UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA

MOLINA

CURSO: BIOLOGÍA CELULAR - LABORATORIO

INFORME DE PRÁCTICA N° 6

Título​:
Extracción de ADN
Profesora de laboratorio​:
Katty Ogatta Gutierrez
Alumnos​:
Astohuaman Ortiz, Fiorella Nicole 20180096
Burgos Sanico, Christine Natalie 20161098
Nuñez La Torre, Claudia Valeria 20180114
Palacios Bett, Nicolás José 20161109
Palacios Barrientos, Brenda Sofia 20180117
Horario de Práctica​:
Lunes 2:00 a 4:00 pm
Fecha de la práctica realizada​: 27/05/2019
Fecha de entrega​: 03/06/2019

2019
​
I. INTRODUCCIÓN
El ADN o ácido desoxirribonucleico es una molécula de suma importancia ya que contiene la
información hereditaria de un organismo, el cual le permite realizar sus funciones vitales e
incluso es responsable de la transmisión hereditaria. Pueden encontrarse en el núcleo de la
célula (células eucariotas), disperso en el citoplasma (células procariotas) o en algunos
organelos (mitocondrias y cloroplastos).
Debido a esta importancia se ha intentando descubrir más acerca de esta molécula desde su
descubrimiento en el año 1869 por el médico y biólogo suizo Friedrich Miescher.
Posteriormente surgieron más descubrimientos importarte como su composición, función
biológica y su estructura, lo cual nos ayuda a entender el cómo funcionan los organismos
vivos y ciertas enfermedades, para ello se han desarrollado técnicas para su extracción que
con el paso del tiempo se vuelven más sofisticadas a fin de obtener resultados de una mayor
calidad.
En este caso veremos una técnica más rudimentaria, ya que lo que se pretende es extraer el
ADN de manera sencilla.
Por lo cual procedemos a la trituración de las células vegetales con el fin de romper la
membrana y pared celular para así liberar el contenido de su citoplasma en donde se
encontrará el ADN que al interactuar con la solución salina la desnaturalizada y hará más
soluble facilitando así su visualización al precipitar por el etanol.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. ​Materiales
- Espinaca
- Mortero
- Micro Tubos y microtubos de centrífuga
- Pipetas graduadas
- Micropipetas
- Centrífuga
- Solución de NaCl 10%
- Etanol
- Milli Q
- Nanodrop
2.2 Procedimiento:
III. RESULTADOS
Extracción de ADN con calidad para PCR a partir de muestras frescas y secas de plantas del
género ​Spinacia oleracea:​ Espinaca.

Muestra Concentración (ng/uL) 260 Índice de calidad (260/280

nm nm)

Spinacia oleracea 213.1 ng/uL 1.94

IV. DISCUSIONES
Una de las características de los seres vivos es su reproducción:con este fin, todos ellos
utilizan los ácidos nucleicos para almacenar y transmitir la información genética. La molécula
en la que se almacena la información en forma codificada es el ácido desoxirribonucleico
(ADN). Además, a partir de la información del ADN, los seres vivos “reproducen” algunas de
sus biomoléculas- como las proteinas los lipidos y los carbohidratos-, y este proceso se
denomina síntesis. Las únicas moléculas que se sintetizan directamente de la información
codificada en el ADN son las proteínas y, a partir de ellas, en su función de enzimas de las
reacciones biológicas, el organismo sintetiza otras sustancias.
La información que hace a cada ser único debe ser preservada y luego transferida, con gran
precisión y exactitud, a un nuevo ADN en las células hijas, ya sea de la progenie o del mismo
individuo. En el proceso de transmisión de la información que se encuentra en el ADN,
primero, esta es transcrita al ARN mensajero, para que la lleve hasta los ribosomas. En los
ribosomas, se realiza la traducción de la información y, por lo tanto la síntesis de la proteína
que se requiere. En la síntesis, colabora el ARN de transferencia, el cual, desde el citoplasma,
transporta los aminoácidos necesarios para formar la nueva proteína. La interrelación entre el
ADN, ARN y las proteínas constituye el dogma central de la biología celular, en la que se
indica que la información genética es transmitida del ADN al ARN mediante el proceso de
transcripción. La secuencia del ARN es luego traducida en los ribosomas en una proteína.
(Quesada M.2007.pág 51-53)

1.- Para la extracción del DNA se Utilizaron células vegetales debido a su alto contenido de
DNA ya que en algunos casos estas presentan poliploidias, es muy común en plantas
domesticadas.​(Hilu, 1993). En el caso de la espinaca su cariotipo es: (2n = 12 cromosomas)
 ● Comparación de métodos de extracción de DNA.

Protocolo de Extracción Estándar Método Utilizado en laboratorio

1. Pulverizar con nitrógeno líquido el tejido foliar colectado de 1. Colocar en el mortero una hoja de espinaca sin
preferencia de hojas jóvenes aproximadamente 200 mg. nervadura, adicionar 5ml de solución de NaCl 5%
2. En un tubo eppendorf de 1,5 ml colocar material vegetal y triturar la muestra.
pulverizado hasta la marca de 500 μl y resuspender con 700 μl de 2.Colectar el sobrenadante de la muestra y colocar
buffer CTAB (2X), Adicionando 2 μl de β mercaptoetanol. Agitar en un microtubo(⅓) .
suavemente e incubar por 30 minutos a 65 ºC. 3.Centrifugar 5 min a 14.000 rpm.
3. Retirar de la incubadora y dejar reposar por espacio de 2 4.Adicionar etanol y esperar a que se forme una
minutos a temperatura ambiente. interfaz compuesta de DNA
4. Agregar 700 μl cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) mezclar 5.Utilizar un NanoDrop para cuantificar el DNA.
suavemente el tubo y centrifugar 5 min a 14.000 rpm. transferir el
sobrenadante a otro tubo.
5. Adicionar 50 μl de CTAB (10X), mezclar suavemente para
homogenizar todo el líquido.
6. Adicionar 700 μl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1),
mezclar suavemente y centrifugar 5 min a 14.000 rpm. transferir
el sobrenadante a otro tubo.
7. Agregar ¾ partes del volumen final (500 μl aprox.) de
Isopropanol helado para precipitar el ADN. Incubar a -20 ºC
durante 40 min.
8. Centrifugar 20 min a 12 000 rpm y descartar el sobrenadante
cuidando de no perder el pellet.
9. Lavar el pellet con 500 μl de Etanol al 70% helado y
centrifugar 20 min a 12 000 rpm descartar el Etanol.
10. Lavar el pellet con 500 μl de Etanol al 95% helado y
centrifugar 20 min a 12 000 rpm descartar el Etanol.
11. Permitir que el ADN(pellet) se seque al aire libre por 2 horas
invertiendo el tubo y luego resuspender el ADN en 80 μl de
buffer T10E1 ó agua estéril (aproximadamente) y almacenar a -20
ºC.
12.Utilizar un NanoDrop para cuantificar el DNA.

(Hoisington, 1994)

Como primera parte existe un símil en la trituración de las hojas debido a que las células vegetales
tiene una pared celular a parte de una membrana lo que impide poder acceder al material genético de
una manera fácil.
En comparación a un método estandarizado en el cual se utiliza un buffer que evita la
desnaturalización o ruptura de las cadenas de nucleótidos. Estos son casi imprescindibles ya que solo
se necesita el material para una prueba cualitativa y no para experimentos moleculares

La concentración de 5% de sal ayudará a hacer precipitar algunas moléculas y debilitar las membranas
lipídicas de la celular y lizarse en su mayoría.
Se llevará está solución a centrifugar para que terminen de precipitar las moléculas más pesadas y se
agrega una pequeña cantidad de alcohol que caerá por las paredes del microtubo.

El DNA termina por unirse al etanol debido a que por ser una molécula anfipática, está tiene una
mayor afinidad con este que por el agua.

Fundamentos del NanoDrop.

El NanoDrop® ND-1000 es un espectrofotómetro de espectro total (220-750nm) que mide

concentraciones con 1 µl de muestra, con gran exactitud y reproductibilidad. Utiliza una nueva
tecnología que usa la tensión superficial para mantener la muestra en su sitio y se eliminan las cubetas
de mesura. Además, el ND-1000 tiene la capacidad de medir muestras muy concentradas, sin
necesidad de diluirlas (acepta 50X más de concentración que las medidas estándars con cubetas). Esta
característica lo hace idóneo para medir la concentración de ácidos nucleicos y para determinar su
cualidad. El software calcula automáticamente la concentración de los ácidos nucleicos siguiendo la
relación:
1 A260nm = 1 OD DNA = 50 µg/ml
1 A260nm = 1 OD RNA = 40 µg/ml
La concentración de proteína se puede calcular para muestras a las cuales se les haya aplicado el
método de Bradford, Pierce, Lowry, BCA o la mesura directa de absorbancia a 280 nm. En este último
caso, se asume la siguiente relación entre absorbancia y concentración de proteína:
1 A280nm = 1 mg/ml

Asimismo, se puede ajustar el coeficiente de extinción molar para cualquier proteína. Además, el
aparato permite la conversión automática de absorbancia en concentración para muestras de BSA,
Lisozima e IgG.

V. CONCLUSIONES

- Los materiales de laboratorio así como el material vegetal (espinaca), fundamentado

en sus propiedades y uso, nos permitieron extraer el ADN del vegetal y pudimos
observar dicho precipitado de estructura fibrilar.

- La técnica utilizada en la práctica nos permitió realizar la extracción de ADN de los

tejidos vegetales con lo que pudimos hallar la concentración igual 213.1 ng/uL con el
valor de la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm.

- Además, la relación de absorbancias de A260/280 nos permitieron evaluar la pureza

de la muestra teniendo un índice de calidad igual a 1,94, concluimos que se obtuvo un
ADN de pureza óptima dentro del rango de 1,8 a 2,0.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

● Hilu, K. (1993). Polyploidy and the Evolution of Domesticated Plants. American Journal Of
Botany, 80(12), 1494. doi: 10.2307/2445679
● Hoisington, D. (1994). Protocolos de laboratorio. Mexico: CIMMYT.
● Quesada, M.(2007). Manual de laboratorio.Costa rica
● Watson, James D. y Francis H. C. Crick. «A structure for Deoxyribose Nucleic Acid.» (PDF).
Nature 171, 737-738 pp. 25 de abril de 1953.
● Ridley, Matt. Francis Crick: Discoverer of the Genetic Code (Eminent Lives), HarperCollins
Publishers; 192 pp., ISBN 978-0-06-082333-7 2006