Unidad 4: Bacteriología: técnicas de

identificación y antibiogramas
4.2 Pruebas bioquímicas de identificación
Las pruebas bioquímicas permiten determinar características metabólicas de la bacteria.

Aspectos del metabolismo Pruebas bioquímicas Lectura

bacteriano que se valoran
Enzimas vinculadas a la Catalasa Inmediata
respiración Oxidasa Inmediata
Estudio de las vías metabólicas Óxido-Fermentación (OF) 18-48 h
Β-galactosidasa (ONPG) <6h
Voges Proskauer 18-48 h
Rojo de metilo 18-48 h
Prueba de fermentación de azúcares 18-48 h
Prueba del agar hierro de Kligler 18-48 h
Prueba TSI 18-48 h
Estudio de la utilización de Prueba de utilización de citrato 18-48 h
compuestos Prueba de utilización de malonato 18-48 h
Prueba de reducción de nitratos 18-48 h
Estudio de la degradación y Prueba de la hidrólisis del hipurato <6h
síntesis de compuestos Prueba de la hidrólisis de la esculina 18-48 h
Prueba de CAMP 18-48 h
Estudio de la capacidad de Indol <6h
degradación de aminoácidos Ureasa <6h
Descarboxilasas (LDC y ODC) 18-48 h
Fenilalalina-desaminasa 18-48 h
Detección de exoenzimas Prueba de la leucinoaminopeptidasa (LAP) <6h
Prueba de la pirrolidonil arilamidasa (PYR) <6h
Prueba de la coagulasa <6h
Prueba de la DNAsa 18-48 h
Prueba de las hemolisinas 18-48 h
Determinación de otras exoenzimas 18-48 h
Pruebas de sensibilidad Prueba de sensibilidad a optoquina 18-48 h
Prueba de sensibilidad a bacitracina 18-48 h
Prueba de sensibilidad en bilis 18-48 h
Prueba de crecimiento en caldo hipersalino 18-48 h

El metabolismo bacteriano se define como el conjunto de procesos por los cuales un

microorganismo obtiene la energía y los nutrientes que necesita para vivir y reproducirse.

Hay dos métodos de identificación bacteriana:

֍ Métodos fenotípicos
 Morfotipo y afinidad tintorial
 Características del cultivo
  Pruebas bioquímicas
֍ Métodos genotípicos
 Hibridación de ácidos nucleicos
 PCR
 Secuenciación

4.2.1 Valoración de enzimas vinculadas a la respiración

Prueba de la catalasa
Consiste en añadir peróxido de hidrógeno a una colonia bacteriana y observar si se forman
burbujas. Las bacterias catalasa positivas son Staphylococcus spp. y Micrococcus spp. Las
catalasa negativas son Streptococcus spp.

Prueba de la oxidasa
Consiste en añadir citocromooxidasa, que en presencia de oxígeno oxida la fenilendiamina y
observar si se produce un cambio de color. Las bacterias oxidasa positivas son Pseudomonas
spp., Neisseria spp., y Campylobacter spp. Las bacterias oxidasa negativas son
Enterobacteriaceae.

4.2.2 Estudio de las vías metabólicas

Prueba de oxidación-fermentación o de Hugh-Leifson (O/F)
Permite identificar un metabolismo oxidativo o fermentativo. Consiste en añadir un indicador,
el azul de bromotimol. Uno de los dos tubos debe estar sellado. La vía fermentativa produce
una acidificación del medio, mientras que la oxidativa no modifica el pH. Si se produce un falso
negativo se debe repetir.

֍ Tubo sin cubrir amarillo y tubo cubierto verde: sólo se ha producido oxidación (aerobia
facultativa).
֍ Ambos tubos amarillos: se ha producido oxidación y fermentación (aerobia
facultativa).
֍ Tubo sin cubrir verde y tubo cubierto amarillo: sólo se ha producido fermentación
(anaerobia estricta).

Prueba de la ONPG
Permite saber si la bacteria es capaz de fermentar la lactosa. Consiste en añadir ONPG y ver si
cambia de color. Si el medio es de color amarillo es beta-galactosidasa positiva, y si el medio es
incoloro es beta-galactosidasa negativa.

Prueba de Voges Proskauer

Determina la capacidad de una bacteria de fermentar la glucosa por vía butanodiólica. Se
añade alfa-naftol, que reacciona con un producto intermedio, la acetoína. Si el medio de color
es rojo/rosado es acetoína positiva, y si es amarillo es acetoína negativa.

Prueba del rojo de metilo

Determina la capacidad de una bacteria de fermentarla glucosa por la vía de ácido mixta. Para
detectarlo se añade un indicador, el rojo de metilo. Si el medio de color es rojizo es positiva, y
si el medio es de color amarillo es negativa.

Prueba de fermentación de azúcares

Es equivalente a la prueba de rojo de metilo, pero se puede aplicar para cualquier
carbohidrato. El indicador que contiene es el violeta de bromocresol.

֍ Medio amarillo y con gas en la campana es positivo con formación de gas.

֍ Medio amarillo y sin gas en la campana es positivo sin formación de gas.
֍ Medio violeta es negativo

Prueba del agar hierro de Kligler

Se utiliza para la diferenciación de enterobacterias y determina la capacidad de un
microorganismo de metabolizar glucosa y lactosa, la producción o no de gas y la producción de
ácido sulfhídrico.

֍ Pico rojo y fondo amarillo: sólo fermenta glucosa.

֍ Pico amarillo y fondo amarillo: fermenta glucosa y lactosa.
֍ Pico rojo y fondo rojo: no fermenta azúcares.
֍ Ennegrecimiento del medio: produce ácido sulfhídrico.

Prueba TSI
Es igual que la prueba del agar hierro de Kligler.

֍ Pico rojo y fondo amarillo: sólo fermenta glucosa.

֍ Pico amarillo y fondo amarillo: fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
֍ Pico rojo y fondo rojo: no fermenta azúcares.

4.2.3 Estudio de la utilización de compuestos

Prueba de utilización de citrato
Determina si una bacteria es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y
compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo. El indicador de
pH es el azul de bromotimol. Si el color es azul es citrato positiva y si no hay cambio de color
(verde) es citrato negativa. Si el medio se ve verde pero se observa un crecimiento bacteriano
en la superficie el resultado es positivo. Se hace en agar inclinado.

Prueba de utilización de malonato

Determina si una bacteria usa el malonato de sodio como única fuente de carbono. El
indicador de pH es el azul de bromotimol. Si el medio es de color azul es malonato positiva y si
no hay cambio de color es malonato negativa.

Prueba de reducción de nitratos

Permite identificar el tipo de respiración anaerobia que tienen las bacterias. Se necesitan
soluciones A y B del reactivo de Griess y de polvo de zinc para revelar los resultados.
Se añaden al tubo 2 gotas de la solución A y luego gotas de la solución B. Si la coloración es
rojiza es una reducción de nitratos positiva. Si no hay cambio de color se añade polvo de zinc.
Si la coloración es rosada/roja es nitrato negativo, y si no hay cambio de color es nitrato
positiva.

4.2.4 Estudio de la degradación y síntesis de compuestos

Prueba de la hidrólisis del hipurato
Permite la identificación de Campylobacter spp. entre otros. Determina si la bacteria sintetiza
la enzima hipuricasa. Si el medio es de color violeta intenso es hipuricasa positiva, y si no ha
habido cambio de color es hipuricasa negativa.

Prueba de la hidrólisis de la esculina

Permite la identificación presuntiva de estreptococos del grupo D. Determina si la bacteria
hidroliza la esculina. Si el medio se oscurece es esculina positiva, y si no se oscurece es esculina
negativa.

Prueba de CAMP
Se utiliza para determinar la capacidad de una bacteria de producir el factor CAMP, y permite
la identificación de estreptococos beta-hemolíticos. Si se forma una punta de flecha es
positiva, y si hay ausencia de punta de flecha es negativa.

4.2.5 Estudio de la capacidad de degradación de aminoácidos

Prueba del indol
Permite determinar si una bacteria es capaz de degradar el indol. Para ello se utiliza el reactivo
de Kovac, dando lugar a un color rosa intenso. Si presenta una banda de color rosa
intenso/violeta es indol positiva, y si el medio es amarillo es indol negativa.

Prueba de la ureasa
La ureasa es una enzima que degrada la urea, y mediante este proceso se alcaliniza el medio.
Para detectar la reacción se utiliza un indicador de pH que vira a rosa intenso cuando el pH
aumenta. Si el medio es de color fucsia es ureasa positiva, y si el medio no cambia de color
(amarillento) es ureasa negativa.

Prueba de las descarboxilasas

Determina si la bacteria sintetiza descarboxilasas. La detección de la reacción se produce a
partir de los cambios de pH, por lo que necesita dos indicadores, uno para ácido y otro para
base.

֍ El medio ha virado a amarillo y luego a violeta: descarboxilasa positiva

֍ El medio es de color amarillento: descarboxilasa negativa. Se ha producido
fermentación de la glucosa, pero no descarboxilación.

Prueba de la fenilalanina desaminasa

La fenilalanina desaminasa es una enzima que desamina la fenilalanina, produciendo ácido
fenil-pirúvico. El indicador es un quelante del ácido fenil-pirúvico, formando un complejo de
color verde. Si el color es verde pálido a intenso en el pico de flauta y en el líquido de
condensación es positiva. Si no hay cambio de color es negativa.

4.2.6 Detección de exoenzimas

Prueba de leucinoaminopeptidasa (LAP)
Se utiliza en cocos grampositivos catalasa negativa. Si el color es rosado/rojo es positiva, y si es
amarillento es negativa.

Prueba de la pirrolidonil arilamidasa (PYR)

Se utiliza para la identificación de Streptococcus pyogenes y enterococos. Si el color es
rosado/rojo es positiva, y si es amarillento es negativa.

Prueba de la coagulasa
La coagulasa es una enzima que convierte el fibrinógeno en fibrina. Se utiliza para diferenciar
Staphylococcus aureus (coagulasa positiva) de otros Staphylococcus (coagulasa negativa). Si se
observa un coágulo es coagulasa positiva, y si no hay coágulo visible es coagulasa negativa.

Prueba de la DNAsa
Se utiliza para la identificación de Staphylococcus.

Prueba de las hemolisinas

Se utiliza en medios que contienen sangre. La hemolisis alfa y beta indica hemolisis. Negativo a
hemolisis no tiene cambios en el agar.

4.2.7 Pruebas de sensibilidad

Prueba de sensibilidad a optoquinona
Inhibe el crecimiento de Streptococcus pneumoniae.

Prueba de sensibilidad en bilis

Sirve para diferenciar Streptococcus pneumoniae.