Producción de polihidroxialcanoatos por bacterias

halófilas nativas en diferentes concentraciones de

almidón contenido en cáscaras de Solanum tuberosum L.

I. Introducción
Los plásticos hoy en día, son esenciales en la vida diaria debido a sus
múltiples aplicaciones; sin embargo, además de los beneficios de su uso, han
traído consigo serios problemas de contaminación, debido a que no son
degradados y se incrementan día a día generando contaminación ambiental.
Se estima que 30 % de los millones de toneladas de residuos sólidos
generados en el mundo son plásticos y la mayoría de ellos se acumulan en el
mar ocasionando muerte de su fauna (Ecopack, 2007). Asimismo, el uso del
petróleo como materia prima para la producción de plásticos genera problemas
ambientales como la emisión de gases de invernadero (metano, gases
conteniendo flúor, cloro y dióxido de carbono) y a pesar de que este recurso es
no renovable, anualmente países como Estados Unidos acumula en el
ambiente alrededor de 25 millones de toneladas de plásticos (Jackel et al.,
2008).
Los poli – B – hidroxialcanoatos (PHAs) se presentan como los
candidatos ideales para reemplazar los plásticos de origen petroquímico. Bajo
este título, se conocen más de 90 polímeros biodegradables y constituyen una
serie de poliésteres de ácidos alcanoicos insolubles en agua y sintetizados
como material de reserva por algunos microorganismos cuando el medio de
cultivo se encuentra desbalanceado con limitación en nitrógeno, fósforo, azufre,
magnesio, oxígeno y con exceso de fuente de carbono. El polihidroxialcanoato
más estudiado es el homopoliéster poli – 3 – hidroxibutirato (P – 3HB) que
puede constituir hasta el 80 % del peso seco de la célula. Las propiedades
físicas del PHA son similares a las del polipropileno en términos de punto de
fusión, densidad y resistencia a la tracción. Asimismo, copolímeros como poli
(3 – hidroxibutirato – co – 3 – hidroxivalerato): P (3HB – co – 3HV) presentan
menor punto de fusión y mayor elasticidad resultando más interesantes; sin
embargo, el proceso de elaboración es muy costoso, calculándose que,
producir 1 kg de PHA por fermentación cuesta 12 dólares, mientras que 1 kg de
plástico derivado del petróleo cuesta sólo 1 dólar (Ecopack, 2007). Los costos
de producción dependen del medio de cultivo, proceso fermentativo y
extracción del PHAs, habiéndose determinado que el costo del sustrato
constituye cerca del 50 % del costo total de producción de PHAs (Chen et al.,
2006).
El problema económico puede ser disminuido mediante el mejoramiento
del proceso fermentativo y separación, desarrollo de cepas más eficientes y el
uso de fuentes de carbono más baratas. Investigaciones realizadas
demuestran que los bacterias halófilas son heterótrofos capaces de utilizar

180
diversos carbohidratos como fuente de carbono y acumular
polihidroxialcanoatos. Asimismo, las condiciones extremadamente salinas en
las que puede desarrollarse y acumular polihidroxialcanoatos, disminuye los
requerimientos de condiciones estériles y el problema de contaminación
durante el proceso fermentativo y por ende se reducirían los costos de
producción. El aislamiento de bacterias halófilas resistentes a condiciones
ambientales extremas y por lo tanto poseedoras de sistemas enzimáticos
eficientes permitirá seleccionar cepas productoras de PHAs en subproductos
industriales como las cáscaras de Solanum tuberosum L. “papa”.

II. Objetivos

✓ Aislar bacterias halófilas a partir de salinas ubicadas en los distritos

de San José y Santa Rosa de la región Lambayeque.

✓ Detectar y seleccionar bacterias halófilas productoras de

polihidroxialcanoatos.

✓ Seleccionar la bacteria halófila con mayor rendimiento en la

producción de polihidroxialcanoatos.

✓ Determinar el efecto de cuatro concentraciones de almidón (5, 10, 15

y 20 g.L-1) contenido en cáscaras de Solanum tuberosum L. como
fuente carbonada en la producción de polihidroxialcanoatos por una
cepa nativa de bacteria halófila.

181
III. Medios de cultivo y diseño metodológico

3.1 Medios de cultivo

a) Medio Halófilo Moderado HM1

Composición gL-1
MgSO4*7H2O 0,025
CaCl2*2H2O 0,009
KCl 0,05
NaBr 0,006
Peptona 0,5
Extracto de Levadura 1
Glucosa 0,1

Disolver estos componentes en agua destilada y ajustar el pH a 7,5

con NaOH 0.1 M.

b) Medio Halófilo Moderado Modificado HM 2

Composición gL-1
MgSO47H2O 0,025
CaCl22H2O 0,009
KCl 0,05
NaBr 0,006
Extracto de Levadura 0,1
Glucosa 1

Disolver estos componentes en agua destilada y ajustar el pH a 8,0

con NaOH 0,1 M.

182
 c) Colorante Sudan Negro B

Pesar 0,3 g de Sudan Negro B en 100 m.L de etanol (70 °C),

reposar por 48 horas y filtrar.

3.2. Diseño metodológico de la investigación

El trabajo de investigación se ejecutó en dos fases. En la primera fase

descriptiva se realizó el aislamiento, detección y selección de bacterias
halófilas nativas productores de PHAs utilizando un diseño no experimental
transeccional descriptivo (Hernández et al., 2003). En la segunda fase
correspondiente a una investigación experimental se determinó el efecto de
cuatro concentraciones de almidón contenido en cáscaras de papa como
fuente carbonada en la producción de PHAs por una cepa nativa de bacteria
halófila. Se utilizó un diseño completamente aleatorio, DCA (Hernández et al.,
2003) con cuatro tratamientos y tres repeticiones totalizando 12 unidades
experimentales. También se incluyó un control constituido por glucosa (10
-1
gL ) como fuente de carbono.

3.2.1 Primera fase: Aislamiento, detección y selección de bacterias

halófilas nativas productoras de PHAs

a) Zona de muestreo
Para aislar bacterias halófilas productoras de PHAs durante el
mes de febrero de 2009 se recolectaron aleatoriamente 35 muestras de agua
de 8 salinas de los distritos de San José y Santa Rosa en la Región
Lambayeque (Figuras 1 y 2).

183
Figura 1. Toma de muestra de agua de salina en el distrito de San José en
Lambayeque, 2009.

184
 Figura 2. Toma de muestra de agua de salina en el distrito de Santa Rosa en
Lambayeque, 2009.
Las salinas del distrito de San José están ubicadas a 6°46’8.26’’
latitud sur y 79°56’56.78’’ longitud occidental; mientras que, las salinas del
distrito de Santa Rosa están ubicadas a 6°53’34.87’’ latitud sur y 79°54’33.08’’
longitud occidental.

b) Obtención y enriquecimiento de las muestras

Para aislar bacterias halófilas se recolectaron 35 muestras de
agua de salinas, 18 en el distrito de San José y 17 en el distrito de Santa Rosa.
Cada una de las muestras en cantidad de 200 mL fueron recolectados en
frascos de vidrio de boca ancha previamente esterilizados y rotulados con la
identificación correspondiente. Inmediatamente después se midió la
temperatura y el pH de las muestras de agua y a continuación se llevaron al
Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias
Biológicas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo para su procesamiento
respectivo.
Para incrementar la población de bacterias halófilas se realizó el
enriquecimiento de las muestras de agua depositando 1 mL de cada muestra
en frascos conteniendo 10 mL de medio HM1 con diferentes concentraciones
de NaCl (5, 10, 15, 20, 25 y 30 g/100 mL). Los frascos fueron incubados a 30
°C por un tiempo suficiente para observar crecimiento bacteriano denotado por
una turbidez.

c) Aislamiento de bacterias halófilas

Con cada una de las muestras enriquecidas se realizaron
diluciones (10-3) en solución salina al 10 % y a continuación se tomó una
alícuota de la dilución 10-3 y se sembró por duplicado sobre placas de Petri
con agar HM1. La incubación se realizó a 30 °C en aerobiosis hasta observar el
crecimiento de las colonias (1 a 15 días) las que fueron caracterizadas y
agrupadas según su color, forma, tamaño y aspecto. A continuación se
seleccionó una colonia representativa de cada grupo y se cultivó en viales con
agar HM1 con una concentración de NaCl igual a la del enriquecimiento y
aislamiento. Después de una incubación a 30 °C en aerobiosis por tiempo
suficiente para observar crecimiento bacteriano, los cultivos puros fueron
guardados en refrigeración a 4 °C

d) Detección de PHAs en bacterias halófilas nativas

Cada uno de los cultivos puros de bacterias halófilas se sembró
en tubos con 5 mL de caldo HM2 y se incubaron a 30 °C en agitación constante

185
(125 rpm) hasta observar crecimiento bacteriano denotado por una turbidez
(1 a 18 días). Posteriormente se realizaron tinciones con Sudan Negro B. La
presencia de gránulos negros o grisáceos en el interior de las células
vegetativas rosadas se consideró como positivo para la detección de PHAs en
bacterias halófilas.
El PHA fue estimado cualitativamente según una escala
convencional elaborada por los autores en base al porcentaje del área del
soma bacteriano ocupado por los gránulos negros o grisáceos (Figura 3). Se
seleccionaron los cultivos puros de bacterias halófilas donde los gránulos de
PHAs constituyeron 70 % a más del soma (+++).

Escala Área del soma Representación

ocupada por los
gránulos (%)
+ 1 a 29

++ 30 a 69

+++ 70 a más

Figura 3. Escala convencional para la estimación cualitativa de PHAs en

bacterias halófilas nativas.

e) Selección de bacterias halófilas según el rendimiento de

PHAs (Y p/x)
Cada una de las bacterias halófilas productoras de PHAs se
cultivó por triplicado en 6 mL de caldo HM2 a 30 °C por tiempo suficiente para
alcanzar la concentración de 107 cel.mL-1, para lo cual, se tomaron muestras
de 0,01 mL a partir de las 10 horas para realizar el conteo celular. A
continuación 5 mL del cultivo fueron inoculados en erlenmeyers de 250 mL de
capacidad conteniendo 45 mL (10 % v/v) de caldo HM2 y se incubaron a 30 °C
en agitación constante (125 rpm) por tiempo suficiente para alcanzar la
concentración celular de 2,4 a 2,7 x 109 cel.mL-1 (tubos 8 y 9 del Nefelómetro
de Mc Farland). Posteriormente se cuantificó la biomasa y PHAs producidos
por bacterias halófilas nativas.

186
 Para cuantificar el peso de la biomasa, cada uno de los cultivos se
centrifugó (3000 rpm durante 15 minutos) y el sedimento o paquete celular se
lavó dos veces con agua destilada para eliminar el exceso de sales del medio
de cultivo. Después se deshidrató en estufa a 60 °C por 48 a 72 horas (peso
constante) y se pesó en una balanza digital.
Para cuantificar el PHA, según el protocolo de Law y Slepecky (1961),
mencionado por Cholula (2005) en el tubo que contenía la biomasa
deshidratada se agregaron 5 mL de hipoclorito de sodio al 5 % para debilitar la
membrana celular y facilitar el proceso de extracción y después de 15 minutos
se agregaron 5 mL de cloroformo para separar la biomasa del polímero. Los
tubos se centrifugaron a 3500 rpm durante 5 minutos y se observaron dos
fases, una superior contiendo hipoclorito con restos celulares y una inferior
conteniendo cloroformo con el polímero (PHA). Inmediatamente después con
pipeta Pasteur se extrajo el cloroformo con el polímero, se depositó en un tubo
y se llevó a estufa a 40 °C por 24 horas para acelerar la evaporación del
cloroformo.
El polímero obtenido fue removido del fondo con ayuda de un
ansa bacteriológica depositándolo sobre un papel metálico para determinar el
peso correspondiente y posteriormente se realizó una corrida espectral (Anexo
4) en un espectrofotómetro UNICO (190-1100 nm), para la observación de un
pico máximo de absorbancia a 235 nm que verificó su naturaleza. El Y p/x es el
coeficiente de rendimiento de producto en relación a la biomasa, o cantidad de
producto obtenido por cantidad de biomasa formada (g.g-1) y se calculó
dividiendo los gramos de PHAs entre los gramos de biomasa. Se seleccionaron
tres cultivos puros debido a que presentaron el mayor en el rendimiento de
PHAs.

3.2.2 Segunda fase: Proceso fermentativo para la producción de

PHAs por cultivo de bacteria halófila nativa en diferentes
concentraciones de almidón contenido en cáscaras de
Solanun tuberosum L. “papa”

a) Tratamientos en estudio y diseño experimental

Se utilizó el Diseño Experimental Completamente Aleatorio (DCA)
con cuatro tratamientos, cada uno con tres repeticiones totalizando 12
unidades experimentales (Figura 4). Los tratamientos correspondieron a la
concentración de almidón contenido en cáscaras de papa con cuatro niveles 5,
10, 15 y 20 g.L-1. También se consideró un testigo con glucosa (10 g.L-1).

187
 A B D A

C B A C

D D C B

E E E

A : 5 g.L-1 almidón B : 10 g.L -1 almidón

C : 15 g.L-1 almidón D : 20 g.L -1 almidón
E : Control ( glucosa 10 g.L-1)

Figura 4. Modelo del Diseño Experimental Completamente Aleatorio (DCA)

para la producción de PHAs por cultivo de bacteria halófila nativa
en diferentes concentraciones de almidón contenido en cáscaras
de Solanum tuberosum L. “papa” y un control con glucosa.

188
 b) Acondicionamiento de biorreactores tipo tanque batch con
flujo de aire descendente (según Carreño y Villanueva, 2008)
Los biorreactores tipo tanque batch con flujo de aire descendente
y en número de 15 estuvieron constituidos por frascos de 1 L de capacidad
ajustados a la geometría y proporciones de un biorreactor estándar (Figuras 5 y
6). El extremo superior de cada biorreactor estuvo cubierto por una tapa de
goma que presentó dos orificios. A través del primer orificio ingresó una cánula
de plástico llevando el aire insuflado por una bomba de pecera Elite 803 de
4 watts y esterilizado por un sistema de burbujeo en solución de cloruro de
sodio al 30 %. A través del segundo orificio ingresó una cánula taponada en su
extremo superior con algodón para permitir la salida de gases. Los frascos de
vidrio se esterilizaron en horno (180 °C por 2 horas), el material de plástico y
goma se sumergieron en hipoclorito de sodio al 5 % durante 30 horas y
posteriormente fueron irradiados con luz ultravioleta durante 30 minutos.

c) Preparación del caldo de fermentación

Las cáscaras de papa, se lavaron con agua potable para eliminar
la tierra adherida. Posteriormente se enjuagaron con agua destilada, se
deshidrataron a temperatura ambiente (30– 32 °C) por 96 horas y el material
obtenido fue molido hasta fracciones de 0,5 a 2 mm. A continuación se
determinó la concentración de almidón mediante el método espectrofotométrico
por reacción colorimétrica con yodo. Se prepararon 100 mL de una solución de
1 mg.mL-1 de almidón químicamente puro y a partir de esta solución madre se
obtuvieron soluciones con 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 y 0,6 mg.mL-1 (Anexo 6). Se
realizó el mismo procedimiento con el almidón de cáscaras de papa (solución
problema) obteniendo soluciones de 0,4 y 0,6 mg.mL-1. A continuación todos
los tubos fueron llevados a baño maría (100 °C) hasta la disolución completa
del almidón. Para su cuantificación, se tomaron 2 mL de la solución de
almidón, se depositaron en un tubo de ensayo y se adicionaron 3 mL de una
solución de yoduro de potasio (2 mL de solución de yodo en 100 mL de agua).
Se observó una coloración azul y se leyó la absorbancia en
espectrofotómetro a 600 nm. Los resultados obtenidos fueron analizados
mediante regresión lineal utilizando el programa Microsoft Excel 2007 y con la
ecuación de la recta equivalente obtenida se calculó la concentración de
almidón en cáscaras de papa. Posteriormente se preparó el caldo de
fermentación teniendo como base el caldo HM2 en donde se reemplazó la
glucosa por cuatro concentraciones de almidón de cáscaras de papa (5, 10, 15,
20 g.L-1).

189
 Entrada de aire
Salida del CO2

Altura del líquido

PROPORCIONES
S

HT = 17,5 cm
DT= 6 cm
HL = 7,5 cm
S = 1,5 cm

HT

HL

DT

Figura 5. Diseño de biorreactor tipo tanque batch con flujo de aire

descendente.

190
 Salida de gases Entrada de aire
estéril

Nivel de
fluido

Burbujas de aire

NaCl al 30%

Bomba de aire Esterilización del aire

Figura 6. Modo de operación de biorreactor tanque batch con flujo de aire
descendente para la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) por
una bacteria halófila nativa.

191
 d) Selección de un aislamiento de bacteria halófila según el
crecimiento y producción de PHAs en diferentes
concentraciones de almidón
Cada uno de los tres cultivos puros de bacterias halófilas
seleccionadas, fueron sembradas por triplicado en tubo de ensayo conteniendo
5 mL de caldo HM2 con cuatro concentraciones de almidón (5, 10, 15 y 20 g.L-1)
e incubados a 30 °C durante 48 horas. Transcurrido el tiempo de incubación se
determinó el crecimiento celular por la turbidez en el medio de cultivo y el PHA
por la presencia de gránulos en coloraciones con Sudan Negro B. Se
seleccionó el aislamiento que presentó una mayor cantidad de PHAs.
e) Cuantificación de la biomasa por turbidimetría
El cultivo puro de bacteria halófila seleccionada, fue sembrado
por dos veces consecutivas (12 y 10 horas respectivamente) y por triplicado en
cuatro tubos con 5 mL de caldo de fermentación con 5, 10, 15, 20 g.L-1 de
almidón de cáscaras de papa y en un tubo con caldo de fermentación con
glucosa (10 g.L-1), a 30 °C y en agitación constante (125 rpm). A partir de las
10 horas y cada 2 horas después se tomaron muestras de 0,01 mL para
determinar la concentración celular hasta alcanzar 107 cel.mL-1.
Una vez obtenido el inóculo, se depositaron 5 mL (10 % v/v) de
cada uno de ellos en erlenmeyers con 45 mL de caldo HM2 con almidón y
glucosa como fuente de carbono y se incubaron a 30 ºC en agitación constante
(125 rpm). Asimismo cada 2 horas a partir de las 18 horas después de la
inoculación se tomaron muestras de 0,01 mL para cuantificar el número de
células y determinar el tiempo óptimo de incubación o tiempo después del cual
la concentración celular comienza a disminuir.Transcurrido eltiempo de
incubación, de cada uno de los erlenmeyers se tomaron 10 mL (tubo 1), se
determinó su absorbancia y luego se realizaron diluciones decimales hasta 10-4
determinándose también su absorbancia a 600 nm (tubos 2, 3, 4 y 5). El
volumen restante del contenido de los erlenmeyers se centrifugó a 3000 rpm
durante 15 minutos. El sedimento o biomasa obtenida se lavó con agua
destilada dos veces y luego se deshidrató a 60° C por 48 a 72 horas. A
continuación se pesó la biomasa deshidratada y se expresó en miligramos por
litro (mg.L-1) correspondiendo al valor obtenido de la absorbancia del tubo 1.
Después el valor del peso se dividió entre 10, 100, 1000 y 10 000
correspondiendo a las absorbancias de los tubos 2, 3, 4 y 5(10-1, 10-2, 10-3 y 10-
4). Con los datos obtenidos se obtuvo la ecuación de regresión para cada una

de las concentraciones de almidón de cáscaras de papa y glucosa (Figura 7).

192
 12 horas
30° C
125 rpm
HM2 – 5 g.L-1 HM2 – 10 g.L-1 HM2 – 15 g.L-1 HM2 – 20 g.L-1 Glucosa – 10 g.L-1

10 horas
30° C
125 rpm

5 mL inóculo
45 mL caldo
HM2

40 mL Centrifugación
10 mL

Sedimento

Lavado
Absorbancia

Deshidratado
10-1 10-2 10-3 10-4
Peso (mg.L-1)

Absorbancia

Figura 7. Esquema para la obtención de la curva patrón donde se relacionó la

biomasa y absorbancia para cada una de las concentraciones de
almidón y glucosa.

193
 f) Proceso fermentativo
Para la obtención del inóculo la bacteria halófila nativa
seleccionada se cultivó por triplicado en cuatro tubos conteniendo 5 mL de
caldo de fermentación con 5, 10, 15 y 20 gL-1 de almidón de cáscara de papa y
en un tubo con glucosa (10 gL-1) a 30 °C y en agitación constante (125 rpm)
hasta alcanzar una concentración de 107 cel.mL-1 (10 horas). A continuación
se tomaron 2,5 mL (10 % v/v) y se inocularon en erlenmeyers de 250 mL de
capacidad conteniendo 22,5 mL de caldo de fermentación con su respectiva
concentración de almidón y glucosa respectivamente. Se incubaron a 30° C en
agitación constante (125 rpm) hasta alcanzar una concentración de
107 cel.mL-1 (10 horas).
Para el proceso fermentativo en 15 biorreactores tipo tanque
batch con flujo de aire descendente y conteniendo 225 mL de caldo de
fermentación con cuatro concentraciones de almidón (5, 10, 15 y 20 g.L-1) de
cáscaras de papa y un control con glucosa (10 g.L -1) se depositaron 25 mL (10
% v/v) de cada uno de los inóculos bacterianos previamente obtenidos y se
incubaron a 30 °C durante 52 horas.
A partir de la inoculación (hora 0) y cada 4 horas se tomaron
muestras de 10 mL para cuantificar la biomasa por turbidimetría y PHAs
formados (Figura 8) según la metodología seguida en la selección de bacterias
halófilas productoras de PHAs.

10 mL de muestra

Turbidimetría Centrifugación 3000 rpm – 15’

Lavado 2 veces con agua destilada

Determinación de la Células centrifugadas

biomasa PHA

Figura 8. Flujograma del procesamiento de las muestras para obtener

biomasa y PHAs.

194
 g) Análisis estadístico
Previo al análisis estadístico se realizó la prueba de normalidad
de los valores del rendimiento Y (p/x) que es una de las asunciones principales
del análisis de varianza en la aplicación de la estadística paramétrica, de tal
manera que los resultados de los análisis tengan validez estadística y se pueda
llevar a cabo el proceso de inferencia a partir de la muestra.
Para el diseño completamente aleatorio, el modelo aditivo lineal
fue:
Yij = u + ti + Eij

Donde:
Yij = observación del i – ésimo tratamiento, j – ésima repetición
u = media general de la variable respuesta
ti = efecto del i – ésimo tratamiento, siendo i = 1,2,3,4
Eij = error experimental en el i – ésimo tratamiento, j – ésima repetición
Para la comparación de medias de los tratamientos la prueba de hipótesis
fue:
Ho = u1 = u2 = u3 = u4
Ha = Al menos una media es diferente

Se realizó el análisis de varianza del rendimiento Y (p/x) de PHAs

y la superioridad entre los tratamientos se determinó mediante la prueba
múltiple de Tukey con un nivel de significancia de 0,05 (Hernández et al.
2003). En el presente trabajo se utilizó el software estadístico SPSS versión
15,0 así como programas Word y Excel para Windows, versión 2007.

195
IV. Resultados
4.1 Bacterias halófilas aisladas de aguas de salinas de San José y
Santa Rosa, en Lambayeque, 2009
En ocho salinas de San José y Santa Rosa se tomaron muestras de
agua con una concentración de sales de hasta 25 g/100 mL en San José y
24 g/100 mL en Santa Rosa (Tabla 1).
En el distrito de San José los pobladores se dedican a la agricultura y
ganadería. Existen seis salinas superficiales ubicadas cerca de la zona
urbana, de tal manera que la población fácilmente tiene acceso, observándose
también la desembocadura de un colector de desagüe en una de las salinas
(Figuras 9 y 10). En el distrito de Santa Rosa los pobladores se dedican a la
pesca, incluyendo el procesamiento y comercialización. Existen doce salinas
fuera de la zona urbana (1,5 Km) en un suelo arenoso y a una profundidad de 3
a 4 metros de la superficie (Figuras11 y 12).
El 100 % de las muestras de agua fue positivo para el enriquecimiento
de bacterias (Tabla 2) observándose turbidez en todas las concentraciones de
NaCl en un tiempo que osciló entre 1 día (5 g/100 mL NaCl) hasta 18 días
(30 g/100 mL NaCl) y una película blanquecina en la superficie de las
concentraciones de 5, 10, 15 y 20 g/100 mL de NaCl durante 1 a 6 días.
El 100 % de las muestras enriquecidas en diferentes concentraciones de
NaCl fue positivo para el aislamiento de bacterias halófilas en un tiempo que
osciló entre 1 a 3 días; 1 a 5 días; 3 a 14 días; 4 a 10 días; 16 a 18 días y 15
a 18 días para 5, 10, 15, 20, 25 y 30 g/100 mL NaCl (Tabla 3). Se obtuvieron
203 aislamientos, con los mayores porcentajes correspondientes a 25,62 %
(52); 25,12 % (51), 24,14 % (49) y 19,21 % (39) pertenecientes a las
concentraciones 15, 10, 20 y 5 g/100 mL NaCl respectivamente. A su vez los
menores porcentajes de 3.45 % (7) y 2.46 % (5) correspondieron a las
concentraciones 30 y 25 g/100 mL NaCl respectivamente (Figura 13).

196
Tabla 1. Características físico – químicas de aguas de salinas de San José
y Santa Rosa en Lambayeque, febrero 2009

Salina Ubicación Temperatura pH Concentración

(°C) de Sales
g/100 mL
1 San José 28,3 °C 7,99 24,8
2 San José 27,8 °C 8,00 25,0
3 San José 27,4 °C 8,00 24,9
4 San José 27,3 °C 7,99 24,8
5 Santa Rosa 32,7 °C 7,37 24,0
6 Santa Rosa 32,6 °C 7,33 23,8
7 Santa Rosa 33,2 °C 7,55 23,9
8 Santa Rosa 33,7 °C 7,72 23,9

197
Figura 9. Salinas de San José ubicadas cerca de la zona urbana.

Figura 10. Desembocadura de un colector de desagüe en las salinas de San

José.

198
Figura 11. Salina de Santa Rosa en una zona arenosa fuera de la zona
urbana.

Figura 12. Salina de Santa Rosa a una profundidad de 3 a 4 metros.

199
Tabla 2. Características del enriquecimiento positivo de muestras de agua de
salinas de San José y Santa Rosa en diferentes concentraciones de NaCl
Lambayeque, 2009
Concentración Tiempo de
Película
de NaCl Salinas incubación Turbidez
superficial
g/100 mL (días)
1 1
2 1
3 1
5 4 1 Positivo Positivo
5 1
6 1
7 1
8 1
1 2
2 2
3 2
10 4 2 Positivo Positivo
5 3
6 2
7 2
8 2
1 3
2 3
3 3
15 4 3 Positivo Positivo
5 5
6 3
7 3
8 3
1 6
2 6
3 6
20 4 6 Positivo Positivo
5 6
6 6
7 6
8 6
1 12
2 12
3 12
25 4 12 Positivo Negativo
5 12
6 12
7 13
8 13
1 18
2 18
3 18
30 4 18 Positivo Negativo
5 18
6 8
7 18
8 18

200
Tabla 3. Tiempo de incubación para el aislamiento de bacterias halófilas en
diferentes concentraciones de NaCl

Concentración NaCl Incubación Número de

(g/100 mL) (días) aislamientos
1 36
5 2 2
3 1
1 44
10 2 3
3 2
5 2
3 5
4 12
15 7 15
9 12
14 8
4 14
20 6 29
10 6
25 16 4
18 1
15 1
30 16 1
18 5

30

25
P orc entaje (% )

20

15

10

0
5 10 15 20 25 30

NaC l (g /100mL )

Figura 13. Porcentaje de bacterias halófilas aisladas en diferentes

concentraciones de NaCl.

201
4.2 Bacterias halófilas productoras de PHAs aisladas de salinas de San
José y Santa Rosa, 2009
En el 38,92 % (79) de los aislamientos de bacterias halófilas se
detectaron gránulos de PHAs mediante la tinción lipofílica de Sudan Negro B.
Los gránulos se observaron de color negro sobre un fondo rosado de la célula
vegetativa (Figura 14).
El porcentaje de aislamientos bacterianos productores de PHAs fue de
3,8 % (3) para 5 g/100 mL de NaCl después de 16 horas de incubación; 34,2 %
(27) para 10 g/100 mL de NaCl después de 1 a 4 días de incubación; 29,1 %
(23) para 15 g/100 mL de NaCl después de 4 a 9 días de incubación; 27,8 %
(22) para 20 g/100 mL de NaCl después de 4 a 10 días de incubación; 2,5 %
(2) para 25 g/100 mL de NaCl después de 16 días de incubación y 2,5 % (2)
para 30 g/100 mL de NaCl después de 18 días de incubación (Figura 15 y
Tabla 4).

Entre las bacterias halófilas productoras de PHAs el 69,62 % fueron

bacilos aislados, el 1,26 % bacilos en cadena, el 7,59 % bacilos pleomórficos y
el 21,52 % formas cocoides, (Tabla 5). Entre los 79 aislamientos positivos se
seleccionaron 24 debido a que presentaron una mayor cantidad de PHAs que
constituyó el 70 % a más del soma bacteriano.

202
 (a)

(b)

Figura 14 (a y b). Gránulos de PHAs en bacterias halófilas nativas teñidas con

Sudan Negro B.

203
 40

35

30
P orc entaje (% )

25

20

15

10

0
5 10 15 20 25 30

C onc entrac ion de NaC l (g /100mL )

Figura 15. Porcentaje de bacterias halófilas productoras de PHAs en diferentes

concentraciones de NaCl.

Tabla 4. Tiempo de incubación para la detección de PHAs en bacterias

halófilas en diferentes concentraciones de NaCl

NaCl Incubación Bacterias productoras

g/100 mL (días) de PHAs

5 0,66 3
10 1 17
4 10
15 4 8
9 15
4 5
20 6 13
10 4
25 16 2
30 18 2

204
Tabla 5. Presencia de PHAs según morfología de bacterias halófilas aisladas
de salinas de San José y Santa Rosa en diferentes concentraciones
de NaCl, 2009

NaCl Bacilos Bacilos Bacilos Formas Total

g/100 mL en pleomórficos cocoide
aislados
cadena s
5 3 0 0 0 3
10 25 0 2 0 27
15 13 0 3 7 23
20 12 1 0 9 22
25 0 0 1 1 2
30 2 0 0 0 2
Total 55 1 6 17 79
(%) 69,62 1,26 7,59 21,52 100

205
4.2 Rendimiento Y (p/x) de PHAs en bacterias halófilas nativas

El tiempo de incubación requerido por las bacterias halófilas nativas para

alcanzar una concentración celular de 107 cel.mL-1 osciló entre 9 (M4C1) y 71
horas (M3C6 y M4C2). Según la concentración de cloruro de sodio el tiempo
requerido fue de 10 a 10,5 horas para 5 g/100 mL NaCl; 9 a 12,5 horas para 10
g/100 NaCl; 13 a 21 horas para 15 g/100 mL y 22,5 a 71 horas para 20 g/100
mL NaCl (Tabla 6).
La naturaleza del polímero (Figura 16) recuperado después de cultivar
las bacterias halófilas nativas en caldo HM2 con glucosa como fuente de
carbono, fue verificada en una corrida espectral (200 a 300 nm), obteniendo un
pico máximo de absorción a 235 nm (Figura 17).
El rendimiento Y (p/x) de PHAs de bacterias halófilas nativas en caldo
HM2 con glucosa como fuente de carbono osciló entre 0,889 y 0,174 gg -1 para
los aislamientos M4C5 (15 g/100 mL NaCl) y M5C3 (10 g/100 mL NaCl) con
porcentaje de 88,9 y 17,4 % respectivamente (Tabla 7). Asimismo 18
aislamientos presentaron una concentración de PHAs menor a 0,0001 g por lo
que no pudo ser cuantificado en las condiciones de la presente investigación.
Fueron seleccionados 3 aislamientos M4C5 y M5C3 (15 g/100 mL NaCl)
así como M4C1 (10 g/100 mL NaCl) debido a que presentaron los mayores
valores en el rendimiento de PHAs (88,9; 84,6; y 85,5 % respectivamente).

206
Tabla 6. Tiempo de incubación requerido por bacterias halófilas nativas para
alcanzar una concentración celular de 107 cel.mL-1

NaCl Código Tiempo Cel.mL-1

g/100 mL (horas)
M7C1 10,0 2,7 x 107
5 M5C1 10,0 3,2 x 107
M6C4 10,0 6,5 x 107
M1C2 10,5 6,4 x 107
M4C1 9,0 1,1 x 108
M2C2 10,5 2,2 x 107
M2C7 10,5 3,1 x 107
M4C2 10,5 8,7 x 107
10 M6C1 12,5 1,8 x 107
M5C4 12,5 2,5 x 107
M5C2 12,5 4,6 x 107
M5C3 12,5 5,3 x 107
M4C5 13,0 8,5 x 107
M5C1 *
15 M5C2 21,0 2,6 x 107
M5C3 21,0 7,4 x 107
M1C3 22,5 3,6 x 107
M1C1 22,5 4,1 x 107
M1C2 22,5 5,8 x 107
20 M2C1 26,0 5,5 x 107
M2C6 26,0 6,2 x 107
M4C3 46,0 2,9 x 107
M3C6 71,0 3,8 x 107
M4C2 71,0 6,7 x 107
* No creció

207
Figura 16. Polímero recuperado en caldo HM2 con glucosa como fuente de
carbono cultivado con bacteria halófila nativa.

Figura 17. Corrida espectral (200 a 300 nm) de polímero con pico máximo a
235 nm.

208
Tabla 7. Rendimiento Y (p/x) de polihidroxialcanoatos de bacterias halófilas en
caldo HM2 con glucosa como fuente de carbono

NaCl Código Biomasa PHA Rendimiento Y(p/x)

g/100 mL (g.L-1) (g.L-1) (g.g-1)
(%)
15 M4C5 0,360 0,320 0,889 88,9
10 M4C1 0,234 0,200 0,855 85,5
15 M5C3 0,260 0,220 0,846 84,6
5 M6C4 0,140 0,030 0,214 21,4
10 M5C3 0,700 0,122 0,174 17,4

209
4.3 Producción de PHAs por bacteria halófila nativa en diferentes
concentraciones de almidón contenido en cáscaras de Solanum
tuberosum L. “papa”

La bacteria halófila nativa que desarrolló en cuatro concentraciones de

almidón de cáscaras de papa y donde se observó el mayor rendimiento (%) de
PHAs fue seleccionada para cuantificar la biomasa y el PHA así como también
el rendimiento Y p/x.

4.4.1 Concentración de almidón de cáscaras de papa

Con los datos de absorbancia obtenidos de una solución de
almidón en diferentes concentraciones (Tabla 8) se obtuvo una ecuación de la
recta equivalente (y = 1,604x + 0,068), producto de tres repeticiones, con un
valor de r2 = 0,999 (Figura 18). Considerando que un valor de r2 > 0,9, muestra
una dispersión homogénea de valores sobre la recta (Mantilla et al., 2007), se
aceptó el uso de la ecuación obtenida como un patrón de referencia para el
cálculo de la concentración de almidón en cáscaras de papa, determinándose
que 1 gramo de cáscaras de papa contiene 0,39 gramos de almidón. Con este
dato se determinó la cantidad de cáscaras de papa requerida para alcanzar las
diferentes concentraciones almidón en el caldo de fermentación (Tabla 9).

4.2.2 Crecimiento y producción de PHAs por tres aislamientos de

bacterias halófilas en diferentes concentraciones de almidón
de cáscaras de papa

Los tres aislamientos de bacterias halófilas seleccionadas (M4C1,

M4C5 y M5C3) crecieron en caldo de fermentación, observándose también
gránulos de PHAs en las cuatro concentraciones (5, 10, 15 y 20 g.L -1) de
almidón de cáscaras de papa en el aislamiento M4C1; sin embargo, no se
observaron estos gránulos en la concentración 5 g.L-1 en los aislamientos
M4C5 y M5C3 (Tabla 10). Se seleccionó el aislamiento M4C1 debido a que se
detectó PHAs en las cuatro concentraciones de almidón.

210
Tabla 8. Valores de absorbancia (600 nm) de diferentes concentraciones de
almidón químicamente puro y cáscaras de Solanum tuberosum L.
“papa”

Sustrato Concentración Absorbancia

(g.L-1) (600 nm)
0,1 0,227
Almidón 0,2 0,385
químicamente 0,3 0,548
puro 0,4 0,725
(QP) 0,5 0,870
0,6 1,024
Almidón de 0,4 0,325
cáscaras de papa 0,6 0,442

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Figura 18. Curva patrón para determinar la concentración de almidón en

cáscaras de Solanum tuberosum L. “papa”.

211
Tabla 9. Concentración de almidón contenido en cascaras de Solanum
tuberosum L. “papa”
Cáscaras de papa Almidón
(g.L-1)
(g.L-1)
12,8 5
25,6 10
38,4 15
51,2 20
* 1 gramo de cáscara de papa contiene 0,39 gramos de almidón

Tabla 10. Presencia de gránulos de PHAs en tres aislamientos de bacterias

halófilas cultivadas en diferentes concentraciones de almidón
contenido en cáscaras de papa
NaCl Código Almidón Gránulos
g/100 mL Aislamiento g.L-1 PHAs
5 +
10 M4C1 10 +
15 +
20 +
5 -
15 10 +
M4C5 15 +
20 +
5 -
15 10 +
M5C3 15 +
20 +

212
 4.2.3 Curva patrón para el cálculo de la concentración de biomasa
por turbidimetría
Con los datos de absorbancia obtenidos (Tabla 11) con diferentes
concentraciones de biomasa de una bacteria halófila nativa cultivada en caldo
de fermentación se obtuvieron las ecuaciones de la recta equivalente
y = 0,002x + 0,000; y = 0,002x - 0,003; y = 0,002x + 0,002; y = 0,002x + 0,000
para 5, 10, 15 y 20 g.L-1 de almidón de cáscaras de papa respectivamente, así
como y = 0,002x + 0,000 para 10 g.L-1 de glucosa (Figura 19). Debido a que en
todas las ecuaciones el valor de r2 fue mayor de 0,9 se aceptaron como patrón
de referencia para el cálculo de la concentración de biomasa.

4.2.4 Concentración de biomasa y PHAs de bacteria halófila nativa

en caldo de fermentación con almidón de cáscaras de papa y
glucosa como fuente de carbono
Al observar la cinética de crecimiento de la bacteria halófila nativa
M4C1, se aprecia que la biomasa y el PHA se incrementaron hasta alcanzar un
valor máximo y luego disminuyeron gradualmente. En glucosa la tendencia fue
similar para el PHA, pero no para la biomasa, donde se observó un incremento
gradual (Figura 20).
Los valores máximos en la concentración de biomasa de la
bacteria halófila nativa fueron de 198 mg.L-1 y 68 mg.L-1 para 5 y 20 g.L-1 de
almidón de cáscaras de papa después de 8 horas de incubación así como 158
mg.L-1y 74 mg.L-1 para 10 y 15 g.L-1 después de 12 horas de incubación. Con
glucosa como fuente de carbono el valor máximo de biomasa fue 959 mg.L-1
después de 52 horas de incubación (Tabla 12).
La naturaleza del polímero (Figura 21) obtenido después de
cultivar la bacteria halófila nativa en caldo de fermentación con almidón de
cáscaras de papa fue verificada obteniendo un pico máximo de absorción a
235 nm.
Los valores máximos en la concentración de PHAs de la bacteria
halófila nativa cultivada en 5, 10, 15 y 20 g.L -1 de almidón de cáscara de papa
fueron 19,0; 15,9; 7,39 y 6,26 g.L-1 después de 20, 40, 24 y 16 horas de
incubación respectivamente. Con glucosa como fuente de carbono el valor
máximo de PHAs fue de 273 mg.L-1 después de 28 horas de incubación
(Tabla 12)

213
Tabla 11. Valores de absorbancia (600 nm) de biomasa de bacteria halófila
nativa en caldo de fermentación con almidón de cáscaras de papa y
glucosa como fuentes de carbono

Fuente de carbono Biomasa Absorbancia

(g.L-1) (600 nm)
(mg.L-1)
144,010 0,404
14,400 0,041
5 1,440 0,005
0,144 0,000
136,530 0,383
13,650 0,035
10 1,365 0,000
135,590 0,380
Almidón 13,560 0,038
1,365 0,011
15 0,136 0,000
160,410 0,450
16,040 0,035
1,604 0,004
20 0,160 0,000
166,470 0,467
16,647 0,052
Glucosa 10 1,665 0,003
0,166 0,000

214
Figura 19. Curva patrón de biomasa de bacteria halófila nativa cultivada en
caldo de fermentación con almidón de cáscaras de papa 5, 10, 15
20 g.L-1 (A, B, C y D respectivamente) y glucosa 10 g.L-1 (E).

215
 (A) (B)

(C) (D)

(E)

Figura 20. Cinética de crecimiento y producción de PHAs por bacteria halófila

nativa M4C1 en caldo de fermentación, con almidón de cáscaras
de papa 5, 10, 15 20 g.L-1 (A, B, C y D ) y glucosa 10 g.L-1 (E).

216
Figura 21. Polímero recuperado en caldo de fermentación con almidón de
cáscaras de papa cultivado con bacteria halófila nativa.

Tabla 12. Valores máximos de biomasa y PHAs alcanzados por bacteria

halófila nativa M4C1 en diferentes concentraciones de almidón de
cáscaras de papa y glucosa como fuentes de carbono

Fuente de carbono Biomasa Tiempo PHAs Tiempo

(g.L-1) (mg.L-1) (horas) (mg.L-1) (horas)
5 198 8 19,0 20

158 12 15,9 40
10
Almidón 74 12 7,39 24

15 68 8 6,26 16

20
Glucosa 10 959 52 273 28

217
 El rendimiento Y (p/x) o gramos de PHAs por gramo de fuente de
carbono fue de 0,107; 0,143; 0,132 y 0,095 equivalentes a 10,7; 14,3; 13,2 y
9,5 % cuando la bacteria halófila nativa fue cultivada en 5, 10, 15 y 20 g.L-1 de
almidón de cáscara de papa. Con glucosa como fuente de carbono el
rendimiento fue de 0,348 g.g-1 equivalente a 34,8 % (Tabla 13). La prueba “F”
del análisis de varianza resultó altamente significativa para las concentraciones
de almidón y según la prueba discriminatoria de Tukey, el mayor valor se
obtuvo en la concentración 10 gL-1, diferenciándose significativamente de las
concentraciones 15,5 y 20 gL-1 (Tabla 14).

218
Tabla 13. Rendimiento de PHAs Y (p/x) de bacteria halófila nativa M4C1 en
diferentes concentraciones de almidón de cascaras de Solanum
tuberosum L. “papa” y glucosa como fuentes de carbono

Fuente de Tiempo Biomasa PHAs Y(p/x)

carbono (horas) (mg.L-1) (mg.L-1) (g.g-1) (%)
(g.L-1)
5 24 177 19,0 0,107 10,7
10 40 111 15,9 0,143 14,3
Almidón 15 24 56 7,39 0,132 13,2
20 16 66 6,26 0,095 9,5
Glucosa 10 28 785 273 0,348 34,8

Tabla 14. Prueba discriminatoria de Tukey (α = 0,05) del rendimiento Y (p/x) de

PHA de bacteria halófila nativa cultivada en diferentes
concentraciones de almidón de cáscaras de papa
Ho = u1 = u2 = u3 = u4
Almidón Y(p/x) Significancia
(g.L-1) g.g-1 (%)
10 0,143 14,3 a
15 0,132 13,2 b
5 0,107 10,7 c
20 0,095 9,5 d

219
V. Discusión
5.1 Bacterias halófilas aisladas a partir de salinas de los distritos de
San José y Santa Rosa
Las salinas son cuencas endorreicas caracterizadas por afloramientos
salinos como resultado de un proceso de acumulación de sales depositadas
fundamentalmente al evaporarse un lago temporal formado por corrientes de
aguas salobres tanto superficiales como subterráneas (Encarta, 2008). En las
muestras de aguas de las salinas de San José y Santa Rosa, región
Lambayeque, la concentración de NaCl fue de hasta 25 g/100 mL, coincidiendo
con López (2010), quien determinó que estos ambientes son considerados
hipersalinos debido a que presentan una elevada concentración de sal.
En todas las muestras de aguas de salinas se aislaron bacterias
consideradas como halófilas porque requieren cierta concentración de NaCl
para su desarrollo y crecimiento (Reyes et al., 2006), coincidiendo con
Quillahuaman et al. (2004), quienes aislaron Halomonas boliviensis a partir de
lagos salinos en Bolivia. Las salinas son buenos hábitats para los procariotas
halófilos extremos. Anteriormente se asumía que las arqueobacterias
dominaban los ambientes extremos, mientras que las bacterias estaban
restringidas a los ambientes moderados. Con las técnicas de biología molecular
se ha demostrado que las bacterias al igual que las arqueas se encuentran en
ambientes extremos como las salinas (Díaz, 2007).
Los mayores porcentajes de aislamientos de bacterias halófilas fueron
obtenidos en las concentraciones 10, 15 y 20 g/100 mL de NaCl. Según Reyes
et al. (2006) éstas bacterias son consideradas halófilas moderadas porque
requieren concentraciones de NaCl comprendidas entre 10 a 20 %; sin
embargo, kushner y Kamekura, (1988) mencionaron que éstas bacterias
requieren concentraciones comprendidas entre 3 a 15 %. También se aislaron
bacterias en las concentraciones de 25 y 30 %, considerados como halófilos
extremos por cuanto requieren concentraciones mayores de 20 % de NaCl
(Reyes et al., 2006).

5.2 Bacterias halófilas productoras de polihidroxialcanoatos (PHAs)

aisladas de salinas de los distritos de San José y Santa Rosa
Los PHAs son poliésteres con características semejantes a los plásticos
derivados del petróleo, pero que son totalmente biodegradables (Pettinari
et al., 2004; Dantas, 2005). Son sintetizados y acumulados en forma de
gránulos en el citoplasma por una variedad de procariotas, siendo utilizados
como fuente de carbono y energía en condiciones de escasez de nutrientes
por lo que constituyen una estrategia desarrollada por los microorganismos
para incrementar su supervivencia. De esta manera, en ambientes extremos
como las salinas de San José y Santa Rosa se detectaron bacterias

220
productoras de PHAs. Los resultados coinciden con Guzmán y Guz (2008),
quienes detectaron y cuantificaron PHAs en bacterias halófilas aisladas de la
Laguna Blanca en Potosí, Bolivia. Asimismo, López (2010) investigó bacterias
productoras de PHAs en sedimentos marinos y encontró cianobacterias,
bacterias fotótrofas anoxigénicas y bacterias heterótrofas entre las que
identificó los géneros Bacillus, Streptococcus, Micrococcus y Paracoccus,
sugiriendo que la producción de PHAs en el tapete microbiano no sólo funciona
como material de almacenaje sino que es necesario para lidiar con el estrés
nutricional de los sitios contaminados. Por su parte, Razzaq et al. (2010)
cuantificaron una mayor cantidad de gránulos de PHAs en bacterias
provenientes de lugares contaminados concluyendo que la síntesis de este
polímero constituye una necesidad para sobrevivir en lugares donde los
requerimientos básicos de carbono pueden estar cubiertos, pero no así los de
nitrógeno.
La técnica de coloración con Sudan Negro B resultó adecuada para la
detección de PHAs en bacterias halófilas. La tinción indicó la naturaleza lipídica
de los gránulos que se observaron grisáceos o negruzcos frente a las células
vegetativas rosadas, coincidiendo con Martínez et al. (2004) y Moreno et al.
(2005).
El porcentaje del área del soma ocupado por los gránulos de PHAs
permitió estimar el contenido del polímero coincidiendo con investigadores
como Grados et al. (2008) y Razzaq et al. (2010), quienes detectaron PHAs por
tinción de los gránulos con Sudan Negro B y a la vez los cuantificaron pudiendo
clasificar a las bacterias productoras según una escala convencional con un
máximo de tres cruces (+++) y un mínimo de una cruz (+) para porcentajes de
PHAs mayores de 25 y menores de 3 % respectivamente.
El mayor porcentaje de bacterias halófilas productoras de PHAs fueron
bacilos, pero también se encontraron formas cocoides, coincidiendo con López
(2010), quien investigó bacterias productoras de PHAs en sedimentos marinos
e identificó Bacillus, Staphylococcus, Micrococcus y Paracoccus. Asimismo,
Dong et al. (2006), Huang et al. (2006) y Koller et al. (2007) observaron la
producción de PHAs en bacilos Gram negativos identificándolos como
Haloferax mediterranei.
El rendimiento Y (p/x) de PHAs de las bacterias halófilas nativas con
glucosa como fuente de carbono alcanzó un máximo de 0,889 g.g-1, valor
superior a 0,324 g.g-1 reportado por García y Rodríguez, mencionados por
Chen et al. (2006), para H. mediterranei con 2 % de almidón hidrolizado como
fuente de carbono y en un cultivo Batch como el utilizado en el presente
experimento.
El valor máximo de rendimiento fue de 88,9 %, superior al rango
comprendido entre 38,7 y 72,8 % reportado por Dong et al. (2006), Huang et al.
(2006) y Koller (2006) para H. mediterranei cultivado en hidrolizado de almidón

221
de maíz, mezcla de paja de arroz-almidón de maíz y suero de leche
respectivamente.
La concentración de PHAs máxima alcanzada para las bacterias
halófilas nativas fue de 0,320 g.L-1 valor cercano a 0, 346 g.L-1 observado por
Guzmán y Guz (2008) para una bacteria halófila aislada de la Laguna Blanca
de Potosí, Bolivia con glucosa como fuente de carbono; sin embargo, en la
literatura se encuentran también valores muy superiores en la concentración de
PHAs con un rango comprendido entre 62,6 a 85,9 g.L-1 (Huang et al., 2006 y
Dong et al., 2006 respectivamente). La diferencia es explicada por el sistema
de cultivo empleado. En un cultivo alimentado el suministro continuo de fuente
carbono permite una mayor conversión de sustrato a producto, desviando el
metabolismo de acumulación de biomasa a síntesis de polímero (Lee y Chang,
1995).
En todas las bacterias halófilas nativas la cantidad de biomasa formada
no estuvo directamente relacionada con la concentración de PHAs como
sucedió en el aislamiento M5C3, que alcanzó el mayor valor en biomasa (700
mg.L-1); sin embargo, obtuvo 122 mg.L-1 de PHAs. El resultado coincide con
Lasala et al. (2004) quienes observaron que Mesorhizobium plurifarium obtuvo
un crecimiento abundante con melaza y glucosa (1,152 y 1,116 mg.L-1 de
biomasa) con una concentración de PHAs de 146 y 192 mg.L-1, inferior al
observado con sacarosa (361,9 mg.L-1) y manitol (336,51 mg.L-1) donde se
observó un crecimiento moderado (0,971 y 0,967 g.L-1).

5.3 Producción de PHAs por bacterias halófilas nativas en diferentes

concentraciones de almidón contenido en cascaras de papa
Se enfatiza la importancia del aislamiento de bacteria halófila M4C1 por
tratarse de una bacteria nativa que creció y sintetizó PHAs utilizando como
fuente de carbono, cáscaras de papa que, industrialmente son considerados
como residuos. Coincidiendo con lo expuesto, Dong et al. (2006) manifestaron
que se han utilizado muchas bacterias para producir PHAs incluyendo
Cupriavidus necator, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas
spp., Escherichia coli recombinante; sin embargo, existen pocos estudios de la
producción de PHAs por bacterias halófilas como Haloferax mediterranei. La
ventaja de usar estas bacterias para la producción industrial de PHAs es que
los requerimientos de condiciones de esterilidad son mínimos debido a la
extrema salinidad del medio de cultivo donde pueden crecer y sintetizar el
polímero.
Aún cuando las ventajas ecológicas de los PHAs son notables, los
costos de producción muy elevados limitan su adopción plena como sustitutos
de los poliésteres derivados del petróleo. Para reducir los costos se deben
obtener cepas bacterianas con mayor rendimiento y buscar sustratos

222
económicos y de fácil accesibilidad para la producción de PHAs así como
optimizar los procesos de extracción y purificación del producto (Arcos y
Vargas, 2006; Rivera y Nevárez, 2009). Las cáscaras de papa contienen
almidón que constituye una fuente de carbono económica y son residuos que
ofrecen por sí mismos poco valor. Coincidiendo al respecto,
Rivera y Nevárez (2009), Grados et al. (2008) demostraron que se pueden
utilizar residuos o subproductos de los procesos industriales como efluentes de
las instalaciones donde se crían cerdos, aceites comestibles post utilizados y
residuos agrícolas hidrolizados para la producción de PHAs por Azotobacter
vinelandii ATCC 53799, Pseudomonas spp. DR2 y consorcio bacteriano
respectivamente.
La bacteria halófila nativa M4C1 productora de PHAs también presenta
la ventaja que para incrementar la producción de PHAs no requiere
condiciones limitantes de algún nutriente esencial. Investigadores como Choi y
Chan (1998); Lasala et al. (2004) y Chen et al. (2006) concluyeron que existen
géneros de bacterias que sintetizan el polímero únicamente en la fase
estacionaria de crecimiento por limitación de nutrientes y con fuente de carbono
en exceso, por ejemplo Cupriavidus necator, Pseudomonas oleovorans,
Azotobacter beijerenckii y Azospirillum brasilense. Otras bacterias acumulan
PHAs durante su crecimiento sin necesidad que se agote un nutriente esencial
ejemplo Mesorhizobium plurifarium, Alcaligenes latus, Pseudomonas putida,
Haloferax mediterranei, Azotobacter chroococcum, los mutantes de
Azotobacter vinelandii y cepas recombinantes de E. coli.
La bacteria halófila nativa M4C1 cultivada con almidón contenido en
cáscaras de papa como fuente de carbono alcanzó un rendimiento de PHA
muy bajo (14,3 %) comparado con el obtenido al utilizar glucosa como fuente
de carbono sugiriendo la necesidad de hidrolizar el almidón o suplementarlo.
Coincidiendo al respecto Chen et al. (2006); Huang et al. (2006) y Koller et al.
(2007); cultivaron Haloferax mediterranei en hidrolizados de almidón de maíz
paja de arroz con almidón de maíz así como suero lácteo obteniendo PHAs en
las concentraciones de 20; 77,8 y 12 g.L-1 correspondientes a los porcentajes
de acumulación en peso seco Y (p/x) de 50,8; 55,6 y 72,8 % respectivamente.
Éstos investigadores propusieron la hidrolisis de los residuos agrícolas, lo que
representan un costo extra en la producción, por lo que sugirieron la utilización
de un extracto enzimático crudo de origen microbiano.
También es posible que existan otros factores como la aireación, que
puede explicar el bajo rendimiento, por cuanto, cuando la bacteria halófila
M4C1 fue cultivada con glucosa como fuente de carbono y sin aireación
alcanzó un rendimiento de 85,5 % frente a 34,8 % alcanzado con aireación.
Diversos investigadores (Rodriguez – Valera y García, 1990; Cholula, 2005)
han demostrado que la aireación favorece la producción de PHA; no obstante,
Lasala et al. (2004) concluyeron que una oxigenación elevada desvía el
metabolismo hacia mayores cuotas de respiración, mayor oxidación del

223
sustrato y por lo tanto menos disponibilidad de Acetil – CoA para la síntesis del
polímero. Por el contrario, con bajos niveles de oxigenación y exceso de fuente
de carbono, el metabolismo energético genera elevadas concentraciones de
NADH y Acetil – CoA, el cual es convertido es formas osmóticamente neutras y
que no afectan el balance redox de la célula como sucede con los PHAs.
Asimismo, Martínez, (2004) informó que cuando Azospirillum brasilense sp 7
es cultivada con alta presión parcial de oxigeno y con cloruro de amonio como
fuente de nitrógeno, el contenido de PHB (un tipo de PHA) es menor al 1 %,
por el contrario, en ausencia de cloruro de amonio y en microaerofilia esta
bacteria acumula cerca del 75 % de peso en PHB.
El incremento de la concentración de almidón de cáscaras de papa
como fuente de carbono para la síntesis de PHAs no estuvo directamente
relacionado con el rendimiento alcanzándose el valor máximo con 10 g.L-1 y
observándose después una disminución conforme se incrementó la
concentración del sustrato. De manera similar en otro bioproceso, Saavedra y
Sarmiento (2007), observaron que el incremento máximo de producción del
polímero por Xantomonas campestris UNPRG – EL13 fue alcanzado con la
concentración de 12,5 % de sacarosa y fue menor con 15 % con valores
equivalentes a coeficientes de conversión de sustratos de 82,72 y 80,3
respectivamente. Asimismo Sutherland, (1993) concluyeron que la
concentración de fuente de carbono en el medio de cultivo es un factor crucial
para el incremento y producción de metabolitos; sin embargo, es muy
importante seleccionar las concentraciones debido a que un exceso puede
conducir a una inhibición del crecimiento y actividad del microorganismo o una
utilización menos eficiente del sustrato con incremento de los costos de
producción.

224
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