Distribuidora de Reactivos y Agentes

de Diagnóstico para Laboratorio

Blvd. J. Alonso de Torres 312 PTE. Col. San Jerónimo León Gto.
(477) 718-5948 lamarkt_viorel@hotmail.com

Inserto CA 15-3 ELISA

MONOBIND, INC.
Código de Producto: 5625-300 Después del período adecuado de incubación, la fracción atada del anticuerpo es
Intención de uso: separado del antígeno desatado por la decantación o la aspiración. Otro anticuerpo
La determinación cuantitativa de la concentración de Antígeno de (directo en un epitope diferente) etiquetado con una enzima es añadido. Otra
Cáncer (CA-15-3) en suero humano por un ensayo interacción ocurre para formar una enzima etiquetada complejo anticuerpo-
inmunoenzimométrico en micro plato. antígeno-biotinilado-anticuerpo sobre la superficie de los pozos. El exceso de
enzima se lava en un proceso de lavado. Un sustrato adecuado se añade para
producir color medible con el uso de un espectrofotómetro de microplato. La
RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA. actividad enzimática, determinada por una reacción con un sustrato que genera
A pesar de que multiples sueros basados en marcadores tumorales han sido
color, en la fracción anticuerpo-atado es directamente proporcional a la
descritos para el cancer de seno, tales como CA 15-3, BR 27-29, antigeno
concentración del antígeno nativo. Utilizando varias diversas referencias del suero
carcinoembrionario (CEA) antigeno tejido polipeptido (TPA) antigeno específico de
de los valores del antígeno conocido, una curva de reacción a cierta dosis puede
tejido polipeptido, y HER-2 (dominio extracelular) la mas ampliamente usada es CA
ser generada de la cual la concentración del antígeno de un desconocido puede
15-3 y CEA. El CA 15-3 es considerado a ser uno de los primeros factores de
ser comprobada.
pronostico circulantes para el cáncer de seno(1). Las concentraciones
preoperativas asi como sus combinaciones con factores de pronostico para
predecir resultados en pacientes con reciente diagnóstico de cancer de seno(2).
Hoy en día la mas importante aplicación clinica de CA 15-3 es monitorear a REACTIVOS
pacientes en terapia con cancer de seno avanzado que no son accesibles por MATERIAL PROVEEIDO
procedimientos clinicos o radiológicos. A. CALIBRADORES (CA-15-3) -- 1ml/vial - frascos del A-F
El ensayo de CA 15-3 mide el producto de la proteína del gen MUC1. La proteina Seis (6) frascos de calibradores de referencia basados en suero humano en niveles
MUC1 esa trasmembraba larga glicosilada molecular que contiene tres dominantes de concentraciones de 0 (A), 10 (B), 40 (C), 100 (D), 200(E) y 400(F) U/ml.
principales, una region celular extracelular, una membrana que abarca secuencia y Almacén en 2-8°C. Se ha agregado un preservativo.
un dominio citoplasmico.(4) A pesar de que la función fisiológica de MUC1 es Nota: Los calibradores son provistos prediluidos.
incierta, la glicoproteína ha sido implicada en la adhesión celular, inmunidd y Nota: Los estándares, basados en suero humano, fueron hechos usando una
metastasis. Comparado con tejido de seno sana, el MUC1 esta presente en preparación purificada de CA-125. La preparación fue calibrada contra el Centocor
grandes concentraciones pero menos glicosilada en carcinoma de seno. CA-15-3 IRMA test.
B. REACTIVO BIOTIN DE CA-15-3 12ml/vial.
En este método, el calibrador prediluido de CA 15-3, el espécimen del paciente o Un frasco (1) que contiene biotinilado anti-humano CA 15-3 mIgG en una matriz
control es primero agregado a un pozo cubierto de streptavidin. El anticuerpo Biotin proteina-estabilizada. Se ha añadido un preservativo. Almacén de 2-8°C
monoclonal (específicamente para CA 15-3) es añadido y los reactivos mezclados. D. Microplaca Cubierta de Streptavidin - 96 pozos - Icono ↓
La reacción entre los anticuerpos de CA15-3 y el CA15-3 nativo forman un Un microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en un bolso de
complejo que se ata con el streptavidin cubierto al pozo. El exceso de proteínas en aluminio con un elemento deshidratador. Almacén en 2-8ºC.
el suero se lava en un paso de lavado. Otra enzima etiquetada de anticuerpo E. Concentrado de Solución de lavado - 20 ml - icono
monoclonal específico para CA15-3 es añadido a los pozos. La enzima etiquetada Un (1) frasco que contiene un surfactante solución salina. Se ha agregado un
de anticuerpo se ata al CA15-3 una vez inmovilizado sobre el pozo a través de este preservativo. Almacén en 2-30ºC.
paso se atan con el anticuerpo monoclonal biotinlado. El exceso de enzima se lava F. Matriz de DILUCIÓN -- 50ml
por un paso de lavado. El color es generado por la adición de un sustrato. La Un (1) bote que contiene diluyente de suero en bufer, sales, proteinas y
intensidad de la generación de color es directamente proporcional a la surfactantes. Almacén en 2-8ºC.
concentración de CA15-3 en la muestra. G. SOLUCION SUSTRATO – 12ml/frasco SN
Un (1) bote que contiene tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido de hidrógeno (H ²O²)
PRINCIPIO en solución. Almacén en 2-8ºC.
ENSAYO INMUNOENZIMOMETRICO SECUENCIAL (Tipo 4): H. Solución de paro -- 8ml/vial - icono
Los reactivos esenciales requeridos por un ensayo Inmunoenzimométrico incluyen Un (1) bote que contiene un ácido fuerte. Almacén en 2-30 ºC.
alta afinidad y anticuerpos específicos (enzima e inmovilizado) con diferentes I. Inserto del producto.
reconocimientos distintos del epítome, en exceso y antígeno nativo. En este
procedimiento, la inmovilización toma lugar durante el ensayo en la superficie del Nota 1: No utilice los reactivos más allá de la fecha de vencimiento del kit.
micropozo a través de la interacción de streptavidin recubierto en el pozo y Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) días cuando están
exógeno agregado anticuerpo biotinlado monoclonal anti-CA15-3. almacenados en 2-8ºC.
Mezclando el anticuerpo monoclonal biotinlado, el anticuerpo etiquetado y un suero Nota 3: Los reactivos son para un solo microplato de 96-pozos.
que contienen el antígeno nativo, la reacción de la competición resulta entre el
antígeno nativo y el anticuerpo, formando un complejo anticuerpo-antígeno. La MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:
interacción es ilustrada por la ecuación seguida: 1. Mida con una pipeta capaz de entregar los volúmenes 25µl y 50µl con una
precisión mejor de 1.5%.
2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volúmenes 0.100ml y 0.350ml
con una precisión de mejor de 1.5%.
3. Pipeta (1000µl) usada para diluir el suero en diluciones de pacientes.
4. Lavador de Microplacas o una botella de apretón (opcional).
5. Lector de Microplato capaz de leer a 450nm y 620 nm.
6. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la microplaca.
7. Plástico envolvente o tapa para la microplaca para los pasos de la incubación.
8. Aspirador de vacío (opcional) para los pasos de lavado.
9. Contador de tiempo.
Simultáneamente, el complejo es depositado en el pozo a través de la reacción de 10. Materiales del control de calidad.
alta afinidad de streptavidin y anticuerpo biotinlado. Esta interacción esta ilustrada
abajo:

1
PRECAUCIONES CONTROL DE CALIDAD.
Para el Uso De Diagnóstico in Vitro. No Para Uso Interno o Externo en Seres Cada laboratorio debe tener controles de ensayo en bajo, medio y alto rango de la
Humanos o Animales. curva de la reacción para monitorear el buen funcionamiento del ensayo. Estos
Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada
no-reactivos para el antígeno superficial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH método de prueba realizada. Las tablas de control de Calidad deben de
1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba mantenerse para seguir el funcionamiento de los reactivos proveídos. Los métodos
sabida puede ofrecer termine el aseguramiento que los agentes infecciosos están estadísticos pertinentes deben ser empleados para comprobar las tendencias.
ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como Desviaciones significativas del funcionamiento establecido pueden indicar un
potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los buenos cambio experimental en las condiciones o degradación del kit de reactivos.
procedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se pueden Reactivos frescos deben usarse para determinar la razón de las variaciones.
encontrar en el Centro para el Control de Enfermedad/el Instituto Nacional de la
Salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos," 2da Edición, CALCULO DE RESULTADOS
1988, publicación No. (CDC) 88-8395 de HHS. Una curva de la reacción a cierta dosis se utiliza para comprobar la concentración
de CA-15-3 en especimenes desconocidos.
1. Registre la absorbancia obtenida de la impresora del lector del micro placas
RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION conforme al ejemplo 1.
Los especimenes serán sangre, suero en tipo y las precauciones generalmente en 2. Trace la absorbancia para cada referencia duplicada del suero contra la
la colección de muestras de veni-puntura deben ser observados. Para la concentración correspondiente de CA-15-3 en U/ml en el papel de gráfico lineal.
comparación exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno (No promedie los duplicados de las referencias del suero antes de trazar).
del suero de la mañana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubo 3. Dibuje la mejor curva a través de los puntos trazados.
llano de venipuntura de tapón rojo sin añadidos o anticoagulantes. Permita que la 4. Para determinar la concentración del CA-15-3 para un desconocido, localice el
sangre coagule. Centrifugue el espécimen para separar el suero de las células. promedio de absorbancia de los duplicados para cada desconocido en el eje
vertical del gráfico, encuentre el punto que se interseca en la curva, y lea la
Las muestras se pueden refrigerar a 2-8°C. por un período máximo de cinco (5) concentración (en U/ml) del eje horizontal del gráfico (los duplicados del
días. Si el espécimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra se desconocido se pueden promediar según lo indicado). En el siguiente ejemplo,
puede almacenar en las temperaturas de -20°C. por hasta 30 días. Antes de hacer promedie la absorbancia (0721) de las intersecciones desconocidas la curva de
el ensayo traer los reactivos y muestras a temperatura ambiente de 20° C- 27° C. calibración a (58.4 U/ml) concentración CA-15-3 (Ver figura 1)*.
Evite congelar y deshelar. Cuando sea analizado en duplicado, se requiere 0.050ml
del espécimen. Ejemplo 1
ID Número Abs ( A) Promedio Valor
PREPARACION DE LOS REACTIVOS: Muestra de pozo Abs (B) (U/ml)
1. SOLUCIÓN LAVADORA. Diluir contenidos del concentrado lavador con 1000ml 0.044
con agua desionizada o destilada en un contenedor adecuado para almacenar. A1 0.043
Almacénese a temperatura ambiente 20-27°C. Cal A 0
0.042
2. Dilución de la Muestra del Paciente (1:21) B1
Dispense 25µl de cada control o espécimen de paciente dentro de 0.500 ml de 0.204
matriz de dilución de CA 15-3 apropiadamente etiquetada en contenedores limpios C1
0.198
y mezcle muy bien antes de usar. Refrigérese para almacenar a 2°-8°C. hasta por Cal B 10
0.191
48 horas. D1
0.560
E1
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA. Cal C
0.543
40
Antes de proceder con el ensayo, tenga todos los reactivos cerca, las referencias 0.525
F1
del suero y controles a temperatura ambiente (20-27°C.).
1. Ajuste el formato de todos los pozos para cada referencia de suero, controles y 1.103
G1
espécimen del paciente a ser ensayados en duplicado. Reempaque cualquier tira 1.064
Cal D 100
de micro pozos dentro de la bolsa de aluminio, séllese y guárdese a 2-8°C. 1.024
H1
2. Pipetear 0.025 ml (25µl) de la referencia de suero apropiada, diluir el control o
espécimen en los pozos designados. 1.784
A2
3. Añada 0.100 ml (100µl) del anticuerpo etiquetado biotinlado a cada pozo. Es 1.777
Cal E 200
muy importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo 1.770
cubierto. B2
4. Remolinear el micro plato gentilmente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir. 2.431
5. Incubar 60 minutos a temperatura ambiente. C2
2.438
6. Descarte los contenidos del micro plato por decantación o aspiración. Si Cal F 400
2.445
decanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con toalla absorbente. D2
7. Agregue 350µl de solución lavadora (ver la sección de preparación de reactivos) 0.737
decante (golpee y borre) o aspire. Repetir dos (2) veces adicionales para un total A3
0.721
de tres (3) lavados. Un lavador automático o manual de platos puede ser Paciente 58.4
0.705
usado. Siguiendo las instrucciones del fabricante para un uso apropiado. Si B3
una botella de apretón es empleada, llene cada pozo presionando el envase Los datos presentados en el ejemplo 1 y el cuadro 1 son ilustrativos solamente y
(evite las burbujas) para dispensar el lavador. Decante el lavador y repita dos no deben usarse en lugar de una curva de reacción a cierta dosis en cada ensayo
(2) veces adicionales.
8. Agregue 0.100 ml (100µl) de Reactivo de enzima CA15-3 a cada pozo.
NO AGITE EL PLATO DESPUES DE AGREGAR EL TRAZADOR.
9. Cubra e incube por 60 minutos a temperatura ambiente.
10. Deseche el contenido del microplato por decantación o aspiración. Si decanta,
golpee el plato y seque con papel absorbente.
11. Agregue 350µl de solución lavadora (ver la sección de preparación de
reactivos) decante (golpee y borre) o aspire. Repetir dos (2) veces adicionales para
un total de tres (3) lavados. Un lavador automático o manual de platos puede
ser usado. Siguiendo las instrucciones del fabricante para un uso apropiado.
Si una botella de apretón es empleada, llene cada pozo presionando el
envase (evite las burbujas) para dispensar el lavador. Decante el lavador y
repita dos (2) veces adicionales.
12. Agregue 0.100 ml (100µl) del reactivo de señal de trabajo a cada pozo (vea la * Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son ilustrativas
Sección de Preparación de Reactivo. Siempre agregue los reactivos en el solamente no deben usarse para basarse en la curva preparada con cada ensayo.
mismo orden para minimizar las deferencias de tiempos de reacción entre
pozos. PARAMETROS de CONTROL DE CALIDAD
13. Incube a temperatura ambiente por (20) minutos. En orden de que los resultados de los análisis sean considerados válidos el
14. Añada 0.050ml (50µl) de solución de paro para cada pozo y mezcle por 15-20 siguiente criterio debe ser conocido:
segundos. Siempre añada los reactivos en el mismo orden para minimizar las 1. La absorbencia (OD) del calibrador F debe ser > 1.3.
diferencias de tiempo de reacción entre pozos. 2. Cuatro fuera de seis pools del control de calidad deben estar dentro de
15. Lea la absorbancia en cada pozo a 450nm (usando una longitud de onda de los rangos.
referencia de 620-630nm para minimizar las imperfecciones de los pozos) en un
lector de microplato. Los resultados deben ser leidos en un plazo de treinta (30)
minutos contando el tiempo después de añadida la solución de paro.

2
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO C. Exactitud
A. Funcionamiento del Análisis. El procedimiento del CA-15-3 fue comparada con un método de referencia de
1. Es importante que el tiempo de la reacción en cada uno de los pozos, está ELISA. Los especimenes biológicos de concentraciones bajo, normal y elevado
llevada a cabo constante para los resultados por reproducir. fueron analizados. El número total de especimenes fue 43. La ecuación de
2. Si más de un (1) plato es usado, se recomienda repetir la dosis de la curva de regresión del ultimo cuadro y el coeficiente de correlación fueron computadas para
respuesta. la CA-15-3 en comparación del método de referencia. La información obtenida se
3. La adición de la solución del sustrato inicia una reacción cinética, que es muestra en la Tabla 4.
terminada por la adición de la solución de paro. Por lo tanto, la adición del sustrato
y de la solución de paro debe agregarse en la misma secuencia para eliminar en TABLA 4
cualquier momento la desviación durante la reacción. Ultimo recuadro
4. Los lectores de la placa miden verticalmente. No toque el fondo de los pozos. Regresión Correlación
5. La falta de retirar la solución adecuadamente en el paso del lavado y de la
Método Significado Análisis Coeficiente
aspiración o de la decantación puede dar lugar a la réplica pobre y a resultados
falsos.
6. Las muestras que puedan estar contaminada microbiológicamente, no deben ser Este método (X) 108.2 y=0.219+1.008(x) 0.999
usadas en este análisis. Alta lipemia o especimenes bemolizados no deben ser Referencia (Y) 178.6
usados.
7. Use componentes del mismo lote. No mezcle los reactivos de diferentes lotes.
8. Especimenes de pacientes con concentraciones de CA-15-3 arriba de 400 U/ml D. Especificidad.
pueden diluirse (por ejemplo 1/10 o mayor) con diluyente de muestra y re- En orden de analizar la especificidad del anticuerpo par usado en concentraciones
ensayarse. Las concentraciones de muestras son obtenidas multiplicando el masivas para posible reactividad cruzada donde se añadieron para pools de suero
resultado por el factor de dilución. conocido y analizado en paralelo con el suero base. No se encontró reactividad
9. Es importante calibrar todos el equipos ejemplo: pipetas, lectores, lavadores y/o cruzada. El porcentaje de recuperación para algunos de estas adiciones está
instrumentos automatizados usados para el analisis. listada abajo en la Tabla 5.
TABLA 5
B. Interpretación Analito Concentracion % Interferencia
1. Si la reducción controlada de información de la computadora es usada para CA 15-3 - 1.000
interpretar el resultado de la prueba, es imperativo que el valor predecible de los
CA 125 10000 U/ml 0.001
calibradores caiga dentro del 10% de las concentraciones asignadas.
2. EL CA-15-3 tiene una sensibilidad clínica baja y especificidad como un marcador CA 19-9 5000 U/ml 0.001
tumoral. Clínicamente, un CA-15-3 elevado no es un valor de diagnóstico PSA 1000 ng/ml 0.026
como prueba para el cáncer y debe ser usada solamente en conjunto con otras AFP 30,000 ng/ml ND*
manifestaciones clínicas (observaciones) y parámetros de diagnóstico. CEA 5,000 ng/ml ND*
hCG 125,000 mIU/ml ND*
RANGOS ESPERADOS DE VALORES RF 12,500 IU/ml 0.001
El suero CA 15-3 es elevado en el 2% de mujeres aparentemente normal y 7% de Billirubina 200 µg/ml ND*
pacientes con condiciones no-neoplásicas. También, se ha reportado a ser elevado Hemolisis 30 µg/ml ND*
en casos de cáncer de hígado, pulmón, ovario y colorrectal. No han sido reportados Lipidos 50 µg/ml -0.009
rangos definitivos para estas condiciones.

TABLA I REFERENCIAS.
Valores Esperados para la CA 15-3 ELISA

Mujeres Sanas ≤ 37 U/ml

Es importante tener presente que el establecimiento de una gama de los valores

que se pueden esperar ser encontrado por un método dado para una población de
"persona-normal" es dependiente sobre una multiplicidad de factores: la
especificidad del método, de la población probada y de la precisión del método en
las manos del analista. Por estas razones cada laboratorio debe depender de la
gama de valores esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que una
lata interna de la gama determinada por los analistas usando el método con una
población indígena al área en la cual el laboratorio está situado.

CARACTERISTICAS DE ACTUACIÓN
A. Precisión.
La precisión en y entre la precisión del análisis del procedimiento de CA-15-3
ELISA fue determinada por análisis en dos diversos niveles de los sueros de
control. El número, el valor medio, la desviación de estándar () y el coeficiente de
variación para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 3 y la
tabla 4.

TABLA 2
Precisión dentro de la prueba (Valor en U/ml)
Muestra N X S.D. C.V.
Nivel 1 20 20.9 1.91 9.1%
Nivel 2 20 61.7 2.03 3.3%
Nivel 3 20 96.9 2.67 2.8%

TABLA 3
Precisión entre las muestras* (Valores en U/ml)
Muestra N X S.D. C.V.
Nivel 1 10 22.2 2.0 9.1%
Nivel 2 10 58.5 3.85 6.6%
Nivel 3 10 104.6 9.33 8.9%
*Según lo medido en diez experimentos en duplicado.

B. Sensibilidad
Este procedimiento tiene una sensitividad analitica de 0.2 U/ml. En tres (3) SD
desde le calibrador cero. La sensitividad funcional (20% CV) se encuentra en 1.25
U/ml.