRE MARCA/ MODELO CARACTERÍSTICAS
ESPECTROFOTOMETRO UV-VIS AGILENT SERIE 8453 AUTOMÁTICO
Incubadora (32.5 +/- 1 °C) FANEM AUTOMATICO
BALANZA ANALITICA OHAUS AUTOMATICA
Pié de rey o Vernier TRUPER DIGITAL
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CRISTALERIA Y MATERIALES
TIPO CAPACIDAD CANTIDAD
MATRAZ VOLUMÉTRICO 25 mL 5
MATRAS VOLUMÉTRICO 100 mL 4
PIPETAS GRADUADAS 2 mL 10
PROBETAS 100 mL 1
BEAKER 50ml 1
CELDA DE CUARZO 1cm 3 mL 1
CILINDROS DE ACERO 8 ± 0,1 MM DE 90
PLACAS DE PETRI DE VIDRIO 100 x 20 mm 15

REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

NOMBRE CONCENTRACIÓN CANTIDAD

Solución amortiguadora (BUFFER) (0,1 M, pH 8,0) 1000 mL

Agar Antibiótico #11 350 mL
Agar Antibiótico #1 100 mL
Solución salina 0.9%: 100 mL

El material de laboratorio usado para almacenar y transferir microorganismos y

diluciones de prueba debe ser estéril y estar exento de residuos que pudieran interferir
en la valoración.

PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN BUFFER:

Pesar 16.73 g de Fosfato de potasio dibásico y 0.523 g de Fosfato de potasio
monobásico, disolver en 1000 ml de agua destilada.

III. ENSAYO CUANTITATIVO

PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR

SOLUCION STOCK GENTAMICINA
Pesar 50 mg de Gentamicina en una balanza analítica y depositar en un matraz
volumétrico de 100 ml, aforar con solución buffer.

Retirar 1 ml de la solución anterior y depositar en un matraz volumétrico de 100mL y

aforar con solución buffer.

CONC FINAL: 5 µg/ml

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IV. PREPARACION DE LA LINEA DOSIS - RESPUESTA

PREPARACION DEL STANDARD A

Transferir 0.96 mL de solución stock a un matraz volumétrico de 25 ml, aforar con
solución buffer, donde se alcanza la concentración de 0.19 µg/ml.

PREPARACION DEL STANDARD B

Transferir 1.2 mL de solución stock a un matraz volumétrico de 25 ml, aforar con
solución buffer, donde se alcanza la concentración de 0.24 µg/ml.

PREPARACION DEL STANDARD C

Transferir 1.5 mL de solución stock a un matraz volumétrico de 25 ml, aforar con
solución buffer, donde se alcanza la concentración de 0.3 µg/ml.

PREPARACION DEL STANDARD D

Transferir 1.87 mL de solución stock a un matraz volumétrico de 25 ml, aforar con
solución buffer, donde se alcanza la concentración de 0.37 µg/ml.

PREPARACION DEL STANDARD E

Transferir 2.34 mL de solución stock a un matraz volumétrico de 25 ml, aforar con
solución buffer, donde se alcanza la concentración de 0.47 µg/ml.

V. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

0.1 g de crema por 100 g de vehículo.

Pesar 1 g de crema que es equivalente a 1 mg de gentamicina sulfato

Agregar en un balón aforado de 100 ml y agregar aprox 30 ml de buffer, agitar por
alrededor de 3 min y llevar el volumen a 100 ml.

A partir de la preparación anterior realizar otra dilución, tomando 3 ml en un balón de

100 ml y llevar a la marca de aforo nuevamente con buffer para obtener una
concentración de 0.3 µg/ml.

VI. PREPARACIÓN DEL INOCULO

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 Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo inclinado reciente de

medio antibiótico 1 de 24 h de incubación en 3 mL de solución salina estéril.
 Sembrar el S. epidirmidis sobre la superficie de una o más placas de agar (medio
CASO), cubriendo toda la superficie.
 Incubar durante 32-35 ºC por 24 h o hasta que el crecimiento sea evidente.
 Después de incubar, recolectar el organismo de la placas, en 10 mL de solución
salina estéril, usando un asa bacteriológica.
 Diluir una cantidad apropiada de la suspensión de recolección con solución
salina estéril. Utilizar un espectrofotómetro U.V. visible para medir el porcentaje
de transmitancia a 580 nm.
 El valor deseado es 25 ± 2 % y utilizar solución salina como blanco. Este valor
se usa para estandarizar el volumen de suspensión de recolección agregado a la
capa de agar para siembra.

VII. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS

A 15 placas de petri agregar a cada una 21 ml de agar antibiótico 11, dejar solidificar
hasta formar una capa lisa y uniforme denominada capa base.

A continuación fundir 100 ml de medio antibiótico 11 colocarlo en baño maría a una

temperatura entre 45 - 50 ºC e inocular con 0.03 ml de suspensión de la cepa,
seguidamente verter 4 ml del medio inoculado en cada una de las placas petri
conteniendo la capa base y dejar solidificar hasta formar una capa lisa.

Figura 6. Preparación de Inóculo de Staphylococcus epidermidis

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VIII. COLOCACION Y LLENADO DE CILINDROS

Se utilizan 3 placas petri por cada Standard y para la muestra.
Colocar 6 cilindros de acero inoxidable a una distancia equidistante, intercalar el
estándar C con cada una de las concentraciones A, B, D, E Y la muestra. Inocular los
cilindros con aproximadamente 200 µg de cada una de las soluciones y la muestra,
reposar las placas por un periodo de tiempo de una hora. Incubar 24 – 48 horas a una
temperatura entre 32 a 35 ºC.

IX. LECTURA DE HALOS DE INHIBICION

Remover los cilindros, medir y documentar los diámetros de cada una de las zonas de
inhibición, con la ayuda de un pié de rey.

Procesar los datos obtenidos para realizar la línea dosis-respuesta para la

determinación de la concentración de cada muestra interpolándola en la gráfica.

XI. CRITERIOS DE ACEPTACION

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Para la lectura de los halos de inhibición se tiene en consideración que todos los halos
de inhibición presentaron una forma circular y bordes bien definidos. Para la lectura de
los estándares y la muestra, el valor máximo aceptable para la desviación estándar
relativa no debe ser mayor de 10%, si sobrepasa este máximo los datos no serán
adecuados y deberá realizarse un nuevo ensayo. El promedio de las muestras debe
estar dentro del siguiente rango: 0,090 g – 0,135 g (90,0%-135,0%).

TOLERANCIA DESVIACION ESTANDAR RELATIVA (RSD) DEBE SER NO

MÁS DEL 10%.
ESPECIFICACIÓN NO MENOR DE 90% Y NO MÁS DE 135% DE LA
CANTIDAD DECLARADA DE GENTAMICINA.

DEFINICIONES

Calificación de Instalación (IQ): Establecer por evidencia objetiva que todos los
aspectos claves del equipo de proceso y la instalación de sistemas a auxiliares cumplen
con las especificaciones aprobadas del fabricante y las recomendaciones del
abastecedor del equipo son consideradas de manera apropiada.

Calificación Operacional (OQ): Establecer por medio de evidencia objetiva los límites
de control de proceso y los niveles de acción que resultan en un producto que cumpla
con todos los requerimientos predeterminados.

Calificación de Desempeño (PQ): Establecer por medio de evidencia objetiva que los
procesos, bajo condiciones anticipadas, producen de manera consistente un producto
que cumple con todos los requerimientos predeterminados.

Método analítico: Adaptación específica de una técnica analítica para un propósito

de medición seleccionado.

Parámetros de desempeño analítico: Características de validación que necesitan

ser evaluadas y que típicamente corresponden a la siguiente lista: exactitud,
precisión, especificidad, linealidad, intervalo de linealidad y robustez.

Validación: La confirmación y presentación de la debida evidencia, de que se han

cumplido los requisitos particulares para el uso planificado y específico de un método
de ensayo
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Validación de procesos: Establecer por medio de evidencia objetiva que un proceso

produce de manera consistente un resultado o que un producto cumple con los
requerimientos predeterminados.

Protocolo de validación de proceso: Un documento que indica cómo se realizará la

validación, incluyendo parámetros de prueba, características de producto, equipo de
fabricación, y puntos de decisión en lo que constituye un resultado de prueba aceptable.

Verificación: Confirmación por medio de examen y disposición de evidencia objetiva,

de que los requerimientos especificados se han cumplido.