PRACTICA Nº3

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GLUCOSA OXIDASA.

I. MARCO TEORICO

I.1. ENZIMAS

I.1.1. CONCEPTO
Las enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica que
aceleran la velocidad de reacción hasta alcanzar un equilibrio.
Constituyen el tipo de proteínas más numeroso y especializado y,
actúan como catalizadores de reacciones químicas específicas en
los seres vivos o sistemas biológicos, es decir, sustancias que,
sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su
velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que
solamente aceleran las que espontáneamente podrían producirse.
Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar
reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas
de presión, temperatura o pH.
Muchas de las enzimas no trabajan solas, se organizan en
secuencias, también llamadas rutas metabólicas, y muchas de
ellas tienen la capacidad de regular su actividad enzimática.
[ CITATION LEH06 \l 10250 ]

I.1.2. ASPECTOS GENERALES SOBRE LOS ENZIMAS

Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar
en los seres vivos están catalizadas por enzimas. Los enzimas
son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo
tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato
o sobre un grupo muy reducido de ellos. En una reacción
catalizada por un enzima:
- La sustancia sobre la que actúa el enzima se llama
sustrato.
- El sustrato se une a una región concreta de la enzima,
llamada centro activo. El centro activo comprende (1)
un sitio de unión formado por los aminoácidos que
están en contacto directo con el sustrato y (2) un sitio
catalítico, formado por los aminoácidos directamente
implicados en el mecanismo de la reacción
- Una vez formados los productos el enzima puede
comenzar un nuevo ciclo de reacción
 Los enzimas, a diferencia de los catalizadores
inorgánicos catalizan reacciones específicas. Sin
embargo hay distintos grados de especificidad. El
enzima sacarasa es muy específico: rompe el enlace b-
glucosídico de la sacarosa o de compuestos muy
similares. Así, para el enzima sacarasa, la sacarosa es
su sustrato natural, mientras que la maltosa y la
isomaltosa son sustratos análogos. El enzima actúa con
máxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor
eficacia sobre los sustratos análogos. Entre los enzimas
poco específicos están las proteasas digestivas como la
quimotripsina, que rompe los enlaces amida de
proteínas y péptidos de muy diverso tipo.

I.1.3. ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS

Para comprender cómo funcionan las enzimas, es necesario
saber qué son y conocer la importancia de su estructura. Las
enzimas son proteínas globulares formadas por una o más
cadenas polipeptídicas plegadas, creando una “hondonada”
donde encaja el sustrato y tiene lugar la reacción. Esta zona de la
enzima se denomina centro activo y sólo unos pocos aminoácidos
están implicados en él. La proximidad de los aminoácidos en el
centro activo está determinada por la estructura terciaria, aunque
también pueden ocupar posiciones adyacentes en la estructura
primaria. En una enzima con estructura cuaternaria, los
aminoácidos del centro activo pueden encontrarse incluso en
diferentes cadenas. La configuración tridimensional del centro
activo es complementaria a la del sustrato y posee una
distribución complementaria de sus cargas sobre la superficie de
unión. Es decir, si una región del sustrato tiene una carga
negativa, la zona correspondiente del centro activo tendrá una
carga positiva y viceversa. En 1894, Emil Fischer, un químico
alemán, comparó la especificidad de la enzima con una llave y su
cerradura [CITATION ALD98 \l 10250 ]. Pero, estudios posteriores
sugirieron que el centro activo es más flexible que el ojo de una
cerradura: la unión entre la enzima y el sustrato altera la
conformación de la enzima, ajustando el centro activo al sustrato.
I.1.4. MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS -CATÁLISIS
ENZIMÁTICA

o Energía de activación:
En toda reacción química se produce la transformación de
unas moléculas iniciales denominadas sustratos (S) en las
reacciones bioquímicas, en unas sustancias finales o
productos (P). Esta transformación necesita, en la mayoría
de las reacciones, un aporte inicial de energía que aumenta
la energía cinética de las moléculas y éstas, reaccionan
permitiendo que un mayor número de ellas, choquen con
suficiente fuerza para superar su repulsión mutua y debilitar
los enlaces químicos que poseen. La energía que deben
poseer las moléculas para iniciar la reacción se conoce con
el nombre de energía de activación.[CITATION NEL06 \l
10250 ] .
o El catalizador
Un catalizador disminuye la energía de activación
necesaria para una reacción, porque forma una asociación
pasajera con las moléculas que reaccionan[ CITATION
LOP98 \l 10250 ]. Esta asociación aproxima a las
moléculas que reaccionan y, favorece tanto la ruptura de
enlaces existentes, como la formación de otros nuevos.
Cuando existe un catalizador en la energía de activación,
esta reacción puede suceder rápidamente sin o con poca
adición de energía. El catalizador no sufre ninguna
alteración permanente en el proceso y puede volver a
utilizarse. Gracias a las enzimas, las células son capaces
de desarrollar reacciones químicas a gran velocidad y a
temperaturas relativamente bajas.

o Reacciones enzimáticas
En estas reacciones, la enzima (E) se une al sustrato (S)
para formar el complejo enzima-sustrato (ES). Después
tiene lugar la transformación del sustrato (S) en producto
(P), liberándose el producto (P) y quedando libre la enzima
(E) para una nueva unión con el sustrato [81].

E + S  ES  EI  EP  P + E

Las enzimas, como los demás catalizadores, aceleran la

reacción sin alterar la posición de equilibrio. En una
reacción química [82] tenemos:
 Sustrato ↔ Producto

o La constante de equilibrio
La constante de equilibrio K, se produce en las reacciones
enzimáticas y siempre tiene un valor constante fijado por la
relación entre las velocidades en uno u otro sentido,
independientemente de que el catalizador esté o no
presente.
La catálisis hace disminuir considerablemente el tiempo
necesario para alcanzar el equilibrio.

K= [P]/ [S]
DONDE:
K = constante de equilibrio
[P] = concentración de producto
[S] = concentración de sustrato

I.1.5. REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

 Rutas metabólicas

En los seres vivos, las maneras para regular la actividad

enzimática son diversas. Existen rutas metabólicas que
están formadas por grupos de enzimas que actúan
conjuntamente en el metabolismo celular. Las enzimas
trabajan en serie, formando vías enzimáticas, de forma que
el producto de una enzima constituye el sustrato de la
siguiente. Todas las rutas metabólicas pueden ser
controladas por enzimas reguladoras. Éstas varían su
actividad dependiendo de ciertas señales y normalmente la
primera enzima de la ruta es la reguladora. Ésta se llama el
punto de compromiso de la vía. La actividad de estas
enzimas se modula por diferentes moléculas señal, que
generalmente son metabolitos de poco peso molecular o
cofactores.
 Las vías enzimáticas suponen ventajas para las células.
Por una parte, los grupos de enzimas que constituyen una
vía común pueden segregarse dentro de la célula e
incluso, si están ubicadas en las membranas, pueden estar
alineadas en secuencia. Otra ventaja es la escasa
acumulación de productos intermedios. Cada producto
tiende a ser usado en la siguiente reacción de la vía
enzimática.

 Cofactores y coenzimas

a) Cofactores: Muchas enzimas necesitan para una

correcta actividad enzimática la adición de
cofactores, que son determinados iones minerales
(magnesio, zinc, cobre, etc.). En algunos casos, los
enlaces entre los iones y los radicales de ciertos
aminoácidos ayudan a mantener la estructura
terciaria o a estabilizar la estructura cuaternaria de
la proteína.
b) Coenzimas Las moléculas orgánicas que actúan
como cofactores se denominan coenzimas. Éstas se
unen de manera temporal o permanente a la enzima
en una zona bastante próxima al centro activo.
Cuando la enzima es activada por una coenzima, el
conjunto se denomina holoenzima, y cuando la
inactiva, apoenzima.

 Efecto de las concentraciones de enzima y de sustrato

La actividad enzimática viene limitada por diferentes

factores como puede ser la concentración de enzimas, de
sustrato y la disponibilidad de cofactores. La velocidad de
la reacción está relacionada directamente con la
concentración de la enzima y esta velocidad es diferente
para cada enzima. Cuando la concentración de la enzima
es constante, la velocidad aumenta hasta alcanzar un
máximo (Vmax) [88 y 89] aunque la concentración del
sustrato siga aumentando. Todas las moléculas de enzima
están ocupadas por moléculas de sustrato y la velocidad
no puede aumentar.

Existe un periodo inicial denominado estado pre-

estacionario que es cuando la enzima se mezcla con el
gran exceso de sustrato y durante el cual, aumenta la
 concentración ES. Seguidamente aparece el estado
estacionario donde ES permanece constante en el tiempo.

Las células regulan la velocidad de las reacciones

enzimáticas mediante la regulación de las concentraciones
de la enzima. Muchas enzimas son degradadas
rápidamente y se sintetizan sólo cuando se necesitan.
Otras, se segregan en forma inactiva y se activan cuando
se necesitan.

 Efectos de la temperatura y del Ph

a) La temperatura
Cada enzima tiene una temperatura óptima de
actuación. Por debajo y por encima de esta
temperatura, la enzima ralentiza la velocidad de la
reacción enzimática. Se observa que muchas de las
enzimas, duplican la velocidad de una reacción
enzimática cuando se aumenta la temperatura de
unos 10° C aproximadamente y luego cae muy
rápidamente por encima de los 40° C. El aumento en
la velocidad de reacción se produce porque con
temperaturas más altas, existen más moléculas de
sustrato con suficiente energía para reaccionar; la
disminución de la velocidad de la reacción es debida
a la desnaturalización de la enzima (la mayoría de
las proteínas globulares se desnaturalizan por
encima de 60 - 70°C).

b) El pH
La actividad enzimática también viene regulada por
el pH de la solución enzimática. El pH óptimo o
intervalo de pH de cada enzima es diferente y
cuando varía, la conformación de la enzima se
altera, produciéndose un cambio en el estado de
ionización de grupos del sitio activo y llegando a no
ser funcional. Esto es debido a que la conformación
de una proteína depende también, de las
atracciones y repulsiones entre los aminoácidos
cargados negativamente y los cargados
positivamente. Además algunas cadenas laterales
de aminoácidos pueden actuar como ácidos o bases
débiles que desarrollan funciones críticas en el sitio
activo del enzima.
 Las enzimas pueden tener dos tipos de curvas:

 La primera curva posible de la actividad enzimática es en

pico. Esto significa que la enzima necesita un control
riguroso del pH del medio en el que se encuentra. El 100%
de su actividad se encuentra en un pequeño intervalo
entorno a un pH determinado.

 La segunda posibilidad es que la enzima mantenga una

actividad superior al 75% alrededor del pH óptimo. Estas
curvas experimentales suelen ser facilitadas por el
fabricante o vienen en documentos técnicos.

o Inhibición
Los inhibidores son sustancias que disminuyen, o incluso
anulan, la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas.
La inhibición puede ser de distintos tipos:

1. Reversible:
 Competitiva
 No competitiva
 A competitiva
2. Irreversible

I.1.6. CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS

En función de su acción catalítica específica, las enzimas se

clasifican en 6 grandes grupos o clases:

 OXIDORREDUCTASAS: Catalizan reacciones de

oxidorreducción, es decir, transferencia de hidrógeno (H) o
electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción
general:

AH2 + B A + BH2
Ared + Box Aox + Bred
  TRANSFERASAS: Catalizan la transferencia de un
grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato
a otro, según la reacción:

A-B + C A + C-B

Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la

reacción representada en la Figura de la derecha:

glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato

 HIDROLASAS: Catalizan las reacciones de

hidrólisis:

A-B + H2O AH + B-OH

Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reacción:

lactosa + agua glucosa + galactosa

 LIASAS: Catalizan reacciones de ruptura o
soldadura de sustratos:

A-B A+B
Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que
cataliza
la reacción:

ácido acetacético CO2 + acetona

 ISOMERASAS: Catalizan la interconversión de

isómeros:

A B

Son ejemplos la fosfotriosa isomerasa y la

fosfoglucosa
isomerasa, que catalizan las reacciones
representadas en
la tabla inferior:
  LIGASAS
Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis
simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP,
etc.):

A + B + XTP A-B + XDP + Pi

Un ejemplo es la piruvato carboxilasa, que cataliza
la
reacción:

piruvato + CO2 + ATP oxaloacetato + ADP + Pi

I.2. GLUCOSA OXIDASA

I.2.1. CONCEPTO

Es un ejemplo de enzima con diversas aplicaciones. La

glucosa oxidasa, (Gox) (E.C.1.1.3.4), es una enzima que
cataliza la oxidación de la -D glucosa, por la vía del D-
glucano- δ-lactona, hacia ácido glucónico y peróxido de
hidrógeno, usando el oxígeno molecular como aceptor final de
electrones (Fiedurek y Gromada, 2000). Entre los productores
más comunes de esta enzima destacan microorganismos
fúngicos como: Aspergillus niger, Penicillium notatum, P.
glaucum, P. amagasakiense, P. purpurogenum, P. variabile, y
Alternaria alternata (Caridis et al., 1991). La Gox también es
producida por algunas variedades de insectos tales como:
Apis mellifera L, Larva Helicoverpa zea, Saltamontes de Pasto
Schistocerca americana (Eichenseer et al., 1999). Se han
encontrado algunas bacterias productoras de Gox
pertenecientes al género Bacillus (Thongkantha et al., 2000).
Además se ha obtenido esta enzima mediante la mutación de
cepas de Pseudomonas Aeruginosa (Patankar, 2012). La Gox
es ampliamente utilizada a nivel industrial para la
conservación de alimentos y forma parte de los reactivos para
la determinación de glicemia y otros parámetros clínicos.
También es empleada en el procesamiento de alimentos para
la determinación cuantitativa de glucosa en los procesos de
fermentación y en la producción de ácido glucónico.

I.2.2. Propiedades naturales

 La función principal de Gox está estrechamente relacionada
con su alta actividad catalítica: esto la lleva a realizar un papel
importante como agente antibacteriano y antifúngico a través
de la producción de peróxido de hidrógeno. Algunos
experimentos han demostrado que en la presencia de la
enzima catalasa solamente requiere concentraciones
milimolares de peróxido de hidrógeno para inhibir el
crecimiento celular, mientras que en la presencia de Gox
necesita de niveles micromolares de peróxido de hidrógeno
para lograr el mismo objetivo (Wong, 2008). Otra de las
funciones naturales importantes de la Gox es que esta enzima
beneficia el proceso de la infección de plantas así como la
degradación de la lignina.

I.2.3. Aplicaciones de la Gox

En la Tabla 1 se muestran algunas de las aplicaciones más
destacables de la Gox. Además de su uso en la industria de
alimentos, se demuestra su empleo en producción de
compuestos orgánicos, geoquímica, ensayos de laboratorio y
de biología molecular, así como su uso importante para el
diseño de biosensores.
En el Departamento de Biotecnología de la U.A. de C. se
llevan a cabo investigaciones de aislamiento, propagación y
utilización de cepas fúngicas del semidesierto de Coahuila, y
en particular de Aspergillus, que poseen la capacidad de
producir metabolitos secundarios. Estas investigaciones tienen
como objetivo principal la obtención de productos comerciales,
dando como resultado alternativas en la obtención de
enzimas, incluyendo la Gox. Actualmente se desarrolla un
proyecto de investigación enfocado al diseño de un
suplemento alimenticio basado en el uso de Gox para el
control de adsorción de glucosa a nivel intestinal.

I.2.4. Conclusión
La glucosa oxidasa es una enzima que tiene una gran
importancia a nivel industrial. Desde hace varias décadas ha
sido aplicada en diversos procesos como en la producción de
alimentos, fabricación de analitos de laboratorio y
blanqueamiento de telas. Actualmente siguen en incremento
las investigaciones relacionadas con las posibles aplicaciones
de esta enzima en múltiples áreas como la geoquímica y la
biología molecular. Debido a la variedad de sus aplicaciones y
a las investigaciones que se generan constantemente, los
 biotecnólogos se han enfocado en la búsqueda de nuevas
fuentes microbianas de Gox.

FUNDAMENTO:

La temperatura del medio influye mucho en la actividad de las enzimas. La

temperatura óptima para la acción de enzimas es la temperatura del cuerpo de
los animales que oscila en el intervalo de 36 a 14ºC. con cierto aumento de la
temperatura del medio ocurre aceleración de la reacción a consecuencia de la
activación de las moléculas del sustrato. A la vez, incluso un aumento pequeño
de la temperatura conduce al debilitamiento de los enlaces que mantiene la
conformación de las moléculas de las enzimas, es necesaria la manifestación
de su actividad catalítica.

Empieza gradualmente, la desnaturalización de la enzima cuando se acelera

con aumento de la temperatura del medio es irreversible. Al bajar la
temperatura la actividad de la enzima disminuye. El mecanismo de este
proceso no está claro. Sin embargo, el enfriamiento no causa desnaturalización
de la enzima por lo tanto su inactivación puede ser reversible.

OBJETIVO:

El objetivo de la presente práctica es demostrar el efecto de la temperatura

sobre la glucosa oxidasa.

I. MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

 Agua destilada
II. REACTIVOS Y MATERIAL BIOLOGICOS
 4-aminofenazona
 Fenol
 Glucosa oxidasa
 Peroxidasa
 Glucosa 100mg/dl
 HCl 0.01M
 NaOH 0.01 M
III. PROCEDIMIENTO:
1. EFECTO DE LA TEMPERATURA:
 Tubo 1:
 Agregar a un tubo de ensayo 1mL del reactivo de trabajo
(enzima).
  Incubar el tubo de ensayo a 37º C (se coloca en las mano
para alcanzar aproximadamente la temperatura ambiental)
por 10 min.
 Con ayuda de una micropipeta agregamos 10µL de
glucosa y nuevamente incubar por 10 min.
 Llevar la muestra al equipo previamente calibrado (para su
calibración se agrega en la celda agua destilada y en
calibración se pone a 0) para medir su absorbancia.
 Por ultimo haciendo los cálculos correspondientes
obtenemos la concentración de glucosa.
 Tubo 2:
 Agregar a un tubo de ensayo 1mL del reactivo de trabajo
(enzima).
 Incubar el tubo de ensayo a 0º C (se coloca en un vaso el
tubo de ensayo en la parte superior de la refrigeradora) por
10 min.
 Con ayuda de una micropipeta agregamos 10µL de
glucosa y nuevamente incubar por 10 min.
 Llevar la muestra al equipo previamente calibrado (para su
calibración se agrega en la celda agua destilada y en
calibración se pone a 0) para medir su absorbancia.
 Por ultimo haciendo los cálculos correspondientes
obtenemos la concentración de glucosa.
 Tubo 3:
 Agregar a un tubo de ensayo 1mL del reactivo de trabajo
(enzima).
 Incubar el tubo de ensayo a 70º C (se calienta con ayuda
de la cocina eléctrica un vaso con agua midiendo la
temperatura con un termómetro de mercurio,
posteriormente se coloca en este, el tubo de ensayo al
llegar a 70º C) por 10 min.
 Con ayuda de una micropipeta agregamos 10µL de
glucosa y nuevamente incubar por 10 min.
 Llevar la muestra al equipo previamente calibrado (para su
calibración se agrega en la celda agua destilada y en
calibración se pone a 0) para medir su absorbancia.
 Por ultimo haciendo los cálculos correspondientes
obtenemos la concentración de glucosa.

2. EFECTO DEL pH:

 Tubo 1:
 Agregar a un tubo de ensayo 1mL del reactivo de trabajo
(enzima).
  Agregar 0.1 mL de HCl 0.01 M, posteriormente agregar 10
µL de glucosa.
 Incubar el tubo de ensayo a 37º C por 10 min.
 Llevar la muestra al equipo previamente calibrado (para su
calibración se agrega en la celda agua destilada y en
calibración se pone a 0) para medir su absorbancia.
 Por ultimo haciendo los cálculos correspondientes
obtenemos la concentración de glucosa.
 Tubo 2:
 Agregar a un tubo de ensayo 1mL del reactivo de trabajo
(enzima).
 Agregar 0.1 mL de NaOH 0.01 M, posteriormente agregar
10 µL de glucosa.
 Incubar el tubo de ensayo a 37º C por 10 min.
 Llevar la muestra al equipo previamente calibrado (para su
calibración se agrega en la celda agua destilada y en
calibración se pone a 0) para medir su absorbancia.
 Por ultimo haciendo los cálculos correspondientes
obtenemos la concentración de glucosa.
 Tubo 3:
 Agregar a un tubo de ensayo 1mL del reactivo de trabajo
(enzima).
 Agregar 10 µL de glucosa.
 Incubar el tubo de ensayo a 37º C por 10 min.
 Llevar la muestra al equipo previamente calibrado (para su
calibración se agrega en la celda agua destilada y en
calibración se pone a 0) para medir su absorbancia.
 Por ultimo haciendo los cálculos correspondientes
obtenemos la concentración de glucosa.
IV. RESULTADO
1. EFECTO DE LA TEMPERATURA:

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3

Reactivo de
1 1 1
trabajo (mL)
Incubar por 10 70º C
37º C 0º C
min
Agregar
glucosa 1% 10 10 10
(µL)
70º C
Incubar 10 min 37º C 0º C
Absorbancia 1.666 1.334 0.152 0.147
Resultados 437.25 500.25 57 55.125
 [GLUCOSA]
Tabla 1: Efecto de la temperatura sobre la glucosa – oxidasa

 Tubo 1:
 Al medir 1 mL del reactivo de trabajo, se llevó a incubación
(como no se contaba con incubadora para esa temperatura
se procedió a tapar la boca del tubo de ensayo con la yema
del dedo pulgar y acercarlo al cuerpo para aproximarla
temperatura).
 Después de añadir la glucosa usando la micropipeta e
incubar se observó un cambio en el color de la sustancia
(de transparente a rosado intenso).
 Al llevar la muestra al espectrofotómetro, este marco una
absorbancia de 1.666 (ver figura 1, pág.…)
 Para calcular la concentración de glucosa en la muestra se
usa la siguiente formula:
[GLUCOSA] = (Absorbancia) x F
F: 375 mg/dL
 Calculando la concentración se obtuvo:
[GLUCOSA] = (1.666)(375mg/dL)
=437.25mg/dL

 Tubo 2:
 Al tener la muestra del reactivo de trabajo, para la
incubación, se procedió a llevarla a la refrigeradora
(cámara superior).
 La muestra es de color transparente.
 Después, al añadir la glucosa e incubar no se observa
reacción alguna.
 Al llevar la muestra al espectrofotómetro, este marcó una
absorbancia de 1.334(ver figura, 2, pág….)
 Calculando la concentración de glucosa se obtuvo:
[GLUCOSA] = (1.334)(375mg/dL)
=500.25mg/dL

 Tubo 3: (Hubieron dos grupos trabajando este ensayo)

  Al tener la muestra del reactivo de trabajo, para la
incubación, se realizó lo siguiente:
Cuando el agua alcanzo la temperatura de 70ºC se
introdujo el tubo de ensayo al vaso (BAÑO MARIA) para la
incubación (ver figura 3, pág.….)
La muestra permanece transparente.
 Al añadir la glucosa e incubar, no se observa reacción
alguna.
 Al llevar la muestra al espectrofotómetro este marco un
absorbancia de:
Para el grupo 1: 0.152 (ver figura, pág. )
Para el grupo 2: 0.147 (ver figura, pág. )
 Calculando la concentración de glucosa se obtuvo:

Para el grupo 1: [GLUCOSA] = (0.152)(375mg/dL)

= 57mg/dL

Para el grupo 2: [GLUCOSA] = (0.147)(375mg/dL)

= 55.13mg/dL

2. EFECTO DEL pH:

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3

Reactivo de trabajo 1 1 1
Agregar HCl 0,01M 0.1 ---- ----
(ml)
Agregar NaOH 0,01M --- 0.1 ----
(ml)
Agregar glucosa 1%μi 10 10 10
Incubar por 10 min 37° 37° 37°
Absorbancia 1.134 0.138 1.467 1.072
[Glucosa] 425,25 51.75 550.13 402
Tabla 2: Efecto del pH sobre la glucosa oxidasa

Tubo 1:
 Al agregar, al reactivo de trabajo (color transparente) HCl
0.01M (0.1ml) y 10 μL de glucosa 1% no se observa
reacción alguna.
 Después de incubar a 37° cubriendo la boca del tubo con la
yema del dedo y acurrucándolo al cuerpo para aproximar la
temperatura, tampoco hay evidencia de reacción (ver fig. 6,
pág. )
 Al llevar la muestra al espectrofotómetro este mide una
absorbancia de 1.134 (ver fig. 7, pág. )
 Calculando la concentración de glucosa :
 [ glucosa ] =( 1.134 ) ( 375 mg/dL )
[ glucosa ] =425.25 mg/dL
Tubo 2:
 Al agregar, al reactivo de trabajo NaOH (color transparente)
0.01M (0.1ml) y 10μi de glucosa 1% no se observa
reacción alguna.
 Después de incubar a 37° aproximadamente, tampoco hay
evidencia de reacción.
 Al llevar la muestra al espectrofotómetro este mide una
absorbancia de 0.138 (ver fig. 8, pág. )
 Calculando la concentración de glucosa :
[ glucosa ] =( 0.138 ) (375 mg /dL )
[ glucosa ] =51.75mg /dL

Tubo 3: (este ensayo fueron trabajados por dos grupos)

 Al agregar, al reactivo de trabajo (color transparente), 10μi
de glucosa 1% se observa un ligero cambio de color
(tendencia a rosa).
 Después de incubar a 37° aproximadamente, se observa la
muestra de una coloración rosa (ver fig 9, pág. )
 Al llevar la muestra al espectrofotómetro este marca una
absorbancia de:
Grupo #1: 1.467 (ver fig. 10, pág.)
Grupo #2: 1.072 (ver fig. 11, pág.)

 Calculando la concentración de glucosa :

[ glucosa ] =( 1.467 ) (375 mg/dL ) [ glucosa ] =( 1.072 )( 375 mg /dL )

1 2
[ glucosa ] =550.13mg /dL [ glucosa ] =402 mg/dL

V. DISCUSIÓN

EFECTO DE LA TEMPERATURA

Por base teórica encontramos que:

 La enzima utilizada, es una Glucosa oxidasa comercial, nombrada como
Maxazyme 4000 L, obtenida por fermentación con Aspergillus niger. A
partir de una cepa de Aspergillus niger, se prepara en el comercio una
mezcla conteniendo una proporción considerable de esta enzima. Esta
enzima es específica para la Glucosa la cual oxida con velocidades
hasta 400 veces superiores que a otros azúcares; esta reacción es la
base de algunas aplicaciones analíticas y médicas. Su actividad máxima
está entre los 20 y los 45 ºC con un pH entre 3.0 a 6.5 con un óptimo en
5,5 y se inactiva rápidamente a temperaturas superiores a 60ºC.
(Cadenas, E,1978, pág. 71).
 La teoría cinética química de Arrhenius; dice que el efecto de las
temperaturas de 40ºC hasta 45ºC será por lo general positivo sobre la
velocidad de reacción, por encima de 45ºC la velocidad alcanza
rápidamente un límite variable según la enzima considerando raramente
superior a 80ºC. Lo que nos indica que en la actividad enzimática de la
enzima libre a temperaturas de 40- 45 ºC muestra una actividad del
66.7%.
 La Glucosa oxidasa Gox (Maxazyme 4.000L) presenta su máxima
actividad enzimática a una temperatura de 55 °C.
Cuando se incrementa la temperatura, también ocurre un aumento de
velocidad de reacción, al llegar al pico 1, sucede el descenso causado
por la desnaturalización de la enzima. Este comportamiento se ocasiona
por el aumento de energía cinética de las moléculas reactantes, al llegar
a 57°C los enlaces débiles (de hidrógeno) que conservan su estructura
secundaria y terciaria de la enzima se rompen, por consiguiente, a esta
temperatura predomina una pérdida precipitada de actividad catalítica.
(Ver figura N° . pág, )
 Puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad
enzimática, cualquiera causa que perturbe esta estructura puede llevar a
una pérdida de actividad. Aunque el rango general de temperaturas
adecuadas para las reacciones enzimáticas es muy estrecho, los
cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. La
temperatura óptima para la mayoría de las reacciones enzimáticas esta,
con ´pocas excepciones, entre 30A°C y 40A°C, en que la actividad es
máxima. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reacción aumenta
y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10A°C duplica e
incluso triplica la velocidad de reacción. Por otro lado, sin embargo, ese
mismo aumento de temperatura acelera también la inactivación de la
enzima por desnaturalización térmica. Para muchas enzimas la región
de inactivación térmica extensiva está muy próxima de la temperatura
óptima.

 Las enzimas muestran a menudo una marcada fragilidad térmica.

Cuando se calientan a temperaturas superiores a los 50A°C la mayoría
 de las enzimas pero no todas, se desnaturan y unas pocas muestran la
desnaturalización cuando se enfrían aproximadamente a 5A°C. A
temperaturas bajas, aunque la actividad enzimática procede muy
lentamente, ella no se detiene del todo, hecho que debe tenerse en
cuenta en la industria congeladora de alimentos. A menos que se
inactiven previamente las enzimas objetables, la mayoría de los
alimentos congelados experimentan un considerable deterioro después
de un almacenamiento prolongado, porque a temperaturas tan bajas
como -18A°C algunas reacciones enzimáticas siguen teniendo lugar.
Habitualmente la desnaturalización a alta temperatura es irreversible,
debido a que se rompen las fuerzas débiles de enlace al aumentar la
vibración termina de los átomos componentes, fenómeno que daña la
estructura tridimensional.

Al contrastar nuestros resultados con la base teórica por diferentes autores

encontramos que nuestro ensayo en el tubo 1 y el tubo 3 coincide con la teoría
ya que en temperaturas de 37 se da su máxima actividad mientras que a
temperaturas de 70 se inactiva rápidamente; en el tubo 2 debió salir la
concentración de glucosa menor que en el primer tubo ya que por teoría
sabemos que esas temperaturas la glucosa oxidasa la velocidad de reacción
debe se menor.

EFECTO DEL Ph

 Toda enzima tiene un pH óptimo, puesto que en las reacciones

catalíticas participan aminoácidos ionizables (como histidina, glutamato y
cisteína). Las enzimas citosólicas tienen un pH óptimo en el intervalo de
pH 7-8. La pepsina, secretada por las células gástricas y que actúa en el
jugo gástrico, tiene un pH óptimo de 1.5 a-2.0; la tripsina y la
quimiotripsina tienen un pH óptimo alcalino, compatible con su actividad
digestiva en el juga pancreático alcalino; las enzimas lisosomales tienen
un pH óptimo ácido. La sensibilidad al pH de las enzimas se debe al
efecto del pH sobre la carga iónica de las cadenas laterales de
aminoácidos de las enzimas. Diversos solutos, como sustratos,
productos, iones metálicos y moléculas reguladoras, también afectan a
la velocidad de las reacciones enzimáticas. (Baynes & Dominiczack,
2011, pág. 60)
En nuestra experimentación obtuvimos que:

- El HCl tiene un Ph =1 lo cual es muy ácido por lo que la concentración

de la glucosa obtenida es muy bajo ; y también en el NaOH tampoco va
a ver tanta concentración ya que es muy básico con un Ph de 13 por lo
que ambas sustancias se encuentran en los extremos del Ph ya que uno
muy ácido y el otro es muy básico y lo que se necesita en una reacción
enzimática es un PH que va de 7-8 pir lo que se obtuvo concentración
 de glucosa menores Mientras que cuando no le agregamos la
concentración de glucosa fue mayor que los dos tubos anteriores debido
a que esta en condiciones óptimas para la reacción enzimática..

VI. ANEXOS

Figura 2: Absorbancia de la muestra a 10º C.

Figura 1: Absorbancia de la
muestra a 37º C.

Figura 4: Absorbancia de muestra a 70º C.

(Grupo 1)
Figura 3: Incubación de la
muestra a 70º C.
 Figura 5: Absorbancia de la muestra a
70º C. (Grupo 2)
Figura 6: Muestra con HCl (pH ácido).

Figura 7: Absorbancia de la muestra a pH

ácido (HCl)

Figura 8: Absorbancia de la muestra

a pH básico (NaOH)

Figura 10: Absorbancia de la muestra a pH

Figura 9: Muestra con glucosa (coloración neutro (solo el reactivo de trabajo + glucosa).
rosa). (Grupo 1)
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Angulo, A., Galindo, A., Avendaño, R., & Pérez, C. (2009). Bioquímica.
Culiacán: UAS-DGEP.
 Anónimo. (s.f.). Bioron. Recuperado el 31 de 03 de 2018, de Cinética
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Barcelona, España: ELSEVIER España S.L.
 Bender, D., Murray, R., Borham, K. K., Rodwell, V., & Weil, P. (2012).
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 Cardella, & Hernandez. (s.f).Bioquímica Médica. Tomo I Biomoléculas.
 David, N., & Cox, M. (2005). Lehninger. Principios de Bioquímica.
(Cuarta ed.). Barcelona, España: Omega.
 Lozano, J., Galindo, J., García-Borrón, J., Martínez-Liarte, J., García, R.,
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 Lucci, H., Castillo, S., & Bulla, R. (2015).Diccionario Lexus de Medicina y
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 Cárdenas, E. (1978). Enzimas alostéricas: cooperatividad en la unión y
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