UNIVERSIDAD FRANCISCO MARROQUÍN

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA GENERAL

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO 2021

CATEDRÁTICA
LICDA LETICIA ALMENGOR
 Contenido del Manual de Laboratorio de Microbiología

Presencia de los 12 Y 19 DE JULIO

microorganismos
1
A. Técnicas de en todos los
cultivo y manejo ambientes
aséptico de Cultivo de 26 JULIO
microorganismos microorganismos 02 AGOSTO
2
B. Diagnóstico e anaerobios
Identificación de
levaduras Observación de 09 Y 16 AGOSTO
Levaduras y
3
hongos
Obtención de 23 Y 30 AGOSTO
cultivos puros por
C. Técnicas de
el método de
cultivo y manejo 4
rayado: uso de
aséptico de
agares
microorganismos
enriquecidos,
selectivos y
diferenciales
6 Y 13
5 Tinción de Gram
SEPTIEMBRE
D. Microbiología del Cultivo por 20 Y 27
6
agua Inmersión SEPTIEMBRE
Fermentación 04 Y 11 OCTUBRE
7a láctea con cultivos
E. Microbiología de liofilizados.
alimentos- Fermentación
proceso de láctea con cepas
fermentación. 7b industriales
provenientes del
yogur

2
 PRÁCTICA NO. 1,
PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN TODOS LOS AMBIENTES

Introducción
Los microorganismos están presentes en el ambiente, el aire, el suelo,
las plantas, las superficies, etc., observándose en mayor número cuando
encuentran condiciones que favorecen su crecimiento.

Debido a la ubicuidad de los microorganismos es inevitable su presencia

en el medio ambiente que nos rodea, se encuentran además en la piel,
nariz, boca, vagina y heces, formando parte de la micro biota normal de
estas áreas. Es importante tener presente que al trabajar en un laboratorio
microbiológico es necesario emplear técnicas asépticas para evitar
contaminaciones en los cultivos que se manejan o bien infectar a las
personas que están trabajando dentro del laboratorio.

Uno de los principales objetivos del siguiente ejercicio práctico es el

demostrar la gran cantidad de microorganismos que nos rodea dentro del
área de trabajo y que pueden estar presentes en las mesas, el piso, el
lavadero, la piel, etc.

Objetivo:
• Demostrar la presencia de microorganismos en diferentes ambientes.

Materiales:

4 cajas de agar nutritivo (por estudiante)

2 cajas de agar Sabouraud (por estudiante)
Hisopos estériles
Marcadores permanentes

Procedimiento:

1) Quitar la tapa de una de las cajas de agar nutritivo y exponerla al aire

del laboratorio o cualquier otro ambiente, durante 5 minutos y volverla a
tapar. (N y S)
2) Destapar otra caja de agar nutritivo, colocar la cabeza en posición
inclinada sobre la caja y sacudirse el cabello para que caigan partículas
con microorganismos sobre el medio de cultivo. (N y S)
3) Con un marcador trace una línea divisoria a la mitad del fondo exterior
de la tercera caja de agar. Levantar la caja y tocar la superficie de una
mitad de agar con la yema de los dedos. Después lavarse bien las
manos con agua y jabón y repetir la operación anterior con la otra mitad
del agar. Rotule cada mitad con la leyenda apropiada. (N)
4) Con un marcador trace una línea divisoria a la mitad del fondo exterior
de la cuarta caja de agar. En la primera mitad pase un hisopo estéril, en

3
 la otra mitad pasar un hisopo previamente frotado sobre cualquier
superficie que usted escoja. (N)
5) Rotular todas las cajas con su nombre y tipo de exposición que se
realizó.
6) Incubar todas las cajas a 32°C por 48 horas. Se observarán las cajas en
la siguiente práctica y 5 días a 25°C.
7) Anote sus resultados y observaciones en la tabla correspondiente.

Presencia de los microorganismos en todos los ambientes

Tabla de Resultados

Tipo de Exposición Descripción

Conclusiones:

4
 PRACTICA No. 2
CULTIVO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

Introducción:

Se puede definir a las bacterias anaerobias como aquellas que para crecer en
la superficie de un medio de cultivo necesitan una atmósfera sin oxígeno, ya
que este elemento es tóxico para ellas.

El hábitat de las bacterias anaerobias está limitado a zonas corporales del

hombre y de los animales donde la tensión de oxígeno es baja. Forman parte
del microbiota normal como comensales y mutualistas, jugando un importante
papel en la resistencia inespecífica a la infección. Son particularmente
frecuentes en la boca (especialmente en la placa dental sobre todo en su
porción subgingival) y en las vías respiratorias altas, vagina e intestino (en
especial en colon, recto y en las heces, donde superan a los aerobios y a los
microorganismos facultativos). La piel es pobre en anaerobios permanentes.
Las infecciones las producen a partir de estos hábitats.

Medio de Cultivo: Como medio líquido de enriquecimiento o de

mantenimiento se recomienda usar caldo de tioglicolato sin indicador,
suplementado con vitamina K1 (200 µl) y hemina (20 µl). Este medio se utiliza
para recuperar las bacterias anaerobias en caso de que falle la anaerobiosis en
la incubación de los cultivos primarios, haya una inhibición del crecimiento
debido a antibióticos o a otros factores, o bien cuando las bacterias se
encuentran en cantidades muy pequeñas.
Sistema de Incubación: Existen diferentes modelos de cámaras para
anaerobios. También se encuentran disponibles en el mercado diferentes
sistemas de bolsas de anaerobiosis de plástico transparente y flexible como
GasPack Pouch® (Becton Dickinson) o AnaerogenCompact® (Oxoid) con
generadores e indicadores adecuados. Se pueden utilizar tanto para el
transporte de muestras al laboratorio como para la incubación de cultivos.

Tiempo de incubación. Inmediatamente después de su siembra los cultivos

se incuban a 35-37ºC en el sistema de anaerobiosis disponible. Si se utiliza una
cámara se pueden examinar a las 24 h, puesto que no es necesario sacarlas,
mientras que si se emplean jarras o bolsas hay que esperar 48 horas.
Si en las placas no se observa ningún crecimiento se deben re-incubar hasta
completar 7 días, al menos las de agar sangre no selectivo, ya que algunos
anaerobios requieren este tiempo para formar colonias visibles (Actinomyces,
Porphyromonas, Propionibacterium, Bilophila,). Se aconseja mantener la
incubación del medio líquido de enriquecimiento entre 7 y 10 días y se deben
realizar subcultivos, si se aprecia turbidez u otro signo de crecimiento, en agar
sangre y agar chocolate que se incubarán en una atmósfera con 10% de CO2, y
en agar sangre para anaerobios incubado en anaerobiosis. En el diagnóstico de
la actinomicosis el tiempo de incubación debe ser mayor, generalmente entre 2
y 4 semanas.
5
Objetivos:
Cultivar diferentes especies de microorganismos bajo condiciones anaeróbicas.

Materiales:
Bacterias de la cavidad oral
Hisopos estériles
3 tubos con caldo de Thioglicolato
Asas
Jarra para anaerobios
Bolsas con Gas-pak

Procedimiento:
1. Disperse bien el medio agitando con las dos manos el tubo de ensayo.
2. Inocule con un asa una cantidad abundante de la bacteria.
3. Coloque los tubos en la jarra de anaerobiosis.
4. Introduzca la bolsa con Gas-Pak actívela
5. Cierre herméticamente la jarra
6. Verifique la anaerobiosis interna después de 2 horas.
7. Incube a 37°C de 24 a 48 horas.
Interpretar resultados de acuerdo al diagrama siguiente:

6
Definir:
 Aerobio
 Microaerofílico
 Facultativo
 Anaerobio
8. Interpretar los resultados de acuerdo a la imagen anterior para
determinar las características del tipo de bacterias de acuerdo a sus
necesidades de oxígeno o no

7
 PRACTICA No. 3

OBSERVACION DE HONGOS Y LEVADURAS

Los hongos son organismos eucarióticos que en su pared celular

contienen quitina, celulosa o ambas y cuya nutrición la hacen por absorción.
Estos organismos pueden crecer y desarrollarse en condiciones diversas de
humedad, temperatura y pH. Las condiciones óptimas de crecimiento son a
temperatura de 25 a 30°C y pH de 5-6.

Existen dos grupos de hongos con base en su tamaño: macroscópicos,

que son hongos grandes, cuyo cuerpo fructífero puede ser observado a simple
vista, ejemplo: hongos comestibles, hongos del bosque; y los microscópicos u
hongos pequeños que para poder observarlos es necesario utilizar el
microscopio.

En el estudia de las levaduras, se usa un solo colorante, una tinción

simple, que es azul de metileno, donde observamos que las levaduras tenían
formas como de botellas o de células gemando.

Las principales estructuras de los hongos, ya sea macroscópico o

microscópico, son:

Hifa: es la estructura básica de los hongos, es un filamento de paredes

paralelas en donde se encuentran contenidas las estructuras de la célula
(núcleo, citoplasma, mitocondrias, etc.)

Micelio: es la unión de hifas.

Existen aproximadamente 250, 000 especies de hongos, de las cuales

solamente unas 100 se conocen como patógenas del ser humano. Las especies
de hongos que causan infecciones en el ser humano pueden ser patógenos
verdaderos ó patógenos oportunistas.

Hongos patógenos verdaderos: son aquellos que tienen la capacidad de

desencadenar un proceso de enfermedad, cuando se enfrentan a un hospedero
sano.

Hongos oportunistas: son hongos que cuya capacidad de producción de

enfermedad va a depender directamente de la resistencia a la infección por
parte del hospedero, o sea que causan enfermedad cuando el hospedero se
encuentra inmunosuprimido.

8
 Las infecciones que causan los hongos se llaman micosis. Una
clasificación que facilita el estudio de las diferentes micosis es la siguiente:

Micosis Superficiales: se localizan en el estrato córneo, ejemplo: Pitiriasis

versicolor (manchas blancas que salen en la espalda y brazos después de un
bronceado intenso)

Micosis Cutáneas: afectan la epidermis, causando inflamación, descamación,

ardor y prurito intenso. En este grupo se incluyen las Dermatofitosis, tineas o
tiñas (ejemplo: pie de atleta, hongos de las uñas) y la Candidosis (ejemplo:
infecciones vaginales por Candida albicans).

Micosis Subcutáneas: se adquieren por traumatismo, se forma una lesión

grave en el sitio de inoculación. La micosis subcutánea más importante en
Guatemala es la esporotricosis.

Micosis Sistémicas o Profundas: se adquieren por inhalación de las esporas

del hongo, el sitio primario de infección son los pulmones y dependiendo de la
especie, puede diseminarse a otras áreas del cuerpo. Son infecciones graves
que pueden causar la muerte. Las micosis sistémicas más importantes son:
histoplasmosis, coccidioidomicosis y paracoccidioidomicosis.

Micosis Oportunistas: para iniciar una infección, estos hongos necesitan

ciertos factores predisponentes del hospedero. Los principales géneros de
hongos oportunistas son: Candida, Cryptococcus y Aspergillus.

Objetivos:
• Observar, en muestras humanas, a las levaduras causantes de micosis
cutáneas.

Material:

• Medios con hongos ambientales

• Láminas Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Bisturís
• Microscopios
• Estereoscopios
• Punzones
• Pinzas
• Asas
• Azul de metileno

Procedimiento:

9
A. Hongos ambientales

• Colocar una gota de Azul de Lactofenol sobre un cubreobjetos-

• Colocar con una pinza una parte del micelio del hongo.
• Dilapidar el hongo con la ayuda de la pinza y el punzón.
• Colocar el cubreobjetos
• Observar la lámina en aumento de 400 (40x)
Procedimiento:
B. Levaduras
• Colocar una gota de Azul de Metileno sobre un cubreobjetos-
• Colocar con un asa una cantidad de levadura
• Mezclar el colorante con la levadura.
• Colocar el cubreobjetos
• Observar la lámina en aumento de 400 (40x)
• Distinguir la forma ovalada de la levadura y la formación de tubos
germinales
•
• Realizar los dibujos y las descripciones correspondientes.
(Ver imágenes en la página siguiente)

Ilustración 1 M etharizium anisopliae

10
I lustración 2 Colonia de Aspergillus flavus

Observación de levaduras (Candida albicans):

Ilustración 3 Candida albicans, forma micelia

11
Ilustración 4 Candida albicans forma levaduriforme y tubo germinativo

12
 PRÁCTICA NO. 4
Obtención de cultivos puros por el método de rayado: Uso de agares
Enriquecidos, Selectivos y Diferenciales

Obtención de cultivos puros

Los microorganismos son observados con el microscopio, pero sus
actividades solamente se pueden estudiar a través de un cultivo puro. Un
cultivo puro es un cultivo de un solo tipo de microorganismos. Cuando se
cultiva un microorganismo, se multiplica y aumenta el número de células. Este
proceso se llama crecimiento. Para obtener un cultivo puro, se debe obtener el
crecimiento de la bacteria en el laboratorio. El estudio en el laboratorio
requiere que proporcionemos al microorganismo los nutrientes apropiados y las
condiciones ambientales adecuadas para que se pueda desarrollar. También es
indispensable que se evite la entrada de otros microorganismos en el cultivo
puro. Esos microorganismos no deseados, llamados contaminantes, son
ubicuos y las técnicas microbiológicas se orientan a evitar los contaminantes.
Una vez que se ha aislado un cultivo puro, se puede proceder a estudiar las
características culturales de las bacterias y determinar sus capacidades.
Cuando hay que estudiar microorganismos que causan enfermedades
(patógenos) se deben tomar precauciones especiales para evitar la infección de
las personas cercanas al área de trabajo. El término técnica aséptica se
refiere a la manipulación de cualquier cultivo microbiano de tal forma que no
haya contaminación.
Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se han añadido los
nutrientes apropiados. La solución acuosa que contiene los nutrientes
necesarios se denomina medio de cultivo líquido o caldo. Los medios de
cultivo contienen fuentes de energía para los microorganismos como glucosa,
lactosa, xilosa, etc., fuentes de carbono como el extracto de carne, y de
nitrógeno como la peptona y el extracto de levadura. Además, debe contener
vitaminas, aminoácidos, ácidos grasos, etc. Al medio de cultivo se le puede
añadir agar, que es un agente solidificante compuesto de carbohidratos
complejos obtenidos de ciertas algas marinas. De esta forma se obtienen
medios de cultivo sólidos o agares.
Para obtener cultivos puros se utilizan la técnica de siembra por estrías o
rayado y la técnica de vaciado; ambas técnicas involucran la disminución de la
concentración de los microorganismos, para seleccionar la especie de interés.

Tipos de medios de cultivo

Aunque la mayoría de bacterias se desarrollan bien en caldo nutritivo o
agar nutritivo, otros no crecen bien, y otros más, simplemente, no crecen.
Además, se necesitan muchos medios de cultivo elaborados para propósitos
especiales que facilitan la identificación, aislamiento y cuantificación de ciertos
tipos de bacterias. Actualmente se cuenta con numerosos medios de cultivo a
los cuales, de acuerdo a su función o aplicación, se les puede clasificar de la
manera siguiente:

13
Medios Enriquecidos: La adición de componentes como sangre, suero o
extractos de tejidos de animales y plantas al caldo nutritivo o agar, les
proporciona sustancias nutritivas complementarias para que el medio pueda
soportar el crecimiento de bacterias exigentes. Ejemplos de medios
enriquecidos: Agar Sangre de Carnero y Agar Chocolate.
Medios Selectivos: La adición al agar nutritivo de ciertas sustancias químicas
específicas, no permitirá el desarrollo de ciertos grupos de bacterias, sin inhibir
al mismo tiempo el crecimiento de otros grupos. Por ejemplo, el cristal violeta
en concentraciones específicas no permite el crecimiento de bacterias Gram.
positivo sin afectar el crecimiento de bacterias Gram. negativo. Ejemplo de
medios selectivos: Agar MacConkey, Agar Endo.
Medios Diferenciales: La adición de ciertos reactivos o sustancias químicas, trae
como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano o de cambios, lo
cual permite diferenciar distintos tipos de bacterias. Por ejemplo, si se siembra
una mezcla de bacterias en un agar sangre de carnero, algunas bacterias
pueden bemolizar (destruir) los glóbulos rojos, mientras que otras no lo hacen.
Cuando aparece una zona clara alrededor de la colonia de la bacteria es
indicativo que ocurre la hemólisis. Así es posible distinguir entre bacterias
hemolíticas y no hemolíticas. El medio agar sangre de carnero sirve
simultáneamente como medio de enriquecimiento y diferencial.

Objetivos:
• Aplicar las técnicas de siembra por estrías o rayado y de vaciado para
obtener cultivos puros.
• Describir las características culturales de las colonias de bacterias
obtenidas en los cultivos puros.
• Realizar la tinción de Gram. a las colonias obtenidas en los cultivos
puros.

Materiales:

• Cajas de agar Manitol Sal (una para cada estudiante)

• Agar Baird-Parker (una para cada estudiante)
• Cajas de agar MacConkey (una para cada estudiante)
• Cajas de agar Endo (una para cada estudiante)

• Tubos con agar MacConkey fundido a 60°C (uno para cada estudiante)
• Cajas de Petri estériles (uno para cada estudiante)
• Baño de María
• Asas bacteriológicas
• Crayón graso o marcador

14
 • Alcohol y algodón
• Cultivo en caldo de soya de Escherichia coli,

Procedimiento para la técnica de siembra por estrías o rayado:

1) Preparar la mesa de trabajo, desinfectando la superficie con alcohol.

2) Etiquetar o rotular el fondo de la caja de Petri de los diferentes agares con:
nombre, fecha y bacteria sembrada.
3) Rayar o estriar la caja, cerca del mechero, tomando una asada del cultivo
mixto y siguiendo cualquiera de los esquemas que se proporcionan en el
diagrama adjunto.
4) Incubar las cajas en posición invertida a 37°C por 24-48 horas. En esta
posición la humedad de la tapadera de la caja no cae en el medio de cultivo.
5) Siguiendo los pasos anteriores, cada estudiante debe sembrar o rayar los
siguientes agares: Manitol-Sal, Baird-Parker, MacConkey., Endo.

Procedimiento para la técnica de vaciado:

1) Preparar la mesa de trabajo, desinfectando la superficie con alcohol.

2) Etiquetar o rotular el fondo de la caja de Petri estéril con: nombre, fecha y
bacteria sembrada.
3) Tomar un tubo de agar MacConkey fundido, enfriar aproximadamente a 40-
45°C (que no queme el dorso de la mano o la mejilla)
4) Colocar el contenido de una pipeta Pasteur con el cultivo de E. coli en caldo
en medio de una caja de Petri vacía.
5) Verter todo el contenido del tubo de agar MacConkey sobre la caja de Petri
estéril, cerca del mechero,
6) Rotar la caja para que el agar quede homogéneamente distribuido.
7) Esperar que la caja enfríe completamente.
8) Incubar las cajas en posición invertida a 37°C por 24-48 horas. En
esta posición la humedad de la tapadera de la caja no cae en el medio de
cultivo.

Características Culturales
Las características culturales de una colonia, se refieren a sus
características macroscópicas en los diferentes tipos de medios de cultivo
después que éstos de han sembrado e incubado correctamente. Es importante

15
observar la apariencia de las colonias formadas, debido a que orienta a la
identificación de las bacterias.
En la observación de colonias debe tomarse en cuenta:
a) La cantidad de crecimiento: negativo, escaso, moderado y abundante.
b) El color o pigmentación que se observa tanto en las colonias como dentro
del medio de cultivo (difusión).
c) La opacidad: opacas, brillantes, translúcidas.
d) La forma de la colonia: configuración, bordes y elevación.

Material:
• Cultivos en cajas de Petri de la práctica anterior (Obtención de
cultivos puros)
• Asas bacteriológicas
• Colorantes de Gram
• Bandejas de tinción
• Pisetas con agua
• Algodón con alcohol isopropílico
• Marcadores
• Fósforos

Procedimiento:
1) Anotar la apariencia de las diferentes colonias crecidas en los agares,
tomando en cuenta las características culturales.
2) Escoger dos colonias macroscópicamente diferentes y realizar la coloración
de Gram a cada una de éstas.
3) Anotar todos los resultados obtenidos.

16
Esquemas de diferentes técnicas de rayado

17
 PRÁCTICA NO. 5
Tinción diferencial de Gram

Las bacterias son microorganismos incoloros, por este motivo deben teñirse
para poder observarlos con ayuda del microscopio. La tinción más importante
para diferenciar bacterias es la Tinción Diferencial de Gram. En este
procedimiento, el frote bacteriano fijado al calor, se somete a las soluciones
siguientes en el orden que se indica:
• Cristal Violeta
• Lugol (solución de yodo)
• Alcohol-acetona (decolorante)
• Safranina

Las bacterias sometidas a la tinción de Gram pertenecen a dos grupos:

bacterias Gram positivo: retienen el cristal violeta y se tiñen de color violeta-
azul profundo y bacterias Gram negativo: No retienen el cristal violeta y por
contraste se tiñen de safranina, se tiñen de color rojo.

La explicación al mecanismo de la reacción al Gram se basa en la estructura

y composición de la pared celular de las bacterias. Las bacterias Gram negativo
contienen un porcentaje más alto de lípidos en la pared celular, la cual es más
delgada que la de las bacterias Gram positivo. El tratamiento con el alcohol-
acetona (decolorante) extrae los lípidos con lo cual se aumenta la porosidad o
permeabilidad de la pared celular Gram negativa. Así el complejo que se ha
formado entre el cristal violeta y el lugol puede extraerse y la bacteria se
destiñe o decolora; y se teñirá con el color rojo de la safranina que se agrega
como último paso de la tinción.

La pared celular de las bacterias Gram positivo por su bajo contenido en

lípidos, se deshidratan durante el tratamiento con alcohol-acetona, los poros
disminuyen, la permeabilidad se reduce y no se logra extraer el complejo del
cristal violeta con el lugol, por lo que quedan teñidas con un color azul-violeta
profundo.

18
 Pasos y resultados de la Tinción de Gram

Reacción y apariencia de las bacterias

Soluciones aplicadas
en orden Gram positivo Gram Negativo
1. Cristal violeta Las bacterias se tiñen Las bacterias se tiñen
violeta violeta
2. Lugol (yodo) Se forma complejo cristal Se forma complejo cristal
violeta-lugol, las violeta-lugol, las
bacterias permanecen bacterias permanecen
violeta violeta
3.Alcohol-acetona Las paredes celulares se Extracción de lípidos de
(decolorante) deshidratan, disminuye la las paredes celulares,
permeabilidad, el aumento de porosidad y
complejo cristal violeta- permeabilidad, el
lugol no puede salir de la complejo cristal violeta-
bacteria, permanece lugol sale de la bacteria y
azul-violeta se destiñe
4. Safranina Las bacterias no son Las bacterias toman este
afectadas, permanecen colorante y se tiñen de
azul violeta rojo

Objetivos:
• Aplicar adecuadamente la tinción de Gram.
• Distinguir entre bacterias Gram positivo y Gram negativo.

Materiales:
• Cultivos de 24 horas en agar MacConkey de Escherichia coli
• Cultivos de 24 horas en agar Baird Parker o Manitol Sal Staphylococcus
aureus
• Cultivo mixto en caldo nutritivo, de Escherichia coli y
Staphylococcus aureus
• Goteros con agua destilada
• Láminas Portaobjetos
• Asas bacteriológicas
• Colorantes de Gram: Cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, safranina
• Bandejas para tinción
• Pisetas con agua
• Gradillas de metal
• Mecheros
• Marcadores permanentes

19
 • Aceite de inmersión
• Papel limpia lentes
• Fósforos
• Microscopios

Procedimiento:
1) Preparar los siguientes frotes fijos:
a. Un frote con Escherichia coli
b. Un frote con Staphylococcus aureus
c. Un frote con el cultivo mixto de ambos microorganismos
2) Colocar los frotes en la bandeja de tinción y cubrirlos con Cristal Violeta
durante un minuto.
3) Lavar suavemente con agua
4) Escurrir la lámina y cubrirla con solución de lugol durante un minuto.
5) Lavarla suavemente con agua
6) Agregar de 2-3 gotas de alcohol-acetona sobre la preparación y lavar
inmediatamente con agua. Paso crítico para la decoloración
adecuada.
7) Cubrir la lámina con solución de Safranina durante un minuto.
8) Lavar suavemente con agua y escurrir la lámina.
9) Secar cuidadosamente al aire.
10) Enfocar las preparaciones con objetivo de inmersión (100X), observarlas
cuidadosamente, anote los resultados y realice los dibujos y
descripciones correspondientes en la hoja de dibujos.

Staphlococcus aureus

20
Escherichia coli

PRUEBAS BIOQUIMICAS GENERALES PARA LA FAMILIA MICROCOCACEAE Y

ENTEROBACTERIACE
En general se clasifican como cocos Gram positivo, aquellos microorganismos
que tienen en común morfología redonda o cocoide y son positivos con la
tinción de Gram.
La
presencia o ausencia de las catalasas y los citocromos separan a los cocos
Gram positivo en dos grandes grupos: el grupo de la familia Micrococcaceae
(género más importante es Staphylococcus), los cuales poseen catalasas y
citocromos y el grupo de los cocos catalasa negativo, cuyo género más
importante es Streptococcus.

Género Staphylococcus :

Características Coloniales o culturales: son colonias redondas, cóncavas, con

bordes regulares, grandes (hasta de 4 mm de diámetro), brillantes;
generalmente son blancas, pero pueden presentar pigmento amarillo y
hemólisis en agar sangre de carnero.
Características Morfológicas: son cocos (bacterias redondas), Gram positivo
(color azul-morado), agrupados generalmente en racimos.

Características Bioquímicas: son catalasa positiva, oxidasa negativa y fermentan

la glucosa. Staphylococcus aureus es coagulasa positiva.

Objetivos:

• Aplicar las pruebas de identificación de los cocos Gram positivo

• Identificar las especies del género Staphylococcus

21
Material:

• Cepas de 24 horas e de Staphylococcus aureus

• 3 frascos goteros con peróxido de hidrógeno al 30% (agua oxigenada)
• 1 caja con manitol sal
• Colorantes de Gram
• Bandejas de tinción
• Portaobjetos
• Asas bacteriológicas
• Pisetas con agua
• Marcadores permanentes
• Aceite de inmersión
• Papel limpia lentes
• Microscopios

• Procedimiento:

1. La prueba de la catalasa:

• -Colocar sobre un portaobjetos una gota de H2 O2 (agua oxigenada) al

30%
• - Con un asa estéril transferir una pequeña cantidad de cultivo puro o
colonia a
• Identificar sobre la gota de agua oxigenada.
• - Observar el aparecimiento de burbujas.
• - Positivo: se observan burbujas (género Staphylococcus)
• - Negativo: no se observan burbujas.

2. La fermentación del manitol:

• Se siembra la bacteria sospechosa en medio manitol sal: estriar el medio

en la
• superficie, no debe pincharse.
• Se incuba de 18-24 horas a 35°C y observar el resultado
• Positivo: presencia de crecimiento y el cambio de color amarillo del
medio indica la
• utilización del manitol.
• Negativo: no hay cambio de coloración en el medio y este permanece
rosado o rojizo.

Los resultados para la identificación del género Staphylococcus

22
Prueba S. aureus
Características coloniales
Gram y morfología
Catalasa
Manitol Sal

Identificación de bacilos Gram negativo (Familia Enterobacteriaceae ):

Son los microorganismos más aislados en el laboratorio de microbiología

clínica. Como lo dice su nombre este grupo de bacterias es micro biota normal
del tracto gastrointestinal. Son bacilos o cocobacilos Gram negativo con un
ancho de 0.5 a 2 u y un largo de 2 a 4 u. Su morfología colonial es variable,
generalmente las colonias son grandes, brillantes y mucoides cuando crecen en
agar sangre de carnero, presentando una hemólisis de tipo variable. Cuando
crecen agar MacConkey, la mayoría de géneros presenta un pigmento rosado
intenso.
Los miembros de esta familia tienen las siguientes características:
fermentan la glucosa y otra gran variedad de carbohidratos, son oxidasa
negativa, reducen el nitrato a nitrito y la mayoría son catalasa positiva.

La familia de las Enterobacterias está constituida por 35 especies bacterianas

aproximadamente. En esta práctica se identificarán 1 de las especies más
importantes. A continuación, se describen las reacciones bioquímicas que
sirven para identificar estas especies:

1. Género Escherichia (especie más importante, Escherichia coli)

Reacción en TSI: A/A, H2 S negativo, gas positivo(A=amarillo)

Objetivos:
• Aplicar las pruebas de identificación de los bacilos Gram negativo
fermentadores.
Materiales:
Cultivos de 24 horas en agar MacConkey de E. coli,
1 tubo con agar TSI (por alumno)

Procedimiento:
Usar tubos con agar inclinado o pico de flauta.

1. Agar Hierro Tres Azúcares (TSI)

A partir de una colonia pura y bien aislada, tomar una asada, utilizando el asa
en punta.
Picar el medio TSI hasta el fondo solamente una vez y luego estriar el inclinado
(slant).
Incubar a 36°C por 18 a 24 horas.
23
Interpretación de las reacciones en TSI:

A. Utilización de los carbohidratos

Fermentación sólo de la glucosa: slant o pendiente alcalino (rojo); fondo ácido
(amarillo) (A).
Fermentación de glucosa y otro azúcar: slant o pendiente ácido (amarillo);
fondo ácido (amarillo) (A/A)
Ninguno de los carbohidratos es fermentado: slant o pendiente alcalino (rojo);
fondo alcalino (rojo)

B. Producción de gas
Positivo: burbujas dentro del medio, rompimiento del medio, desplazamiento
del medio hacia arriba.
Negativo: No se produce ninguna reacción anterior.

C. Producción de H2 S (ácido sulfhídrico)

Positivo: todo el fondo del tubo de observa negro o se produce un precipitado
escaso (se observa color negro entre el fondo y el slant).

Tabla de resultados de la identificación de bacilos Gram negativo

Prueba
TSI
Gas
Ácido sulfhídrico

Procedimiento:
Usar tubos con agar inclinado o pico de flauta.

24
Tabla de resultados de la identificación de bacilos Gram negativo

Prueba

E. coli (típico)
TSI +
Gas +
Ácido sulfhídrico -

25
 PRÁCTICA NO. 6
MICROBIOLOGÍA DEL AGUA

El agua potable se define como aquella que es apta para consumo

humano y no posee elementos químicos, físicos o microbiológicos que alteren
su composición. También se consideran constituyentes indeseables del agua
aquellos elementos capaces de causar un impacto negativo en la salud pública
Los agentes infecciosos causantes de gastroenteritis son transmitidos
principalmente por excretas de humanos o animales. Uno de los vehículos más
apropiados para transportar agentes infecciosos es el agua y la utilización de
agua contaminada en una comunidad puede dar como resultado infecciones en
sus habitantes
Los organismos patógenos que presentan un alto riesgo de causar
infección gastrointestinal, si se encuentran presentes en agua utilizada para
consumo humano, son los siguientes: Shigella spp., Salmonella spp.,
Escherichia coli enteropatógena, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica,
Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Giardia spp., Entamoeba histolytica,
Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Dracunculus medinensis,
Rotavirus, Adenovirus y Enterovirus. La mayor parte de ellos suelen provenir
de heces fecales.
La mayor parte de ensayos utilizados para evaluar la calidad
microbiológica del agua se han diseñado para la determinación de
microorganismos indicadores más que para patógenos, ya que la detección de
éstos últimos presenta mayores complicaciones en cuanto a metodología, por lo
que detectar a los indicadores es la manera más eficiente de asegurar la calidad
higiénica del agua. Se le llama microorganismos indicadores a aquellos cuya
presencia significa que la muestra estuvo expuesta a condiciones que pudieron
determinar la llegada o acceso de microorganismos patógenos. Los
microorganismos indicadores más frecuentes son los siguientes: Escherichia
coli, bacterias coliformes (totales y termotolerantes), estreptococos fecales,
clostridios reductores de sulfito, colifagos y algunos otros de menor
importancia.

Dentro de las pruebas de rutina realizadas por los laboratorios para

determinar la contaminación fecal del agua se encuentran las siguientes:

Materiales:

• 2 pipetas de 1 ml
• 1 caja con agar EMB (Eosina Azul de Metileno) o Agar Endo

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Procedimiento:

1. Prueba Semicuantitativa:
a. Sembrar un 1.0 y 0.1 ml de agua dentro de una caja de Petri
estéril
b. Agregue agar EMB o Endo-C o MacConkey
c. Incubar por 48 horas a 44 º C.
d. Observar y contar colonias características de E. coli.
Busque colonias negras con brillo metálico característico.
E Informar los resultados

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 PRÁCTICA NO.7
FERMENTACION DE LÁCTEOS

1. Objetivo:
La conservación de la leche a través de la fermentación láctica por
microorganismos del género Lactobacillus y Streptococcus. La preparación se
logra a través de disminución del pH; por lo que puede decirse que el yogurt es
leche entera o descremada, pasteurizada y coagulada (consistencia similar al
flan) por medio de un cultivo combinada de Lactobacillus bulgaricus,
responsable de acidificar la leche, y de Streptococcus thermophilus, que le
brinda propiedades aromatizantes.
El primer crecimiento de lactobacilos libera aminoácidos glicina e
histidina y estimula el crecimiento de estreptococos. El beneficio obtenido de
dichos cultivos se presenta por medio de la alteración de las proteínas de la
leche, cuya degradación hace al producto más digerible para el ser humano.

1. Materiales y Métodos:

Cepas de L. bulgaricus y S. thermophilus liofilizado (7a) y cepas provenientes

del yogurt comercial preparado para la venta (7b)

• 250 mL de leche fresca

• 10 gramos de leche en polvo
• Erlenmeyer de 500 mL
• Probetas de 250-500 mL
• Agitadores de vidrio
• Balanza
• Papel pH
• Papel encerado
• Espátulas
• Trípodes y telas de asbesto
• Termómetro
• Refrigeradora a 7 º C

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3. Procedimiento: (7a)

1) Disolver 10 gr de leche en polvo en 250 mL de leche pasteurizada

2) Enfriar la mezcla hasta una temperatura aproximada de 45 º C
3) Agregar el cultivo láctico aproximadamente 50 g (2 cucharaditas)
4) Incubar de 41 a 42 º C de 3 a 4 horas o hasta que tenga la
consistencia de flan.
5) Enfriar y almacenar de 5 a 7 º C
6) Medir el pH inicial de la leche, con papel pH o con potenciómetro
7) Medir el pH del producto final
8) Hacer un frote con tinción de Gram de la leche y el yogurt
9) Observar, anotar y discutir las características de textura y
consistencia de los productos elaborados.

Nota: Si se usa leche fresca se debe calentar entre 82 a 85°C por 5

minutos.

Procedimiento: (7b)

1) Agregar yogurt comercial activo aproximadamente 10 ml a un litro

de leche pasteurizada
2) Usar jeringa de 10 ml sin aguja para agregar el cultivo.
3) Incubar de 41 a 42 º C de 3 a 4 horas o hasta que tenga la
consistencia de flan.
4) Enfriar y almacenar de 5 a 7 º C
5) Medir el pH inicial de la leche
6) Medir el pH del producto final
7) Hacer un frote con tinción de Gram de la leche y el yogurt
8) Observar, anotar y discutir las características de textura y
consistencia de los productos elaborados.

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REFERENCIAS

1. Almengor L. Manual de Laboratorio Microbiología de Alimentos. Guatemala:

Universidad Francisco Marroquín, 2004.
2. Bran M. Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología Aplicada.
Guatemala: Universidad de San Carlos, 2000.
3. Brock TD., Madigan MT. Microbiología. 6 ed. México: Prentice Hall
Hispanoamericana, S.A., 1993.
4. Gini G. Manual de procedimientos para la identificación de las bacterias con
importancia clínica. Guatemala: Universidad de San Carlos, 1993.
5. Gini G., et al. Microbiología General; Manual de Laboratorio 2001. Guatemala:
Universidad de San Carlos, 2001.
6. Isenberg HD. Essential Procedures for Clinical Microbiology. USA: American
Society for Microbiology -ASM-, 1998.
7. Koneman EW, et al. Diagnóstico Microbiológico. 5ta ed. Buenos Aires: Editorial
Médica Panamericana, 1999.
8. Logemann HE., Manual Práctico de Micología Médica. Guatemala: Universidad
de San Carlos, 1995.
9. National Committe for Clinical Laboratory Standards -NCCLS-. Normativa para la
puesta en práctica del estudio de susceptibilidad antimicrobiana; octavo
suplemento informativo. USA: NCCLS, 1998. (versión en español: Elizabeth
Palavecino, Universidad Católica de Chile).
10. Méndez, Rebeca Manual de Laboratorio Microbiología General. Guatemala:
Universidad Francisco Marroquín, 2006.
11. Pelczar MJ., Reid RD., Chan ECS. Microbiología. 4 ed. México: McGrawHill,
1981.
12. Torres M. ¿Manual Práctico de Bacteriología Médica; Norma Obligatoria para
los laboratorios clínicos nacionales de la República de Guatemala. 2 ed.
Guatemala: Editorial Serviprensa, 1999.
13. Velásquez T. Manual de Laboratorio Microbiología Médica. Guatemala:
Escuela de Nutrición., Universidad Francisco Marroquín, 2002.
NOTA: Los laboratorios se deberán entregar al cumplir 15 días después
de la práctica, eso va en relación de acuerdo a la fecha que se les asigne
su laboratorio. Se unificaron los laboratorios 1,2 y 3 tambien 4 y 5, ya
que llevan una misma secuencia y relación entre ellos.

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