Unidad 5: Protocolos de

identificación
5.1 Los protocolos de identificación
El tipo de muestra y la solicitud que la acompaña determinan los procedimientos de
identificación que se deben aplicar. Estas son:

֍ Tinción de Gram: permite diferenciar si la bacteria es grampositiva o gramnegativa, y

permite observar su morfología, cocos, bacilos, agrupaciones, etc.
֍ Cultivo: según el resultado de la tinción, observación, y el tipo de muestra, se utilizan
unos u otros medios de cultivo, a se aplican distintas condiciones de cultivo, como la
temperatura.
֍ Observación de colonias: permite conocer la forma, color, textura y otras
características de las bacterias.
֍ Pruebas bioquímicas: dependiendo de las características de las bacterias se realizan
unas u otras pruebas bioquímicas para su identificación.

5.2 Cocos grampositivos y gramnegativos

5.2.1 Cocos grampositivos
Existen 3 géneros de interés clínico, todos ellos anaerobios facultativos.

֍ Staphylococcus
֍ Streptococcus
֍ Enterococcus

Staphylococcus spp.
Son los únicos cocos grampositivos que también son catalasa positivos. Son los cocos más
virulentos, responsables de un gran número de enfermedades. Se agrupan en racimos.

Entre los Staphylococcus destaca el S. aureus, la especie más virulenta. Es coagulasa positiva,
mientras que el resto de Staphylococcus son coagulasa negativa. Es capaz de crecer en medios
de hasta un 10% de NaCl, por lo que en el medio manitol salado es capaz de crecer, pero el
resto de Staphylococcus no. El S. aureus resistente a la meticilina (SARM) es resistente a la
penicilina y meticilina. Otra cepa denominada SARV, ha desarrollado resistencia a la
vancomicina.

Streptococcus spp.
Son cocos grampositivos catalasa negativos. Requieren medios enriquecidos con sangre o
suero. La prueba de las hemolisinas permite identificar el tipo de hemolisis que produce la
bacteria, lo cual permite clasificarlos en 3 grupos:

Alfa-hemolíticos
Se utilizan 2 pruebas para distinguir el Streptococcus pneumoniae de otros Streptococcus alfa-
hemolíticos.

֍ Prueba de solubilidad en bilis: S. pneumoniae es soluble en bilis, mientras que el resto

de Streptococcus no.
֍ Prueba de la sensibilidad a la optoquina: la optoquina inhibe el crecimiento de S.
pneumoniae.

Beta-hemolíticos
La prueba de CAMP se utiliza para la identificación de Streptococcus beta-hemolíticos. Existen
2 grupos de Streptococcus beta-hemolíticos:

֍ Streptococcus del grupo A: el más característico es Streptococcus pyogenes. Para

diferenciarlos de otros Streptococcus, se realiza la prueba de sensibilidad a bacitracina,
puesto que son sensibles a muy bajas concentraciones.
֍ Streptococcus del grupo B: el más característico de este grupo es Streptococcus
agalactiae.

No hemolíticos
Pueden actuar como patógenos oportunistas.

Enterococcus spp.
Son cocos grampositivos, catalasa negativos y oxidasa negativos, que en cultivos en agar con
sangre producen gamma-hemolisis.

Causan importantes infecciones urinarias, bacteriemias, endocarditis, diverticulitis y

meningitis. Tienen un alto nivel de resistencia a antibióticos. Las especies más importantes son
E. faecalis y E. faecium.

5.2.2 Cocos gramnegativos

Los más habituales son del género Neisseria y Kingella, que es de baja patogenicidad, pero que
puede causar casos clínicos graves. La especie de mayor interés es Kingella kingae.

Las Neisseria tienen una forma característica de granos de café (diplococos). Son oxidasa
positivas, y catalasa positivas. Las especies de interés clínico son:

֍ Meningitidis: provoca meningitis, neumonía y pericarditis.

֍ N. gonorrhoeae: provoca gonorrea y oftalmía neonatal.

Si se observa la presencia de diplococos gramnegativos se siembra:

֍ En agar sangre y/o agar chocolate. Las especies no patógenas de Neisseria crecerán,
mientras que las patógenas no crecerán.
֍ En medio Thayer-Martin. Las especies patógenas crecerán, mientras que las no
patógenas no crecerán.

Las colonias de N. meningitidis y N. gonorrhoeae en el medio Thayer-Martin se ven grisáceas.

Tras 48 horas se transforman en colonias mucoides.
N. meningitidis puede usar glucosa, lactosa y maltosa, mientras que N. gonorrhoeae puede
usar glucosa y maltosa pero no lactosa. La prueba de fermentación de azúcares permite
diferenciar ambas especies.

5.3 Bacilos grampositivos

5.3.1 Bacilos grampositivos esporulados
Bacillus spp.
Son bacilos grandes y la mayoría tienen flagelos. El género incluye especies aerobias y
anaerobias facultativas. En condiciones adversas forman endosporas. Algunas forman parte de
la flora y suelen ser contaminantes de laboratorio. Algunas especies relevantes son:

֍ B. anthracis: causa del ántrax respiratorio e intestinal. No tiene flagelos y es sensible a

la penicilina.
֍ B. cereus: provoca intoxicaciones alimentarias. Es móvil y resistente a la penicilina.

5.3.2 Bacilos grampositivos no esporulados

Listeria spp.
Son bacilococos que no forman esporas ni tienen capsula. Tienen entre 1 y 5 flagelos perítricos
que se inactivan a 37ºC. son catalasa positivos y fermentan azúcares. Son anaerobios
facultativos. No son exigentes e hidrolizan esculina. Sólo una especie es patógena para los
humanos, la L. monocytogenes. La siembra en el medio selectivo agar cromogénico Listeria
pone en evidencia su presencia porque el medio vira a azul alrededor de las colonias por la
acción de la β-glucosidasa, una enzima que sintetizan todas las especies de Listeria. Los
enterococos también sintetizan esta enzima, pero el medio contiene inhibidores de
enterococos. Las colonias de L. monocytogenes presentan un halo de opalescencia, que las
diferencia de otras especies de Listeria. El halo se puede producir gracias a la lipasa-C.

Nocardia spp.
Son bacilos de forma filamentosa, que no tienen movilidad ni forman esporas. Son bacterias
estrictamente aerobias y se pueden desarrollar en un amplio rango de temperaturas. Son
catalasa positivas y pueden crecer en los medios de cultivo más comunes. Son de crecimiento
lento, por lo que a veces es necesario prolongar la incubación algunas semanas. Sólo son
clínicamente significativas en infecciones oportunistas en pacientes inmunodeprimidos.

Campylobacter spp.
Son bacilos rectos o ligeramente curvados, que se observan en forma de letras chinas en la
tinción de Gram, pero pueden adaptar otras formas. No forman esporas y no tienen movilidad.
Son aerobios o anaerobios facultativos, y catalasa positivos. La especie más destacada como
patógeno es C. diphtheriae, el agente causante de la difteria por la secreción de la toxina
diftérica. El gen tox, que codifica esta toxina se introduce en las cepas de C. diphtheriae
mediante un bacteriófago.

5.4 Bacilos gramnegativos

5.4.1 Enterobacterias
Las enterobacterias forman parte de la microbiota intestinal. Algunas especies pueden vivir en
tierra, plantas o en animales acuáticos.

Las enterobacterias pueden contaminar alimentos cuando no se mantiene una higiene

personal adecuada por parte de los manipuladores. Es importante tener en cuenta que algunas
enterobacterias producen toxinas, responsables de los cuadros clínicos. Es posible eliminar la
bacteria de un alimento contaminado, pero puede permanecer la toxina en este y causar así la
enfermedad.

La identificación
Son bacilos gramnegativos y oxidasa negativos. A excepción de Shigella y Klebsiella las demás
poseen flagelos, y a excepción de E. coli y Klebsiella pneumoniae, no presentan cápsula.

Para su determinación se deben hacer pruebas para ver el o los tipos de carbohidratos que
fermenta cada especie. Se deben sembrar en un medio Kligler o TSI, que permiten la
identificación de los carbohidratos que fermenta cada bacteria, y permiten una determinación
presuntiva.

Después, se deben realizar las pruebas IMVIC (indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y
utilización de citrato), que permiten definir otras características identificativas de los distintos
géneros y especies.

Para muchos patógenos existen pruebas rápidas de identificación, que detectan

cualitativamente la presencia de los antígenos bacterianos. Un ejemplo es la prueba serológica
de la Salmonella spp. Además, las enterobacterias se pueden identificar de manera rápida y
fiable con el equipo MALDI-TOF.

Hay varios antígenos que se utilizan en las pruebas de identificación de enterobacterias:

֍ Antígeno O: es somático y se encuentra en la pared celular.

֍ Antígeno K: se localiza en la capsula de las bacterias encapsuladas.
֍ Antígeno Vi: es un polisacárido que rodea a la bacteria. Es característico de algunas
especies de Salmonella.
֍ Antígeno H: se localiza en los flagelos.
֍ Antígeno F: se localiza en las fimbrias.

5.4.2 Bacilos gramnegativos no fermentadores (BGNNF)

Tienen forma de bacilo, aunque algunos son bacilococos. No forman esporas y pueden ser
inmóviles o móviles (con flagelos). Son aerobios estrictos, no utilizan hidratos de carbono
como fuente de energía, o bien los degradan a través de vías metabólicas distintas de la
fermentación, sin formación de gas. Crecen abundantemente en las primeras 24 horas sobre
TSI o Kligler.

No producen enfermedades en personas sanas, pero pueden provocar infecciones

oportunistas en pacientes inmunodeprimidos.

Identificación
Los BGNNF aislados con mayor frecuencia son Pseudomonas aeruginosa y distintas especies de
Acinobacter.

Para ambas especies , la observación del cultivo y las pruebas rápidas permiten llegar a un
diagnostico presuntivo, que se debe confirmar mediante pruebas inmunológicas o
moleculares.

֍ Pseudomonas aeruginosa: el cultivo en agar Cetrimida presenta brillo nacarado, olor

característico a uvas y pigmentación amarillo-verdosa bajo luz fluorescente.
Al microscopio se observan bacilos gramnegativos y móviles, con un flagelo polar. Se
obtienen resultados positivos a las pruebas de catalasa y oxidasa.
֍ Acinetobacter spp.: se observan bacilococos gramnegativos inmóviles. En las pruebas
se obtiene catalasa positivo y oxidasa negativo.

Para completar la identificación se puede utilizar MALDI-TOF y sistemas de identificación

comerciales.

5.4.3 Bacilos gramnegativos exigentes

Son bacterias que crecen con dificultad o que no crecen en los medios comunes, como agar
sangre, agar chocolate, agar MacConkey o agar Cled, y que necesitan suplementos nutritivos.
Se utiliza el sistema MALDI-TOF y los sistemas de identificación comerciales o métodos
moleculares rápidos para su identificación.

Haemophillus spp.
Son bacilos inmóviles, gramnegativos, anaerobios facultativos y oxidasa positivos. Para su
crecimiento requieren uno o 2 factores presentes en la sangre, el factor X y el factor V.

El factor V se puede adicionar al medio o puede proceder de otro microorganismo, en cuyo

caso se produce un crecimiento de Haempophilus spp. alrededor de las colonias que
proporcionan el factor V. Esto se denomina satelitismo.

Los Haemophilus spp. forman parte de la flora normal de las mucosas del aparato respiratorio
superior.

֍ H. influenzae:
 Encapsulado: meningitis, epiglotitis, celulitis asociada a bacteriemia, artritis
séptica y neumonía.
 No encapsulado: otitis media, sinusitis, conjuntivitis y bronquitis crónica.
֍ H. parainfluenzae: bacteriemia, endocarditis e infecciones oportunistas.
֍ H. ducreyi: cancroide (ETS)

Bordetella spp.
Son bacilococos gramnegativos capsulados e inmóviles que se presentan solos o en parejas y
rara vez en cadenas. Son aerobios estrictos y no forman esporas. Hay 3 especies patógenas:

֍ Bordetella pertussis: es el agente causante de la tos ferina.

֍ Bordetella parapertussis: causa una variante más leve de la tos ferina.
֍ Bordetella bronchiseptica: provoca enfermedades respiratorias en animales, y
bronconeumonía en humanos.
Brucella spp.
Son bacilos gramnegativos aerobios pequeños, inmóviles, no esporulados que pueden tener
cápsula. Hay 3 especies capaces de producir zoonosis en seres humanos: B. abortus, B.
melitensis y B. suis.

Una de las pruebas de reactividad ante anticuerpos es una prueba rápida de aglutinación en
placa, que pone en contacto el suero del paciente con una suspensión de bacterias teñidas con
rosa de Bengala. Esto permite detectar en el suero del paciente anticuerpos específicos contra
Brucella.

Campylobacter spp.
Suelen tener forma de espiral o curva. Tienen un flagelo polar, no forman esporas y no
presentan cápsula. Son oxidasa y catalasa positivas.

Son la principal causa de enfermedades diarreicas de transmisión alimentaria y de

gastroenteritis. Algunas de las especies patógenas son C. jejuni y C. coli. Para detectar su
presencia se utiliza la prueba de la hidrolisis del hipurato.

Helicobacter spp.
Son bacilos gramnegativos, que tienen movilidad mediante flagelos. El número y disposición de
los flagelos es identificativo de cada especie. Son de crecimiento lento. Son catalasa positivas.

La especie de mayor interés clínico es H. pylori, que se localiza en la mucosa gástrica y provoca
gastritis y úlceras pépticas. La muestra más habitual para el cultivo es la biopsia a partir de
mucosa gástrica. La siembra se realiza en medios generales, y en algún medio selectivo. Existen
diversas pruebas para detectar antígenos de H. pylori, que proporcionan un diagnóstico
definitivo.

Legionella spp.
Son bacilos gramnegativos móviles. Son bacterias aerobias obligadas y nutricionalmente
exigentes. Requiere medios de cultivo con L-cisteína y hierro. Bioquímicamente son
relativamente inertes, no son fermentadoras. Son catalasa positiva y oxidasa variable.

El género más importante es Legionella pneumophila, responsable de la legionelosis. Este

género tiene 16 serogrupos. L. pneumophila se puede aislar en el tracto respiratorio. Se
siembra en dos medios, BCYE α y BMPA.

5.4.4 Otros bacilos gramnegativos

Vibrio, Aeromonas y Pleisomonas tienen unas características en común. No forman parte de la
microbiota gastrointestinal, por lo que su detección indica una situación patológica. Son
aerobios facultativos, móviles, pueden desarrollarse en temperaturas de 20ºC a 30ºC, en un
pH de 5’5 a 9 y requieren una baja concentración de NaCl, puesto que son halófilas.

Las especies de Vibrio clínicamente importantes son:

֍ V. chlorae: causa el cólera.

֍ V. vulnificus: provoca bacteriemia, infección de heridas y celulitis.
֍ V. parahaemolyticus: provoca gastroenteritis, infección de heridas y bacteriemia.
En cuanto a Aeromonas spp., los patógenos más destacados son A. hydrophila y A. veronii.
Estos microorganismos provocan gastroenteritis e infección de heridas.

Pleisomonas shigelloides causa gastroenteritis, y en pacientes inmunodeprimidos septicemia.

La identificación de estos géneros no es sencilla, ya que tienen muchas características

comunes. La diferenciación entre Vibrio spp. y Aeromonas spp. es más complicada, puesto que
hay muchas similitudes entre ambas especies.

5.5 Rickettsias, clamidias y micoplasmas

Las rickettsias y clamidias se consideran bacterias gramnegativas, aunque no se tiñen bien con
la tinción de Gram. son parásitos intracelulares obligados, por lo que no se pueden cultivar en
los medios habituales.

5.5.1 Rickettsias
Causan zoonosis y los seres humanos son hospedadores fortuitos. El diagnostico presuntivo se
realiza mediante la observación de bacterias compatibles con Rickettsia spp. en tejidos o
sangre. Para la tinción se utilizan:

֍ Coloración de Maquiavelo: las bacterias se ven de color rojo brillante sobre un fondo
azul.
֍ Coloración de Castañeda: las bacterias se ven azules sobre un fondo rojo.
֍ Coloración de Giemsa: colorea a las bacterias de color violeta azulado.

La posterior confirmación se realiza mediante técnicas inmunológicas o moleculares.

5.5.2 Clamidias
Son bacterias gramnegativas, que se agrupan en cadenas. Presentan dos morfologías distintas
según la etapa de su ciclo vital, el cuerpo elemental, que es la forma infecciosa, y el cuerpo
reticulado, que es la forma replicativa.

Cuando el cultivo es necesario debe hacerse en cultivos celulares. Las especies patógenas son
C. trachomatis, C. pneumoniae, C. piscatti y C. pecorum.

El diagnóstico se basa en analizar las muestras de los exudados que provoca la enfermedad. La
observación de cuerpos de inclusión en las células permite un diagnóstico presuntivo, y la
confirmación se realiza mediante ELISA y PCR.

5.5.3 Micoplasmas
Los micoplasmas son bacterias que carecen de pared celular, lo cual les hace los resistentes a
los antibióticos que actúan bloqueando la síntesis de la pared celular, como los betalactámicos.
Forman parte de la microbiota. Entre las especies patógenas se encuentra M. pneumoniae. Son
contaminantes habituales de cultivos celulares.

5.6 Micobacterias
Presentan una pared celular muy gruesa, hidrofóbica, cerosa y rica en ácidos micólicos, que les
proporciona resistencia. Son BAAR, y se utilizan las tinciones de Ziehl-Neelsen y auramina-
rodamina para su identificación.

Son inmóviles, no forman esporas y no tienen cápsula. Son aerobias estrictas, y se debe tener
precauciones extras en el laboratorio.

5.6.1 Clasificación
Complejo tuberculoso
Son capaces de provocar tuberculosis M. tuberculosis, M. bovis y M. africanum.

El diagnóstico de la tuberculosis se puede realizar a partir de la sintomatología y de una serie

de pruebas clínicas. El aislamiento de la bacteria permite conseguir un diagnóstico definitivo y
poder realizar antibiogramas que permitan aplicar un tratamiento efectivo.

La identificación del microorganismo se realiza a partir de pruebas bioquímicas, como niacina,

nitratos y catalasa, pero la identificación de la especie es complicada, por lo que sólo se
identifica la especie en situaciones concretas. Una prueba especifica es la prueba de la
tuberculina.

Lepra o enfermedad de Hansen

La lepra se puede manifestar con distintos cuadros clínicos, que siguen una gradación. La lepra
tuberculoide (LT) presenta lesiones localizadas, y la lepra lepromatosa (LL) presenta lesiones
generalizadas. El causante es la M. leprae, que es un parásito intracelular obligado, por lo que
no se puede cultivar en los medios habituales. El diagnóstico se basa en el cuadro clínico y en
la detección de BAAR en las muestras obtenidas de las lesiones.

Otras micobacteriosis
Existen micobacteriosis atípicas, no tuberculosas (MNT), ambientales u oportunistas.

5.6.2 Tratamiento de las muestras

La detección de micobacterias al microscopio y su aislamiento para siembra son complicados
debido a la baja concentración en que se encuentran en algunas muestras. Hay dos tipos de
tratamiento, la concentración y la descontaminación.

Concentración de las muestras

Mejora la detección durante el examen microscópico y el aislamiento para el cultivo. En el caso
de fluidos corporales estériles, que tienen pequeñas concentraciones, es necesario
concentrarlos al máximo por centrifugación antes de sembrar.

Descontaminación de las muestras

Se aplica cuando existe la sospecha de que la muestra está contaminada. La descontaminación
debería eliminar los agentes contaminantes sin afectar la viabilidad de las micobacterias,
aunque todos los métodos son tóxicos en algún grado para las micobacterias.
Si las muestras contienen mocos es necesario realizar la homogeneización de las muestras
antes de descontaminar, puesto que el moco actúa como barrera protectora contra los
agentes contaminantes.

5.6.3 Identificación
El diagnóstico en el laboratorio se basa en las tinciones y el estudio al microscopio para
detectar BAAR. La interpretación de los resultados se realiza según el número de BAAR
observados.

El aislamiento posterior es necesario para poder realizar el antibiograma. También existen

distintos sistemas automáticos que permiten detectar micobacterias.

5.7 Bacterias anaerobias

5.7.1 Principales bacterias anaerobias
Clostridium spp.
Son bacilos grampositivos anaerobios estrictos, capaces de formar endosporas. Forman parte
de la microbiota, pero algunas especies son patógenas:

֍ C. tetani, que causa el tétanos

֍ C. botulinum, que causa botulismo
֍ C. perfringens, que causa desde un cuadro digestivo diarreico hasta una gangrena
gaseosa
֍ C. septicum, que causa gangrena gaseosa
֍ C. difficile, que causa un cuadro digestivo diarreico

5.7.2 Tratamiento de las muestras

Se aplica un protocolo preanalítico en el que se verifican las condiciones de conservación y
transporte, se revisa la información que acompaña a cada muestra, y si todo es correcto se
acepta la muestra y se registra.

Se deben realizar unos controles especiales a las muestras a las que se debe efectuar un
estudio de anaerobios.

Se utiliza un agar para el aislamiento no selectivo de anaerobios y un agar selectivo. La

incubación se realiza en cámaras de incubación, en jarras de anaerobiosis y en sistemas de
bolsas de anaerobiosis.

5.7.3 Identificación
Tinción y observación microscópica
֍ Si observamos bacilos pleomórficos teñidos débilmente con tinción de Gram
sospecharemos de Bacteroides fragilis.
֍ Si observamos bacilos gramnegativos finos y fusiformes sospecharemos de
Fusobacterium spp.
֍ Si observamos bacilos grampositivos gruesos, de forma rectangular y sin esporas
sospecharemos de Clostridium perfringens.
֍ Si observamos bacilos grampositivos ramificados sospecharemos de Actinomyces spp.