Técnica de Western Blot

También llamado inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica analítica

usada en biología celular y molecular, aunque no solamente para estos dominios
de la biología específicamente, sino también para la bioquímica, la biotecnología
o la inmunología. Esta técnica sirve para identificar proteínas específicas en una
mezcla compleja de proteínas, por ejemplo las que se presentan en extractos
celulares o tejidos. Western Blot consta de tres etapas, las cuales son las
siguientes: la separación por tamaño, la transferencia a un soporte sólido y, por
último, la visualización o detección mediante la marcación de proteínas con el
uso de anticuerpos, que pueden ser primarios o secundarios, pero que sean los
apropiados para el tipo de muestra con la que se esté llevando a cabo la muestra.

Pasos para realizar la Western Blot

1. Preparación de la muestra: para esto vamos a necesitar de una pequeña
cantidad de tejido o de un cultivo celular, este se introducirá en una solución
amortiguadora o en un tampón de extracción. Procedemos a homogenizarlos,
si es que se tratasen de volúmenes grandes de muestra, o centrifugarlos, si
se tratasen de volúmenes pequeños de muestra, sin embargo, no debemos
olvidar de que este proceso se debe realizar a bajas temperaturas (un
intervalo de -4°C hasta los -10°C, para que de esta manera se evite la
desnaturalización proteica. Después de esto, se ha de haber producido lo que
nosotros conocemos como “lisis celular”.

En el presente gráfico, podemos observar cómo es que se prepara la

muestra, aunque podemos objetar el hecho de que la centrifugación y la
homogenización no son los únicos métodos para favorecer la lisis celular. En
el gráfico se pueden apreciar el ácido clorhídrico, que es una solución de
cloruro de hidrógeno en medio acuoso; azul de bromo fenol, que es un
indicador de potencial de hidrogeniones o pH simplemente, un buffer o
amortiguador simple. Y es que claro, también podemos usar los detergentes,
las sales o tampones para favorecer la lisis celular y la solubilización de las
proteínas. En la última imagen podemos apreciar un tubito de ensayo,
después de haber hecho la centrifugación, vamos a observar básicamente el
pellet y el sobrenadante, las proteínas asociadas a la membrana quedarán
en el pellet; mientras que las solubles en el sobrenadante.
 Otra de las maneras en la podemos aislar las proteínas es por medio de
la electroforesis en gel. Se estarán preguntando ¿Qué es eso? La
electroforesis en gel es otra técnica, esta consiste en la separación de
moléculas en base a sus propiedades, como el tamaño, la forma o el punto
isoeléctrico. Ahora, en base a esas propiedades, vamos a separar a las
proteínas. Vamos a recalcar que la EEG más frecuente es conocida como
SDS-PAGE, del inglés sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis o como electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico. En esta se perderán las estructuras tanto secundaria
como terciaria de las proteínas, mas podrán separarse únicamente en función
de su tamaño.

2. Transferencia: Esta etapa se basa en la accesibilidad de las proteínas para

que sean detectadas por anticuerpos, es decir, lo que se busca en esta etapa
es hacer que las proteínas se vuelvan accesibles para su detección en la
última etapa. El resultado de la electroforesis en la etapa anterior se transfiere
desde el gel de poliacrilamida a una membrana nitrocelulosa o de PVDF
(fluoruro de polivinilideno) Esta transferencia se puede realizar por difusión,
por vacío o por acción de un campo eléctrico (electrotransferencia).
- Difusión simple: nosotros conocemos lo que es la difusión simple a través
de la membrana, sabemos que es un mecanismo de transporte activo, por
medio de canales. Bueno, en el Western Blot y para ser más específicos,
en la transferencia, lo que va a ocurrir es que se van a poner en contacto
tanto la superficie de gel electroforético de la membrana y un taco de
papeles de filtro. Este montaje se va a colocar sobre un tampón,
acuérdense que los tampones son soluciones acuosas amortiguadoras o
reguladoras, entonces lo que va a suceder es que este tampón va a
ascender por capilaridad hacia el papel de filtro y arrastrará consigo a las
proteínas.
- Transferencia al vacío: Lo vamos a relacionar con el transporte activo de
la membrana en cierto aspecto, ya que esta consta también de bombas.
En esta técnica, se añadirá lo que viene a ser el poder de succión de una
bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el cual
llevará las proteínas desde el gel hasta la superficie de la membrana de
nitrocelulosa.
- Electrotransferencia: Se basa en una corriente eléctrica y un tampón de
transferencia. Como podemos observar en este gráfico, observamos que
 los elementos están apilados del polo negativo o ánodo al polo positivo o
cátodo: Podemos observar el papel filtro, la membrana de nitrocelulosa, el
gel y el papel filtro nuevamente. Entonces, como había mencionado, al
hacer uso de la corriente, este sistema lleva las proteínas desde el gel
hacia la membrana (las proteínas quedan atrapadas en la membrana).
Cabe destacar que la electrotransferencia es la técnica de transferencia
más usada gracias a la velocidad con la que realiza la transferencia de
proteínas y por el porcentaje de proteínas que son transferidas.

3. Visualización y detección de proteínas: Previo a esta última etapa, cabe

destacar que la membrana que observamos después de la
electrotransferencia necesita poder unirse a las proteínas de forma
inespecífica, es por ello que se deben bloquear los lugares de unión que han
quedado libres tras la transferencia. Sino el anticuerpo (de naturaleza
proteica) empleado en la detección puede unirse a ellos, dificultando la
distinción del complejo antígeno – anticuerpo que se forma. Este proceso
previo a la detección de proteínas es conocido como bloqueo, y en bloqueo
se incuban a la membrana soluciones de proteínas, como la albúmina de
suero bovino, la ovoalbúmina, la caseína, etc. La visualización y detección
propiamente dichas comprueban la presencia de una determinada proteína en
la membrana. Para ello se emplea un anticuerpo específico unida a una
enzima que, en presencia de su sustrato, catalizará una reacción colorimétrica
(o sea, producirá color). De esta forma se hace patente (visible, latente es que
existe pero está oculto) la unión del antígeno con la proteína, así como su
localización. Los dos pasos de los que consta la detección son la unión de un
anticuerpo primario y la de un anticuerpo secundario.
- Anticuerpo primario: los anticuerpos son equivalentes a las
inmunoglobulinas, no se vayan a alarmar. En lo único en lo que difieren es
que el primer término hace referencia a la función (anti – cuerpo), mientras
que el término inmunoglobulina hace referencia a la estructura. Los
anticuerpo son producidos por nuestro sistema inmunitario en respuesta a
agentes dañinos a quienes nosotros conocemos como antígenos. Ahora,
en base a esta breve definición de anticuerpo, podemos decir que si
nosotros queremos buscar una proteína, debemos generar un anticuerpo
contra esa proteína. Esto se consigue inoculando esta proteína que
queremos buscar a un cultivo celular, aunque en laboratorio, muchas
veces se involucra a animales. Una vez nosotros introducimos ese
antígeno en el cultivo celular, se deberá desencadenar una respuesta
inmune cuyo resultado incluya la producción del anticuerpo, primario en
este caso, pero ¿por qué? Porque ya se conoce a la proteína.

- Anticuerpo secundario: Lo que vamos a hacer ahora es eliminar los

restos de anticuerpos primarios que no se han unido a la membrana y para
ello necesitamos lavar la membrana. Posterior al lavado, se expone al
anticuerpo secundario. Este anticuerpo va a reconocer de forma específica
la región concreta en donde se ha ubicado el anticuerpo primario. Este tipo
de inmunoglobulinas suelen estar marcadas para ser detectables, en unión
a la B8 o biotina, a una enzima reportera como la fosfatasa alcalina, etc.
Entonces varios de estos anticuerpos secundarios se unirán a cada
anticuerpo primario, amplificándose la señal y de esta manera,
reconociéndose la proteína.
Aplicaciones
1. Actualmente, la Western Blot es de las técnicas más usadas en el estudio de
la biología molecular.
2. Como prueba diagnóstica, ratifica la presencia del VIH, aunque por lo general,
acuérdense que el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA (ensayo
por inmunoabsorción ligado a enzimas). Es decir, si una persona presenta
VIH, para verificar que lo presenta se hace un análisis de sangre en donde se
estudia la presencia de justamente lo que hemos venido hablando: de
anticuerpos y antígenos. Si se da positivo por medio de la prueba de ELISA,
pero quieres gastar más dinero porque estás seguro que no tienes VIH,
entonces la prueba con mayor índice de veracidad será la de Western Blot.
3. En el caso del covid 19, por medio de la Western Blot es que a través del
componente sérico de la sangre es que se detecta la presencia de una
proteína de interés mediante la emisión de un anticuerpo o indicador
coloreado que interactúa con la proteína viral. Cabe mencionar que las
inmunocromatografías, lo que nosotros conocemos como pruebas rápidas,
son solo indicadores. Al igual que en el VIH, la Western Blot sirve como prueba
definitoria ya que es una prueba molecular.
4. En los casos clínicos veterinarios, al igual que en los humanos, servirá como
prueba definitiva tanto de la encefalopatía espongiforme bovina y la FIV en
gatos, la primera es conocida como enfermedad de las vacas locas y es que
básicamente ese son los signos de las vacas, se vuelven locas, el ganado
tiene un modo de andar anormal, hiperactividad, etc. La segunda se relaciona
con la presencia de VIH, pero en los felinos, es el virus de la inmunodeficiencia
felina. Este tipo de virus difiere de otros dos retrovirus felinos que por lo
general son inocuos, inofensivos, y es que este virus está más emparentado
con el VIH humano, pero no se alarmen, no es contagioso. Los gatos que
desarrollan el mismo cuadro de Sida en humanos por lo general no mueren
por enfermedades oportunistas como si ocurre con los humanos. Sin
embargo, sí son portadores y transmisores de la enfermedad por muchos
años.
Introducción y conclusión
Muy buenas tardes, profesor, compañeros e integrantes del grupo. ¿Cómo
están? Espero que bien. Es de mi agrado informarles que el día de hoy nos
encontramos aquí en pantalla para poder hablarles un poquito más acerca de un
tema que, no solo nos acompañará en biología, sino que tendrá múltiples
aplicaciones a lo largo de nuestra vida. Así es, ¿cómo es que lo adivinaron?
Vamos a hablarles sobre las herramientas moleculares. En esta ppt encontramos
el índice, en el orden en que se hablará, así como en esta ppt se encuentran los
integrantes de este maravilloso grupo. Bienvenidos sean los compañeros… y
quien les habla, les narra, les explica y les comenta: Jesús Zegarra. Entonces,
muchachos, sin más que decir, procedo a cederle la palabra a mi compañero
Andrés Zevallos, quien les comentará acerca de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).