Bcym Informe 1 Fase 2

FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERIAS
BIOLOGICAS Y QUIMICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AREA: BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

TEMA: EXTRACION DE ADN DE ALETA DE
PESCADO
DOCENTE: HERBERT MISHAELF AGUILAR
BRAVO
PRESENTADO POR: ANA GABRIEL
HUARACHA MAMANI
SEMESTRE: III
AREQUIPA – PERÙ-2022
EXTRACION DE ADN DE ALETA DE PESCADO
Objetivos:-
 Para aislar el ADN de las aletas de los peces.

 Para obtener la forma purificada de ADN que puede utilizarse posteriormente para el
análisis molecular.
 Comprender el principio y el proceso de extracción de ADN.
Teoría:-
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un ácido nucleico complejo que contiene el código genético
con las instrucciones para el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos,
a excepción de algunos virus. Los segmentos de ADN que llevan esta información genética se
llaman genes. El ADN se transcribe en ARN que luego se utiliza como molde en la síntesis de
proteínas.
El aislamiento de ADN se refiere al proceso de extracción de ADN de una célula en forma pura. La
extracción de ADN es un paso preliminar importante en el que se obtiene ADN purificado a partir
de otros componentes celulares como proteínas, ARN y lípidos. El ADN se puede aislar de
cualquier célula nucleada de diversas fuentes, tanto vivas como muertas, como sangre entera,
cabello, esperma, huesos, uñas, tejidos, heces, plumas mudadas, cáscaras de huevo, saliva, células
epiteliales, orina, bacterias, animales. tejidos o plantas.
El aislamiento de ADN es necesario para una variedad de aplicaciones en ciencia, medicina y

medicina forense. Por ejemplo, los científicos introducen ADN en las células de animales o plantas
para el análisis de SNP, el análisis de metilación del ADN, la variación del número de copias (CNV) o
el análisis de hibridación genómica comparativa (CGH), el Southern Blot, la PCR, etc. En medicina,
el aislamiento del ADN es útil para propósitos de diagnóstico. Además, la extracción de ADN es
una herramienta importante en la ciencia forense para la identificación de personas (por ejemplo,
violadores, ladrones, accidentes o víctimas de guerra), determinación de paternidad, identificación
de cadáveres, etc.
Hay varios procedimientos diferentes para la preparación de ADN genómico. Todos comienzan
con alguna forma de lisis celular, seguida de desproteinización y recuperación de ADN. Las
principales diferencias entre varios enfoques radican en el grado de desproteinación y en el peso
molecular del ADN producido. Los factores que afectan los métodos de aislamiento de ADN son la
edad, la fuente y el tamaño de la muestra.
La presencia de proteínas, lípidos, polisacáridos, etc. durante la preparación del ADN puede
interferir con los métodos de análisis del ADN al reducir la calidad del ADN. Los métodos de
extracción para purificar eficientemente el ADN de diversas fuentes deben adaptarse según
factores como el tamaño de la muestra, la frescura de la muestra y el contenido bioquímico de las
células de las que se extrae el ADN. El método de aislamiento debe variar dependiendo del
tamaño de la muestra. La frescura de la muestra también afecta a la técnica de extracción. Los
métodos de extracción también varían según el contenido bioquímico de las células fuente. Por
ejemplo, en el caso de las bacterias, los principales bioquímicos presentes en un extracto celular
son las proteínas, el ADN y el ARN. Por lo tanto, la extracción con fenol o el tratamiento con
proteasa, seguido de la eliminación del ARN con ribonucleasa, deja una muestra de ADN
puro. Estos tratamientos pueden no ser suficientes si las células también contienen cantidades
significativas de otros bioquímicos. Los tejidos vegetales son particularmente difíciles a este
respecto, ya que a menudo contienen grandes cantidades de carbohidratos que no se eliminan
mediante la extracción con fenol.
molécula de adn
Las aletas de pescado son una fuente excelente y confiable de ADN de alta calidad con una serie
de ventajas. En la mayoría de los casos, el ADN se obtiene de la recolección de sangre del pez. En
el caso de especies raras o en peligro de extinción, este método no es recomendable. Por lo tanto,
el tejido de las aletas se usa a menudo para la extracción de ADN porque el muestreo es
relativamente rápido, logísticamente simple y no letal. Un pequeño trozo de tejido proporciona
una gran cantidad de ADN para PCR y resúmenes de restricción. Lo más importante es que la
recolección de muestras de aletas de pescado no daña a los peces. Esta es una consideración muy
importante, especialmente relevante con respecto a las especies raras y ornamentales. Las
muestras de aletas de pescado se utilizan para estudios basados en el ADN sobre diversidad
genética, sistemas de apareamiento y determinación de la paternidad de las poblaciones de peces
con una perturbación
mínima.
Principio:-
El aislamiento del ADN suele comenzar con la lisis de células o tejidos para destruir las
estructuras proteicas y permite la liberación de ácidos nucleicos del núcleo. La lisis se lleva a cabo
en una solución de lisis que contiene ingredientes importantes: cloruro de sodio que proporciona
un choque osmótico a las células; Tris HCl, que es un tampón para mantener un pH
constante; EDTA, que secuestra los iones metálicos divalentes necesarios para la actividad de la
nucleasa y, por lo tanto, inhibe su acción; un detergente, generalmente SDS, que rompe la
membrana celular y la envoltura nuclear, lo que hace que las células se abran y liberen su ADN. El
ADN todavía está muy apretado alrededor de las proteínas histonas.
A continuación, los ácidos nucleicos se purifican del complejo proteína-ácido nucleico mediante
extracción en fase con una mezcla de disolventes orgánicos, a saber, fenol, cloroformo y alcohol
isoamílico en una proporción de 25:24:1. El fenol disocia las proteínas del ADN. El cloroformo
desnaturaliza las proteínas y los lípidos y ayuda a mantener la separación de la fase orgánica y
acuosa. También hace que el ADN sea menos soluble en el fenol, reduciendo así las pérdidas a la
fase orgánica. A menudo se agrega alcohol isoamílico para evitar la formación de espuma. A pH 7-
8, el ADN se divide en la fase acuosa mientras que la proteína se desnaturaliza y se extrae en una
fase orgánica inmiscible en agua, que se separa de la fase acuosa que contiene ácido nucleico
mediante centrifugación. Cuando hay una gran cantidad de proteína presente, forma un
precipitado blanco entre la fase orgánica y la acuosa.
Luego, el ADN se precipita con etanol frío o isopropanol después de ajustar con acetato de sodio
3M y luego centrifugar. El ADN es insoluble en el alcohol y saldrá de la solución, y el alcohol sirve
como lavado para eliminar las sales residuales. Luego se elimina el alcohol y el ADN se almacena
en un tampón biológico, como el tampón TE (Tris-EDTA). El ARN contaminante en la muestra de
ADN puede eliminarse mediante digestión con una RNasa.
Sin embargo, dado que se generan fuerzas de cizallamiento en cada paso, las moléculas de ADN
resultantes en la preparación final rara vez superan los 100-150 kb de longitud. El ADN de este
tamaño es adecuado para análisis de Southern en geles de agarosa estándar, como molde en PCR
y para la construcción de bibliotecas de ADN genómico en vectores de bacteriófago λ.
Materiales necesarios:-
 Aletas de pescado.
 Bisturí.
 Pinzas.
 Mortero y majadero.
 Centrífugo.
 Viales.
 Micropipetas y puntas de pipeta.
 Baño de agua.
 Papel filtro / Papel secante.
Reactivos:
TrisCl 1 M (pH 8,0) - 2,5 ml.
EDTA 0,5 M (pH 8,0) - 50 ml.
ARNasa pancreática - 5 mg.
Proteniasa K - (Obligatorio).
Base Tris - 10mM.
EDTA - 1 mM.
 Tampón de extracción 200ML

 Tampón TE:
 Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamílico (50ml)- (25:24:1).
 Cloroformo: Alcohol isoamílico (50Ml) - (48:2).
 70%, 100% Etanol (Frío como hielo).
 Acetato de Sodio 3M.
Procedimiento:-
1. Arrancar 20-100 mg de aleta de pescado con un bisturí estéril y unas pinzas.

2. Homogeneizar las aletas en 600 μl de tampón de extracción utilizando un mortero
estéril.
3. Recoja la pasta en un tubo de microcentrífuga (MCT) de 1,5 ml.
4. Incubar a 37°C durante 1 hora en un baño de agua.
5. De nuevo incubar a 55°C durante 1 hora en el baño de agua.
6. Centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos.
7. Retire el sobrenadante, colóquelo en un MCT nuevo y agregue un volumen igual de
Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamílico (25:24:1). Mezcle lenta y completamente
invirtiendo repetidamente el MCT.
8. Centrifugar a 12000 rpm durante 10 minutos y recoger la capa acuosa superior en un
MCT nuevo. No perturbe la capa intermedia.
9. Agregar cloroformo: alcohol isoamílico en la proporción 24:1. Mezcle lenta y
completamente por inversión del tubo.
10. Centrifugar el tubo a 12000 rpm durante 10 minutos.
11. Recoja la capa acuosa en un MCT fresco y agregue 0,1 volúmenes de acetato de sodio
3M y un volumen igual de etanol enfriado con hielo (100%). Mezcle bien la solución
hasta obtener el sedimento de ADN. (Ahora puede ver los grupos de ADN en el tubo).
12. Incube el MCT a -20 °C durante 1 hora.
13. Sacar el tubo y centrifugar a 1000 rpm durante 10 minutos y decantar el sobrenadante
(Etanol).
14. Lavar el tubo con etanol al 70%, centrifugando a 1000 rpm durante 10 minutos y
decantar el etanol cuidadosamente sin perder el sedimento. (Si encuentra dificultad,
use una pipeta para retirar).
15. Seque al aire los gránulos de ADN a temperatura ambiente manteniendo el tubo
abierto y también seque con papel de filtro/papel secante.
16. Resuspender el precipitado en 50-100 μl de tampón TE o agua estéril triplemente
destilada.
17. Agregue 2,0 μl de RNasa a 100 μl de solución de ADN y luego mantenga la muestra a
37 °C durante 2 horas. (Para la purificación.)
18. Electroforesis de la muestra en gel de agarosa al 0,7%.
19. Estime la concentración de ADN a 260 nm. (DO a 260 nm correspondiente a 50 μg/ml
de ADN estándar doble). Concentración de la muestra = Factor de dilución X
Absorbancia.
20. Diluir el ADN para hacer la concentración entre 10-100 μ g/ml.
21. Utilice 1 μl de muestra de ADN para PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
22. Mantenga la muestra a -20 °C o liofilice la muestra con nitrógeno líquido.
CUESTIONARIO

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 Para aislar el ADN de las aletas de los peces.

El aislamiento de ADN es necesario para una variedad de aplicaciones en ciencia, medicina y

TrisCl 1 M (pH 8,0) - 2,5 ml.

EDTA 0,5 M (pH 8,0) - 50 ml.

ARNasa pancreática - 5 mg.

Base Tris - 10mM.

 Tampón de extracción 200ML

1. Arrancar 20-100 mg de aleta de pescado con un bisturí estéril y unas pinzas.

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