LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

EXTRACCION DE ADN APARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE

JULIANA SANCHEZ VILLA

66020221019
MARIA JOSE HERRERA
66020191022

SANTA ROSA DE CABAL

UNISARC
09/06/2022
 RESUMEN

Este informe describe un proceso objetivo realizado por el laboratorio en dos

procedimientos, el primero es la extracción de ADN bacteriano y el segundo es
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los cuales son relevantes como
apoyo diagnóstico en un gran número de enfermedades infecciosas. y
enfermedades de base genética, por lo que es una de las mayores áreas de
desarrollo médico en este momento, sin excluir otras aplicaciones. Utilice
materiales experimentales como el UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO
BIO Laboratories Inc.) y reactivos como Taq Polymerase, Taq Polymerase
Buffer, agua, primers y DNA template; a su vez, estos métodos son de acuerdo
con el fabricante del kit y Kary Mullis, quien desarrolló PCR Se lleva a cabo la
justificación para el establecimiento. Los resultados de esta práctica no han
sido validados electroforéticamente, por lo que solo se destacan algunos
intermedios observados por los cineastas. Sin embargo, como partículas o
sustancias incoloras y espesas, identificar este proceso y sus etapas
correspondientes nos permite comprender los eventos microscópicos que sufre
el ADN en estas condiciones de extracción y catalíticas.

Objetivos:
 Identificar las etapas fundamentales de un protocolo de extracción de
ADN
 Reconocer los cambios que sufre la muestra en cada uno de los pasos
del protocolo de extracción saliting out
 Conocer el fundamento teórico y la importancia de la aplicación de
dichas técnicas para la obtención de ADN de buena calidad

INTRODUCCION
El campo de vincular diferentes formas de funcionamiento en cualquier
organismo. A nivel molecular, el ADN y el ARN son responsables de conservar
y convertir la información necesaria para el funcionamiento celular en
proteínas, junto con los lípidos y los carbohidratos, que, junto con las
estructuras proteicas, mantienen y activan los complejos moleculares
conocidos como células. El ADN y el ARN son componentes vitales de
cualquier célula, pero a nivel celular, tisular y orgánico, son solo actores en un
sistema biológico que está en constante comunicación consigo mismo y con su
entorno. Los procesos patogénicos en humanos son la evidencia más clara del
papel central del ADN y el ARN en enfermedades hereditarias como la fibrosis
quística, la hemofilia, la enfermedad de Huntington y ciertos tipos de cánceres
hereditarios. Pero a su vez, también es posible encontrar una afectación
limitada en enfermedades multifactoriales como la diabetes, las cardiopatías, la
obesidad y la demencia. En la lucha contra las enfermedades infecciosas se ha
vuelto necesario optimizar la especificidad, sensibilidad y rapidez de las
técnicas diagnósticas tradicionales, sin embargo, con el auge de la
investigación y la necesidad de un diagnóstico oportuno y efectivo, se aplican
técnicas de laboratorio basadas en biología molecular para la prevención. han
surgido programas de control y tratamiento. Entre las alternativas diagnósticas
propuestas para estos desafíos, la reacción en cadena de la polimerasa, la
hibridación de sondas de ADN, la secuenciación del genoma, la secuenciación
paralela, también conocida como secuenciación a gran escala o de próxima
generación (NGS), la piro secuenciación, las tecnologías de polimorfismo
amplificado como el ADN aleatorio (RAPD) y polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP), etc. Se introdujo en el laboratorio para
respaldar resultados altamente confiables

PROCEDIMIENTO
1. Tomar entre 0,2 y 0,5 mL de sangre total y agregarlos en 0,5 mL de Lisis I en
tubos eppendorf
2. Mezclar por inversión e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
3. Centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto
4. Voltear el tubo suavemente para descartar el sobrenadante y evitar que se
salga el precipitado. Escurrir en una servilleta limpia
5. Adicionar 1 mL de solución de Lisis I y mezclar por inverion. Hacer vortex
hasta desbaratar lo máximo posible el pellet, o usar una punta resistente para
desbaratarlo
6. Centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto y descartar el sobrenadante
7. Repetir los pasos 5 y 6 hasta lograr un pellet (precipitado) totalmente blanco
o transparente (2 o 3 veces más)
8. Agregar al precipitado 400 µL de solución de Lisis II y 10 µL de proteinasa K
(10µg/µL). Resuspender con punta resistente
9. Incubar por 30 minutos a 56 ◦C y hacer vorte periódicamente. Se puede
dejar por más tiempo, incluso hasta el otro día
10. Agregar 300 µL de solución NaCl 5M. Hacer vortex de 30 a 60 segundos y
centrifugar a 14000 rpm por 12 minutos
11. Pasar 350 µL de sobrenadante a un tubo nuevo, con 900 µL de etanol
absoluto frío. Mezclar suavemente por inversión y observar la malla de ADN.
En este paso se puede dejar hasta el otro día a -20 ◦C.
12. Centrifugar a 14000 rpm por 12 minutos
13. Descartar suavemente el sobrenadante para evitar perder el pellet
14. Agregar 1 mL de etanol al 70%, mezclar por inversión por 2 minutos,
centrifugar a 14000 rpm por 5 minutos
15. Descartar suavemente el sobrenadante y dejar secar el pellet por 20
minutos en la cabina extractora de gases
16. Adicionar 100 µL de TE 1X
17. Dejar para a determinación de la concentración al menos por 5 minutos a
37 ◦C o toda la noche a temperatura ambiente

PREGUNTAS:
1. ¿Cuál es la importancia de realizar un adecuado procedimiento para extraer
el ADN?
 La extracción de ADN se ha convertido en un procedimiento importante
para el estudio molecular de las enfermedades genéticas, por dicho
motivo es de importancia tanto para el médico investigador como para
el médico clínico contar con un protocolo adecuado de extracción de
DNA y la relevancia que tienen en la concentración, pureza e integridad
del DNA genómico.
2. ¿De qué forma se puede verificar la concentración y calidad del ADN
obtenido?
 Mediante espectrofotometría se puede determinar la concentración y la
pureza de una muestra de ADN basándose en la capacidad de
absorbancia de un compuesto presente en una solución a una longitud
de onda determinada
Se le llama extracción al método por el cual se obtiene el ADN a partir
de material biológico (ej.: cepillado bucal, saliva, sangre o cualquier
tejido) utilizando técnicas físicas y químicas. La extracción consiste en
la separación y purificación del ADN con el fin de poder estudiarlo,
analizarlo o manipularlo.
3. ¿Cuáles son los usos que se le podrían dar al ADN extraído?
 El ADN genómico extraído a partir de uñas ha sido utilizado para
análisis genético de genes que codifican para enzima, tipificación de
alelos de histocompatibilidad e incluso detección de ácido nucleico de
agentes infecciosos.

OBJETIVOS
• Conocer los componentes, las fases y las aplicaciones del proceso de PCR
• Identificar los procedimientos prácticos metodológicos para la realización de
una PCR
• Adquirir destrezas en los cálculos para realizar el coctel para la amplificación
• Realizar la amplificación de un fragmento de ADN, producto de la extracción
realizada en el laboratorio anterior
• Reconocer los cuidados necesarios con cada uno de los reactivos

PROCEDIMIENTO:
Se realizará el procedimiento estandarizado para la amplificación de un
fragmento de 702 pb del exón 12 del gen DBH ubicado en el cromosoma 11
bovino, el cual codifica para la Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH), enzima
indispensable para la síntesis de noradrenalina. Los cebadores presentan la
siguiente secuencia:
Forward: 5` TTTGGTTTGGGAGAAGG 3`
Reverse: 5´ TGCACCCGTCACACTCAA 3´
1. Marcar los tubos para PCR y servir el ADN en los 2 primeros tubos
2. Preparar el coctel en el tercer tubo (tubo control), teniendo en cuenta que los
reactivos permanezcan en frío todo el tiempo y agregando por último a
Taqpolimerasa
3. Servir el coctel en los otros dos tubos
4. Preparar el coctel necesario para la amplificación de 2 muestras y un control
negativo (tubo en el cual no hay PCR)

PREGUNTAS:
1. ¿Cuáles son las características más predominantes de la Taq
polimerasa?
 La más predominante es su actividad 5’ > 3’ añadiendo bases
nitrogenadas en ese sentido de la hebra de ADN
 Tiene una velocidad de 1Kb por minuto, queriendo decir que no
es de las más rápidas
 Tiene una tasa de error más elevadas que otras
2. ¿Cuáles son los cuidados que se deben tener en cuenta para un
procedimiento exitoso y cuáles son los factores que pueden inhibir el
proceso de amplificación?
ÉXITO
 Añadir un control negativo en el procedimiento
 Se debe de tener en cuenta una temperatura adecuada
 Que los materiales estén estériles
 Un buen manejo de las pipetas
 Que no entre aire al coctel
 Añadir las cantidades adecuadas de los reactivos
 Para cada muestra se debe de cambiar el tubo de la pipeta

FACTORES QUE INHIBEN

 Tener un ambiente contaminado es el primer factor que va a
inhibir la amplificación
 Se deben de tener kits adecuados para que no se inhiba la
prueba
 Utilizar materiales de bioseguridad para evitar contaminación
 Adecuado manejo de las pruebas y de las herramientas que se
utilizan allí
 3. ¿Cuál es la importancia de incluir con control negativo en el
procedimiento?

 La importancia de incluir un control negativo en el procedimiento

es que este nos va a permitir ver posibles casos de
contaminación y así podemos estar más seguros de que la
prueba va a salir exitosa

4. ¿Qué usos se le pueden dar a la PCR en el área de la ciencia animal?

Mencione 4 de ellos y con un artículo científico (adecuadamente citado) dé un
ejemplo de cada aplicación

La PCR se puede utilizar en la ciencia animal para:

 Diagnosticar enfermedades infecciosas
 Identificación de microorganismos
 Genotipificación de microorganismos
 Extracción de ADN

ARTICULO

Implementación de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Para el

Diagnóstico de la Brucelosis de Bovinos en el Ecuador
Orly Fernando Cevallos Falquez1 , Emerick Motte2 , Virna Cedeño2 , Mercedes
Susana Carranza Patiño1 , Hayron Fabricio Canchignia Martínez1 y Silvia Gicela
Saucedo Aguiar1 1 Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Laboratorio de
Biotecnología, Unidad de Investigación de Ciencia y Tecnología. Quevedo, Los
Ríos, Ecuador. Km. 1.5 Vía Sto. Domingo. orlycevallos@hotmail.com 2
Programa de Biotecnología, Universidad de Guayaquil. Guayaquil, Guayas,
Ecuador

 La técnica de amplificación de ácidos nucleicos por medio de la

PCR resulta cada vez una mayor alternativa para diagnosticar
enfermedades infecciosas causadas por microorganismos
desagradables o de lento crecimiento como la brucella spp, otra
ventaja es que permite diagnosticar con rapidez y eficacia.
Se recolectaron 172 muestras de sangre y 143 salieron negativas
a PCR en cuanto a la extracción de ADN genómico y se estimó
que el ADN era competente para realizar la prueba.

 Se utilizaron oligonucleótidos sintéticos para detectar la presencia

del patógeno y se seleccionaron 3 oligonucleótidos homólogos.
 Se pudo validar el protocolo de la extracción de ADN y se
implementaron técnicas para el diagnóstico y confirmación de
brucella spp abortus.
CONCLUSIONES:
 Uno de los fines de la práctica es aprender a dominar el uso de las PCR,
para así determinar los fragmentos de ADN del patógeno y así poder
determinar de qué índole es la afección que está presentando un
individuo.

 Saber identificar y manejar los protocolos y fundamentos de la

extracción correcta del ADN para llevar a cabo el desarrollo de las
pruebas, al igual identificar los cambios que van a ocurrir en la muestra
con cada uno de los pasos de protocolos.