Espectrofotometría:

Los métodos espectrofotométricos se basan en la interacción materia-energía. La radiación

EM interacciona con la materia produciendo algún efecto, se dice que materia absorbe
energía. Se lleva la materia desde un estado fundamental a un estado excitado.
Dependiendo de la cantidad de energía aplicada, la interacción ocurrirá a distintos niveles.
Con ello se distinguen varios tipos de espectroscopia según sea el tipo de interacción con la
REM:

Para el caso de la espectrofotometría UV-visible la interración ocurre a nivel de los e- de la

capa de valencia  existe un cambio en la distribución electrónica.

Absorción UV-visble : Para que ocurra la absorción de una radiación UV-visible en

moléculas orgánicas, se requiere que la energía absorbida corresponda al salto de un orbital
poblado a uno desocupado. En el caso molecular, los niveles no son tan discretos por lo que
existe una gamma de frecuencias posibles.

Absorción y Emisión: Cuando se absorbe energía se pasa de un estado fundamental a un

estado excitado. Este estado excitado vuelve a su estado basal luego de un cierto periodo de
desfase, ocurriendo emisión de radiación (no siempre puede ocurrir, la energía se puede
disiparse de otras formas). Este fenómeno da origen a otro tipo de espectroscopía como la
espectroscopia de luminiscencia, fluorescencia.

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Cada analito molecular tiene un  máximo de absorción en la zona del UV-visible.
Atendiendo a esta  para cada sustancia y a la intensidad en que se absorbe la radiación se
diseña un método para cuantificar la cantidad de sustancia .

La cubeta: Recipente de la muestra

Procedimiento experimental:

 Una vez que se tiene la muestra, se obtiene una solución perfectamente disuelta y
transparente que se coloca en la cubeta.
 En general se ocupan cubetas cuadradas de un cm de paso. Si la disolución es muy
diluida, se ocupa una cubeta más ancha (mayor posibilidad de paso de luz y absorción).
 Se ocupan cubetas de cuarzo (no absorbe radiación visible ni UV)
 Los fenómenos ópticos (reflexión, dispersión) causan atenuación del haz que atraviesa
la solución que se deben considerar en la medición. Para compensar estos efectos, se
coloca una solución blanco que da cuenta de las perdidas anteriores. Esta se conoce
como solución o cubeta de referencia.

Absorción de la Luz

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 La figura ilustra la atenuación (disminución de energía por unid. de area) de un haz de
radiación monocromatica, antes y después de haber atravesado una capa de solución con un
grosor de b cm y una concentración c. A causa de la interacción entre los fotones y las
partículas absorbentes, la potencia del haz disminuye de Po a P.
Se define la transmitancia T de una solución como la fracción de radiación incidente
transmitida por la solución:

Y el porcentaje de transmitancia como %T= (P/Po)*100

Los valores de transmitancia pueden ir de 0 a 1, cero si no pasa nada de luz y uno si pasa
toda la luz.
Se define la absorbancia A de una solución:

La absorbancia toma valores entre 0 e infinito. Obsérvese que la absorbancia aumenta

conforme disminuye la transmitancia.

Los instrumentos miden transmitancia, es decir, comparan la potencia incidente y

emergente. Tienen un procesador integrado que convierte los valores en absorbancia. En
general , los instrumentos comunes tienen una escala de absorbancia de 0 a 2.

Ley de Beer:

De acuerdo a la ley de Beer, la absorbancia esta relacionada linealmente con la

concentración de la especie absorbente (c ) y con la longitud de la trayectoria (b) de la
radiación con el medio absorbente.

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 a es una constante de proporcionalidad denominada absortividad. Si c esta en gr/L, a esta
en Lgr-1m-1 y se c esta en mol/L a se denomina absortividad molar y se designa por 
(unidades de Lmol-1cm-1)

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Análisis Cuantitativo:

Para efectuar el análisis la radiación de la fuente luminosa debe ser monocrómatica . Se

debe elegir  máximo para obtener la máxima sensibilidad y minimizar los errores. El
espectrofotómetro contiene un monocromador, que transforma la luz policromática en
monocromática. Depende de la calidad de este, que tan buena es esta transformación.

Se debe establecer el rango de concentración donde la relación con la absorbancia es lineal.

Depende de la absorbilidad de la sustancia. Solo debería usarse el rango lineal.

Existe un rango de absorbancia óptima para la medición (alrededor de 0.15-0.7). Esto

debido a que en la zona de alta absorbancia se producen desviaciones como consecuencia
de que la luz que logra pasar es casi nula y se confunde con el ruido de fondo. Este rango
depende de la calidad del aparato, incluso hay algunos que llegan a valores de 3 en
absorbancia, pero llevan implícito cierto error. Esto se conoce como desviaciones
instrumentales.
También pueden ocurrir desviaciones químicas de la ley de Beer producto de que las
especies que forman la muestra interactúan y se desvía de la linealidad. Esto ocurre a altas
concentraciones.
Para construir la curva de calibración se toman valores limite de concentración en los
valores 0.15-0.7 de A y luego se toma un par de puntos más. Lo ideal es que la curva de
calibración se construya en las mismas condiciones que la muestra (misma matriz). Cuando
no procede esto, se puede eliminar el efecto de la matriz si se aplica el Método de Adición
Estándar.

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Componentes de un Espectrofotómetro

1. Monocromador: Dispersa la luz y selecciona una longitud de onda

2. Colimador: Selecciona de la franja de luz una determinada longitud de onda
3. Detector: Transforma los fotones recibidos en una señal eléctrica.
4. Fuentes radiante: Origen de luz (lamparas)

General mente se toman dos extremos:

Blanco 100% de transmitancia
Objeto opaco  0% de transmitancia
Luego se toma el valor para la muestra.

Fuentes radiantes:

 Lampara de Tungsteno no tiene una longitud de onda constante en su radiación, lo

que obliga a calibrar el instrumento cada vez que se cambia la longitud de onda.
Permite medir solo en el rango del espectro visible.

 Lámpara de Deuterio  También tiene intensidad variable en la longitud de onda lo

que obliga a recalibrar el instrumento cada vez que se varia la longitud de onda. Sirve
para medir en el rango UV.

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Selector de Longitud de Onda  Dispositivo que selecciona la longitud de onda que será
utilizada a una banda estrecha que es absorbida por el analito. Con esto se garantiza de que
al analito siga la ley de Beer, se asegura una mayor selectividad ya que no es probable que
interfieran sustancias con un máximo de absorción en regiones de otras longitudes de onda
y además se aumenta la sensibilidad ya que una banda estrecha origina una máxima
variación en la absorbancia al variar la concentración.

Monocromador: Dispositivo que dispersa un haz de radiación policromático en las

longitudes de onda que lo componen, para luego selecciona una longitud de onda
determinada del espectro.

Filtros de Absorción y rejilla de reflexión: En este tipo de monocromadores la dispersión

angular se origina por la difracción que se produce en la superficie reflectante. Se genera
una dispersión pareja de la luz, es decir, la dispersión de la longitud de onda es
independiente de la longitud de onda.

Prisma: La difracción en las dos caras del prisma da lugar a una dispersión angular de la
radiación. Algunas longitudes de onda son más dispersadas que otras. La dispersión
producida por un monocromador de prisma es mayor a longitudes de onda cortas que a
longitudes de onda largas.

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Portamuestras, cubetas:

 Material  Rango UV: cuarzo

Rango visible : cuarzo, vidrio, plástico

 La cubeta debe estar perfectamente limpia (no tocar con las manos)
 No debe tener burbujas
 En general, el largo es de 1 cm. Cuando las soluciones son muy diluidas se debe utilizar
una cubeta más ancha para aumentar la sensibilidad (5-10 cm)

Detectores:

Espectrofotómetro de haz simple:

Del tipo que se ha visto anteriormente, el problema es la sensibilidad del detector, ya que
el detector puede ser más sensible para una longitud de onda y menos para otras. Este tipo
de espectrofotómetro esta bien adecuado para mediciones de absorción de una sola longitud
de onda.

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Espectrofotómetro de doble haz:

Para compensar lo anterior, se inventó un sistema de doble haz. Un haz pasa por un divisor
de haz (espejo en forma de V) formando dos haces en el espacio. Un haz pasa por una celda
de referencia y otra por una celda de muestra simultáneamente (se requieren dos cubetas),
luego los haces pasan por dos fotodetectores idénticos. Lo que se mide al final es la
diferencia entre las dos mediciones (se utiliza un amplificador de diferencia). Es decir, cada
medición implica una recalibración automática.
Con este tipo de instrumentos se puede obtener espectros de absorción de una sustancia ya
que se hace un barrido de las longitudes de onda.

Espectrofotómetro de Fotodiodos (arreglo de diodos):

La luz separada (múltiples longitudes de onda) se hace incidir en un arreglo de diodos que
absorbe a las distintas longitudes de onda. El corazón del instrumento es la disposición de
varios centenares de diodos detectores de silicio que se fabrican de lado a lado sobre un
solo chip de silicio. Estos perciben para cada una de las distintas longitudes de onda de
manera electrónica mediante un arreglo de circuito.
Experimentalmente se coloca primero un blanco y luego la muestra. Se percibe una menor
señal de la muestra , es decir, con menos señales en el espectro.
Con este instrumento se puede detectar el espectro completo en fracción de segundos, es
mucho mas útil. Incluso, la cubeta puede estar en un lugar accesible a la luz ambiente, no
se afectan las mediciones.

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