CAPTULO 2.5.

PIROPLASMOSIS EQUINA

RESUMEN
La piroplasmosis equina o babesiosis es una enfermedad de los caballos, las mulas, los asnos y las cebras, producida por protozoos y transmitida por garrapatas. Los agentes etiolgicos son parsitos de la sangre llamados Theileria equi y Babesia caballi. Anteriormente Theileria equi se designaba como Babesia equi. Los animales infectados pueden ser portadores de estos parsitos por mucho tiempo y actuar como fuentes de infeccin para las garrapatas, que actan como vectores. Los parsitos se localizan dentro de los eritrocitos de los animales infectados. La introduccin de los animales portadores en reas con prevalencia de garrapatas vectoras puede conducir a una distribucin epizotica de la enfermedad. Identificacin del agente: Los caballos infectados se pueden identificar mediante la demostracin de los parsitos en sangre teida o en frotis de rganos. Los mtodos de tincin tipo Romanovsky, como el de Giemsa, dan los mejores resultados. El bajo nivel de parasitemia en los animales portadores hace muy difcil la deteccin de los parsitos, especialmente en el caso de las infecciones por B. caballi, aunque, a veces, se pueda demostrar su presencia utilizando una tcnica de frotis fuerte de sangre. Una caracterstica diagnstica de la infeccin por B. caballi es la presencia de parejas de merozoitos unidos por sus extremos posteriores. Los parsitos de los eritrocitos merozoitos de T. equi presentan una longitud inferior a 23 m, y son piriformes, redondos o de forma ovoide. Una caracterstica de T. equi es la disposicin de cuatro merozoitos con forma de pera formando una ttrada conocida como Cruz de Malta. Se han elaborado y contina extendiendo el uso de tcnicas moleculares para la deteccin de T. equi y B. caballi basadas en pruebas de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), orientadas al gen 18S rARN. se examinan sus eritrocitos para investigar la presencia de los parsitos. Se ha demostrado que estas pruebas son muy sensibles y especficas y prometen desempear un papel muy importante en el diagnstico de las infecciones. Pruebas serolgicas: La mejor manera de demostrar la infeccin en los animales portadores es estudiar sus sueros para analizar la presencia de anticuerpos especficos. En la actualidad, las pruebas de fijacin de complemento (FC), inmunofluorescencia indirecta (IFI) y enzimoinmunoensayo de competicin (C-ELISA) son las ms utilizadas para calificar caballos de importacin. La prueba de fijacin del complemento, utilizada durante muchos aos como la prueba fundamental, ha sido reemplazada por las pruebas IFI y C-ELISA. Se ha demostrado que estas pruebas son ms efectivas para la deteccin de los animales con una infeccin duradera y los animales tratados con medicamentos antiparasitarios. Dichos animales pueden ser negativos a la fijacin del complemento y, an as, estar infectados. Se ha demostrado que las pruebas IFI y CELISA son muy especficas para cada una de las dos especies de agentes causantes de la piroplasmosis. Las tcnicas ELISA indirectas tambin se pueden utilizar para la deteccin de las mencionadas especies en caballos infectados, aunque se da reaccin cruzada entre T. equi y B. caballi. La aplicacin de protenas recombinantes de los merozoitos de T. equi y B. caballi en pruebas de diagnstico parece ser muy prometedora para determinar con precisin la infeccin por piroplasmosis Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: No existen productos biolgicos disponibles.

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A. INTRODUCCIN
La piroplasmosis equina es una enfermedad de los caballos, las mulas, los asnos y las cebras producida por protozoos y transmitida por garrapatas. Los agentes etiolgicos de la piroplasmosis equina son Theileria equi y Babesia caballi. Se han identificado 12 especies de garrapatas de tipo ixdico en los gneros Dermacentor, Rhipicephalus y Hyalomma como vectores horizontales de B. caballi y T. equi, aunque ocho de estas especies fueron tambin capaces de transmitir las infecciones por B. caballi transovricamente (7, 36, 44, 45). Los animales infectados pueden permanecer como portadores de estos parsitos sanguneos durante por largos perodos de tiempo y actuar como fuentes de la infeccin para las garrapatas que actan como vectores. Estos parsitos se presentan en el sur de Europa, Asia, pases de la Unin de Estados Independientes (Commonwealth), frica, Cuba, Sudamrica y Amrica Central, y ciertas partes del sur de los Estados Unidos de Amrica. Theileria equi se ha descrito tambin en Australia (aunque en apariencia nunca se ha establecido all) y se cree que tiene una distribucin general ms amplia que B. caballi. Durante el ciclo de vida de Babesia, al principio los esporozoitos invaden los eritrocitos (RBC) y se transforman all en trofozoitos (10, 37). En esta situacin, los trofozoitos crecen y se dividen en dos merozoitos redondos, ovales o piriformes. Los merozoitos maduros son entonces capaces de infectar a nuevos eritrocitos y luego se repite el proceso de divisin. Babesia caballi: en los eritrocitos los merozoitos son piriformes, de 25 m de longitud y 1.33.0 m de dimetro (27). Los pares de merozoitos unidos por sus extremos terminales son una caracterstica diagnstica propia de la infeccin por B. caballi (32). Theileria equi: los merozoitos de este microorganismo son relativamente pequeos, con una longitud menor de 23 m (27), y son piriformes, de forma redonda u ovoide. Una caracterstica de T. equi es que se suelen encontrar juntos cuatro parsitos de unos 2 m de longitud dispuestos en forma de una ttrada conocida como Cruz de Malta (14). En la infeccin por T. equi, se ha demostrado que los esporozoitos inoculados en caballos a travs de la picadura de garrapata invaden los linfocitos (41). Los esporozoitos se desarrollan en el citoplasma de estos linfocitos y eventualmente forman esquizontes semejantes a Theileria. Los merozoitos liberados de estos esquizontes penetran en los eritrocitos. La posicin taxonmica de T. equi ha sido polmica y tan solo recientemente se ha redescrito y admitido como una Theileria (33). Ms evidencia para apoyar una estrecha relacin con especies de Theileria deriva de la homologa encontrada entre las protenas de superficie de 30 y 34 kDa de T. equi y las protenas de tamao similar de otras especies de Theileria (22, 24). Sin embargo, la posicin de T. equi en los rboles filogenticos basados en los genes para el ARN de la subunidad pequea ribosmica es variable y casi siempre aparece como clado de las theilerias (6, 35), lo que induce a algunos a creer que T. equi es un ancestro de las theilerias (3) o un grupo totalmente distinto. Habitualmente los sntomas clnicos de la piroplasmosis equina no son especficos, y la enfermedad se puede confundir fcilmente con otras enfermedades. La piroplasmosis se puede presentar en las formas hiperaguda, aguda o crnica. Los casos agudos son los ms comunes, y se caracterizan por fiebre, que suele superar los 40C, disminucin del apetito y malestar, elevacin del pulso y de la actividad respiratoria, congestin de las membranas mucosas, y deposiciones fecales ms pequeas y secas de lo normal. En los casos subagudos, los signos clnicos son semejantes. Adems, los animales afectados muestran prdida de peso, y la fiebre es a veces intermitente. Las membranas mucosas varan de color rosa plido a rosa, o de amarillo plido a amarillo fuerte. En las membranas mucosas tambin se pueden apreciar petequias (pequeas hemorragias superficiales) y/o equimosis (extravasacin sangunea bajo la mucosa). Los movimientos normales del intestino pueden disminuir ligeramente y los animales pueden mostrar los sntomas de un clico leve. A veces se presenta una ligera inflamacin edematosa en el extremo distal de las extremidades. Los casos crnicos presentan sntomas clnicos inespecficos como inapetencia ligera, cambio de comportamiento y un descenso de la masa corporal. Mediante el examen rectal el bazo, se detecta habitualmente agrandado. Se ha descrito una forma hiperaguda rara en la que los caballos aparecen muertos o moribundos (28).

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente

Los caballos infectados pueden identificarse demostrando los parsitos en frotis teidos de sangre o de rganos, obtenindose la primera preferiblemente de capilares cutneos durante la fase aguda de la enfermedad. Los

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mtodos de tincin de tipo Romanovsky, como el de Giemsa, normalmente proporcionan los mejores resultados (43).Sin embargo, en los casos de infeccin por B. caballi, la parasitemia es muy baja y difcil de detectar. Los analistas con experiencia pueden a veces detectar una parasitemia muy baja utilizando una tcnica de frotis gruesos de sangre (30). Se preparan extensiones densas colocando una pequea gota de sangre (aproximadamente 50 l) sobre un porta de vidrio limpio. Esta gota se seca al aire, se fija a 80C durante 5 minutos, y se tie con Giemsa al 5% por 2030 minutos. A veces es deseable una identificacin precisa de la especie, ya que con frecuencia se presentan infecciones mixtas de T. equi y de B. caballi. La identificacin mediante el examen de frotis sanguneos no solo es difcil sino tambin imprecisa, por lo que son preferibles los mtodos serolgicos (vase ms adelante). Sin embargo, se pueden encontrar reacciones negativas falsas o positivas falsas en el desarrollo de las pruebas serolgicas (8, 9, 49). En tales casos, aunque constituye un ejercicio incmodo y costoso, la transfusin de sangre completa es una tcnica muy til para determinar la verdadera situacin. Se transfieren a un caballo susceptible, preferiblemente esplenectomizado, grandes cantidades de sangre completa (500 ml). Este animal se mantiene luego bajo una observacin estrecha para detectar sntomas clnicos de la enfermedad. El diagnstico se confirma por la presencia de parsitos en sus eritrocitos. En una tcnica adicional, se deja que una garrapata especfica no infectada se alimente sobre un animal sospechoso, y la presencia del microorganismo puede identificarse en la garrapata misma, o mediante la transmisin del microorganismo a otro animal susceptible por medio de la garrapata vector. Para identificar a los portadores de los parsitos, una alternativa que complementa los mtodos anteriores puede ser el lograr establecer cultivos in vitro de T. equi y de B. caballi (15, 16, 53, 54). Se han logrado cultivar parsitos de Babesia caballi de la sangre de dos caballos que dieron negativo a la prueba de fijacin de complemento (FC) (16). De modo anlogo, se ha podido cultivar T. equi a partir de caballos que no mostraban ninguna parasitemia patente al tiempo de iniciacin de los cultivos (53, 54). Se han descrito tcnicas moleculares para la deteccin de T. equi y B. caballi (2). Estas tcnicas son la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) especfica para especie, orientada sobre todo al gen 18S rARN (4, 6, 40). Versiones ms refinadas de esa tcnica incluyen la PCR anidada (38), la amplificacin isotrminca mediante bucles (LAMP) (1), a la que se atribuye una mayor sensibilidad; la muy sensible prueba de transferencia lineal inversa (RLB) y la PCR multiplex para la deteccin e identificacin simultneas de las especies Theileria y Babesia en los caballos (2, 35).

2.

Pruebas serolgicas

Resulta muy difcil diagnosticar la presencia de los microorganismos en animales portadores mediante un examen microscpico de los frotis de sangre. Adems, este sistema no es prctico a gran escala. Por consiguiente, se recomienda el anlisis serolgico de los animales como el mtodo preferido de diagnstico, en especial cuando los caballos se destinan a la importacin a pases donde no se presenta la enfermedad, pero en los que est presente el vector. Los sueros se deben recoger y enviar a los laboratorios de diagnstico siguiendo las especificaciones de dichos laboratorios. Los caballos para la exportacin que hayan sido sometidos a pruebas serolgicas y que estn libres de la infeccin deben ser mantenidos en ausencia de garrapatas para evitar infecciones accidentales. En el diagnstico de la piroplasmosis se han utilizado varias tcnicas serolgicas, como la prueba de la FC, la prueba de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (IFI), y el enzimoinmunoensayo (ELISA). Adems, recientemente se ha descrito una prueba sencilla y rpida de inmunocromatografa para T. equi, que podra resultar muy til para el anlisis masivo de muestras de suero (17).

a)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (prueba ordenada para el mercado internacional)
La prueba de la IFI se ha aplicado con xito en el diagnstico diferencial de infecciones por T. equi y B. caballi (29). El reconocimiento de una reaccin fuertemente positiva es relativamente sencillo, pero, para cualquier diferenciacin entre una reaccin positiva dbil y una negativa dbil, se requiere una experiencia considerable de cara a su interpretacin. Se ha ofrecido una descripcin detallada del protocolo de la prueba IFI (29, 34). Ms adelante se ofrece un ejemplo de protocolo para esa prueba. Produccin de antgeno

Se recoge sangre para antgeno de caballos con parasitemia creciente; lo ideal es 25. Los animales portadores que ya han producido anticuerpos no son adecuados para la produccin de antgeno. Se recoge

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sangre (unos 15 ml) en 235 ml de solucin salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2. Los eritrocitos se lavan tres veces con PBS fro (1.000 g durante 10 minutos a 4C). El sobrenadante y la capa celular blanca de leucocitos se eliminan despus de cada lavado. Despus del ltimo lavado, los eritrocitos empaquetados en el precipitado despus de la centrifugacin se reconstituyen al volumen normal inicial con una solucin al 4% de la fraccin V de seroalbmina bovina preparada en PBS, es decir, el volumen de clulas empaquetadas se considera un 30% del original, de modo que alrededor de un tercio sean eritrocitos. Si el volumen original era 15 ml, entonces 5 ml de eritrocitos empaquetados + 10 ml de seroalbmina bovina al 4% en PBS constituyen el antgeno. Despus de mezclar bien, se coloca el antgeno en pocillos preparados sobre un porta excavado mediante un sacabocados o una jeringa (34). Alternativamente, se pueden extender cuidadosamente las clulas sobre portas para microscopio, cubriendo por completo el porta con una capa uniforme y moderadamente gruesa. Estos portas se dejan secar, se envuelven en papel suave y se sellan en bolsas de plstico o se envuelven en papel de aluminio, guardndose a 20C hasta por 1 ao. i) ii) iii) iv) Procedimiento de la prueba Se ensaya cada muestra de suero frente a antgeno de B. caballi y de T. equi. Antes de su uso, se retiran los portas congelados de su lugar de mantenimiento a 20C y se incuban a 37C durante 10 minutos. Los frotis de antgeno se sacan luego de su cubierta protectora y se fijan en acetona con hielo seco (20C) durante 1 minuto. Existen portas comerciales disponibles que estn prefijados. Si se trata de frotis sobre la superficie completa del porta, se forman cuadrculas sobre el frotis de antgeno con esmalte para uas o un medio de montaje de secado rpido (como Cytoseal) (se dibujan 1421 cuadrculas en total, es decir 23 filas de 7 en cada una). Se diluyen de 1/80 a 1/1280 con PBS los sueros a ensayar y los sueros de control positivo y negativo. Se incluyen los sueros de control negativo y positivo en cada prueba. Se aplican los sueros (10 l de cada uno) a las diluciones apropiadas en los diferentes pocillos o cuadrculas sobre el frotis de antgeno, se incuba 30 minutos a 37C, y se lava varias veces con PBS y una vez con agua). Se diluye en PBS una inmunoglobulina anti-caballo preparada en conejos y conjugada con isotiocianato de fluorescena (este conjugado est disponible comercialmente) y se aplica al frotis, que se incuba y se lava luego como antes.

v) vi)

vii)

viii) Despus del lavado final, se colocan en cada frotis dos gotas de una solucin que contenga glicerina y PBS a partes iguales, y se monta con un cubre para la observacin microscpica. ix) Luego se examinan los frotis al microscopio para observar parsitos fluorescentes. Por lo general, los sueros diluidos 1/80 o ms, que den fluorescencia fuerte, se consideran positivos, aunque hay que tener tambin en cuenta el tipo de fluorescencia que presentan los controles positivos y negativos.

b)

Enzimoinmunoensayo
En los ltimos aos se ha descrito la produccin de varios antgenos recombinantes para su uso en tcnicas de ELISA. Se han producido protenas recombinantes de T. equi, EMA-2:Be82, B158 y B. caballi RAP-1; Bc48; Bc134) en Escherichia coli (12, 13, 18, 20, 21, 25, 46) en clulas de insectos mediante baculovirus (47, 52). Los antgenos recombinantes producidos en E. coli o por baculovirus presentan la ventaja obvia de evitar la necesidad de infectar caballos para la produccin de antgenos y de eliminar las reacciones cruzadas que se han experimentado con los antgenos crudos de la prueba ELISA. Tambin suponen una fuente lgica de antgeno para su distribucin y estandarizacin a nivel internacional. Los ELISA indirectos en los que se utiliza EMA-2 y BC48 han mostrado una gran especificidad y sensibilidad en la deteccin de anticuerpos en caballos infectados (18, 19, 47). Los resultados iniciales de estas pruebas son prometedores y est en curso la validacin adicional de las pruebas La protena EMA-1, y un anticuerpo monoclonal especfico (MAb) que define el eptopo de esta protena superficial del merozoito, se han utilizado en ensayos C-ELISA para T. equi (25). Con este mtodo se evita el problema de la pureza del antgeno, ya que la especificidad de esta prueba depende solo de la especificidad definida por el eptopo de T. equi para el MAb. En la deteccin de anticuerpos frente a T. equi, se observ una correlacin del 94% entre las pruebas C-ELISA y FC. En los sueros que dieron resultados discrepantes se comprob su capacidad para inmunoprecipitar los productos de la traduccin in vitro del ARN mensajero del merozoito de T. equi marcados radiactivamente con 35S-metionina. Sin embargo, los resultados de la inmunoprecipitacin con las muestras de suero que fueron negativos en el C-ELISA y positivos en la FC no fueron concluyentes. Los datos limitados hasta la fecha parecen sugerir que la prueba C-ELISA es especfica para T. equi (26). Esta prueba C-ELISA fue tambin recientemente validada para T. equi en Marruecos y en Israel, presentando una similitud del 91% y del 95,7%, respectivamente, con la

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prueba IFI (39, 42). Se ha elaborado un mtodo C-ELISA similar utilizando la protena1 recombinante (RAP1) de B. caballi, que es un componente asociado al orgnulo secretor (rhoptry), y un MAb que reacciona con un pptido del eptopo del antgeno de 60 kDa de B. caballi (21). Los resultados de 302 muestras de suero ensayados por C-ELISA y FC mostraron un 73% de concordancia. De las 72 muestras que fueron negativas a la FC y positivas al C-ELISA, 49 (el 67%) fueron positivas a la IFI, mientras que cuatro de las cinco muestras que fueron positivas a la FC y negativas al C-ELISA fueron positivas en la prueba IFI (21). Se ha descrito un procedimiento para C-ELISA en la piroplasmosis equina y se ha utilizado en estudios adicionales de validacin (23, 51). La aparente especificidad de los ensayos C-ELISA para T. equi y B. caballi cae dentro del 92,2%99,5% cuando se utilizan sueros de 1.000 caballos que se suponen libres de piroplasmosis. La sensibilidad diagnstica aparente de ambas pruebas aplicadas a ms de 1.000 caballos de origen extranjero y de estado infeccioso desconocido origin la deteccin neta de un 1,1% (T. equi) y un 1,3% (B. caballi) ms de animales seropositivos que por la prueba de la FC, segn lo confirmado mediante la prueba de la IFI por dos observadores independientes. En un estudio similar con 645 caballos de origen extranjero que se ensayaron con fines de importacin y preimportacin se usaron sueros tratados con calor (el 58C durante 30 minutos dio como resultado un 3.6% (T. equi) y un 21% (B. caballi) ms de animales seropositivos detectados mediante el C-ELISA que mediante la FC; ambas pruebas de C-ELISA fueron muy reproducibles pocillo a pocillo, placa a placa y da a da, con variaciones globales de 1,2% y 1,6%, para las pruebas de T. equi y B. caballi, respectivamente. A continuacin se expone un protocolo de C-ELISA. Los National Veterinary Services Laboratories del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) (51) han ofrecido una descripcin detallada de la produccin de antgeno y el protocolo de la prueba. Existe un kit comercial disponible que se basa en los mismos antgenos y anticuerpos monoclonales (VMRD, Inc. Pullman, Washington USA, http://www.vmrd.com/). Soluciones

Tampn de revestimiento de antgeno: se prepara el volumen necesario de tampn de revestimiento de antgeno usando las siguientes cantidades de reactivos para cada litro: 2,93 g de bicarbonato sdico; 1,59 g de carbonato sdico; suficiente agua bidestilada para disolver lo anterior, y se lleva a un volumen de 1 litro con agua bdestilada. Se ajusta el pH a 9,6. Solucin de lavado para C-ELISA (diluyente de alta salinidad): se prepara el volumen necesario de solucin de lavado para C-ELISA usando las siguientes cantidades de reactivos para cada litro: 29,5 g de cloruro sdico; 0,22 g de fosfato sdico monobsico; 1,19 g de fosfato sdico dibsico; 2 ml de Tween 20; suficiente agua bidestilada para disolver lo anterior, y se lleva a un volumen de 1 litro con agua bidestilada. Se mezcla bien. Se ajustar el pH a 7,4. Se esteriliza en autoclave a 121C. Produccin de antgeno

Un cultivo congelado de clulas transformadas de E. coli se inocula a una dilucin 1/10,000 en cualquier medio lquido no selectivo estndar para permitir el crecimiento bacteriano (por ejemplo, caldo de Luria) y que contenga carbenicilina (100 g/ml) e isopropil-tiogalactsido (IPTG, 1 mM). Los cutivos se incuban en un agitador orbital a 200 rpm a 37C toda la noche. Las clulas crecidas despus de ese perodo se recogen por centrifugacin (5.000 g durante 10 minutos), se lavan con tampn Tris-HCl 50 mM y cido etilndiamino tetraactico (EDTA), pH 8,0, y se colectan de nuevo como antes. (El antgeno est disponible en los National Veterinary Services Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010, USA). Las clulas se resuspenden al 10% de su volumen original en el tampn Tris-ClH, al que se aade 1 mg/ml de lisozima, y se mantienen en hielo 20 minutos. Luego se aade el detergente Nonidet P-40 (NP-40) a una concentracin final del 1% (v/v), se agita con un vrtex, y se deja la muestra en hielo 10 minutos. El material se sonica a continuacin con cuatro ciclos de 4 segundos a 100 vatios, en hielo, con intervalos de 2 minutos entre cada ciclo de sonicacin para evitar el calentamiento de la muestra. El sonicado se centrifuga a 10,000 g durante 20 minutos. El sobrenadante resultante se distribuye en tubos de microcentrfuga en alcuotas de 0,5 ml y puede conservarse durante aos a 70C. La presencia de los antgenos bacterianos heterlogos en el hospedador no interfiere en la unin con los anticuerpos especficos equinos antipiroplasma o la unin de los pares de MAb a los epitopos de los antgenos recombinantes expresados mediante los procedimientos siguientes. Se controla la calidad de los sobrenadantes que contienen el antgeno titulndoles con sus anticuerpos emparejados y con antisueros equinos monoespecficos de referencia para verificar un nivel de expresin adecuado y una especificidad completa para la especie homloga del agente de la piroplasmosis. Los controles normales de suero (suero negativo) no deben interferir con la unin de los MAb, o sueros equinos de referencia, con la preparacin de antgeno expresada.

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i)

Procedimiento de la prueba Se preparan las placas de microtitulacin revistiendo los pocillos con 50 l de antgeno de T. equi o de B. caballi diluido en tampn de revestimiento de antgeno, Se determina la dilucin usada por tcnicas estndar de titulacin serolgica. La placa se sella con su tapadera, se guarda durante la noche a 4C y se congela a 70C. Las placas se pueden guardar a 70C hasta 6 meses. Los MAb de T. equi o anti-B. caballi y el conjugado de peroxidasa y anticuerpos secundarios se diluyen, segn las instrucciones del fabricante, en el momento en que vayan a utilizarse en un CELISA, con el tampn de dilucin de los anticuerpos (proporcionados con el kit de la prueba). Los sueros control y las muestras del suero de prueba se diluyen a un 1/2 con tampn para dilucin de suero antes de aadir 50 l de sueros a los pocillos. Se ensaya cada muestra de suero desconocida en pocillos individuales o duplicados. Los sueros de control positivos y los pocillos vacos se ensayan por duplicado, mientras que los sueros control negativos se ensayan por triplicado o en diferentes partes de la placa. Las placas se cubren e incuban a temperatura ambiente (2125C) durante 30 minutos en una cmara hmeda y luego se lavan tres veces con solucin de lavado para C-ELISA Se aade a cada pocillo una dilucin de peroxidasa secundaria conjugada con IgG anti-ratn marcada con biotina (50 l/pocillo). Las placas se cubren e incuban 30 minutos a temperatura ambiente en una cmara hmeda y luego se lavan tres veces con solucin de lavado para C-ELISA. Se aade a cada pocillo una dilucin de peroxidasa secundaria conjugada con IgG anti-ratn (50 l/pocillo). Las placas se cubren e incuban 30 minutos a temperatura ambiente en una cmara hmeda y luego se lavan tres veces con solucin de lavado para C-ELISA. A todos los pocillos se aade un substrato cromgeno para el enzima (50l/pocillo). Las placas se incuban cubiertas durante 15 minutos a temperatura ambiente (2125C) durante el revelado del color.

ii)

iv)

v)

vi)

vii)

viii) El desarrollo del color se detiene aadiendo a todos los pocillos 50l de solucin de parada y se leen las placas de forma inmediata mediante un lector de placas. ix) Las placas se leen a 620, 630 o 650 nm de longitud de onda (OD). Se calcula la OD590 media del par de pocillos para cada uno de todos los sueros control y los pocillos vacos. Para que un ensayo sea vlido, la media de los controles debe producir un OD > 0.300y < 2.000. La media del control positivo debe producir una inhibicin de 40%. El porcentaje de inhibicin [%I] se calcula del modo siguiente: %I = 100 [(OD de la muestra 100) (OD de la media del control negativo)]. Si la muestra de prueba produce una inhibicin 40%, se considera positiva; si produce una inhibicin <40%, se considera negativa.

x) xi)

c)

Fijacin del complemento (prueba prescrita para el mercado internacional)

La prueba de la FC se ha utilizado en el pasado en algunos pases para certificar caballos de importacin (48). Se dispone de una descripcin detallada de la produccin del antgeno y del procedimiento de la prueba, como la ofrecida por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) (7, 9, 50). La prueba de la FC no identifica a todos los animales infectados, especialmente si han sido tratados, y debido a las reacciones anti-complementarias de algunos sueros, y a la incapacidad de la IgG (T) (el principal isotipo de las inmunoglobulinas de los quidos) para fijar complemento de cobaya (31). De ah que tambin se acepte el uso de la IFI y de C-ELISA, en lugar de la de FC como las prescritas para el mercado internacional. Soluciones

Solucin de Alsever: se prepara 1 litro de solucin de Alsever disolviendo 20,5 g de glucosa; 8,0 g de citrato sdico; y 4,2 g de cloruro sdico en suficiente cantidad de agua. Se ajusta el pH a 6,1 utilizando cido ctrico y se ajusta hasta 1 litro con agua destilada. Se esteriliza por filtracin. Stock de tampn veronal (5 ): se disuelven los siguientes componentes en 1 litro de agua destilada: 85,0 g de glucosa; 3,75 g de 5,5 dietil barbiturato sdico; 1,68 g de cloruro magnsico (MgCl2.6H2O); y 0,28 g de cloruro clcico. Se disuelven 5,75 g de cido 5,5 dietil barbitrico en 0,5 litros de agua destilada caliente (casi hirviendo). Se enfra esta solucin de cido y se aade a la anterior solucin de sales. Se lleva el volumen a 2 litros con agua destilada y se guarda a 4C. Para preparar una solucin de trabajo, se aade una parte de solucin stock a cuatro partes de agua destilada. El pH final debe estar entre 7,4 y 7,6. Produccin de antgeno

La sangre se obtiene a partir de caballos con alta parasitemia (por ejemplo, 37% para B. caballi y 6085% para T. equi), y se mezcla con un volumen idntico de solucin de Alsever como anticoagulante. Cuando los

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eritrocitos se han decantado al fondo del recipiente, se retira el sobrenadante que contiene el plasma y la solucin de Alsever, y la capa de leucocitos. Los eritrocitos se lavan varias veces con tampn veronal fro y luego se lisan. El antgeno se recoge del lisado por centrifugacin a 30.900 g durante 30 minutos. El antgeno recuperado se lava varias veces en tampn veronal fro mediante centrifugacin a 20.000 g por 15 minutos. Se aade como estabilizador polivinil pirrolidona 40.000 (15% [p/v]) y la preparacin se mezcla bien en un agitador magntico durante 30 minutos, se tamiza a travs de una capa doble de gasa estril, se distribuye en volmenes de 2 ml y se liofiliza. El antgeno se puede conservar a continuacin por debajo de 50C durante varios aos. i) Procedimiento de la prueba Deben comprobarse la especificidad y la potencia de cada lote de antgeno frente a los antisueros estndar de especificidad y potencia conocidas. Se determinan tambin las diluciones ptimas del antgeno en una titulacin primaria por el sistema de tablero de ajedrez o tabla de doble entrada. Los sueros de ensayo se inactivan 30 minutos a 56C (los sueros de asnos y mulas se inactivan a 62,5C durante 35 minutos) y se prueban a diluciones de 1/5 a 1/5120. Para todas las diluciones se utiliza tampn veronal. El complemento se prepara y se titula espectrofotomtricamente para determinar la dosis hemoltica media (CH50) (45) y se utiliza en la prueba a valores de 5 veces CH50. El sistema hemoltico consta de partes iguales de una suspensin al 2% de eritrocitos de oveja (RBC) y de tampn veronal con 5 dosis hemolticas mnimas (MDH) de hemolisina (amboceptor) (50). Algunos laboratorios utilizan el 100% de la dosis hemoltica, que da una sensibilidad equivalente. La prueba se ha adaptado a las placas de microtitulacin (11). El volumen total del ensayo es 0,125 ml, formado por fracciones iguales (0,025 ml) de antgeno, complemento (cinco veces CH50) y suero diluido. La incubacin se realiza a 37C durante 1 hora. Se aade una fraccin doble (0,05 ml) del sistema hemoltico y se incuban las placas durante otros 45 minutos a 37C con agitacin despus de 20 minutos. Las placas se centrifugan a 200 g durante 1 minuto antes de proceder a la lectura sobre un espejo. Se considera como resultado positivo una lisis del 50%, y el ttulo es la dilucin mayor de suero que produce un 50% de lisis. Un ttulo de 1/5 se considera como suero positivo. En cada ensayo se debe incluir un juego completo de controles (sueros positivos y negativos) as como un control de antgeno preparado de eritrocitos (RBC) de un caballo normal (no infectado).

ii)

iii)

iv)

v) vi) vii)

Las muestras que no dan la reaccin del complemento se examinan por la prueba de la IFI. Los sueros de asno son frecuentemente negativos para la reaccin del complemento.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

En la actualidad no existen productos biolgicos disponibles.

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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la piroplasmosis equina (vase el cuadro de la parte 3 de este Manual de animales terrestres, o consltese una lista ms actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int).

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