Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas

Facultad de Ciencias Agropecuarias

OBTENCIÓN DE ACTINOMICETOS

MARINOS CON ACCIÓN PROBIÓTICA

EN OSTIONES Y CAMARONES

Tesis presentada en opción al grado científico de

Doctor en Ciencias Veterinarias

Autora: Lic. Milagro R. García Bernal, MSc.

Santa Clara, Cuba

2016
 Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas
Facultad de Ciencias Agropecuarias

OBTENCIÓN DE ACTINOMICETOS MARINOS CON

ACCIÓN PROBIÓTICA EN OSTIONES Y CAMARONES

Tesis presentada en opción al grado científico de

Doctor en Ciencias Veterinarias

Autora: Lic. Milagro R. García Bernal, MSc.

Tutores: Dr. C. José Manuel Mazón-Suástegui

Dr. Cs. Manuel Valdivié Navarro

Santa Clara, Cuba

2016
“Para empezar un gran proyecto, hace falta valentía. Para
terminar un gran proyecto, hace falta perseverancia”.
(Autor anónimo).
 El presente trabajo de tesis doctoral fue financiado por:

Proyecto Institucional del Centro de Bioactivos Químicos. Búsqueda de nuevas cepas de

actinomicetos productoras de antibióticos.

Proyecto Internacional. Fundación Internacional para la Ciencia (IFS). The search for new
antibiotic producing strains from Cuban Actinomycetes , Suecia.

Becas para realizar investigaciones pre-doctorales de la Secretaría de Relaciones Exteriores de

México.

Proyecto Internacional. CB sep-conacyt Ciencia Básica 258282. México. Evaluación

experimental de homeopatía y nuevos probióticos en el cultivo de moluscos,
crustáceos y peces de interés comercial.

Proyecto Internacional. CONACyT-PROINNOVA 221894. México. Innovación y

mejora continua de productos y procesos para optimizar la producción de semilla de
ostión (C. virginica) en laboratorio.
 Dedicatoria

A mis hijos, por ser la razón de mi vida, sin ellos la fuerza de levantarme cada día para ser

mejor persona no sería una realidad, gracias Ricardito y Eli por existir.

A Ricardo, por estar presente incondicionalmente en los momentos más difíciles, haber hecho

de ellos mejores momentos, y por hacer de estos, momentos inolvidables. Ahora puedo decir

que esta tesis lleva mucho de ti, gracias por estar siempre a mi lado.

A mis padres quienes me apoyaron todo el tiempo, por su paciencia, por su ayuda constante,

y por todo su amor y comprensión.

 Agradecimientos

Quiero agradecer la colaboración de todas aquellas personas que de una forma u otra

contribuyeron a la culminación satisfactoria de esta tesis y en especial:

 Al Doctor Ricardo Medina Marrero, quien fue el primero en emprender

entusiasmadamente, junto conmigo, este proyecto doctoral. Sin su interés y confianza

en mí, esta tesis no hubiera sido posible. Igualmente quiero destacar la contribución de

nuestras discusiones, si bien por momentos acaloradas, a mi formación académica y

profesional. Además, quiero agradecerle enormemente haber sido mi confidente en los

malos momentos, y compartir alegremente los buenos, además de su paciencia,

comprensión y generosidad.

 Al Dr. José Manuel Mazón-Suástegui, primero por creer en mí, aceptándome bajo su

dirección, lo que me trajo un sinnúmero de enseñanzas, tanto personales como

académicas. Le agradezco profundamente el gran apoyo intelectual, compartiendo

conmigo generosamente cada idea que pudiera hacer de mi tesis un mejor trabajo.

Además, le agradezco todo el tiempo invertido en lo personal, siempre apoyándome en

momentos difíciles, escuchándome cada vez que fue necesario y enseñándome que las

cosas son más sencillas de lo que aparentan. Doctor, quiero que sepa que en todo

sentido usted es un ejemplo para mí.

 Al Dr. Manuel Valdivié Navarro por su gentileza en la revisión de este material,

acertadas sugerencias, por sus consejos, preocupación constante, así como por todas

las coordinaciones y apoyo brindado para llevar a feliz término la presente tesis de

doctorado.
 Quisiera hacer extensiva mi gratitud a mis compañeros del Área Biológica y

especialmente al Departamento de Microbiología: Marlen, Yeny, Micaela, Miriam y

Cupull; por su amistad y colaboración.

 Al Centro de Bioactivos Químicos por darme la oportunidad de crecerme profesional y

personalmente.

 Al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C. (CIBNOR) por el apoyo

durante las estancias de investigación realizadas. A Norma Ochoa del Laboratorio de

Diagnóstico Microbiológico, por su amistad y por todo su apoyo. A Natalia Trabal por

su contribución. A Delfino Barajas y Pablo Omart del Laboratorio de Moluscos por su

colaboración y a Fernando Abasolo por su amistad incondicional.

A todos, gracias.
 SÍNTESIS

El presente trabajo tuvo como objetivo obtener actinomicetos marinos con actividad

probiótica en ostiones y camarones; así como caracterizar algunos metabolitos relacionados

con dicho efecto. De las cepas aisladas, tres identificadas molecularmente como Streptomyces

spp. (V4, RL8 y N7), mostraron las mejores características in vitro según su antagonismo

contra Vibrio spp., actividad hemolítica, capacidad de adhesión, tolerancia a la salinidad y pH

ácidos, producción de sideróforos y enzimas extracelulares. Estudios con juveniles de

Crassostrea sikamea y Crassostrea corteziensis demostraron que RL8 aumenta

significativamente el peso y la actividad SOD de ambas especies, mientras que N7 aumenta

significativamente el peso de C. sikamea y la actividad SOD de C. corteziensis. Estas cepas

modularon la microbiota de C. sikamea, propiciaron una elevada riqueza y diversidad de

especies, incluida la bacteria benéfica Bacteriovorax sp., y eliminaron especies del género

Vibrio. Las cepas RL8 y N7 solas, combinadas entre sí (Strep), o combinadas con Bacillus

spp. (BMix) o Lactobacillus sp. en la dieta de juveniles de Litopenaeus vannamei, mejoraron

varios indicadores inmunológicos, microbiológicos y productivos; destacándose la cepa RL8

y la combinación BMix-Strep del resto de los tratamientos. La obtención de los nuevos

compuestos antimicrobianos, Lunalipin A y B, demostró uno de los mecanismos de acción

probiótica de Streptomyces sp. RL8.

 ABREVIATURAS

AAH: Agar Ácido Húmico ISP2: Agar extracto de levadura

extracto de malta
ACA: Agar Caseína Almidón IT: Incremento de la Talla
ADN: Ácido Desoxirribonucleico L: litro
ATCC: Americam Type Culture mm: milímetros
Collection;
http://www.atcc.org
ARNr: ARN ribosómico MRS: Agar de Man, Rogosa y
Sharpe
BLAST: Basic Local Alignment ng: nanogramos
Search Tool
CA: Conversión Alimenticia P: Probabilidad
CIM: Concentración Inhibitoria pb: pares de base
Mínima
CTH: Conteo Total de Hemocitos PCA: Análisis de Componentes
Principales
CV: Coeficiente de Variación ProFO: Enzima profenoloxidasa
EE: Error Estándar RCP: Reacción en Cadena de la
Polimerasa
EROs: Especies Reactivas de RDP: Ribosomal Database Project
Oxígeno
GMD: Ganancia Media Diaria RMN: Resonancia Magnética
Nuclear
IP: Incremento de Peso SOD: Enzima Superóxido Dismutasa
GRAS: Generally Recognized As TCBS: Agar Tiosulfato Citrato Bilis
Safe Sacarosa
g: fuerza centrífuga expresada TSA: Agar Tripticasa Soya
en unidades de gravedad
TGI: Tracto gastrointestinal ºC: grados Celsius
TSB: CaldoTripticasa Soya µL: microlitro
UFC: Unidades Formadoras de µg: microgramo
Colonias
UTOs: Filotipos o unidades
taxonómicas operacionales
g: gramos
 ÍNDICE

Pág.
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………. 1

CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA…………………...….…. 6

1.1 . La acuicultura en el mundo……………………………………….…... 6
1.1.1. Cultivo del ostión ………………………………………………...… 8
1.1.2. Cultivo del camarón……………………………………………….... 10
1.2. Enfermedades bacterianas en la acuicultura.. ………………………... 11
1.3. Respuesta inmune en invertebrados marinos .……………………..…. 12
1.4. Antibióticos usados en la acuicultura …………………………...……. 14
1.5. Uso de probióticos en la acuicultura………………………...………... 15
1.5.1. Efecto de los probióticos en la microbiota intestinal..…………….... 16
1.5.2. Criterios de selección de una cepa probiótica………………………. 17
1.5.3. Mecanismos de acción de los probióticos………………………...… 18
1.5.4. Principales microorganismos usados como probióticos en la 18
acuicultura……………………………………………………………….….. 21
1.6. Características generales de los actinomicetos…………...…………… 24
1.7. Metabolitos producidos por actinomicetos marinos…………...……… 26

CAPÍTULO II. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN IN VITRO

DE ACTINOMICETOS CANDIDATOS A PROBIÓTICOS…………. 29
2.1. Introducción……...…………………………………………………...... 29
2.2. Materiales y métodos…………...…………………………………...…. 29
2.3. Resultados y discusión…………………………………………………. 36
2.4. Conclusiones parciales…………………………………………………. 44

CAPÍTULO III. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROBIÓTICA

DE STREPTOMYCES SPP. EN EL CULTIVO DE OSTIÓN C.
SIKAMEA Y C. CORTEZIENSIS, Y SU EFECTO EN LA
MICROBIOTA ASOCIADA A C. SIKAMEA…………………………... 46
3.1. Introducción……………………………………………………………. 46
3.2. Materiales y métodos…………...…………………………...…………. 47
3.3. Resultados y discusión……………………………………………...….. 53
3.4. Conclusiones parciales…………………………………………...…….. 70

CAPÍTULO IV: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROBIÓTICA

DE STREPTOMYCES SPP., SOLAS O EN COMBINACIÓN CON
BACILLUS Y LACTOBACILLUS EN JUVENILES DE CAMARÓN
BLANCO L. VANNAMEI............................................................................ 71
4.1. Introducción………………………………………………………...…. 71
4.2. Materiales y métodos…………...…………………………………….... 71
4.3. Resultados y discusión………………………………………………..... 76
4.4. Conclusiones parciales……………………………………………...….. 86
CAPÍTULO V: OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
COMPUESTOS QUÍMICOS PRODUCIDOS POR LA CEPA DE
STREPTOMYCES SP. RL8…………………………………………...…... 87
5.1. Introducción…………………………………………………………..... 87
5.2. Materiales y métodos…………...…………………………………….... 87
5.3. Resultados y discusión……………………………………………...….. 89
5.4. Conclusiones parciales……………………………………………...….. 95

CAPÍTULO VI: DISCUSIÓN GENERAL………………………………. 96

CONCLUSIONES GENERALES…………………………………...…… 99

RECOMENDACIONES…………………………………………………... 100

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANEXOS
 ÍNDICE DE TABLAS

Pág.
Tabla 1. Actividad antimicrobiana y hemolítica de los actinomicetos
aislados de sedimentos marinos de Cuba…………………………...…..…... 38

Tabla 2. Hidrofobicidad, producción de sideróforos, tolerancia a NaCl (%)

y crecimiento a diferentes pH de los actinomicetos aislados de sedimentos
marinos………………...……………………………………………………. 39

Tabla 3. Actividad enzimática de los aislados de actinomicetos

seleccionados………………………………………………………………... 43

Tabla 4. Indicadores productivos en juveniles de Crassostrea corteziensis

y Crassostrea sikamea tratados durante 30 días con Streptomyces spp. (V4,
RL8 y N7) y una mezcla de Bacillus spp. (BMix)………………………….. 54

Tabla 5. Secuencias obtenidas por pirosecuenciación del ARNr

16S…………………………………………………………………………... 59
Tabla 6. Abundancia relativa de Proteobacterias asociadas a juveniles de
C. sikamea tratados con Streptomyces spp. (RL8 y N7). Abundancia
relativa (%) de cada género en relación al total…………………………….. 64

Tabla 7. Abundancia relativa de Actinobacterias asociadas a juveniles de

C. sikamea tratados con Streptomyces spp. (RL8 y N7). Abundancia
relativa (%) de cada subclase en relación al total…………………………... 67

Tabla 8. Efecto de la adición de los candidatos probióticos en los índices

productivos del camarón blanco L. vannamei………….………..………….. 76

Tabla 9. Conteo de heterótrofos totales, vibrio y hemocitos después del

tratamiento de camarón L. vannamei con cepas candidatas a
probiótico……………………………………………………………………. 79

Tabla 10. Actividad antimicrobiana de Lunalipin A y B………………...... 92

 ÍNDICE DE FIGURAS

Pág.
Figura 1. Evolución de la producción acuática mundial (acuicultura y
pesca de captura) en el período 1950-2012…………………...…………….. 7

Figura 2. Especies de moluscos bivalvos que se cultivan o que sostienen

pesquerías locales en México y Centroamérica. …………………………… 9

Figura 3. Mecanismo de acción desplegado por las bacterias probióticas.... 19

Figura 4. Árbol filogenético derivado de la secuenciación del gen del

ARNr 16S de las cepas de actinomicetos (V4, N7 y RL8) y especies
estrechamente relacionadas…………………………………………………. 44

Figura 5. Actividad de la enzima SOD en juveniles de C. corteziensis y C.

sikamea después de 30 días de tratamiento con cepas de Streptomyces spp.
(V4, RL8 y N7) y una mezcla de Bacillus spp.
(BMix)………………………………………………………………………. 56

Figura 6. Abundancia relativa de diferentes filos de bacterias, en la

microbiota asociada a juveniles de ostión C. sikamea tratados con
Streptomyces spp. (N7 y RL8).……………………………………………... 61

Figura 7. Abundancia relativa de la clase Proteobacteria asociada a C.

sikamea tratado con Streptomyces spp. (N7 y RL8)………………………... 63

Figura 8. Análisis de componentes principales (ACP) de la variación de la

microbiota basado en la abundancia relativa de UTOs en juveniles de C. sikamea
(●) depurados y (▲) no depurados. …………………………...………………. 69

Figura 10. Actividad de la enzima SOD en el tejido del camarón blanco L.

vannamei tratados con cepas de Streptomyces spp. (RL8 y N7), BMix y
Lactobacillus sp. RL5 después del reto con V. parahaemolyticus………….. 81

Figura 11. Supervivencia de los juveniles de Litopenaeus vannamei

tratados con cepas de Streptomyces spp. (RL8 y N7), BMix y Lactobacillus
sp. RL5 después del reto con V. parahaemolyticus. ………………………. 84

Figura 12. Estructura de dos nuevos compuestos (Lunalipin A y Lunalipin

B), obtenidos a partir de la cepa de Streptomyces sp. RL8, aislada de
sedimentos marinos de Cuba…………………………………....................... 91
 ANEXOS

Anexo 1. Actividad antimicrobiana del aislado RL8 contra Vibrio harveyi (a),
Vibrio parahaemolyticus (b) y Vibrio vulnificus (c).

Anexo 2. Diseño experimental de ostiones C. sikamea tratados con diferentes cepas

de Streptomyces.

Anexo 3. Histograma de la longitud de secuencias obtenidas durante la

pirosecuenciación de amplicones del gen del ARNr 16S de la microbiota asociada
a Crassostrea sikamea.

Anexo 4. Curva de rarefacción de las secuencias del gen del ARNr 16S bacteriano
de ostiones tratados con las cepas de Streptomyces spp. (N7 y RL8). Las UTOs
fueron identificadas usando un punto de corte del 97 %.

Anexo 5. Espectro de Masa de Alta Resolución de Lunalipin A.

Anexo 6. Datos de RMN 1H y 13C de los compuestos Lunalipin A y B.

Anexo 7. Espectro de Masa de Alta Resolución de Lunalipin B.

INTRODUCCIÓN
 Introducción

INTRODUCCIÓN

La acuicultura es el sector de la producción alimentaria que crece a mayor ritmo en el mundo

y actualmente aporta casi el 50 % del producto de origen acuático, es decir marino y

dulceacuícola, destinado al consumo humano. Según predicciones de FAO (2014), en 2030 la

producción acuícola mundial deberá ser 2,5 veces superior, a fin de evitar que disminuya el

consumo per cápita de productos acuáticos y marinos a nivel mundial. En este contexto se

asume que si se desarrolla y se practica responsablemente, la acuicultura puede generar

beneficios duraderos para la seguridad alimentaria y el crecimiento económico mundial

(FAO, 2014).

Una de las principales dificultades que existe en el cultivo comercial de organismos marinos

es la aparición de enfermedades infecciosas asociadas a la incidencia de bacterias, hongos y

virus. Las epizootias están frecuentemente asociadas al aumento en la densidad de cultivo y al

rápido desarrollo de la acuicultura, sin que de manera paralela se desarrollen suficientes

métodos efectivos para el manejo de los organismos en alta densidad sin afectar la calidad del

agua y optimizar el valor nutricional del alimento utilizado, entre otros factores (Pruzzo et al.,

2005; Rattanachuay et al., 2010 y Diana et al., 2013).

Los organismos acuáticos (moluscos, crustáceos y peces), son susceptibles a una amplia

variedad de patógenos bacterianos, entre los cuales están los géneros Aeromonas, Vibrio y

Pseudomonas; que son componentes de la biota normal del ambiente acuático que les rodea,

pero se muestran virulentos como respuesta a situaciones de estrés, a un fallo en el

funcionamiento fisiológico de los organismos cultivados o a una mala calidad del agua

1
 Introducción
(Balcázar et al., 2006 y Lara-Flores et al., 2010). Los antibióticos se han usado

tradicionalmente para controlar dichas enfermedades; sin embargo, su uso indiscriminado ha

conducido al desarrollo de microorganismos multirresistentes por lo que algunos han sido

proscritos en la mayoría de los países (Hirsch et al., 1999 y Jerbi et al., 2011). En este sentido,

la intervención microbiana puede jugar un rol vital en la producción acuícola y los probióticos

pueden ofrecer una mayor protección natural e inespecífica de amplio espectro frente a los

patógenos causantes de las enfermedades. Otros métodos para la reducción de

microorganismos patógenos en acuicultura, como la filtración del agua, la ozonización y el

uso de la luz UV, son también útiles pero no tanto como los probióticos; los cuales se reportan

como el método más exitoso para aumentar la producción acuícola (Gomez-Gil et al., 2000 y

Lakshmi et al., 2013).

De acuerdo a la Organización de Naciones Unidas (ONU) y la Organización Mundial de la

Salud (OMS), los probióticos se definen como microorganismos vivos que cuando se

administran en las concentraciones adecuadas, confieren un efecto beneficioso para el

hospedero (FAO/WHO, 2001). Los probióticos ayudan a lograr una mejor digestión de los

alimentos e incrementan su valor nutricional, por la capacidad de aumentar la capacidad de

respuesta del hospedero ante el patógeno causante de la enfermedad. Los probióticos

previenen las enfermedades bacterianas a través de una serie de mecanismos de acción, entre

los que destacan (1) el desarrollo de un ambiente hostil (antibiosis, antagonismo, exclusión)

para las bacterias patógenas, (2) la producción de sustancias inhibitorias, (3) la competencia

por nutrientes esenciales o sitios de adhesión, o (4) la modulación de la respuesta inmune del

hospedero (Balcázar et al., 2006 y Merrifield et al., 2010). Resulta importante señalar, que en

la acuicultura los efectos beneficiosos de los probióticos no se limitan al tracto gastrointestinal

del hospedero, sino que también pueden mejorar la calidad del agua al modificar la

comunidad microbiana presente en el agua y en el sedimento, y por tanto mejoran de manera

2
 Introducción
integral la calidad del medio acuático en las unidades de producción acuícola (Verschuere et

al., 2000b y Zheng et al., 2012).

Actualmente la utilización de bacterias probióticas está cobrando gran importancia en el

campo de la acuicultura, no sólo porque mejoran los índices de crecimiento, sino también,

porque crean una mayor resistencia de las organismos a las enfermedades, lo que conlleva a

mejores resultados en la producción acuícola (Neissi et al., 2013; Ramos et al., 2013 y Lobo

et al., 2014).

Los actinomicetos son microorganismos Gram positivos, recientemente reconocidos por su

potencial probiótico (Das et al., 2008). Dentro de las características distintivas que los hacen

ideales para este fin se destacan que son organismos saprófitos que contribuyen al reciclaje de

biopolímeros complejos, por lo que pueden contribuir a la mineralización y al ciclo de

nutrientes en la acuicultura; no son patógenos para animales, plantas o peces; producen una

gran variedad de exoenzimas que pueden mejorar la digestibilidad y el aprovechamiento de

los alimentos en los peces y son organismos productores de metabolitos secundarios por

excelencia, por lo que pueden inhibir el crecimiento de patógenos en la acuicultura (Das et al.,

2010 y Augustine et al., 2015).

De ahí la hipótesis de la presente tesis:

Los actinomicetos aislados de sedimentos marinos de Cuba tienen acción probiótica y

potencial aplicación en el cultivo de juveniles de moluscos y crustáceos marinos.

Para aceptar o refutar esta hipótesis se propusieron los siguientes objetivos:

3
 Introducción

Objetivo general:

Obtener actinomicetos de origen marino con actividad probiótica, para su utilización en la

acuicultura de ostiones y camarones, así como caracterizar nuevos metabolitos con actividad

biológica que pudieran estar asociados al efecto probiótico de los microorganismos

seleccionados.

Objetivos específicos:

1. Aislar y evaluar in vitro actinomicetos con potencialidades probióticas e identificar

molecularmente los candidatos a probióticos para su uso en la acuicultura.

2. Evaluar in vivo la actividad probiótica de microorganismos candidatos a probióticos en

juveniles de los ostiones (Crassostrea sikamea y C. corteziensis) y modulación de la

microbiota asociada a C. sikamea.

3. Evaluar in vivo la actividad probiótica de microorganismos candidatos a probióticos en

juveniles del camarón blanco del Pacífico Litopenaeus vannamei.

4. Obtener y caracterizar nuevos compuestos químicos producidos de manera natural por

los microorganismos seleccionados y determinar in vitro su potencial antimicrobiano.

Novedades científicas

 Se informa la obtención, caracterización e identificación de microorganismos con

acción probiótica, aislados de sedimentos marinos de Cuba.

 Se informa la respuesta de tipo probiótica de cepas de Streptomyces spp. en ostiones

(Crassostrea sikamea y Crassostrea corteziensis) y en el camarón blanco del Pacífico

Litopenaeus vannamei.

 Se reporta la obtención de dos nuevos compuestos químicos con acción

antimicrobiana producidos por la cepa de Streptomyces sp. RL8.

4
 Introducción

Aportes científicos

 Se informa la obtención, caracterización e identificación de microorganismos

candidatos a probióticos, a partir de sedimentos marinos de Cuba.

 Se registra en el GenBank tres cepas candidatas a probiótico del género Streptomyces

spp. (V4, N7 y RL8).

 Se propone una metodología para el aislamiento, caracterización y selección de cepas

de actinomicetos procedentes de sedimentos marinos de Cuba con potencial

probiótico.

Importancia teórica y práctica

La importancia teórica está dada por la información actualizada que genera la presente

investigación en la temática de probióticos y su uso en el cultivo de ostiones y camarones,

para mejorar su estado de salud e incrementar la eficiencia productiva de estas especies, al

incluir en su dieta cepas de actinomicetos probióticos.

La importancia práctica está dada por disponer de una metodología sobre el uso de

actinomicetos como posibles agentes probióticos en la acuicultura de moluscos y crustáceos

marinos. Esta investigación constituye además, un nuevo material de referencia para aumentar

la eficiencia en las tecnologías de producción de otras especies marinas y dulceacuícolas,

mediante el uso de nuevos probióticos del género Streptomyces.

5
 CAPÍTULO I
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
 Capítulo I

CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1. La acuicultura en el mundo

La acuicultura se define como el cultivo de organismos acuáticos bajo condiciones controladas o

semi-controladas, en la que están implicadas una gran variedad de especies, gran parte de ellas

destinadas al consumo humano (Stickney, 2009). De acuerdo con la FAO (2014), la producción

pesquera mundial, incluida la acuicultura, ha aumentado de forma constante en las últimas cinco

décadas y el suministro de peces comestibles se incrementa a una tasa media anual del 3,2 %, lo

cual supera la tasa de crecimiento de la población mundial del 1,6 %. La acuicultura se mantiene

como uno de los sectores de producción de alimentos de más rápido crecimiento, ya que en 2012

se estableció otro máximo histórico de producción de 90,4 millones de toneladas en peso vivo

con un valor de 144 400 millones de USD (figura 1). De ese total, 66,6 millones de toneladas

correspondieron a peces comestibles (137 700 millones de USD) y 23,8 a plantas acuáticas,

principalmente algas marinas (6 400 millones de USD). De acuerdo con la misma fuente, se

prevé que esta proporción aumente un 62 % para el año 2030, debido a la estabilización del

rendimiento de la pesca de captura salvaje y al aumento considerable de la producción acuícola,

en respuesta a la demanda de una nueva clase media mundial.

6
 Capítulo I

Figura 1. Evolución de la producción acuática mundial (acuicultura y pesca de captura) en

el período 1950-2012 (FAO, 2014).

Por todo lo antes expuesto, es válido asumir que si la acuicultura se desarrolla y se practica

responsablemente, puede generar beneficios duraderos para la seguridad alimentaria y el

crecimiento económico mundial (FAO, 2014). Sin embargo, es indispensable que conforme se

desarrollan nuevos métodos intensivos e hipertensivos de producción, se mejore también el nivel

de control sobre los procesos productivos, ya que se observó un incremento notable en la

aparición de agentes patógenos bacterianos y virales, causantes de enfermedades infecciosas. La

prevención y control de estas patologías es uno de los principales retos que debe resolver la

acuicultura moderna, sobre todo por las graves pérdidas económicas que están ocasionando al

sector (Kalatzis et al., 2016 y Zhang et al., 2016).

7
 Capítulo I
1.1.1. Cultivo del ostión

Los moluscos bivalvos (ostiones, mejillones, almejas y vieiras) constituyen una parte importante

de la producción pesquera mundial; son organismos filtroalimentadores y se ubican en la base de

la cadena alimenticia, crecen rápido, especialmente en los trópicos, y son ampliamente

demandados por los mercados globales. Por lo anterior, los bivalvos son candidatos ideales para

la acuicultura y los proyectos comerciales no requieren inversiones grandes ni equipos

sofisticados de estanquería en tierra o alimento balanceado (Mazón-Suástegui, 2005; Cáceres-

Martínez y Vásquez-Yeomans, 2014).

De acuerdo con las estadísticas de la FAO (2014), en 2012 los moluscos representaron el 11,5 %

de la producción pesquera mundial. La producción de moluscos bivalvos por pesca y acuicultura

se incrementó en los últimos 50 años, de casi un millón de toneladas en 1950 a cerca de 15,2

millones de toneladas en 2012. Los principales componentes de la producción de moluscos en

2010 fueron las almejas, los ostiones, los mejillones y los pectínidos. Entre los principales

productores de moluscos por acuicultura se encuentran China, Japón, Estados Unidos de

América, la República de Corea, Tailandia, Francia, España, Chile y México. El cultivo de

moluscos bivalvos en América Latina y el Caribe alcanzó unas 128 410 toneladas con un valor

estimado en 432 millones de dólares (Lovatelli et al., 2008).

En México, Centroamérica y el Caribe la mayor producción por cultivo y captura de moluscos

bivalvos corresponde a México, con una producción de ostiones del género Crassostrea que

alcanza unas 40 000 toneladas; para Cuba se reporta una producción del ostión de mangle C.

rhizophorae superior a las 1 000 toneladas (Betanzos et al., 2014). La producción ostrícola

mexicana se basa en tres especies, el ostión americano (C. virginica) que se captura y cultiva a

nivel extensivo en el Golfo de México y representa el 80 % de la producción, el ostión japonés

(C. gigas) y el ostión de placer (C. corteziensis), especies que se cultivan en la región Noroeste

8
 Capítulo I
del país incluyendo el Océano Pacífico y Mar de Cortez. El cultivo del ostión japonés,

introducido en México s, depende de la producción de semillas en el

laboratorio y en su cultivo se utilizan tecnologías modernas. El cultivo del ostión de placer (C.

corteziensis) es a un nivel más artesanal, depende mayormente de la captación de semillas del

medio natural, pero en algunos casos de la producción en laboratorio (Islas-Olivares et al., 1978;

Mazón-Suástegui et al., 2008, 2009 y Cáceres-Martínez et al., 2010). Adicionalmente hay una

baja producción acuícola del ostión kumamoto (C. sikamea), introducida en México como una

variedad de C. gigas, y extracción pesquera del ostión de mangle C. rhizophorae y del ostión de

piedra Ostrea iridiscens (figura 2).

Figura 2. Especies de moluscos bivalvos que se cultivan o que sostienen pesquerías locales en

México y Centroamérica. A. ostión japonés Crassostrea gigas. B. ostión de placer

Crassostrea corteziensis. C. ostión kumamoto, Crassostrea sikamea. D. curil o concha

negra, Anadara tuberculosa. E. casco de burro, Grandiarca grandis. F. ostión de

mangle Crassostrea rhizophorae (Cáceres-Martínez y Vásquez-Yeomans, 2013).

9
 Capítulo I
1.1.2. Cultivo del camarón

En la producción de crustáceos marinos predomina el camarón blanco del Pacífico Litopenaeus

vannamei (Boone, 1931), contrastando de forma acusada con la producción de langostino jumbo

(Penaeus monodon) que ha perdido importancia en el último decenio. Las principales especies de

agua dulce incluyen cangrejo de las marismas (Procambarus clarkii), cangrejo chino (Eriocheir

sinensis) y camarón gigante (Macrobrachium rosenbergii).

En la última década, el cultivo de camarón se ha desarrollado de manera exponencial en todo el

mundo, expandiéndose más que cualquier otro sector productivo pecuario (Allsopp et al., 2008).

Teniendo en cuenta el valor, el camarón sigue siendo el producto individual más importante, pues

en 2012 representó el 15 % del valor total de los productos pesqueros comercializados a nivel

internacional. Se produce principalmente en países en desarrollo y gran parte de la producción

termina en el comercio internacional. La producción mundial de camarón cultivado descendió en

2012 y 2013, debido principalmente a problemas relacionados con enfermedades como el

síndrome de mortalidad temprana, en algunos países de Asia y América Latina (FAO, 2014).

El camarón blanco del Pacífico (L. vannamei) es la especie más cultivada en el hemisferio

occidental (Davis et al., 2004) y, debido a su alta tolerancia a la baja salinidad se cultiva, en

aguas continentales (Saoud et al., 2003), siendo una práctica común en Tailandia (Boyd et al.,

2002) y una nueva modalidad en países americanos como Brasil, Ecuador, EUA, México,

Panamá y Venezuela (Salame y Salame, 2002; Treece, 2002 y Balbi et al., 2005). En Cuba se

realizaron estudios en el cultivo de L. vannamei en aguas interiores donde la salinidad puede

registrar valores de 0 ups (Jaime-Ceballos et al., 2008).

10
 Capítulo I
1.2. Enfermedades bacterianas en la acuicultura

Las infecciones son un problema muy común en la acuicultura marina. La mayoría de estas

infecciones son causadas por bacterias y virus. Entre las bacterias Gram negativas se destacan los

géneros Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Tenacibaculum y Photobacterium. Dentro de las

Gram positivas, el género Streptococcus es el de mayor interés y entre los virus, el que mayor

daño produce es el asociado al síndrome de la mancha blanca o WSSV, por sus siglas en inglés

(Lightner, 1996 y Lightner y Redman, 1998). La mayoría de estos agentes patógenos se

encuentran en el medio marino y únicamente ocasionan daño, cuando por ciertas circunstancias

sobrepasan las barreras defensivas en organismos sometidos a condiciones primarias de estrés,

inmuno-depresión, deficiencias nutricionales, heridas y/o un grave deterioro o contaminación

del medio acuático circundante (Romalde et al., 2013 y Wang et al., 2015). Por esta razón, las

enfermedades infecciosas son la causa mayoritaria de las pérdidas económicas en granjas

acuícolas debido a la alta mortalidad de los animales, los costos de los tratamientos y el descenso

de la producción.

Las vibriosis son infecciones producidas por diferentes especies del género Vibrio, que afectan a

peces, moluscos y crustáceos del medio marino, dulce o salobre y se caracteriza por un cuadro de

curso agudo, con una sintomatología típica de septicemia hemorrágica. Aunque los vibrios

forman parte de la biota normal del camarón, son patógenos oportunistas y pueden ser aislados de

hemolinfa o tejido muscular en larvas, postlarvas y juveniles de camarón cuando se encuentran

en grandes cantidades en el individuo (Romalde et al., 2013 y Wang et al., 2015).

El virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) fue inicialmente descrito en China y Japón en

1992-1993 (Inouye et al., 1994) y en EUA en 1995, presentando una rápida dispersión en

Tailandia, Vietnam, Malasia, India, Nicaragua, Guatemala y Honduras (Jory y Dixon, 1999). Las

infecciones por WSSV se extienden a diversas especies de peneidos tales como: P. monodon, L.

11
 Capítulo I
vannamei, L. stylirostris, Marsupenaeus japonicus y Fenneropenaeus chinensis, y otros

crustáceos como Macrobrachium rosenbergii y Procambarus clarkii (Lo et al., 1996, Lightner y

Redman, 1998 y Wang et al., 1999). Esta enfermedad es detectable visualmente por la letargia y

nado errático de los organismos y por la presencia de manchas blancas (que confieren el nombre

a la enfermedad), producidas por la formación de depósitos de calcio en la cutícula. El WSSV

puede ocasionar hasta el 100 % de mortalidad dentro de los 10 días siguientes a la aparición de

los primeros signos de enfermedad, causando grandes pérdidas económicas (Lightner, 1996).

1.3. Respuesta inmune en invertebrados marinos

Como se mencionó en la sección anterior, las enfermedades infecciosas son la principal causa de

pérdidas económicas en el cultivo de camarón y de moluscos. A fin de contrarrestar el daño

causado por las enfermedades y combatir a sus agentes causales, es necesario conocer los

mecanismos innatos de defensa que los organismos de cultivo emplean para evitar una infección,

y con base en ese conocimiento, implementar nuevas estrategias de manejo.

Tanto la cutícula en camarones como las mucosas en los moluscos, son una barrera mecánica que

evita la entrada de agentes invasores. Sin embargo, cuando un organismo patógeno logra

introducirse en su hospedero, el sistema inmune entra en acción. El sistema inmune de los

invertebrados no cuenta con memoria adaptativa, por lo que depende de la respuesta innata y sus

dos componentes: celular y humoral (Ellis et al., 2011).

La respuesta celular está dada por los hemocitos, que constituyen la principal línea de defensa

contra agentes invasores. En moluscos se distinguen dos tipos de hemocitos: granulares e

hialinos, mientras que, en crustáceos, además de los anteriores, se reconoce también un tercer

tipo: los hemocitos semigranulares (Bachère et al., 1995).

12
 Capítulo I
Uno de los procesos de defensa interna de los hemocitos para eliminar al agente invasor es la

fagocitosis, que conlleva a una serie de pasos comenzando por la quimiotaxis, mediante la cual,

h m t “p r gu ” r tr quím g t v r. A tr r t t g t

invasor tiene lugar el reconocimiento por medio de moléculas presentes en la membrana de los

hemocitos y en la del agente invasor, además de la secreción de moléculas denominadas

opsoninas. Los receptores y el mecanismo de reconocimiento son fundamentales en la activación

de la respuesta inmune. Finalmente, se internaliza el agente invasor dentro del fagosoma el cual

forma el fagolisosoma al fusionarse con un lisosoma. De esta manera se liberan una serie de

enzimas lisosomales que actúan ya sea intracelular o extracelularmente para destruir al agente o

partícula invasora (Jiravanichpaisal et al., 2006).

La generación de radicales libres es un proceso asociado a la fagocitosis por su alto potencial

microbicida. Durante el proceso de fagocitosis, los hemocitos llevan a cabo un fenómeno

conocido como estallido respiratorio, el cual tiene como función eliminar microbios o células

reconocidas por el fagocito mediante la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) tales

como O2¯ (anión superóxido), H2O2 (peróxido de hidrógeno) y OH¯ (ión hidroxilo), las cuales,

una vez que cumplieron su objetivo, deben ser eliminadas rápidamente del sistema pues

también pueden ocasionar daño celular al organismo. Para la eliminación de las EROs los

organismos cuentan con una maquinaria enzimática especializada, integrada por enzimas

antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD) encargada de la eliminación del O2¯, y la

catalasa que elimina el H2O2 (Destoumieux et al., 1997).

En el caso de los moluscos bivalvos y crustáceos, estos presentan un sistema para la eliminación

de patógenos conocido como el sistema profenoloxidasa (proFO). Cuando la pared celular del

agente microbiano invasor es reconocida, se activa una proteasa serina conocida como la enzima

activadora de la profenoloxidasa (ppA). La forma activada de la ppA activa a su vez, a la enzima

13
 Capítulo I
proFO y se desencadena una cascada enzimática de proteínas y factores asociados al sistema

proFO. Un factor de adhesión celular liberado por los hemocitos induce la desgranulación de los

hemocitos granulares y semigranulares, amplificando la generación del sistema proFO, además

de estimular la fagocitosis por los hemocitos hialinos (Sritunyalucksana y Söderhäll, 2000).

La respuesta humoral se refiere a la producción de efectores solubles tales como las enzimas

lisosomales, bactericidinas, aglutininas y lectinas, implicados en el reconocimiento y mecanismos

de defensa contra agentes patógenos. Las lectinas pueden actuar como opsoninas tanto en

moluscos bivalvos como en crustáceos. En el caso de los crustáceos se identificó una familia de

péptidos antimicrobianos (PAM) denominados peneidinas (Destoumieux et al., 1997). En

moluscos también se han descrito PAMs como el MGD2 de la familia de las defensinas,

particularmente mytilina y myticina en los mejillones Mytilus galloprovincialis y M. edulis (Ellis

et al., 2011).

1.4. Antibióticos usados en la acuicultura

La práctica de la acuicultura, particularmente la forma intensiva, requiere a menudo el uso de

agentes terapéuticos como métodos curativos y/o profilácticos. Estos agentes terapéuticos

incluyen a los antibacterianos, antiparasitarios, antifúngicos, hormonas, etc. El número de

sustancias químicas usadas en la acuicultura es amplia, ya que son utilizadas en el mantenimiento

de las instalaciones acuícolas y en la desinfección del agua (Ringø et al., 2010). El incremento de

la productividad en la acuicultura ha estado acompañado por impactos ecológicos incluyendo la

emergencia de una gran variedad de patógenos y bacterias resistentes; así como residuos

antimicrobianos indeseables en los productos cosechados que se venden para el consumo

humano. Esos impactos son en parte debidos al uso indiscriminado de agentes quimioterapéuticos

como resultado de prácticas de manejo en los ciclos de producción (Balcázar et al., 2006).

Aproximadamente el 80 % de los antimicrobianos usados en acuicultura ingresan al ambiente con

14
 Capítulo I
su actividad intacta, de manera que pueden contribuir a la selección de bacterias cuya resistencia

aumenta debido a mutaciones, a través de elementos genéticos móviles y transferencia horizontal

de genes a otras bacterias. Como resultado de este proceso se altera la biodiversidad del medio

ambiente y de la biota normal de peces y mariscos (Cabello et al., 2013 y Labella et al., 2013).

1.5. Uso de probióticos en la acuicultura

La definición de los probióticos ha evolucionado en el tiempo, pero de manera generalizada, se

acepta que son microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas

confieren un beneficio al hospedero (FAO/WHO, 2001). El uso de probióticos o bacterias

benéficas es visto de forma interesante como una alternativa al tratamiento con antibióticos,

porque ayudan a controlar a los patógenos. El uso de agentes probióticos en la nutrición de

humanos y animales está bien estudiado (Fuller, 1989) y su aplicación en la acuicultura ha sido

investigado por muchos autores porque representa una alternativa más ecológica y natural para la

prevención y control de diversas enfermedades, logrando efectos beneficiosos para la salud y la

seguridad de una acuicultura sostenible ( Lara-Flores, 2011; Cruz et al., 2012; Lakshmi et al.,

2013 y Newaj-Fyzul et al., 2014). Actualmente la utilización de microorganismos probióticos

está cobrando una gran importancia en el campo de la acuicultura, no sólo porque se observa

una mejora sustancial en los índices de crecimiento, sino también, una mayor resistencia a las

enfermedades, lo que conlleva a mejores resultados en la producción (Nayak, 2010).

En Cuba, el uso de probióticos en la acuicultura es limitado y solo se circunscribe a algunas

experiencias que han demostrado la utilización del PROBICID, aditivo compuesto por bacterias

ácido lácticas con potencialidades probióticas en la alimentación de tilapias, el cual mejora la

salud de los peces en los sistemas de cultivo intensivo (García de la Cruz et al., 2012). Otro

estudio fue el reportado por Franco et al. (2016) quienes aislaron la cepa de Bacillus

licheniformis CIGBC-232, y la aplicaron en el cultivo del camarón blanco L. vannamei,

15
 Capítulo I
mejorando su supervivencia, respuesta inmune y parámetros de crecimiento así como la calidad

del agua de cultivo.

1.5. 1. Efecto de los probióticos en la microbiota intestinal

Los animales marinos portan gran cantidad de microorganismos que pueden llegar a formar

complejas comunidades, especialmente en el tracto intestinal. Los ostiones son filtradores, sus

branquias cubiertas con moco y cilios les facilitan la respiración y simultáneamente atrapan

partículas suspendidas, entre estas bacterias y virus (Prieur et al., 1990). En los moluscos

bivalvos y en otras especies, también pueden distinguirse dos categorías de microbiota bacteriana

normal: (1) la microbiota autóctona o residente y (2) la microbiota transitoria o no autóctona. La

microbiota autóctona o residente es una comunidad bacteriana que permanece relativamente

estable en el tiempo y no cambia en función de las bacterias ingeridas por el hospedero; está

compuesta de tipos relativamente fijos de microorganismos y si se les perturba, tienden

espontáneamente a recuperarse con rapidez. La microbiota transitoria o no autóctona está

formada por microorganismos potencialmente patógenos que se ingieren con los alimentos,

sobreviven el paso por el intestino (posiblemente puedan proliferar allí) y se eliminan con las

heces (Harris, 1993; Berg, 1996 y Moriarty, 1997).

La microbiota intestinal de los organismos acuáticos muestra alta dependencia de la colonización

bacteriana durante el desarrollo temprano, las condiciones ambientales y los cambios en la

dieta (Ringø y Birkbeck, 1999; Olafsen, 2001 y Ringø et al., 2006). El impacto que generan los

probióticos en la modulación de la microbiota intestinal ha sido ampliamente estudiado y

aplicado en la producción de vertebrados pero tanto la generación de nuevo conocimiento, como

sus potenciales aplicaciones productivas en invertebrados marinos es muy limitado (Trabal-

Fernández et al., 2014 y Abasolo-Pacheco et al., 2015).

16
 Capítulo I
En los últimos años, se incorporó a la acuicultura, el uso de probióticos para controlar las altas

concentraciones de microorganismos potencialmente patógenos por exclusión competitiva. Esto

ha ayudado a disminuir su incidencia y a prevenir mortalidades masivas y epizootias de alto

impacto en la producción acuícola de varias especies marinas (Gibson et al., 1998; Gomez-Gil,

2000 y Devaraja et al., 2002). No obstante, muchas veces el fracaso de la utilización de

probióticos se debe al desconocimiento del tipo de interacción que tienen las cepas añadidas con

la microbiota autóctona del hospedero, ya que esta última puede desplazar a las cepas con

actividad probiótica (Moriarty, 1997 y Gibson et al., 1998). Derivado de lo anterior, se considera

de vital importancia generar un nuevo conocimiento científico básico sobre la composición de la

diversidad bacteriana presente en invertebrados marinos y sus complejas interacciones, así como

desarrollar zootecnias y procedimientos para utilizar nuevas cepas probióticas de manera más

eficiente en la acuicultura.

1.5.2. Criterios de selección de una cepa probiótica

En general, para que una cepa sea considerada como probiótica, debe cumplir una serie de

características como las que a continuación se mencionan:

(a) Antagonismo frente a diferentes patógenos.

Esta es una vía muy común para la primera selección de posibles probióticos. Las cepas en

estudio son expuestas in vitro a los patógenos seleccionados, o a sus productos extracelulares.

Dicho efecto puede evaluarse en medio líquido o sólido (Verschuere, 2000a; Chang y Liu, 2002 y

Irianto y Austin, 2002).

(b) Resistencia al pH y a la bilis.

Dentro de las pruebas de selección in vitro se incluye la resistencia a la acidez gástrica y a las

sales biliares, que constituyen condiciones limitantes para la supervivencia a través del tracto

gastrointestinal, de lo contrario los microorganismos probióticos no llegarían viables al final del

17
 Capítulo I
intestino para ejercer su acción beneficiosa para la salud del hospedero (Kesarcodi-Watson et al.,

2008).

(c) Inocuidad.

Una cepa probiótica debe estar exenta de patogenicidad y ser incapaz de ocasionar daño al

hospedero, además de ofrecer efectos beneficiosos mediante su interacción con el mismo

(Schrezenmeir y de Vrese, 2001 y Irianto y Austin, 2002). Al mismo tiempo, debe ser reconocida

como GRAS (generalmente considerada como segura, por sus siglas en inglés) (FAO/WHO,

2002).

(d) Capacidad de adhesión a células intestinales.

Para sobrevivir y competir en un ecosistema complejo como el intestino, es necesario que la cepa

seleccionada pueda adherirse a la mucosa intestinal del hospedero, siendo este un criterio

importante a la hora de evaluar una cepa como probiótica. Solo las cepas capaces de adherirse

podrían llegar a colonizar el intestino, y de esa manera formar parte de una primera barrera

defensiva frente a los patógenos. En caso contrario la cepa se convertirá en un organismo

transitorio, limitando sus posibles efectos positivos y haciendo indispensable su ingestión

periódica (Verschuere et al., 2000b y Vine et al., 2006).

1.5.3. Mecanismos de acción de los probióticos

Los probióticos generalmente modulan el crecimiento de la microbiota intestinal, suprimiendo a

las bacterias potencialmente perjudiciales y reforzando los mecanismos de defensa naturales del

hospedero (Giraffa et al., 2010), mejorando así su resistencia contra las enfermedades infecciosas

(Gildberg et al., 1997). Los mecanismos de acción de las bacterias utilizadas como probióticos se

enumeran a continuación (figura 3):

18
 Capítulo I

Figura 3. Mecanismo de acción desplegado por las bacterias probióticas (Lazado et al., 2015)

(a) Producción de compuestos inhibitorios

Los probióticos juegan un papel importante en la prevención de la aparición de enfermedades

mediante la producción de ciertos compuestos inhibitorios que actúan antagónicamente contra los

microorganismos patógenos y por lo tanto, evitan su proliferación en el hospedero (Tinh et al.,

2007). La actividad de un probiótico contra diversos agentes patógenos puede ser debida a la

producción de antibióticos (Williams y Vickers, 1986), bacteriocinas (Panigrahi y Azad, 2007 y

Tinh et al., 2007), sideróforos, lisozimas, proteasas y peróxido de hidrógeno.

(b) Competencia por sitios de adhesión o exclusión competitiva

La competencia por sitios de adhesión sobre el mucus del tracto gastrointestinal y otras

superficies de tejidos, es un posible mecanismo para prevenir su colonización por patógenos. La

adhesión bacteriana a la superficie de un tejido determinado, es una etapa importante para la

19
 Capítulo I
infección patógena, por lo tanto para que un probiótico ejerza su acción benéfica, debe competir

con los patógenos por los sitios de adhesión, ejerciendo así un efecto de exclusión competitiva

(Verschuere et al., 2000b).

La exclusión competitiva consiste en la prevención o reducción de la colonización de una

bacteria patógena, por parte de las bacterias presentes en el tracto gastrointestinal del hospedero.

Las bacterias probióticas se establecen en los sitios de adhesión de la mucosa intestinal, formando

una barrera física y de esa manera limitan o evitan el establecimiento de las bacterias patógenas

en el intestino (Lara-Flores y Aguirre-Guzmán, 2009).

(c) Competencia por nutrientes

Una vez suministrados, los probióticos más competentes constituyen parte de la microbiota

residente del tracto gastrointestinal del hospedero. Lo cual se logra mediante su adhesión

duradera o permanente a la mucosa, a las células epiteliales y a otros tejidos, para mantener e

incrementar la salud o el bienestar del hospedero (Gatesoupe 1999 y Farzanfar, 2006). La

capacidad de adhesión de algunas bacterias se probó in vitro e in vivo y sus resultados sugieren

que el patógeno es desplazado por el potencial probiótico como resultado de la competencia por

espacio y nutrientes esenciales (Verschuere et al., 2000b).

(d) Modulación del sistema inmunológico

Las bacterias probióticas tienen una acción estimulante sobre el sistema inmunitario del

hospedero, ya que actúan sobre las células implicadas tanto en la inmunidad natural como en la

inmunidad específica. Estos microorganismos activan a los macrófagos, favorecen la

producción de anticuerpos y estimulan la respuesta defensiva ante virus, bacterias y parásitos que

provocan enfermedades. Muchos probióticos han sido identificados por su acción

inmunomoduladora, al mejorar la actividad fagocítica, el estallido respiratorio y la actividad

superóxido dismutasa y peroxidasa, además de incrementar el número de leucocitos, linfocitos y

20
 Capítulo I
eritrocitos en vertebrados. (Newaj-Fyzul et al., 2014). En otro estudio, Marzouk et al. (2008)

reportaron efectos positivos en la respuesta inmune de la tilapia (Oreochromis niloticus)

mediante el uso de cepas probióticas de Bacillus subtilis y la levadura Saccharomyces cerevisiae,

a través de su aplicación en la dieta regular de los peces durante seis semanas.

(e) Mejoras en la calidad del agua

Las bacterias Gram positivas, tales como Bacillus spp., estimulan el sistema inmune del

hospedero y también actúan mejorando la calidad del agua. Bacillus spp. actúa de manera más

eficiente en la conversión de materia orgánica en dióxido de carbono, mientras que las bacterias

Gram negativas convierten mayor proporción de materia orgánica en biomasa bacteriana o en

limo (Nemutanzhela et al., 2014).

1.5.4. Principales microorganismos usados como probióticos en la acuicultura

Muchos microorganismos marinos, entre los que se incluyen bacterias, hongos, bacteriófagos

(Park et al., 2000) y levaduras (Tovar et al., 2002), son considerados como fuentes promisorias

de sustancias bioactivas, de donde pueden derivarse sus propiedades probióticas. A continuación

se describen los grupos más importantes y sus propiedades específicas.

(a) Bacterias Gram positivas

De acuerdo a Villamil y Martínez-Silva (2009), la mayoría de los microorganismos probióticos

propuestos para ser utilizados en la acuicultura son bacterias ácido lácticas (BAL), de las cuales

los géneros más utilizados son Lactobacillus y Lactococcus. Kongnum y Hongpattarakere, (2012)

aislaron Lactobacillus plantarum del tracto digestivo del camarón Litopenaeus vannamei y

evaluaron su crecimiento y supervivencia posterior a una infección con Vibrio harveyi,

concluyendo que L. plantarum mejoró la supervivencia de los camarones. Por su parte, Vieira et

al. (2007) demostraron que con la adición de dos cepas de bacterias ácido lácticas en un cultivo

21
 Capítulo I
del camarón L. vannamei se mejora la supervivencia y la población de bacterias luego de ser

infectados experimentalmente con Vibrio harveyi.

Diversas bacterias Gram positivas aerobias formadoras de esporas (Bacillus spp.) han sido

evaluadas para determinar su potencial probiótico. En igual forma, se ha determinado que tienen

la capacidad para mejorar la calidad del agua, al influir en la composición general de las

poblaciones microbianas y reducir el número de patógenos en el entorno de las especies

cultivadas (Cha et al., 2013). La mayoría de las especies del género Bacillus no son consideradas

perjudiciales para el hombre ni para los animales, y tienen un gran interés comercial por su

capacidad para producir antibióticos y enzimas (Pérez-Sánchez et al., 2014). Zokaeifar et al.

(2014) evaluaron dos cepas de Bacillus subtilis en el agua de cultivo del camarón blanco del

Pacífico L. vannamei comprobando que proporcionan efectos beneficiosos en la calidad del agua,

resistencia del camarón a las enfermedades y mayores rendimientos en crecimiento, actividad de

las enzimas digestivas y respuesta inmune del hospedero. También en L. vannamei se evaluó una

cepa de Arthrobacter sp. (CW9), aislada del mismo camarón, con lo cual se incrementó la

supervivencia, el crecimiento y la respuesta inmune con respecto al grupo control (Xia et al.,

2014). El empleo de B. subtilis redujo la mortalidad de camarones (L. vannamei) infectados con

V. parahaemolyticus (Balcázar et al., 2007). Además, varias cepas de Bacillus spp. se han

utilizado para mejorar la calidad del agua en la acuicultura, aprovechando su capacidad de

degradar nitritos en condiciones aeróbicas (Song et al., 2011).

(b) Bacterias Gram negativas

Entre las principales bacterias Gram negativas que han sido evaluadas y propuestas como

probióticos para uso en la acuicultura, se incluyen especies de los géneros Aeromonas,

Pseudomonas, Alteromonas, Shewanella, Roseobacter y Vibrio (Nayak, 2010 y Pérez-Sánchez et

22
 Capítulo I
al., 2014). La cepa Pseudomonas I-2 produjo compuestos inhibitorios contra vibrios patógenos de

camarones V. harveyi, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. damsela y V. vulnificus (Chythanya et

al., 2002). La suplementación de la dieta con Pseudomonas aeruginosa mejoró la inmunidad

innata y la resistencia a enfermedades provocadas por Aeromonas hydrophila en el pez ciprínido

Labeo rohita (Giri et al., 2012). Balcázar et al. (2007) aislaron cuatro cepas del tracto

gastrointestinal de camarones adultos (L. vannamei) Vibrio alginolyticus (UTM 102), Bacillus

subtilis (UTM 126), Roseobacter gallaeciensis (SLV 03) y Pseudomonas aestumarina (SLV 22).

Los autores evaluaron estas cepas por su uso potencial como probióticas en el cultivo de

camarón. Los estudios in vitro demostraron antagonismo frente a V. parahaemolyticus y los

grupos de camarón que fueron tratados con las cepas probióticas, mostraron mejor factor de

conversión alimenticia en comparación con el grupo control. Alavandi et al. (2004) realizaron

estudios con cepas de Pseudomonas sp. (PM 11) y Vibrio fluvialis (PM 17), aisladas de estanques

utilizados para cultivo de camarón, a concentraciones de 1 x 103 UFC mL-1 y demostraron un

mejoramiento en los indicadores de inmunidad en el camarón P. monodon. Gibson et al. (1998)

también demostraron que Aeromonas media redujo la proliferación de Vibrio tubiashii en larvas

de los ostiones japoneses (Crassostrea gigas).

(c) Levaduras

La principal especie de levadura propuesta para su uso como probiótico en la acuicultura es

Saccharomyces cerevisiae, aunque en los últimos años está teniendo un gran interés el estudio de

la especie Debaromyces hansenii, para su empleo en peces. Los principales efectos beneficiosos

que se reportan con el uso de S. cerevisiae son una mejora en el crecimiento y la supervivencia, al

igual que la estimulación del sistema inmune de los peces. La levadura S. cerevisiae posee

efectos benéficos al aumentar el crecimiento, mejorar la utilización del alimento e incrementar la

resistencia del pez payaso, Amphiprion percula, a enfermedades causadas por Streptococcus sp.

23
 Capítulo I
(Gunasundari et al., 2013). La misma fue utilizada como probiótico en el cultivo de tilapia del

Nilo Oreochromis niloticus, con estimulación de su crecimiento (Lara-Flores et al., 2003 y

Meurer et al., 2006). Resultados similares fueron observados en la trucha arcoíris Oncorhynchus

mykiss (Sheikhzadeh et al., 2012) y en juveniles del esturión beluga Huso huso (Hoseinifar et al.,

2011), en cuyo alimento se incluyó S. cerevisiae. Este microorganismo también mejoró la

resistencia a la vibriosis en juveniles de camarón L. vannamei (Scholz et al., 1999). La levadura

marina, Yarrowia lipolytica, mejoró la supervivencia y el crecimiento de la ostra perlera o

Madreperla, Pinctada mazatlanica (Aguilar-Macías et al., 2010). Tovar et al. (2004) reportaron

que la incorporación del 1,1 % de D. hansenii (cepa CBS 8339) en la dieta de larvas del pez

Dicentrarcus labrax, incrementó en un 10 % la supervivencia y duplicó el peso de los grupos

tratados con respecto al grupo control. Sajeevan et al. (2006) evaluaron una levadura marina

(Candida sake) en el camarón de la India (Fenneropenaeus indicus), concluyendo que los

camarones tratados con una dieta que incluyó 10 % de esta levadura, mostraron un 44 % de

supervivencia y estimularon su sistema inmune. Yang et al. (2010) observaron un incremento en

el peso y en la supervivencia de juveniles de camarón L. vannamei, al ser tratados con una dieta

en la que se incluyó la levadura Rhodosporidium paludigenum, al 1 %.

1.6. Características generales de los actinomicetos

Los actinomicetos son microorganismos abundantes en el suelo, sin embargo se encuentran

también en ambientes acuáticos, tanto dulces como marinos (Leiva et al., 2004). Entre sus

características particulares se encuentra la de producir un olor típico a suelo húmedo, debido a la

producción de un metabolito denominado geosmina (Suffett et al., 1996). Además, se

caracterizan por presentar una actividad metabólica alta, y producir terpenoides, pigmentos y

enzimas extracelulares que les confieren una gran capacidad para degradar la materia orgánica de

origen vegetal y animal. Los actinomicetos constituyen un grupo heterogéneo de

24
 Capítulo I
microorganismos; son bacterias Gram positivas que se caracterizan por su capacidad de formar

filamentos ramificados. El orden de los Actinomycetales comprende 63 géneros, constituyendo

aproximadamente del 20 al 60 % de la población microbiana total del suelo (Ezziyyani et al.,

2004).

Actualmente, los actinomicetos se encuentran incluidos en el dominio bacteria debido a las

siguientes razones: (1) su pared celular está compuesta por péptidoglicanos, (2) el diámetro de

sus hifas (0,5 a 2, μm) f r r h g , (3) son sensibles a los antimicrobianos,

pero (4) presentan resistencia a los antifúngicos y (5) la disposición de su material genético es

típicamente procariótico (Sylvia et al., 2005). Se caracterizan por presentar un alto contenido de

guanina y citosina en su ADN, encontrándose entre el rango de 51 a 78 % G+C. Estas bacterias

son generalmente aerobias pero algunas son anaerobias, pudiéndose encontrar en animales o en el

hombre; son heterótrofas, por lo cual pueden utilizar fuentes de carbono simples o complejas, y

compuestos moleculares orgánicos tales como ácidos, azúcares, polisacáridos, lípidos, proteínas e

hidrocarburos alifáticos. Los actinomicetos utilizan como fuentes de nitrógeno amonio, nitratos,

aminoácidos, peptonas y un gran número de proteínas (Leveau y Bouix, 2000).

Los actinomicetos son los miembros más importantes en el mundo microbiano por su potencial

para producir compuestos biológicamente activos. Alrededor del 45 % de todos los compuestos

bioactivos obtenidos a partir de microorganismos son producidos por actinomicetos (Berdy,

2005). Los antibióticos utilizados en la práctica clínica tales como la fosfomicina, lincomicina,

neomicina, estreptomicina, daptomicina, la eritromicina y la tetraciclina son producidos por el

género Streptomyces perteneciente al Orden Actinomycetales (Mahajan y Balachandran, 2011 y

Ullah et al., 2012). Streptomyces es un género de bacterias Gram positivas, que crece en

diferentes entornos y su forma se asemeja a los hongos filamentosos. La diferencia morfológica

de Streptomyces implica la formación de una capa de hifas que pueden diferenciarse en una

25
 Capítulo I
cadena de esporas. Los miembros de este géner son habitualmente reconocidos como

microorganismos GRAS (según sus siglas en inglés) (Lanoot, 2005). La propiedad más

interesante de Streptomyces es la capacidad de producir metabolitos secundarios bioactivos, tales

como antifúngicos, antivirales, antitumorales, antihipertensivos, inmunosupresores y

especialmente antibióticos. La producción de la mayoría de los antibióticos es específico de la

especie, y estos metabolitos secundarios son importantes para las especies del género

Streptomyces, ya que les confieren una capacidad especial para competir con otros

microorganismos con los que entran en contacto, incluso con especies del mismo género (de

Lima Prócopio et al., 2012).

1.7. Metabolitos producidos por actinomicetos marinos

Los productos naturales constituyen la fuente más propicia de obtención de antibióticos (Bull y

Stach, 2007 y Reen et al., 2015). Hay aproximadamente 32 500 productos naturales obtenidos a

partir de fuentes microbianas, incluyendo alrededor de 1 000 metabolitos derivados de

microorganismos marinos (Singh y Pelaez, 2008 y Romano et al., 2016).

Los actinomicetos marinos son productores de varios antibióticos (Baltz, 2008); y se ha

determinado que éstos son más efectivos en el tratamiento de las infecciones microbianas porque

las bacterias terrestres no han desarrollado resistencia contra ellos (Donia y Hamman, 2003).

Debido a la necesidad de buscar nuevos agentes antibacterianos, las actinobacterias constituyen

una fuente por demás importante para la obtención de compuestos antimicrobianos con

estructuras novedosas. Entre las actinobacterias, las especies del género Streptomyces producen

alrededor de 7 600 compuestos bioactivos, aproximadamente el 80 % del total de antibióticos

disponibles actualmente en el mercado (Valli et al., 2012).

Hasta la fecha existen pocos estudios sobre la aplicación de actinomicetos como probióticos en

la acuicultura (Das et al., 2006, Kumar et al., 2006 y Lakshmi y Rosamma, 2008). La mayoría de

26
 Capítulo I
los probióticos propuestos como agentes de control biológico en la acuicultura son bacterias

ácido lácticas (Lactobacillus, Carnobacterium, etc.), Bacillus spp. y Pseudomonas spp.

(Verschuere et al., 2000b). Dhevendaran y Annie, (1999) realizaron un trabajo para evaluar

especies marinas del género Streptomyces y demostraron que pueden producir antibióticos in

vitro, que inhiben el crecimiento de Vibrio spp. en peces y crustáceos. You et al. (2007)

recomendaron el uso de actinomicetos para prevenir las infecciones causadas por Vibrio spp.

Sahu et al. (2007) aislaron cepas de actinomicetos de muestras de agua y sedimento, las mismas

fueron evaluadas frente a patógenos del género Vibrio que causan enfermedades en camarones.

Recientemente, Velmurugan et al. (2015) realizaron una investigación para evaluar el efecto de

bacterias probióticas en el cultivo de camarón (P. monodon), donde emplearon como probióticos

Streptomyces de origen marino. Con este trabajo se demostró que las cepas de Streptomyces

ayudan al hospedero a incrementar su resistencia a diversas infecciones causadas por Vibrio. Patil

et al. (2001) aislaron cepas de Streptomyces de agua y sedimento marino, que mostraron

actividad inhibitoria frente a patógenos de peces (Aeromonas hydrophila, A. sobria y

Edwardsiella tarda). Estos resultados sugieren que Streptomyces de origen marino pueden tener

una futura aplicación en los sistemas de acuicultura. Augustine et al. (2015) sugieren que

Streptomyces rubrolavendulae M56 aislado de sedimentos marinos es una prometedora

alternativa al uso de antibióticos y puede contribuir de manera significativa como un agente de

biocontrol en los sistemas de producción de larvas de camarón. Sridevi y Dhevendaran (2014)

estudiaron el efecto probiótico de cepas de Streptomyces aisladas de algas marinas, en larvas de

Macrobrachium rosenbergii. Los resultados revelaron mayor tasa de crecimiento, reducción de la

mortalidad y aumento de la actividad enzimática de los grupos tratados, con relación al grupo

control. Das et al. (2006) demostraron que la suplementación del alimento con Streptomyces

mejoró el crecimiento, la supervivencia, y la resistencia a las enfermedades en el camarón P.

27
 Capítulo I
monodon. Dharmaraj y Dhevendaran (2010) evaluaron el crecimiento en peces ornamentales

Xiphophorus helleri tratados con una cepa probiótica de Streptomyces. Los autores concluyen que

en un futuro próximo la aplicación de Streptomyces como probiótico jugará un papel importante

en la acuicultura.

En un estudio realizado por Das et al. (2010) se demostró que cepas marinas de Streptomyces

pueden proteger a los nauplios y adultos de Artemia, de la infección causada por Vibrio spp. y

que no son tóxicos para los camarones, pues son capaces de protegerlos de Vibrio spp. Por lo

antes expuesto, los actinomicetos del género Streptomyces pueden ser incluidos entre los posibles

agentes de control biológico en la acuicultura en el futuro cercano.

Los trabajos realizados por León et al. (2016) señalan al molusco pectínido Argopecten

purpuratus como una fuente promisoria para el aislamiento de nuevas cepas de Streptomyces con

alta capacidad bioactiva y antagonista contra patógenos de importancia en la acuicultura, y con

posibilidades de ser utilizadas en el futuro como potenciales agentes probióticos. Por otra parte,

se ha descrito la capacidad de cepas de Streptomyces de origen cubano de producir metabolitos

secundarios con actividad antimicrobiana que avalan la búsqueda de cepas probióticas novedosas

a partir de este género (Thaker et al., 2012).

Los conceptos analizados en este capítulo de revisión bibliográfica contribuyen a formular la

hipótesis y objetivos de la presente tesis doctoral.

28
 CAPÍTULO II
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN IN
VITRO DE ACTINOMICETOS CANDIDATOS A
PROBIÓTICOS
 Capítulo II

CAPITULO II: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN IN VITRO DE

ACTINOMICETOS CANDIDATOS A PROBIÓTICOS

2.1. Introducción

El desarrollo de microorganismos probióticos capaces de controlar patógenos en ambientes

acuáticos constituye una alternativa biotecnológica para disminuir la mortalidad en cultivos de

organismos marinos de importancia comercial (Irianto y Austin, 2002). En este sentido, los

microorganismos marinos, en particular los actinomicetos, son de considerable interés en

biotecnología debido a la capacidad de producir diversos metabolitos secundarios bioactivos

con actividad biológica y a la vez exoenzimas, que en el medio acuático contribuirían a

reducir la presencia de patógenos y la carga orgánica respectivamente (Das et al., 2008 y

Dharmaraj, 2011 ).

De ahí que el presente capítulo tenga como objetivo:

1. Aislar y evaluar in vitro actinomicetos con potencialidades probióticas e identificar

molecularmente los candidatos a probióticos para su uso en la acuicultura.

2.2. Materiales y métodos

Área de muestreo

Se recolectaron 12 muestras de sedimentos marinos de zonas costeras de Cuba,

específicamente de Nazabal (22°45'56"N, 79°44'14"O), Varadero (23°7'5"N, 81°16'7"O),

Cienfuegos (22°4'27"N, 80°24'13"O) y Ciego de Ávila (22°10'22"N, 78°38'7"O), en frascos

estériles y transportadas de inmediato al laboratorio de Microbiología del Centro de

Bioactivos Químicos de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, en

29
 Capítulo II
donde fueron almacenadas a temperatura de 4 °C y procesadas dentro de las 72 horas

posteriores a la recogida.

Procesamiento de las muestras y aislamiento de actinomicetos

De cada muestra se tomó 1 g de sedimento y se suspendió en 9 mL de agua de mar estéril

mediante agitación con vórtex. Las suspensiones se incubaron durante 6 min en baño de maría

a temperatura de 55 °C (Pisano et al., 1986), y a continuación se realizaron diluciones

decimales en agua de mar estéril hasta obtener una dilución final equivalente a 10-5 de la

concentración inicial. A partir de cada dilución final se sembraron 100 µL en placas de ACA

(almidón 10 g, K2HPO4 2 g, KNO3 2g, caseína 0,3 g, MgSO4·7H2O 0,05 g, CaCO3 0,02 g,

FeSO4·7H2O 0,01 g, agar 15 g, agua de mar 1L), AAH (ácido húmico 1 g, K2HPO4 0,5 g,

FeSO4·7H2O 0,001 g, agar 20g, solución de vitamina B 1 mL (tiamina-HCl (50 mg),

riboflavina (50 mg), niacina (50 mg), pyridoxina-HCl (50 mg), inositol (50 mg), Ca-

pantotenato (50 mg), ácido p-aminobenzoico (50 mg), biotina (25 mg) y agua destilada (100

mL), ISP2 (extracto de levadura, 4 g; extracto de malta, 10 g; dextrosa, 4 g; agar, 15 g) y

AMM (almidón, 10 g; extracto de levadura, 4 g; peptona, 2 g; agar, 18 g; agua de mar, 1 L),

suplementados con cicloheximida (100 µg mL-1) y ácido nalidíxico (30 µg mL-1) para evitar

el desarrollo de especies indeseables, particularmente de hongos.

Las placas se incubaron a 30 ºC durante 21 días. Las colonias aisladas con morfología típica a

actinomicetos (cultivos puros) se conservaron en 20 % de glicerol a -20 °C para estudios

posteriores.

Análisis de la actividad antimicrobiana

Se determinó la actividad antagónica de los aislados frente a cuatro especies de Vibrio: Vibrio

algynolyticus (CAIM 57), Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802), Vibrio harveyi (CAIM

1793) y Vibrio vulnificus (CAIM 157), aplicando el método de difusión en agar (González et

30
 Capítulo II
al., 2005). Las cepas CAIM fueron obtenidas de la colección de Microorganismos de

Importancia Acuática (C.A.I.M., siglas en inglés) pertenecientes al Centro de Investigación

para la Nutrición y Desarrollo, Unidad Mazatlán para Acuicultura y Manejo Ambiental de

México y la cepa ATCC (American Type Culture Collection; http://www.atcc.org), de la

colección de microorganismos del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.

(CIBNOR-México).

Los microorganismos fueron cultivados en TSB (Caldo Tripticasa Soya) con 3 % (p/v) de

NaCl e incubadas a 30 ºC por 24 horas. El cultivo se centrifugó a 5 000 x g durante 10 min, se

eliminó el sobrenadante y el precipitado bacteriano se resuspendió en una solución estéril de

NaCl al 3 % (p/v). Se determinó la densidad óptica a 600 nm, la cual se ajustó a 1,0 para

obtener una concentración de 1x109 UFC mL-1. A partir de la muestra con densidad de 1,0 se

hicieron las diluciones requeridas para las pruebas de antagonismo.

Cada uno de los microorganismos aislados se sembró en placas de ACA y se incubaron a

30 °C durante 7 días. Las cepas de Vibrio spp. se sembraron en toda la superficie de las placas

petri con TSA (Agar Tripticasa Soya), suplementadas con cloruro de sodio al 3 % (p/v),

estableciendo una carga microbiana de 1x108 UFC mL-1. Seguidamente, se extrajeron

muestras circulares en forma de disco (plugs) de 6 mm de las placas con actinomicetos y se

colocaron en la superficie de las placas sembradas con vibrios, utilizando como control, plugs

sin actinomicetos. La actividad antimicrobiana se evaluó y se expresó tomando como

referencia el diámetro del halo de inhibición (mm), alrededor de cada plug, el cual se midió a

las 48 horas de incubación a 35 ºC.

Análisis de la actividad hemolítica

Para determinar la actividad hemolítica de los actinomicetos seleccionados, se utilizó agar

base sangre, con 5 % (v/v) de sangre humana y 2,5 % (p/v) de NaCl. Los aislados que

31
 Capítulo II
presentaron actividad antimicrobiana se sembraron por estría simple y se cultivaron durante 7

días a 30 ºC. Se determinó el tipo de hemólisis de los aislados como: α (parcial), ß (total) ó γ

(sin halo de hemólisis) (Cowan y Steel, 1993). Se seleccionaron los microorganismos con

hemólisis del tipo γ (no hemolíticas) para estudios posteriores. Para los efectos

correspondientes, se empleó una cepa control ß-hemolítica de V. parahaemolyticus.

Pruebas de hidrofobicidad

Rojo Congo

Los aislados de actinomicetos con actividad antimicrobiana y no hemolíticas fueron

seleccionadas y se sembraron por estrías en placas de TSA con 3 % de cloruro de sodio y

0,03 % de Rojo Congo y se incubaron a 30 °C durante 7 días (Berkhoff y Vinal, 1986). Se

consideró un resultado positivo cuando las colonias adquirieron coloración rojiza oscura y

negativo cuando tomaron coloraciones de blanco a translúcido (Sharma et al., 2006).

Adhesión Bacteriana a Hidrocarburos

Para evaluar la adhesión bacteriana a hidrocarburos (Bacterial Adhesion to Hydrocarbons;

BATH, por sus siglas en inglés), se aplicó la metodología descrita por Sweet et al. (1987).

Los aislados de actinomicetos se cultivaron en TSB a 30 ºC por 7 días, bajo condiciones de

agitación, 120 rpm.

Las células de cada cultivo fueron lavadas con buffer PBS (NaCl, 137 mM; KCl, 2,7 Mm;

Na2HPO4, 2 Mm; pH 7,4) por centrifugación en tres ocasiones a 5 000 x g, y posteriormente

el cultivo se llevó a una densidad óptica de 1 a 540 nm (109 UFC mL-1). Seguidamente 4

mL de la suspensión se transfirieron a tubos de 15 mL y se mezclaron con 1 mL de xileno.

Los tubos se agitaron en un vórtex por 2 min. Después la mezcla se dejó reposar por 10 min

para asegurar la separación de la fase acuosa y la fase orgánica.

32
 Capítulo II
Finalmente, se extrajo cuidadosamente 1 mL de la fase acuosa y se determinó su densidad

óptica a 540 nm. Se realizó tres réplicas por cepa. El porcentaje de hidrofobicidad se calculó

mediante la siguiente fórmula:

H (%)= (DOi-DOf)/DOix 100; Donde: H = Hidrofobicidad; DOi = densidad óptica de la

suspensión antes de la mezcla; DOf = densidad óptica después de la mezcla.

Los aislados fueron considerados como muy hidrofóbicos cuando los valores fueron mayores

al 50 %, ligeramente hidrofóbicos cuando los valores estuvieron en un rango de 20-50 % e

hidrofóbicos cuando los valores fueron menores al 20 % (Mattos-Guaraldi et al., 1999).

Producción de sideróforos

Para la detección de sideróforos se utilizó un compuesto quelante de hierro, el crome azurol S

(CAS), que utiliza un complejo hierro–colorante que cambia su color al perder hierro, de azul

a anaranjado. Los aislados seleccionados (V4, N7 y RL8) se sembraron por estrías sobre

placas con CAS-agar (para preparar 1 L de medio CAS-agar se disolvió 60,5 mg de CAS en

50 mL de agua y posteriormente se mezcló con 10 mL de una solución que contenía

FeCl3·6H2O 1 mM disuelto en HCl 10 mM. La solución resultante se añadió lentamente y con

agitación a otra solución que contenía 72,9 mg de HDTMA disuelto en 40 mL de agua. La

mezcla resultante (solución 1) se autoclavó. También se autoclavó otra solución (solución 2)

que contenía 750 mL H2O, 100 mL medio mínimo M9 (10x), 15 g agar, 30,24 g Pipes y

NaOH para ajustar el pH a 6,8.

Después de enfriar a 50 ºC, se mezclaron 50 mL de la solución 1 con 450 mL de la solución 2,

añadiéndose a esta mezcla acetato sódico 50 mM, NH4Cl 2 mM y 1,5 μL de la solución de

trazas del medio M9 descrita anteriormente. Las placas fueron incubadas a 30 ºC durante 7

días, zonas anaranjadas alrededor de las colonias, fueron consideradas como

microorganismos productores de sideróforos (Payne, 1994). Las placas se sembraron

colocando un punto de cultivo en el agar.

33
 Capítulo II

Actividad enzimática

Para determinar la capacidad enzimática de los aislados se realizaron bioensayos para detectar

la actividad hidrolítica de sustratos tipo proteínas, lípidos y carbohidratos.

Hidrólisis del almidón (producción de amilasas): La actividad amilolítica se determinó por el

método de difusión radial, para ello se utilizaron placas de agar marino suplementadas con 2

% (p/v) de almidón (León et al., 2000). Las placas fueron incubadas a 30 ºC por 7 días. La

producción de amilasa se determinó midiendo los halos alrededor de las colonias de

actinomicetos después de la adición de una solución de lugol a la superficie de la placa.

Hidrólisis del Tween 80 (producción de lipasas): Para medir la actividad lipolítica se empleó

el medio Agar Tween (Harley y Prescott, 2002): peptona, 10 g; cloruro de sodio, 5 g; cloruro

de calcio, 0,1 g; agua destilada, 1L; Tween 80, 10 mL; agar, 15 g; pH final 7,0-7,4. Después

de la incubación a 30 ºC por 7 días, los microorganismos que hidrolizan el Tween 80 forman

un halo de precipitación alrededor de las colonias, debido a la combinación del Ca2+ y los

ácidos grasos liberados por la hidrólisis; el cual fue medido.

Hidrólisis de caseína y gelatina (producción de proteasas): Para determinar la capacidad de

los actinomicetos de hidrolizar las proteínas se usó el medio de TSA suplementado con leche

descremada 1 % (p/p) y gelatina 0,4 % (p/p) (Harley y Prescott, 2002). Para medir la

hidrólisis de caseína, fue medido el diámetro de los halos claros alrededor de las colonias

sobre las placas de leche descremada, después de la incubación a 30 ºC durante 7 días. La

hidrólisis de la gelatina fue monitoreada al inundar las placas con una solución de HgCl2

(HgCl2, 15 g; HCl, 20 mL y H2O, 100 mL), después de la incubación a 30 ºC por 7 días. Un

precipitado blanco opaco indicó la presencia de gelatina no hidrolizada y la formación de una

zona clara alrededor del crecimiento bacteriano indicó la hidrólisis de la gelatina; la cual fue

medida.

34
 Capítulo II
Hidrólisis de la celulosa (producción de celulasa): Para evaluar la actividad celulolítica de los

organismos evaluados se utilizaron placas de agar ISP2 suplementadas con CMC al 1 % (p/p).

Los halos claros alrededor de las colonias fueron medidos después de la incubación a 30 ºC

por 7 días con la adición de una solución de lugol (Tuong et al., 2011).

Tolerancia a concentraciones de NaCl y diferentes pH

Para estudiar la tolerancia de los actinomicetos a NaCl, se utilizaron placas de ACA con

diferentes concentraciones de NaCl (0; 0,4; 0,6; 2; 3 y 10 %) (Tresner et al., 1968). La

tolerancia de los microorganismos a pH ácido fue examinada por el crecimiento de los

mismos en TSB a valores de pH de 1; 2; 3; 4 y 7,2. Los aislados fueron observados después

de la incubación en medio líquido o sólido a 37 °C por 7-15 días, y la presencia o ausencia de

crecimiento fue registrado a partir del séptimo día.

Identificación molecular de los microorganismos con potencial probiótico

El ADN total fue extraído de las microorganismos seleccionados (V4, RL8 y N7) y para ello

se utilizó el reactivo PrepMan® Ultra (Applied Biosystems), de acuerdo al procedimiento

descrito por el fabricante. Para amplificar aproximadamente 1,5 kb de los genes del ARNr

16S se usaron los cebadores universales 27f (5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’) y 1492r

(5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT3’).

La amplificación se llevó a cabo en volúmenes de 50 μL conteniendo 1 μg de ADN, 20 μM de

cada cebador, 10 μM de cada dNTP, 5 μL de 10 × MgSO4 y 1U de Polimerasa Taq. Las

reacciones se llevaron a cabo utilizando el siguiente programa: (1) Un ciclo de

desnaturalización inicial a 94 ºC por 3 min, 30 ciclos desnaturalizando a 94 °C por 30

segundos, 47 °C por 33 segundos y 72 °C por 90 segundos y extensión a 72 °C por 7 min

como paso final. Los productos se purificaron utilizando PureLink™ purification kit

(Invitrogen™, EUA).

35
 Capítulo II
Los productos de PCR fueron directamente secuenciados usando el ABI Prism Dye

Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin Elmer™) y el ABI 310 Prism automated DNA

sequencer (Applied Biosystems™).

Las secuencias (> 1420 pb) se compararon con aquellas existentes en la base de datos del

GenBank, usando el BLAST y el algoritmo RDP para identificar las secuencias cercanas

relacionadas (Altschul et al., 1990 y Cole et al., 2005). Los alineamientos de secuencias

múltiples con secuencias de referencia recuperadas del GenBank (DDBJ/ EMBL/GenBank

databases) se ejecutaron mediante el uso del algoritmo MUSCLE implementado en el

software MEGA6 (Tamura et al., 2013), seguido por el recorte manual y antes de los demás

análisis.

El árbol filogenético, basado en las secuencias del gen del ARNr 16S para los

microorganismos seleccionados, se construyó con el empleo del programa MEGA6 con el

algoritmo Neighbour-Joining (Saitou y Nei, 1987), mediante el uso de los parámetros del

método de Kimura 2-parameter (Kimura, 1980) y un muestreo de 1 000 réplicas para

computar las distancias evolutivas y las topologías de los árboles resultantes. La cepa de

Escherichia coli WD01 se usó como grupo de validación externa. El árbol final se construyó

con el programa Consensus usando el método de la regla mayoritaria basado en la base de

datos de Neighbour-Joining.

2.3. Resultados y discusión

Aislamiento de actinomicetos a partir de sedimentos marinos

Se aislaron y purificaron 31 microorganismos por ser Gram positivos, esporulados y presentar

micelios aéreos y de sustrato, características que presentan los actinomicetos (Sylvia et al.,

2005). Inicialmente, las colonias aisladas tenían una apariencia suave, pero más tarde

36
 Capítulo II
desarrollaron micelios aéreos con apariencia granular, en polvo, o aterciopelada. El color del

micelio aéreo y de sustrato varió desde blanco y amarillo a violeta y rosado.

Durante mucho tiempo, se creía que las cepas de actinomicetos aisladas de ambientes marinos

eran producto de los arrastres terrestres y aunque esto puede ser cierto para algunos aislados,

esta percepción general desapareció después del descubrimiento de un actinomiceto indígena

de la biota de ambientes marinos (Mincer et al., 2005 y Kwon et al., 2006). Posteriormente,

varias cepas de actinomicetos fueron aisladas de sedimentos marinos, de esponjas, briozoos y

corales, a menudo como resultado de los esfuerzos para el descubrimiento de metabolitos

secundarios novedosos para el desarrollo de nuevos fármacos (Hodges et al., 2012; Sun et al.,

2012 y Xi y Huang, 2012). Hallazgos recientes demostraron que los actinomicetos también

pueden ser parte de la microbiota de los peces (Sheeja et al., 2011, Sanchez et al., 2012 y Wu

et al., 2012), abriendo así una puerta para el descubrimiento de probióticos potenciales para la

acuicultura de peces, moluscos y crustáceos.

Actividad antimicrobiana y hemolítica

De los 31 aislamientos de actinomicetos procedentes de sedimentos marinos de Cuba, cinco

de ellos mostraron actividad antimicrobiana frente a patógenos del género Vibrio que afectan

a organismos de interés acuícola comercial (tabla 1). Esto equivale a un 16,13 % del total de

los microorganismos aislados. Estos resultados difieren de los obtenidos por You et al.

(2005), quienes mostraron que el 51,1 % de las cepas de actinomicetos aisladas de camarón

tuvieron actividad antimicrobiana contra Vibrio sp. En contraparte, nuestros resultados

concuerdan con Tuong et al. (2016), quienes encontraron un efecto antimicrobiano al evaluar

la cepa de Streptomyces sp. A8, aislada de sedimento de estanque de camarón frente a V.

parahaemolyticus. Por otra parte Augustine (2014) encontró que el 23,4 % de los

actinomicetos aislados mostraron actividad frente V. parahaemolyticus, V. harveyi y Vibrio

37
 Capítulo II
alginolyticus. Ninguno de los aislados de actinomicetos obtenidos de la presente investigación

mostraron actividad frente a Vibrio alginolyticus (tabla 1, anexo 1).

Tabla 1. Actividad antimicrobiana y hemolítica de los actinomicetos aislados de sedimentos

marinos de Cuba.
Actividad antimicrobiana de actinomicetos frente a patógenos acuícolas
Aislados V. parahaemolyticus V. harveyi V. vulnificus Hemólisis
M DE CV M DE CV M DE CV β γ
La7 10,10 0,10 0,99 9,13 0,15 1,67 13,13 0,11 0,87 + -
La12 12,06 0,11 0,95 8,06 0,11 1,43 16,10 0,10 0,62 + -
N7 10,10 0,10 0,99 10,03 0.05 0,57 14,06 0,11 0,82 - +
RL8 16,03 0,05 0,36 12,16 0,15 1,25 21,06 0,11 0,54 - +
V4 18,10 0,10 0,55 12,06 0,11 0,95 22,10 0,10 0,45 - +
M: media (mm), DE: desviación estándar, CV: coeficiente de variación (%).

Una de las principales características a considerar en una especie bacteriana, durante la

evaluación de su potencial probiótico in vivo, es su inocuidad, tanto para el hospedero

objetivo como para el ser humano que es el consumidor final de la especie cultivada. La

prueba de hemólisis es una de las más aplicables en este sentido, ya que se basa en la

capacidad de las bacterias para lisar las células sanguíneas del hospedero. El ensayo de

hemólisis que se realizó para los microorganismos que exhibieron actividad antimicrobiana,

mostró que sólo los aislados V4, RL8 y N7 fueron no hemolíticos (γ hemólisis),

contrariamente a los aislados La7 y La12, que fueron hemolíticos (tabla 1).

Las pruebas de toxicidad son importantes no sólo para descartar aquellas pocas especies de

algunos géneros de actinomicetos, tales como Nocardia y Mycobacterium, las cuales se

reportaron como patogénicas para peces (Wang et al., 2005 y Arafah et al., 2013), sino

también para aquellas cepas que producen metabolitos secundarios tóxicos. Por consiguiente,

los tres aislados γ hemolíticos obtenidos durante la presente investigación, son los candidatos

probióticos más promisorios de los 31 actinomicetos aislados de sedimentos marinos de Cuba,

38
 Capítulo II
porque son activos frente a especies del género Vibrio, y no hemolíticos y por tanto no

productores de sustancias tóxicas que pudieran provocar daños a peces y crustáceos.

Prueba de hidrofobicidad

La capacidad de adherencia de los aislados que mostraron actividad antimicrobiana y fueron

no hemolíticos, se determinó in vitro, en base a la hidrofobicidad de la cepa, evidenciada por

su capacidad de unión al colorante Rojo Congo y al solvente xileno (Rosenberg et al., 1980).

Dichas técnicas resultaron útiles para evaluar de manera no específica el grado de

hidrofobicidad de los microorganismos aislados y permitieron tener una idea de la capacidad

de adhesión que podrán presentar dentro del hospedero. Como estas pruebas no son

determinantes, es necesario llevar a cabo un estudio más específico con mucus del hospedero,

que podrá proveer mayor información. Los aislamientos V4, RL8 y N7 presentaron una

coloración rojiza para la prueba de Rojo Congo, lo cual indica de manera cualitativa el

carácter hidrofóbico de los aislados. Para la prueba BATH, todos los aislados presentaron

valores de hidrofobicidad mayores del 50 %, lo cual se considera como un buen indicador del

carácter hidrofóbico de los aislados, y por ende mayor capacidad para adherirse a la mucosa

intestinal y, posteriormente colonizarla (tabla 2).

Tabla 2. Hidrofobicidad, producción de sideróforos, tolerancia a NaCl (%) y crecimiento a

diferentes pH de los actinomicetos aislados de sedimentos marinos.
Cepa Hidrofobicidad Sid Tolerancia a NaCl (%) Crecimiento a pH
RC BATH (%) 0 0,4 0,6 2 3 10 1 2 3 4 7.2
N7 + 84,6 + +++ +++ +++ +++ +++ +++ – – – +++ +++

RL8 + 77,6 + – – + +++ +++ +++ – – – +++ +++

V4 + 64,4 - +++ +++ +++ +++ +++ +++ – – – +++ +++

RC: Rojo Congo, BATH: Adhesión Bacteriana a Hidrocarburos, Sid: sideróforos.

Una de las características más importantes de un probiótico es su capacidad de adhesión al

tracto digestivo del hospedero, para asegurar su colonización. Esta característica es un

proceso muy complejo, ya que depende de muchas variables, como el tipo de sustrato y las

39
 Capítulo II
propiedades de las células bacterianas. La adhesión ocurre en dos fases; una inespecífica

basada en fuerzas de atracción y repulsión que impactan sobre la hidrofobicidad de las

superficies y permiten iniciar la colonización (Nadell et al., 2009), y la otra específica, que

ocurre por interacciones entre proteínas de la pared celular de las bacterias que actúan como

adhesinas y los receptores de las células epiteliales (Hinsa et al., 2003).

La hidrofobicidad de la superficie bacteriana juega un papel importante en la adhesión, debido

a que cuanto menos polar es una, o ambas superficies involucradas, es mayor la cantidad de

interacciones hidrofóbicas que tienden a establecerse. En este contexto, es importante

considerar que a pesar de estar cargadas negativamente, la mayoría de las bacterias contienen

componentes hidrofóbicos en su superficie (Rosenberg y Kjelleberg, 1986).

Producción de sideróforos

En este estudio los aislados RL8 y N7 produjeron sideróforos. El hierro es un metal

bioactivo limitante en el agua de mar y es esencial para el crecimiento de bacterias marinas

(Reid et al., 1993). Por lo tanto, las bacterias marinas tienen que desarrollar estrategias para

adquirir el hierro, y la estrategia principal es la producción y utilización de sideróforos, que

son agentes quelantes de hierro de bajo peso molecular, los cuales son sintetizados y

excretados por muchos microorganismos.

Los actinomicetos marinos que pueden producir sideróforos podrían adaptarse a las

condiciones de estrés de hierro en el medio marino, e incluso competir por hierro con los

patógenos. La competencia por el hierro es también un posible mecanismo de acción que

pueden tener los actinomicetos probióticos para controlar a los patógenos en la acuicultura de

camarones y ostiones con un alto valor comercial.

En gran número de estudios se ha analizado la producción de sideróforos por parte de

microorganismos como potenciales agentes para el biocontrol antagónico. El antagonismo

permite desplazar e inhibir la proliferación de agentes patógenos mediante la competencia

40
 Capítulo II
por el el hierro biodisponible, cuando el patógeno utiliza este mismo mecanismo y necesita de

este elemento para su crecimiento (Sullivan, 2001). Así, por ejemplo, ciertas levaduras

aisladas de ambientes marinos inhiben el crecimiento de V. anguillarum y V.

parahemolyticus, mediante la producción de sideróforos (Wang et al., 2009), sugiriéndose por

parte de la industria piscícola que en granjas con altas densidades de cultivo se deberían

utilizar bacterias con esta capacidad, para lograr un efectivo control de la proliferación de

enfermedades infecciosas (Fgaier y Eberl, 2011). En este sentido, las cepas de Streptomyces

productoras de sideróforos, pueden influir en el crecimiento de Vibrio spp. patógenos por

medio de una competición por el hierro disponible en los sedimentos marinos (Hieu et al.,

2011). Un ejemplo de esto es que una cepa de Streptomyces sp. A1, aislada de muestras de

sedimento marino de estanques de cultivo de camarón, mostró actividad contra dos cepas

patógenas de Vibrio sp. (V7 y V10), a través de la producción de compuestos inhibidores y de

sideróforos (Tuong et al., 2011).

Tolerancia a concentraciones de NaCl y diferentes pH

Los aislados de actinomicetos seleccionados (V4, N7, RL8) en la presente investigación

tuvieron un comportamiento similar a diferentes valores de pH; no crecieron a valores de pH

entre 1 y 3, pero crecieron a un pH superior a 3 (tabla 2). Se estima que la tasa de

supervivencia de los probióticos tradicionales en el intestino del hospedero es solamente del

20-40 %, siendo la acidez gástrica uno de los principales obstáculos para su supervivencia

(Bezkorovainy, 2001). El pH del TGI de los camarones y ostiones oscila entre 5 y 6,2, por

tanto estos aislados pueden ser utilizados como candidatos probióticos en estos organismos

marinos ya que pueden tolerar pHs superiores a 3. A pesar de que los aislamientos obtenidos

durante este estudio no pueden soportar un pH entre 1 y 3, se podrían esperar mayores tasas

de supervivencia en comparación con los probióticos bacterianos tradicionales, ya que

muchos actinomicetos son capaces de producir esporas resistentes a condiciones de estrés

41
 Capítulo II
tales como la acidez (Velmurugan et al., 2015); pensando en la utilización de estos

microorganismos como candidatos probióticos en peces marinos donde el pH del TGI es

ácido en las primeras porciones del mismo.

Dado al gran número de actinomicetos que son indudablemente arrastrados desde la orilla de

la costa hacia el mar, es importante distinguir entre las cepas que surgieron debido a cambios

ambientales marinos específicos y las cepas que están disponibles en ese ambiente como

esporas latentes (Jensen et al., 2005). Esta distinción es de suma importancia si se pretende

utilizar esas cepas como probióticos, ya que deben poseer crecimiento activo para ejercer su

efecto. Los aislamientos N7 y V4 crecieron a concentraciones de NaCl desde 0 a 10 %,

mientras que el aislado RL8 necesita concentraciones de NaCl superiores a 0,6 % en el medio

de cultivo para crecer. A medida que estos microorganismos son capaces de crecer a

concentraciones altas de sal, es razonable esperar que puedan permanecer activas en

ambientes marinos y en el intestino del hospedero. La tolerancia a la salinidad es una

propiedad muy importante y deseable para probióticos utilizables en la acuicultura de especies

marinas. Debido a la amplia gama de salinidades que pueden encontrar en su tránsito por el

hospedero anfitrión y en el medio acuático, particularmente cuando se tiene el propósito de

utilizarlos en especies marinas como ostión y camarón, las cepas deben crecer

satisfactoriamente para ejercer su efecto.

Actividad enzimática extracelular

Los actinomicetos son conocidos por su capacidad de producir varias enzimas extracelulares

que descomponen la materia orgánica, tales como almidón, celulosa, proteínas y lípidos

(Chater et al., 2010 y Prakash et al., 2013). Los tres aislados de actinomicetos más

promisorios para su utilización como candidatos probióticos mostraron diferentes actividades

enzimáticas extracelulares (tabla 3).

42
 Capítulo II

Tabla 3. Actividad enzimática de los aislados de actinomicetos seleccionados.

Proteinasa
Cepa Amilasa Lipasa Celulasa Caseinasa Gelatinasa
N7 +++ +++ + + ++

RL8 +++ – + + +

V4 – +++ + – ++
Tamaño del halo de hidrólisis (mm): -,0; +, ≤ 5; ++, > 6, +++, > 15.

El aislado N7 fue capaz de degradar todas las macromoléculas (proteínas, lípidos y

carbohidratos); RL8 no mostró actividad de la lipasa y V4 fue incapaz de degradar el almidón

y la caseína. En los sistemas de acuicultura, los probióticos pueden ayudar a los peces,

camarones y mariscos en la digestión de los alimentos, maximizar el crecimiento y mejorar la

calidad del agua, mediante la degradación de la materia fecal y el alimento no consumido en

las plantas de incubación, tanques y estanques de engorde (Das et al., 2008). Tuong et al.

(2016) evaluaron una cepa de Streptomyces sp., la cual produjo enzimas extracelulares, que

pueden ser utilizadas en la descomposición de compuestos orgánicos. Esto revela el potencial

que tienen estos microorganismos como coadyuvantes en los ciclos de mineralización en los

estanques de cultivo de camarón. En el presente estudio, el aislado N7 exhibió la capacidad de

degradación más completa de los compuestos macromoleculares. Sin embargo, la actividad

antimicrobiana de este microorganismo fue menos potente que la representada por V4 y RL8.

Teniendo en cuenta todos los parámetros in vitro tamizados, los tres aislados no hemolíticos

son candidatos a agentes probióticos. Sin embargo, los aislados N7 y RL8 se destacan sobre

V4 dado que fue el único que no fue capaz de producir sideróforos y con menor espectro de

actividad enzimática extracelular (tablas 1, 2 y 3).

Identificación molecular de los actinomicetos seleccionados

El análisis filogenético del gen del ARNr 16S reveló que las cepas N7 y V4 tuvieron un 99 %

de similitud con Streptomyces spp. Por otro lado la cepa RL8 mostró 98,0 y 98,2 % de

43
 Capítulo II
identidad con Streptomyces panacagri y Streptomyces flocculus, respectivamente. Las

secuencias del gen del ARNr 16S de las cepas RL8, N7 y V4 se depositaron en el GenBank,

Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) bajo los

números de acceso KM590924, KM590925 y KM590926, respectivamente. Las tres cepas

probióticas más prometedoras (N7, RL8 y V4) son miembros del género Streptomyces (figura

4), el cual se encuentran entre los géneros más ricos en la producción de antibióticos en el

orden Actinomycetales (Berdy, 2005). Del mismo modo, se puede esperar que otros

miembros productores de antibióticos, tales como Micromonospora y Actinoplanes, y cepas

productoras de enzimas extracelulares de actinomicetos puedan surgir como candidatos

probióticos prometedoras en un futuro próximo.

Figura 4. Árbol filogenético derivado de la secuenciación del gen del ARNr 16S de las cepas
de actinomicetos (V4, N7 y RL8) y especies estrechamente relacionadas.

2.4. Conclusiones parciales

1. Se demostró que las cepas de Streptomyces spp. seleccionadas (V4, N7 y RL8) fueron

las que presentaron mejor actividad frente a los vibrios patógenos evaluados (V.

parahaemolyticus, V. harveyi y V. vulnificus) y no presentaron actividad hemolítica.

44
 Capítulo II
2. Se comprobó que las cepas de Streptomyces spp. seleccionadas (V4, N7 y RL8)

presentaron porcentajes de hidrofobicidad elevados, indicando que poseen un alto

potencial de adhesión. Las tres cepas tuvieron un comportamiento similar a los

diferentes pH evaluados, y crecieron en alta salinidad, a partir de una concentración de

0,6 % de cloruro de sodio, lo que sugiere capacidad para resistir ambientes estresantes

como alta salinidad y la acidez gástrica del TGI (tracto gastrointestinal) del hospedero.

3. Se comprobó que las cepas de Streptomyces spp. (RL8 y N7) presentaron actividad

enzimática in vitro y produjeron sideróforos, por lo que se puede asumir que tienen un

potencial probiótico y aplicabilidad en la acuicultura.

45
 Capítulo III

CAPITULO III. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROBIÓTICA DE

STREPTOMYCES SPP. EN EL CULTIVO DE OSTIÓN C. SIKAMEA Y C.

CORTEZIENSIS, Y SU EFECTO EN LA MICROBIOTA ASOCIADA A C. SIKAMEA

3.1. Introducción

En el capítulo presedente se demostraron las características in vitro de las cepas de

Streptomyces spp. V4, RL8 y N7 como candidatas a agentes probióticos. Sin embargo, es

imprescindible comprobar la respuesta biológica de los animales cuando se adicionan estos

cultivos (FAO/WHO, 2002).

Entre los moluscos de interés comercial acuícola y pesquero, los ostiones son quizás el grupo

más importante a nivel mundial (Romalde et al., 2013). La gran abundancia, distribución,

aceptación como alimento y adaptabilidad a diferentes condiciones ecológicas de algunas

especies, ha facilitado su amplia y exitosa introducción en diferentes regiones, con fines de

cultivo (FAO, 2014). Estos organismos son especialmente sensibles a las enfermedades

infecciosas porque son animales filtradores y al ser liberados al medio acuático durante etapas

ontogénicas tempranas, comparten el entorno con diversas bacterias, tanto benéficas como

altamente patogénicas, como algunas especies del género Vibrio (Prado et al., 2010), que

eventualmente pueden producir enfermedades infecciosas graves y por tanto provocar grandes

pérdidas económicas (Garnier et al., 2007).

Por las razones antes expuestas el objetivo de este capítulo fue:

1. Evaluar in vivo la actividad probiótica de microorganismos candidatos a probióticos en

juveniles de ostiones (C. sikamea y C. corteziensis) y modulación de la microbiota

asociada a C. sikamea.

46
 Capítulo III

3.2. Materiales y métodos

Cepas bacterianas

Las cepas de Streptomyces spp. (V4, RL8 y N7) fueron seleccionadas a partir de estudios

previos in vitro e identificadas por medio de técnicas moleculares, según resultados obtenidos

en el capítulo II. La mezcla de Bacillus, denominada BMix, fue formulada con las cepas

Bacillus tequilensis (YC5-2), Bacillus endophyticus (C2-2) y Bacillus endophyticus (YC3-b)

en proporción 1:1:1, pertenecientes a la colección de microorganismos del Centro de

Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR) y con probada actividad probiótica

en estudios in vitro e in vivo (Luis-Villaseñor et al., 2011).

Cultivo de microorganismos

Todos los microorganismos se cultivaron en TSB; los actinomicetos se incubaron con

agitación a 30 °C durante siete días y los bacilos con los cuales se preparó la mezcla BMix, se

incubaron a 35 °C durante 24-48 horas. Después del tiempo de incubación, los cultivos se

centrifugaron a 4 696 × g a 4 °C durante 10 min, eliminando el sobrenadante y lavando dos

veces con agua de mar estéril. La biomasa resultante se resuspendió con agua de mar estéril,

en la proporción requerida para obtener una densidad óptica equivalente a 1; a 600 nm para

los actinomicetos y a 540 nm para bacilos, a fin de obtener una concentración final de trabajo

de 1 x 109 UFC mL-1.

Evaluación de actinomicetos y bacilos en ostión C. corteziensis y C. sikamea, en función

del crecimiento

Se utilizaron juveniles de ostión de placer C. corteziensis (21 ± 0.65 mm; 0.83±0.14 g) y

ostión kumamoto C. sikamea (17± 1.20 mm; 1.11±0.10 g), producidos en el laboratorio de la

empresa Acuacultura Robles, La Paz, B.C.S., México. Después de su aclimatación durante

una semana, los ostiones fueron mantenidos durante 30 días en unidades experimentales de

plástico de 4 L de capacidad, con agua de mar filtrada a 1 µm y esterilizada por luz

47
 Capítulo III
ultravioleta, a temperatura de 29±1 ºC, salinidad de 37 ups y aireación constante. Las

unidades fueron dispuestas en tanques de fibra de vidrio con sistema tipo baño maría

recirculante, para mantener una temperatura constante. En cada unidad experimental se

colocaron 30 juveniles, para conformar cinco tratamientos, con tres réplicas cada uno,

incluyendo tres actinomicetos V4 (Streptomyces sp. V4); RL8 (Streptomyces sp. RL8); N7

(Streptomyces sp. N7); una mezcla de bacilos BMix (Bacillus tequilensis YC5-2, Bacillus

endophyticus C2-2 y Bacillus endophyticus YC3-B; en proporción 1:1:1) y un grupo Control

(sin aditivos). Los juveniles fueron alimentados con microalgas cultivadas (Isochrysis

galbana y Chaetoceros calcitrans en proporción 1:1 a 150 x 103 células mL-1). Los desechos

orgánicos disueltos y particulados fueron eliminados diariamente con manguera-sifón hasta

reducir al 50 % el volumen del agua, restableciendo el nivel operativo (1 L) con agua de mar

filtrada y esterilizada.

Para efectos de la evaluación, se realizaron biometrías al inicio y al final del experimento,

determinando el incremento en talla y peso para cada tratamiento y sus réplicas. Todos los

tratamientos se administraron añadiéndolos directamente al agua de cultivo a la concentración

de 1 x 106 UFC mL-1, diariamente, durante los 30 días del bioensayo.

Determinación de la actividad SOD

Para determinar la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD), se pesaron 100 mg de

tejido de nueve ostiones por cada grupo experimental después de los tratamientos y fueron

añadidos a 500 µL de PBS, con pH 7,5. El tejido se procesó utilizando un homogenizador de

tejidos (marca Toption, modelo JS18) y enseguida el producto homogenizado fue

centrifugado a 9 327 x g durante 10 minutos a 4 ºC, recuperando el sobrenadante, que fue

almacenado a -20 ºC para su evaluación posterior. La actividad SOD fue determinada usando

el kit comercial SOD Assay kit-WST #19160, Sigma-Aldrich, E.U.A., siguiendo las

instrucciones del fabricante. Los resultados fueron expresados como una medida indirecta de

48
 Capítulo III
la actividad de la SOD, a través del porcentaje de inhibición de formación del complejo WST-

1 (water-soluble tetrazolium, por sus siglas en inglés) Formazán (Dudonne et al., 2009). Este

kit utiliza un método colorimétrico indirecto, no mide directamente la actividad de la SOD,

sino la presencia de radicales superóxido. El WST, en presencia de aniones superóxido, forma

un complejo coloreado que se mide a 440 nm. A mayor actividad SOD, es menor la cantidad

de radicales superóxido en los tejidos y es por tanto menor la formación del complejo

coloreado WST-formazán y viceversa.

Efecto de la cepa de Streptomyces sp. RL8 en la microbiota asociada a C. sikamea

Se llevó a cabo un estudio de metagenómica, para lo cual se seleccionaron 20 ostiones de los

grupos tratados con Streptomyces spp. (RL8 y N7) y el grupo control (anexo 2). De ellos

diez juveniles fueron sometidos a un proceso de depuración sin proveerles alimento, a fin de

vaciar el intestino y eliminar las heces fecales. Para el proceso de depuración, las conchas de

los ostiones fueron lavadas con agua de mar natural filtrada (0,2 μm) y esterilizada por UV y

en autoclave. Manualmente se eliminó toda la epifauna acompañante adherida a las conchas.

La depuración de los juveniles se realizó durante cinco días con un cambio total del agua,

utilizando para ello agua de mar natural estéril (filtración mecánica, radiación UV y

autoclave), y manteniendo a los ostiones con aireación automática constante. El proceso de

depuración se efectuó siguiendo las recomendaciones del Programa de Sanidad de Moluscos

(1992), a fin de reducir al máximo la microbiota transitoria contenida en las heces fecales

(Son y Fleet, 1980 y Lee et al., 2008).

Extracción del ADN

El ADN de los ostiones se extrajo antes de la administración de los tratamientos bacterianos

con actinomicetos candidatos a probióticos (t0), e inmediatamente después de haber concluido

el experimento (t30). Este proceso se aplicó a los animales depurados y no depurados de cada

grupo tratado y del grupo control como se muestra en el anexo 2. El ADN se extrajo del tejido

49
 Capítulo III
total de los animales siguiendo la metodología modificada de Sambrook (Sambrook et al,

1989).

El tejido fue homogenizado y transferido a un tubo eppendorf con 400 μL de buffer de lisis

(NaCl 100 mM, Tris 50 mM, EDTA 100 mM pH 8, SDS 1 % (p/v)) y 100 µL de lisozima (50

mg mL-1) e incubado a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, el tejido homogenizado se

incubó durante toda la noche a 65 °C con 20 μL de proteinasa K (20 mg mL-1). Después de la

lisis, se añadió 200 μL de NaCl 6 M al tejido homogenizado, luego se incubó en hielo (10

min) y seguidamente se procedió a centrifugar la muestra (10 min, a 8 000 x g, a 4 °C). El

ADN fue precipitado del sobrenadante con etanol absoluto frío (-20 °C). Los pellets de ADN

fueron lavados dos veces con alcohol al 70 % y se desecaron en desecador de vacío. Luego el

ADN se resuspendió en 100 μL de agua de calidad Biología Molecular y se dividió en

réplicas de 50 μL. La calidad y cuantificación del ADN extraído fue realizado mediante

electroforesis en gel de agarosa al 0,5 % (p/v). Las muestras de ADN fueron diluidas en agua

libre de nucleasas para obtener una concentración de 100 ng μL-1 y almacenadas a 4 °C para

su análisis posterior.

Construcción de la biblioteca del gen del ARNr 16S y pirosecuenciación

El ADN extraído de todo el animal de C. sikamea fue utilizado como molde para amplificar la

región hipervariable V3-V5 (570 pb) del gen del ARNr 16S (posición 357-926 en E. coli).

Los cebadores 341 (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') y 939 (5'-

CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC-3') (Muyzer et al., 1993 y Rudi et al., 1997) fueron

utilizados para la amplificación. Estos cebadores fueron seleccionados debido a su alta

variabilidad (Andersson et al., 2008) y por que, alineados in silico, coinciden con múltiples

secuencias de referencia del dominio bacteriano (1 921 179 secuencias del gen del ARNr 16S)

del Ribosomal Data Project (RDP) (Cole et al., 2009); y además no mostraron alineación con

secuencias del dominio Arquea ni amplificación cruzada con el genoma de C. sikamea. Para

50
 Capítulo III
reducir el sesgo y errores de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en

inglés), se redujo el número de ciclos de la PCR (Acinas et al., 2005). La PCR se realizó con

una mezcla de reacción (100 µL) que contenía 0.2 mM de cada desoxinucleósido trifosfato,

1 U.µL-1 de ADN polimerasa AccuPrimePfx (Invitrogen, San Diego, CA, EUA), 1X de

tampón de reacción de la polimerasa, 2 mM de MgCl2, 0.25 pmol.µL-1 de cada cebador y 100

ng mL-1 de ADN. Las mezclas de reacción fueron incubadas en un termociclador

Mastercycler Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) con una desnaturalización inicial

a 95 °C durante 10 min, seguido de 12 ciclos a 95 °C durante 1 min 30 s, 55 °C durante 1 min

30 s, 72 °C durante 1 min 30 s y una elongación final a 72 °C durante 6 min para la primera

fase de la PCR anidada. Posteriormente, 1µL de ADN amplificado (no purificado) se

reamplificó utilizando una mezcla de reacción de la PCR idéntica a la mezcla descrita

anteriormente y con una desnaturalización inicial a 94 °C durante 10 min seguido de 16 ciclos

a 97 °C durante 1 min, 54 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min 30 s, y una elongación final

a 72 °C durante 6 min.

Los productos de la PCR fueron analizados utilizando electroforesis en gel de agarosa al 1 %

y tinción con GelRedTM (Biotium, Hayward, CA, EUA.). Se realizaron tres amplificaciones

por PCR para cada muestra individual usando los correspondientes identificadores multiplex

(MID, por sus siglas en inglés) de la plataforma de pirosecuenciación 454 de Roche Life

Sciences. Los amplicones del gen del ARNr 16S para cada muestra, con concentraciones

finales ≥ 100 ng µL-1 se mezclaron en concentraciones iguales para generar una concentración

final de 300 ng µL-1. La purificación se realizó utilizando el Kit PCR System Clean-up

Wizard ® SV Gel (Promega, Madison, WI, EUA.). Después de la eficiente amplificación,

purificación y remoción de fragmentos menores a 200 pb, los productos que se obtuvieron de

los diferentes MIDs se combinaron en igual proporción, y 10 µg del producto de la PCR

(concentración ≥ 50 ng µL-1 y D260/280 ≥ 2,0) y su correspondiente réplica fueron utilizados

51
 Capítulo III
para la pirosecuenciación en 2 corridas en un secuenciador FLX-Junior (454 Roche Life

Sciences, Bradford, CT, EUA).

Abundancia y clasificación taxonómica de las secuencias

Procesamiento de las secuencias obtenidas

Todas las secuencias del gen del ARNr 16S se analizaron usando el software SeqClean para

eliminar regiones de secuencias que podrían causar errores en el proceso de análisis. Áreas de

baja complejidad (por ejemplo, secuencias de nucleótidos con un solo tipo de nucleótido

repetido) y terminaciones N-ricas (por ejemplo, bases indeterminadas) fueron seleccionadas

para los procedimientos de enmascaramiento. Seguidamente, las secuencias potencialmente

quiméricas detectadas utilizando el programa MOTHUR (Schloss et al., 2009) fueron

retiradas usando el programa UCHIME, el cual mejora la sensibilidad y la velocidad de

detección de quimeras (Edgar et al., 2011). Por último, sólo las secuencias que mostraron un

tamaño de 520-560 pb fueron consideradas para el análisis; este tamaño se eligió sobre la base

de los resultados del histograma (anexo3), ya que la tasa de error de secuenciación alrededor

de la distribución normal de la longitud de las secuencias fue demasiado alta (Huse et al.,

2008). Las secuencias erróneas correspondientes a cianobacterias, arqueas y eucariotas (ARNr

16S de cloroplastos y mitocondrias) también fueron eliminadas.

Clasificación taxonómica de las secuencias, abundancias relativas y diversidad.

Análisis estadístico.

La clasificación taxonómica de las secuencias de cada grupo se realizó usando el Clasificador

Naïve Bayesiano del RDP (Wang et al., 2007) con un intervalo de confianza del 80 % (Cole

et al., 2009). Las secuencias con valores de identidad > 95 %, >85 % y >80 % fueron

resueltas a nivel de género, clase y filo; respectivamente. Las abundancias relativas se

calcularon sobre la base de los resultados de la pirosecuenciación del gen del ARNr 16S y se

expresaron como el porcentaje de las secuencias que fueron asignadas a un género o filo dado.

52
 Capítulo III
La determinación de las UTOs se llevó a cabo a través del software MOTHUR v 1.35.1

(Schloss et al., 2009). Los UTOs fueron determinados en un umbral de similitud de secuencias

del 97 %. Los diagramas de Venn en base a los UTOs compartidos por las diferentes muestras

también se generaron utilizando el software MOTHUR (Scholoss et al., 2009), al igual que

los cálculos de las estimaciones de riqueza de Chao, los índices de Simpson 1-D y la

diversidad de Shannon. Las estimaciones no paramétricas de la riqueza de las especies se

determinaron utilizando una cobertura basada en la abundancia a una distancia de 0,03. Las

curvas de rarefacción (diversidad alfa) se calcularon usando un punto de corte de 0,03

(definido por un umbral del 97 % de similitud de secuencias UTOs) utilizando el software

MOTHUR.

Los datos se procesaron mediante análisis de varianza según diseño completamente

aleatorizado. Antes de aplicar el ANOVA se procedió a verificar la normalidad de los datos

mediante la prueba de Shapiro Wilk y para la homogeneidad de la varianza se utilizó la

prueba de Levene (Sokal y Rohlf, 1995). Para detectar diferencias significativas en los valores

de crecimiento y actividad enzimática SOD en función de los tratamientos con los candidatos

probióticos suministrados y el grupo control, se empleó la prueba de rangos múltiples de

Tukey (1949). Los datos de porcentaje de SOD fueron transformados a arcoseno√%, para

garantizar las condiciones de normalidad. Para todos los análisis efectuados, el nivel de

significación fue de P<0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa

estadístico SPSS versión 21 para Windows (SPSS Inc., Chicago I1).

3.3. Resultados y discusión

Crecimiento y supervivencia

Los ostiones de la especie C. sikamea tratados con las cepas V4, N7 o RL8 de Streptomyces,

pero no con BMix, tuvieron un incremento de peso comparado con el grupo control (P<0,05)

(tabla 4). Con respecto a la especie C. corteziensis, se observó un incremento de peso en los

53
 Capítulo III
grupos tratados con la cepa RL8 de Streptomyces y también con la mezcla de bacilos BMix

(P<0,05), pero no con las cepas V4 y N7 de Streptomyces, con respecto al grupo control

(P>0.05) (tabla 4). Para ambas especies de ostiones, no se encontraron diferencias con

respecto al incremento de la talla, entre los grupos tratados con actinomicetos y el grupo

control (P>0,05) (tabla 4).

Tabla 4. Indicadores productivos en juveniles de Crassostrea corteziensis y Crassostrea

sikamea tratados durante 30 días con Streptomyces spp. (V4, RL8 y N7) y una
mezcla de Bacillus spp. (BMix).
C. sikamea C. corteziensis
Tratamientos
IP (g) IT (mm) IP (g) IT (mm)
a c
V4 0,22 2,14 0,10 0,13b
RL8 0,28a 1,54 0,22a 1,30a
a ab
N7 0,29 2,06 0,21 1,18a
BMix 0,07b 1,31 0,23a 0,33b
b bc
Control 0,06 1,21 0,07 0,78ab
*** **
EE± 0,04 0,54 0,15 0,26**
a,b,c
Medias con letras diferentes en cada columna difieren a P<0,05 (Tukey, 1949).
**
P<0,01 P***<0,001

Los probióticos han sido asociados con el incremento o disminución del peso tanto en

humanos como en animales (Angelakis et al., 2013). Al suministrar la cepa X153

de Pseudoalteromonas, se redujo el peso de la ostra vieira Pecten maximus (Longeon et al.,

2004), mientras que al suministrar la cepa probiótica CA2 de Alteromonas, se incrementó el

peso del ostión japonés C. gigas (Douillet y Langdon, 1994). En el presente estudio, al

suministrar la cepa de Streptomyces sp. RL8, se incrementó el peso de los juveniles de C.

sikamea y C. corteziensis sobre el grupo control. Campa-Córdova et al., 2009, reportaron un

incremento en el crecimiento de la misma especie (C. corteziensis), con una dosis diaria de

5×104 UFC mL-1 de Lactobacillus sp. (cepa NS6.1), aislado de almeja mano de león

Nodipecten subnodosus. Aguilar-Macías et al. (2010) reportaron que los juveniles de la ostra

perlera Pinctada mazatlanica, incrementaron su crecimiento y supervivencia cuando se les

administró diariamente 1 x 106 UFC mL-1 de una cepa de Lactobacillus sp., también aislado

de N. subnodosus. De acuerdo a Granados-Amores et al. (2012), Pseudomonas aeruginosa

54
 Capítulo III
en combinación con Burkholderia cepacia también influyó positivamente sobre el

crecimiento y supervivencia de juveniles de N. subnodosus.

Las cepas de Streptomyces spp. RL8 y N7 exhibieron un incremento de peso superior que

Streptomyces V4 en juveniles de ostiones, lo cual está en correspondencia con el espectro de

actividad enzimática extracelular in vitro mostrados por estas cepas. Por tanto, este espectro

puede ser un buen predictor in vitro del incremento de los parámetros de crecimiento en

ostiones por cepas de actinomicetos, lo cual debe ser confirmado por estudios similares con

otros actinomicetos. Además también pudiera estar relacionado con lo informado por Awad et

al. (2009) de que cuando se incluyen los probióticos en la dieta de los animales se mejora la

estructura intestinal y aumenta la eficiencia de los procesos digestivos y absortivos.

Determinación de la actividad SOD

La actividad de la enzima SOD en C. sikamea fue superior (P<0,05) en el grupo tratado con el

actinomiceto RL8, comparado con el grupo control (figura 5). Los actinomicetos RL8, N7 y la

mezcla de bacilos BMix, indujeron un incremento (P<0,05) de la actividad SOD en C.

corteziensis. En contraste, la administración de la cepa V4 disminuyó la actividad SOD en

esta misma especie.

55
 Capítulo III

a,b,c
Columnas con letras diferentes difieren para (P<0,05) (Tukey, 1949).
(C. sikamea E±2,80, ***P<0,001; C. coerteziensis E±4,80, ***P<0,001).

Figura 5. Actividad de la enzima SOD en juveniles de C. corteziensis y C. sikamea después

de 30 días de tratamiento con cepas de Streptomyces spp. (V4, RL8, N7) y una
mezcla de Bacillus spp. (BMix).

Los invertebrados marinos, incluyendo moluscos, han desarrollado un sistema inmune innato

que se basa principalmente en la fagocitosis y en la generación de péptidos antimicrobianos y

EROs, con la finalidad de neutralizar y destruir a los agentes invasores (Bachère et al., 2000

y Lemaitre y Hoffmann, 2007). Debido a que el oxígeno reactivo (en su mayoría aniones

superóxido) también daña al tejido del hospedero, los invertebrados contrarrestan su efecto

por medio de enzimas tales como catalasa, glutatión peroxidasa y SOD (Fridovich, 1998). La

enzima SOD facilita la dismutación de radicales superóxido para formar peróxido de

hidrógeno, el cual se elimina posteriormente por la catalasa y la glutatión peroxidasa (Warner,

1994). La actividad de la SOD no sólo protege al organismo de los aniones superóxido, sino

también de los radicales hidroxilos, que son los más oxidantes de todas las EROs (González y

Arenas, 2002). Así, la actividad de la SOD en hemolinfa y tejido puede ser utilizada para

56
 Capítulo III
medir la competencia del sistema inmune y el efecto inmunomodulador de sustancias

bioactivas y probióticos en moluscos (Campa-Córdova et al., 2009).

En el presente estudio, la máxima actividad SOD fue inducida por la cepa RL8 de

Streptomyces, con valores más altos en ambas especies de ostión, seguido por el actinomiceto

N7 y la mezcla de bacilos BMix, los cuales tuvieron una mayor actividad en C. corteziensis.

Estos resultados experimentales sugieren que las cepas de actinomicetos (RL8 y N7), aisladas

de sedimentos marinos de Cuba, presentan actividad probiótica y pueden usarse para proteger

a los animales de las especies reactivas de oxígeno. Las EROs son autogeneradas como una

respuesta a las enfermedades infecciosas y al estrés usual en los sistemas acuícolas,

particularmente cuando se aplican tecnologías de cultivo intensivo e hiperintensivo

(Anderson, 2001).

Los actinomicetos producen una amplia variedad de antibióticos y enzimas extracelulares

(Prakash et al., 2013 y Barka et al., 2016), lo cual hace que sean candidatos promisorios para

su uso como probióticos en la acuicultura, y sin embargo, la información al respecto es

limitada. Existen sin embargo algunos estudios que han demostrado que determinadas

especies del género Streptomyces aumentan el crecimiento, supervivencia y resistencia a las

enfermedades en el langostino jumbo Penaeus monodon (Das et al., 2006 y Das et al.,

2010).

En el presente estudio, los mejores resultados se obtuvieron con la cepa de Streptomyces sp.

RL8, ya que aumentó el peso y la actividad SOD en juveniles de ostión C. corteziensis y C.

sikamea; seguido de cerca por Streptomyces sp. N7 que aumentó el peso de C. sikamea y la

actividad SOD en C. corteziensis. Este mejor desempeño in vivo de las cepas de Streptomyces

spp. RL8 y N7 que Streptomyces sp. V4 está en correspondencia con los resultados in vitro

obtenidos con dichas cepas; lo cual confirma que la batería de ensayos propuestos en este

57
 Capítulo III
estudio es efectiva para discernir tempranamente los mejores candidatos a probióticos a partir

de actinomicetos de origen marino.

Considerando esta evidencia experimental, se puede asumir que estas dos cepas de

actinomicetos presentan actividad probiótica y su utilización es recomendable para el cultivo

de juveniles de ostión C. sikamea y C. corteziensis en condiciones de laboratorio, y

potencialmente en otros moluscos e invertebrados marinos. Si a este efecto se suma el efecto

inmunomodulador y de mejoría en los parámetros de crecimiento demostrados aquí, este

estudio sienta las bases para el desarrollo de agentes probióticos novedosos, efectivos y

altamente competitivos a partir de cepas de actinomicetos para ser usados en la acuicultura.

Análisis de la diversidad y riqueza de especies en la microbiota

Se obtuvieron un total de 10 147 secuencias válidas y 7 786 UTOs con un tamaño que oscila

entre 520-560 bases se obtuvieron después de procesar 25 767 lecturas con una longitud

media de 530 bases, durante la pirosecuenciación de los 4 grupos de tratamientos tanto de

animales depurados como no depurados (promedio de ~ 3200 secuencias por biblioteca).

Todas las secuencias tuvieron una identidad de 100 % dentro del dominio Bacteria, pero no

todas las secuencias válidas se pudieron clasificar a nivel de filo, utilizando el clasificador

Naïve-bayesiano del RDP. El porciento de secuencias clasificadas a nivel de filo osciló de

80,8 % a 92,8 % (tabla 5).

58
 Capítulo III

Tabla 5. Secuencias obtenidas por pirosecuenciación del gen del ARNr 16S.
Índices de Estimaciones
Número de secuencias
diversidad Riquezas
Tratamientosa
Tiempo Lecturas Números % Filos UTOs-simples Simpson Shanno
Depuración Lecturas* UTOsd Chao-1
(días) válidasb Clasificadosc Clasificadosc (%)e _1-D n_H
Control Inicial T=0 No 3707 1575 1273 80,8 1222 1106 ( 90,5) 0,9989 7,005 9056
Control Inicial T=0 Si 3380 1274 1140 89,5 1061 986 (92,9 ) 0,9989 6,902 10220
Streptomyces N7 T=30 No 3482 1233 1111 90,1 941 861 (91,5) 0,9982 6,722 8061
Streptomyces N7 T=30 Si 3787 1396 1250 89,5 960 863 (89,9) 0,9973 6,630 7159
Streptomyces RL8 T=30 No 3293 1340 1177 87,8 1108 913 (90,6) 0,9981 6,764 7513
Streptomyces RL8 T=30 Si 3187 1637 1505 91,9 1174 1061 (90,4) 0,9981 6,853 9825
Control Final T=30 No 2456 681 617 90,6 564 522 (92,5) 0,9979 6,274 5253
Control Final T=30 Si 2475 1011 938 92,8 756 683 (90,3) 0,9975 6,478 5608
Total Secuencias 25767 10147 9011 7786
a
30 organismos por tratamiento.
*
Número correspondiente al total de secuencias obtenidas en dos corridas.
b
Secuencias seleccionadas (longitud > 520 pb y < 560 pb; no-quiméricas, terminaciones no-ricas en N, entre otras características, secuencias
Cloroplastos).
c
Clasificador Naïve Bayesiano del ARNr del RDP Version 2.1. Filo = 80 % de similitud de secuencias.
d
UTO, unidades taxonómicas operacionales, calculada con el programa MOTHUR v 1.35.1 a un nivel de distancia del 3 %.
e
# de UTOs de lectura simple; porciento calculado para el número obtenido de UTOs de lectura simple/número total de UTOs.

59
 Capítulo III
La riqueza de diversidad de especies más alta y más baja se observó en el grupo control al

principio y al final del experimento, tanto para ostiones depurados como no depurados. De

forma general, los ostiones alimentados con los actinomicetos aislados de sedimentos

marinos, mostraron valores intermedios, con la cepa Streptomyces sp. RL8 mostrando una

riqueza de diversidad cercana a la del grupo control inicial. El índice de diversidad de

Shannon varió de 6,27 a 7,00 con los grupos control final exhibiendo los niveles más bajos,

los grupos control inicial con los niveles más altos y los grupos tratados con actinomicetos,

mostrando valores intermedios (tabla 5). La curva de rarefacción no tendió a alcanzar el

equilibrio de saturación en ningún grupo experimental (anexo 4). Este resultado sugiere que

en dichas muestras pudieran recuperarse muchas más UTOs no detectadas.

Composición de la microbiota

Durante el presente estudio fueron identificados un total de 13 filos diferentes en el tejido de

C. sikamea: Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Candidatus Saccharibacteria,

Chlamydiae, Deferribacters, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospinae,

Proteobacteria, Spirochaetes y Verrucomicrobia. La abundancia relativa de los filos más

abundantes detectados, antes de la aplicación de los tratamientos (t0) e inmediatamente

después de concluido el experimento (t30), incluyendo ostiones depurados y no depurados, se

muestra en la figura 6. El filo Proteobacteria fue el más abundante, con valores entre 81,4 y

95,1 %. En términos generales, en el presente estudio, la abundancia relativa de los filos

Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria siguió al filo Proteobacteria, pero con valores

relativamente más bajos.

60
 Capítulo III

CINODEP: Control Inicial, No Depurado; CIDEP: Control Inicial, Depurado;

N7NODEP: Streptomyces sp. N7, No Depurado; N7DEP: Streptomyces sp. N7,
Depurado; RL8NODEP: Streptomyces sp. RL8, No Depurado; RL8DEP:
Streptomyces sp. RL8, Depurado; CFNODEP: Control Final, No Depurado; CFDEP:
Control Final, Depurado.
Figura 6. Abundancia relativa de diferentes filos de bacterias, en la microbiota asociada a
juveniles de ostión C. sikamea tratados con Streptomyces spp. (N7 y RL8).

En concordancia con lo anterior, estudios similares realizados por Fernandez-Piquer et al.,

2012; revelaron que este filo (Proteobacteria) prevaleció en C. gigas, con predominio de

Mesorhizobium, Sphingomonas y Thalassospira como miembros de Alfaproteobacteria.

Después de la clase Firmicutes, este filotipo ha demostrado ser dominante en la glándula

digestiva del ostión de roca sydney, Saccostrea glomerata, basado en análisis RFLP. En este

caso, miembros de los géneros Anaplasma, Rickettsia, Sphingomonas y Ehrlichia fueron las

principales Alfaproteobacterias detectadas en el ostión S. glomerata (Green y Barnes, 2010).

Las Proteobacterias han sido también detectadas como el filo más abundante en semillas,

juveniles y adultos depurados de C. corteziensis, C. gigas y C. sikamea en dos sitios de

61
 Capítulo III
crecimiento, a excepción de los adultos de C. sikamea en uno de esos sitios (Trabal-Fernández

et al., 2014). Contrario a nuestro estudio, estos autores describieron cantidades similares

de Alfaproteobacterias y Gammaproteobacterias en las semillas, mientras que las

Betaproteobacterias o las Gammaproteobacterias prevalecieron en estadíos adultos. Estos

autores encontraron varios géneros de Proteobacteria tales como Cohaesibacter, Oceanicola,

Rhodovulum y Roseovarius abundantes solo en semillas. Sin embargo, en el presente estudio

se encontraron varios de estos géneros, tanto al inicio (t0) como al final (t30) del experimento.

Las diferencias encontradas pueden explicarse, en función de que esos autores trabajaron en

condiciones de campo, mientras que la presente investigación se llevó a cabo en condiciones

de laboratorio.

Las clases de Proteobacterias más abundantes asociadas a C. sikamea fueron

Alfaproteobacteria seguida de Gammaproteobacteria, las cuales representaron el 71-79,4 % y

el 11,8-18,9 % del total de Proteobacterias detectadas, respectivamente. Los otros miembros

no alcanzaron el 5 % para esta clase de microorganismos, tanto en los grupos tratados como

en el grupo control (figura 7).

62
 Capítulo III

CINODEP: Control Inicial, No Depurado; CIDEP: Control Inicial, Depurado;

N7NODEP: Streptomyces sp. N7, No Depurado; N7DEP: Streptomyces sp. N7,
Depurado; RL8NODEP: Streptomyces sp. RL8, No Depurado; RL8DEP: Streptomyces
sp. RL8, Depurado; CFNODEP: Control Final, No Depurado; CFDEP: Control Final,
Depurado.
Figura 7. Abundancia relativa de la clase Proteobacteria asociada a C. sikamea tratada con
Streptomyces spp. (N7 y RL8). Abundancia relativa: (%) de cada subclase en
relación al total de Proteobacterias clasificadas usando el sistema Naïve Bayesiano
del RDP.

Entre las Alfaproteobacterias se detectaron los géneros Anderseniella, Oceanicola,

Roseovarius, Ruegeria y Sulfitobacter en cantidades iguales o superiores al 1 %, las cuales

estuvieron presentes en todos los grupos experimentales, tanto depurados como no depurados.

Los géneros Marivita y Shimia también estuvieron presentes en la mayor parte de los grupos.

El género Sphingorhabdus también se detectó en todos los grupos experimentales, aunque en

niveles bajos (tabla 6).

El grupo control inicial no depurado exhibió, al inicio (t0), una mayor diversidad de la clase

Alfaproteobacteria en comparación con el grupo control inicial depurado y los demás grupos

experimentales. Debido a que las proporciones de Alfaproteobacterias oscilaron de 71 a

79,4 % en todos los grupos experimentales, esta disminución en la diversidad representa un

cambio hacia géneros desconocidos de esta clase. El género Bacteriovorax, perteneciente a la

63
 Capítulo III
clase Deltaproteobacteria, fue detectado en todos los grupos experimentales, excluyendo el

grupo control final y el grupo depurado tratado con la cepa Streptomyces sp. N7. Otros

géneros de esta clase se detectaron esporádicamente en uno a tres grupos experimentales

(tabla 6).

Tabla 6. Abundancia relativa de Proteobacterias asociadas a juveniles de C. sikamea tratados

con Streptomyces spp. (RL8 y N7). Abundancia relativa (%) de cada género en
relación al total.
Abundancia Relativa (%)*
CINODEP CIDEP N7NODEP N7DEP RL8NODEP RL8DEP CFNODEP CFDEP
Alphaproteobacteria
Altererythrobacter 1,8 0,9 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,3
Anderseniella 1,1 0,1 1,6 0,9 0,4 0,3 0,9 0,8
Cohaesibacter 3,8 0,3 0,5 0,0 0,0 0,5 0,5 0,0
Donghicola 1,0 0,4 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 2,7
Erythrobacter 1,9 0,0 0,1 0,3 0,0 0,4 0,0 0,0
Litoreibacter 1,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,3
Loktanella 3,5 1,1 0,3 0,0 0,3 0,3 0,0 0,0
Maribius 1,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Marivita 4,0 0,6 0,1 0,0 0,3 0,1 12,7 0,0
Oceanicola 10,0 1,6 1,1 1,6 2,4 1,3 1,1 2,4
Phaeobacter 2,3 0,4 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0
Pontibaca 1,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Pseudoruegeria 1,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Rhodovulum 1,5 0,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,6
Roseobacter 1,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Roseovarius 16,4 2,1 1,9 2,1 3,8 2,1 1,9 4,4
Ruegeria 4,3 5,9 15,1 10,2 9,0 11,3 9,9 18,0
Shimia 0,5 0,0 1,7 0,0 1,1 0,1 1,7 0,6
Sulfitobacter 5,7 2,9 0,7 0,2 0,1 0,3 0,5 1,7
Tateyamaria 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Thalassobacter 3,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Thalassobius 1,9 0,0 0,1 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0
Otros 12,1 1,7 2,2 1,8 2,3 1,0 1,1 3,7
No clasificados 16,1 81,3 74,6 82,7 80,2 81,8 69,6 64,5

Deltaproteobacteria
Bacteriovorax 10,0 3,7 4,0 0,0 2,9 4,5 0,0 0,0
Haliangium 5,0 0,0 0,0 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Nannocystis 35,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Plesiocystis 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 5,3
Peredibacter 0,0 0,0 12,0 5,0 0,0 0,0 0,0 5,3
Polyangium 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Vampirovibrio 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 5,6 0,0

64
 Capítulo III

No clasificados 40,0 96,3 84,0 90,0 97,1 95,5 94,4 89,5

Gammaproteobacteria
Acinetobacter 0,0 1,6 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0
Aestuariibacter 1,6 1,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Alcanivorax 0,0 0,0 1,4 0,0 2,4 0,0 2,9 0,0
Alteromonas 0,0 0,0 0,7 0,6 0,0 1,4 0,0 0,0

Arenicella 2,1 1,1 5,7 0,0 4,8 0,5 1,0 1,9

Colwellia 2,7 4,9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Cycloclasticus 1,1 2,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Endozoicomonas 1,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,9 0,0
Enterobacter 0,0 1,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Granulosicoccus 5,3 1,1 2,8 6,9 1,6 2,8 2,0 2,5
Haliea 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,2
Kangiella 1,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Legionella 0,0 0,0 0,0 0,6 0,0 0,0 1,0 0,0
Marinicella 10,6 3,3 9,9 3,5 9,6 0,5 1,9 3,8
Marinobacter 2,1 8,2 0,0 0,6 0,0 2,3 1,0 6,3
Marinobacterium 0,0 1,1 0,0 0,6 0,0 0,0 0,0 13,3
Neptuniibacter 1,6 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Oleibacter 1,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Photobacterium 0,5 2,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Porticoccus 3,7 2,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Pseudoalteromonas 1,1 1,6 0,0 0,6 0,0 0,5 0,0 0,0
Pseudomonas 0,0 0,5 4,3 2,3 2,4 1,4 1,0 1,9
Rheinheimera 0,0 0,0 0,0 0,0 1,6 0,0 0,0 0,0
Thalassomonas 2,1 1,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Thiothrix 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,9 0,0 1,3
Vibrio 2,1 7,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 5,7
Otros 1,6 1,1 0,7 0,5 0,0 0,3 0,0 0,6
No clasificados 57,4 56,0 74,5 83,8 76,8 89,4 86,5 61,4

Uno de los resultados más significativos derivados del presente estudio fue la detección de

miembros de la familia Bacteriovoracaceae del orden Bdellovibrionales, fundamentalmente

del género Bacteriovorax en el Grupo Control Inicial pero no en el Final, así como su

mantenimiento en los grupos tratados con Streptomyces, excluyendo el grupo Streptomyces

sp. N7 depurado. Bacteriovorax es una bacteria pequeña, depredadora, móvil que invade el

espacio periplásmico de ciertas bacterias gramnegativas, incluyendo especies de Vibrio,

alterando la pared celular de su presa, consumiendo el contenido citoplasmático y lisando la

célula hasta liberar la progenie depredadora (Chen et al., 2012 y Crossman et al., 2013).

65
 Capítulo III
Como consecuencia, se ha demostrado que este microorganismo es un agente prometedor para

ser usado en la acuicultura (Cao et al., 2014). Es de la mayor relevancia destacar que las cepas

de Streptomyces spp. (N7 y RL8) mostraron un efecto estimulador de la población de

Bacteriovorax en el ostión juvenil C. sikamea. Este hallazgo pudiera tener implicaciones

importantes, si consideramos que las cepas de Streptomyces tendrían al parecer la capacidad

de reducir a diversos microorganismos patógenos mediante una doble acción; que implicaría

un efecto probiótico directo y un efecto indirecto al estimular la población de Bacteriovorax.

En relación con las Gammaproteobacteria, los géneros Granulosicoccus y Marinicella se

detectaron en todos los grupos experimentales; aunque también prevalecieron los géneros

Arenicella, Marinobacter y Pseudomonas. Otros géneros tales como Aestuariibacter,

Colwellia, Cycloclasticus, Neptuniibacter, Photobacterium, Porticoccus y Thalassomonas,

fueron detectados en el grupo control inicial, pero no estuvieron presentes al final del

experimento.

El género Vibrio fue detectado en el grupo Control Inicial (t0) y en el grupo Control Final (t30)

depurado, pero no en los ostiones que fueron tratados con las cepas de Streptomyces

seleccionadas (N7 y RL8). Esto sugiere que estos actinomicetos aislados de sedimentos

marinos de Cuba tienen propiedades probióticas y pueden jugar un rol importante en el

control y la eliminación de estos microorganismos patógenos. La exclusión de Vibrio, por

cepas de actinomicetos del género Streptomyces, ha sido previamente demostrada tanto in

vitro como in vivo en el camarón Penaeus monodon (Das et al., 2010 y Augustine et al.,

2015).

El efecto controlador de Streptomyces spp. sobre especies de Vibrio spp., en el ostión

kumamoto C. sikamea detectado durante la presente investigación, es importante por su

potencial para prevenir brotes de enfermedad causados por este tipo de microorganismos,

66
 Capítulo III
tanto en esta especie de ostión como en otros invertebrados marinos de interés acuícola

comercial.

En la tabla 7 se muestran los géneros de actinobacterias asociados a juveniles de ostión C.

sikamea, tratados con las cepas de Streptomyces spp. (N7 y RL8). De los 12 géneros de

Actinobacteria clasificados, solo Ilumatobacter y Propionibacterium fueron detectados en los

grupos tratados con Streptomyces y en los grupos control. No obstante, el primer género no

fue detectado en el grupo Control Final no depurado y el segundo en el grupo Control Final

depurado. El número de géneros de Actinobacteria clasificados en el grupo Control Inicial no

depurado y depurado fue de 4 y 5, respectivamente; en el grupo tratado con N7, de 3 y 3; en el

grupo tratado con RL8, de 5 y 4; y en el grupo Control Final, de 1 y 3; respectivamente.

Tabla 7. Abundancia relativa de Actinobacterias asociadas a juveniles de C. sikamea tratados

con Streptomyces spp. (RL8 y N7). Abundancia relativa (%) de cada subclase en
relación al total.
ABUNDANCIA RELATIVA (%)
Género
CINODEP CIDEP N7NODEP N7DEP RL8NODEP RL8DEP CFNODEP CFDEP

Actinomyces 0 2 0 0 0 0 0 0
Brachybacterium 2 0 0 0 0 0 0 0
Corynebacterium 0 0 0 11 4 10 0 0
Dietzia 0 2 5 0 0 0 0 0
Gaiella 0 2 0 0 0 0 0 0
Iamia 0 0 0 0 0 0 0 16
Ilumatobacter 9 49 55 17 12 23 0 11
Propionibacterium 20 5 9 39 24 23 13 0
Rothia 2 0 0 0 0 0 0 0
Solirubrobacter 0 0 0 0 0 0 0 5
Streptomyces 0 0 0 0 4 0 0 0
Turicella 0 0 0 0 8 3 0 0
No clasificados 66 40 32 33 48 42 88 68

Hasta el presente, las Propionibacterias han sido el principal género de Actinobacterias

detectado en diferentes especies de ostiones (Green y Barnes, 2010 y Trabal-Fernández et al.,

2012; 2014). Sin embargo, en el presente estudio realizado con juveniles de C. sikamea, se

detectó una población más diversa de actinobacterias, compuesta por Ilumatobacter y

67
 Capítulo III
Propionibacterium como núcleo principal de este filo, junto con otros géneros que aparecen

esporádicamente. Interesantemente, en el grupo tratado con Streptomyces sp. RL8 (t30) no

solamente se registró el mismo número de géneros de actinobacterias que el grupo Control

Inicial (t0), sino que además fue el único grupo en el cual se detectó el género Streptomyces.

Por consiguiente, la cepa Streptomyces sp. RL8 fue capaz de establecerse en el tracto

gastrointestinal y/o en otros tejidos, pasando a formar parte de la microbiota residente de C.

sikamea, especie en la cual se mantuvo al mismo tiempo una elevada diversidad de

actinobacterias.

La figura 8 muestra los resultados del análisis de componentes principales asociado con la

variación de la microbiota de C. sikamea, en función de cada tratamiento para los grupos de

ostiones depurados y no depurados. En general, hubo variaciones en la composición de la

microbiota de los ostiones durante el curso del tratamiento porque se observaron diferencias

entre las comunidades bacterianas al inicio (t0) y al final (t30) del experimento. Estas

diferencias pueden explicarse por un valor eigen > 1 y una varianza acumulativa del 85,8 %

(PC1= 57,9 % y PC2=27,9 %) en ostiones no depurados y del 83,5 % (PC1= 55,9 % y

PC2=27,6 %) en ostiones depurados.

Un cambio significativo en la composición de la comunidad bacteriana fue observado en los

ostiones no depurados tratados con la cepa de Streptomyces sp. N7 pero no con la cepa de

Streptomyces sp. RL8 comparados con el grupo control no depurado. Aunque las diferencias

en la composición de la comunidad bacteriana, expresada como UTOs, fueron también

observadas en ostiones depurados tratados con las cepas de Streptomyces spp. (N7 y RL8),

solo el grupo tratado con la última cepa mostró diferencias significativas con respecto al

grupo control.

68
 Capítulo III

Figura 8. Análisis de componentes principales (ACP) de la variación de la microbiota basado en la

abundancia relativa de UTOs en juveniles de C. sikamea (●) depurados y (▲) no
depurados.

A pesar de que varios factores bióticos y abióticos pueden determinar la comunidad y la

dinámica de la microbiota asociada a los ostiones (Aagesen y Hase, 2014 y Lokmer y

Wegner, 2015), en el presente estudio, que fue realizado bajo condiciones controladas de

laboratorio, se demostró claramente que las cepas de Streptomyces spp. (N7 y RL8) inducen

un cambio significativo en la composición de la microbiota de C. sikamea, tal como se reveló

por el análisis de componentes principales. Exceptuando una composición similar de la

microbiota del grupo Streptomyces sp. RL8 no depurado y del grupo Control Final no

depurado, ambas cepas de Streptomyces cambiaron la microbiota de los ostiones depurados y

no depurados, con respecto a los grupos Controles Inicial y Final (figura 8). Aunque esta

modulación de la microbiota bacteriana ha sido reportada para otros productos en diferentes

especies animales (Wang et al., 2005; Mountzouris et al., 2007 y Zhang et al., 2009), este es

el primer estudio que demuestra el efecto de cepas de Streptomyces sobre el microbioma de

un animal. Por tanto, esta habilidad de las cepas de Streptomyces spp. (N7 y RL8) de modular

la microbiota en juveniles de C. sikamea, caracterizada por mantener consistentemente una

69
 Capítulo III
elevada diversidad y riqueza de especies, incluyendo además una microbiota beneficiosa

como la del orden Bdellovibrionales y disminuyendo el número de Vibrios, pudiera ser muy

ventajoso en la acuicultura de moluscos ostreidos y de otros moluscos e invertebrados

marinos. Si a este efecto se suma la acción inmunomoduladora y de mejoría en los parámetros

de crecimiento demostrados aquí, este estudio sienta las bases para el desarrollo de agentes

probióticos novedosos, efectivos y altamente competitivos a partir de cepas de actinomicetos

para ser usados en la acuicultura.

3.4. Conclusiones parciales

1. Se demostró que la cepa de Streptomyces spp. RL8 aumenta significativamente el peso

y la actividad SOD de juveniles de los moluscos bivalvos ostreidos C. sikamea y C.

corteziensis cultivados en condiciones de laboratorio.

2. Se demostró que la cepa de Streptomyces spp. N7 aumenta significativamente el peso

de juveniles del molusco bivalvo ostreido C. sikamea y la actividad SOD de C.

corteziensis cultivados en condiciones de laboratorio.

3. Se comprobó que las cepas de Streptomyces spp. N7 y RL8 ejercen un efecto

modulador de la microbiota asociada a la especie de ostión C. sikamea, manteniendo

una elevada riqueza y diversidad de especies, incluyendo la bacteria benéfica

depredadora del género Bacteriovorax sp y disminuyendo las especies patógenas del

género Vibrio.

4. Se demostró el efecto probiótico de cepas de actinomicetos (N7 y RL8) en estadios

juveniles de dos bivalvos marinos de importancia acuícola comercial, como el ostión

kumamoto C. sikamea y el ostión de placer C. corteziensis.

70
 CAPÍTULO IV
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
PROBIÓTICA DE STREPTOMYCES SPP.,
SOLAS O EN COMBINACIÓN CON BACILLUS
Y LACTOBACILLUS EN JUVENILES DE
CAMARÓN BLANCO L. VANNAMEI
 Capítulo IV

CAPITULO IV: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROBIÓTICA DE

STREPTOMYCES SPP., SOLAS O EN COMBINACIÓN CON BACILLUS Y

LACTOBACILLUS EN JUVENILES DE CAMARÓN BLANCO L.VANNAMEI

4.1. Introducción

En el capítulo anterior de la presente tesis se demostró que las cepas de Streptomyces spp.

RL8 y N7 producen un efecto beneficioso en el crecimiento, actividad SOD y modulación de

la microbiota de las especies de ostiones C. sikamea y C. corteziensis. Por consiguiente, estos

microorganismos también pudieran tener un efecto benéfico en el camarón blanco L.

vannamei, una especie de gran importancia acuícola y comercial que ha mostrado alta

susceptibildad a bacterias patógenas del género Vibrio; el cual provoca grandes pérdidas

económicas en la camaronicultura a nivel mundial.

Teniendo en cuenta lo anterior, este capítulo tuvo como objetivo evaluar la actividad

probiótica de microorganismos candidatos a probióticos en juveniles del camarón blanco del

Pacífico Litopenaeus vannamei.

4.2. Materiales y métodos

Organismos y mantenimiento

Se utilizaron juveniles de camarón blanco L. vannamei, procedentes del laboratorio

camaronícola comercial de la empresa Acuacultura Mahr, ubicado en el Puerto de

Pichilingue, La Paz, México. Los mismos se aclimataron durante 7 días en

71
 Capítulo IV
tanques de fibra de vidrio de 1 500 L en el laboratorio de moluscos del CIBNOR con agua de

mar filtrada a 1 µm y esterilizada con luz ultravioleta, salinidad de 37 ups, aireación continua

y temperatura de 29±1 °C. Los camarones se alimentaron ad libitum tres veces al día con una

dieta balanceada comercial (Purina®, Ciudad Obregón, México, 35% de proteína).

Cepas probióticas y patógenas

Se utilizaron las cepas de Streptomyces spp. (RL8 y N7) aisladas de sedimentos marinos de

Cuba, y seleccionadas mediante estudios in vitro como se describió en el capítulo II. Se utilizó

también una mezcla de Bacillus (BMix) compuesta por Bacillus tequilensis (YC5-2), B.

endophyticus (C2-2) y B. endophyticus (YC3-b) (Luis-Villaseñor et al. 2011) y una cepa de

Lactobacillus graminis (Lact) (Abasolo-Pacheco et al., 2015); pertenecientes a la colección

bacteriana del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR), con

probada acción probiótica.

Todas las cepas se cultivaron en medio TSB con 3 % (p/v) de NaCl, excepto la cepa de

Lactobacillus que se cultivó en caldo MRS. Los actinomicetos se incubaron con agitación a

30 °C durante 7 días; los Bacillus incluidos en la mezcla BMix y el Lactobacillus se

cultivaron a 35 °C durante 24-48 horas. Después del tiempo de incubación, los cultivos se

centrifugaron a 4 696 x g a 4 °C durante 10 minutos, se eliminó el sobrenadante y se lavaron

dos veces con agua de mar estéril. Luego se resuspendieron en agua de mar estéril y se midió

la densidad óptica equivalente a 600 nm para actinomicetos (Gopalakrishnan et al., 2013) y

540 nm para BMix y Lact; correspondiente con 1 x 109 UFC mL-1 (Abasolo-Pacheco et al.,

2015). Se utilizó la cepa patógena Vibrio parahaemolyticus CAIM 170, que fue cultivada en

TSB a 35 °C por 24-48 horas. El cultivo se centrifugó a 4 696 x g a 4 °C durante 10 minutos;

el pellet fue resuspendido en solución salina al 3 % (p/v) y la densidad bacteriana se ajustó a

1,0 para obtener una densidad final de 1 x 109 UFC mL-1.

72
 Capítulo IV

Preparación del alimento con los diferentes microorganismos

Las suspensiones bacterianas se añadieron al alimento por aspersión, en cantidad suficiente

para establecer una concentración final de 1 x 106 UFC g-1 de alimento para Bacillus (BMix) y

Lactobacillus (Lac) (Luis-Villaseñor et al., 2011 y Abasolo-Pacheco et al., 2015). De manera

similar, las cepas de actinomicetos (RL8 y N7) del género Streptomyces fueron añadidas en la

cantidad requerida para obtener una concentración de 1 x 108 UFC g-1, la cual es la media de

los rangos de dosis utilizados para la mayoría de los probióticos (Newaj-Fyzul y Austin,

2014). El alimento utilizado para el tratamiento control fue asperjado con un volumen

equivalente de agua de mar estéril. En todos los casos, el alimento fue preparado en cantidad

suficiente para su uso total en un periodo no mayor de una semana y secado a temperatura

ambiente durante 24 horas después de la adición de las suspensiones, y luego se almacenó a

4 °C en recipientes plásticos cerrados.

Diseño experimental

Para este bioensayo se utilizaron camarones juveniles con un peso medio inicial de

0,78±0,32 g, los cuales fueron distribuidos aleatoriamente (50 camarones/grupo) en unidades

de fibra de vidrio de 120 L, con un volúmen operativo de 80 L, con agua de mar filtrada

(5 μm) a temperatura de 29±1 °C y aireación constante. Se estableció un diseño experimental

con nueve grupos experimentales con tres réplicas cada uno como sigue: RL8 (Streptomyces

sp. RL8); N7 (Streptomyces sp. N7); Strep. (Streptomyces sp. RL8 y Streptomyces sp. N7 en

proporción 1:1); Lact (Lactobacillus graminis); Lact-Strep (Lactobacillus graminis +

Streptomyces sp. RL8 y Streptomyces sp. N7; en proporción 1:1:1); BMix (Bacillus

tequilensis YC5-2, Bacillus endophyticus C2-2 y Bacillus endophyticus YC3-B; en

proporción 1:1:1); BMix-Strep (Bacillus tequilensis YC5-2, Bacillus endophyticus C2-2,

Bacillus endophyticus YC3-B, Streptomyces sp. RL8 y Streptomyces sp. N7; en proporción

73
 Capítulo IV
1:1:1:1:1); Mix (mezcla de todos los probióticos en igual proporción) y un grupo Control (sin

bacterias añadidas).

Los animales se alimentaron ad libitum con la dieta comercial preparada. Mediante sifoneo se

eliminó diariamente la materia particulada del fondo de las tinas, recuperando enseguida el

volumen de agua eliminado (25 %). Al final del experimento (30 días), los diferentes

tratamientos se evaluaron de acuerdo con el método descrito por Felix y Sudharsan (2004) y

Venkat et al. (2004), considerando los siguientes indicadores de desempeño:

IT (Incremento de la Talla) = Talla final (cm) - Talla inicial (cm); IP (Incremento de Peso) =

Peso final (g) - peso inicial (g); GMD (Ganancia Media Diaria) = (Peso final - peso

inicial)/días experimentación; CA (Conversión Alimenticia) = Alimento seco

ingerido/Incremento de peso.

Evaluación microbiológica

Se tomaron muestras del agua de cultivo y de hepatopáncreas de los grupos tratados y del

grupo control al inicio y al final del tratamiento, para la enumeración de bacterias heterótrofas

totales y de Vibrio en agua y en hepatopáncreas de los camarones. Se usó el medio agar

marino para bacterias heterótrofas y Agar TCBS para el conteo de Vibrio. Los hepatopáncreas

fueron extraídos con un bisturí estéril, después de desinfectar cada animal con etanol al 70 %,

y se homogenizaron en solución salina estéril. Se realizaron diluciones decimales de todos los

grupos experimentales y sus tres réplicas, y se extendieron 100 µL sobre los medios de

cultivos descritos. Las placas se incubaron a 35 ºC durante 24-48 horas.

Conteo total de hemocitos (CTH)

Después de 30 días de tratamiento, se tomaron al azar tres camarones por réplica, para un total

de nueve camarones por tratamiento, los cuales se usaron para obtener las respectivas

muestras de hemolinfa. Se extrajeron aproximadamente 200 µL de hemolinfa por camarón en

periodo de intermuda, de la región ventral del primer segmento abdominal con jeringuillas

74
 Capítulo IV
para insulina (27 G x 13 mm). Las muestras fueron preparadas con anticoagulante (NaCl 450

mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM + EDTA-Na2 10 nM, pH 7,3), en proporción volumétrica

2:1, con una presión osmótica de 850 mOsm kg.L-1, de conformidad con el método de

Vargas-Albores et al. (1993). Las muestras de hemolinfa se colocaron en hielo y procesadas

inmediatamente; luego, 50 µL de cada solución (hemolinfa/anticoagulante) se mezclaron con

150 µL de una solución de formaldehido al 6 % en proporción volumétrica 1:3. Las células se

cuantificaron usando una cámara de Neubauer. El CTH se expresó como células mL-1.

Reto con V. parahaemolyticus CAIM 170

Después de 30 días de haber aplicado los tratamientos experimentales antes descritos, se

procedió a realizar el reto aplicando el patógeno por el método de inmersión, con una

suspensión de V. parahaemolyticus CAIM 170 a 1x106 UFC mL-1 (Austin et al., 1995). Se

conformaron nueve grupos con 10 camarones cada uno y tres réplicas, todos fueron retados

con el patógeno excepto el grupo control. La supervivencia se registró diariamente durante

4 días.

Determinación de la actividad SOD

La actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) fue determinada después del reto con

V. parahaemolyticus con los candidatos probióticos, como se describió en el capítulo anterior.

Análisis estadístico

Los datos se procesaron según tratamiento estadístico utilizado en el capítulo III. La

transformación arcoseno √% se realizó para el porcentaje de supervivencia antes de aplicar

ANOVA. Los resultados del conteo de microorganismos se sometieron a pruebas no

paramétricas Kruskal Wallis y Mann Whitney para la diferenciación de medias de los rangos.

Para todos los análisis efectuados, el nivel de significación fue de P<0,05.

75
 Capítulo IV

4.3. Resultados y discusión

Efecto de los tratamientos bacterianos en el crecimiento del camarón

La utilización de bacterias probióticas se ha convertido en un paradigma sostenible para

reemplazar el uso de compuestos químicos y antibióticos en la acuicultura (De et al., 2014) y

en consecuencia, nuevas bacterias benéficas están siendo estudiadas para encontrar cepas con

potencial probiótico y propiedades mejoradas. En la tabla 8 aparecen los indicadores

productivos (IT, IP, GMD y CA) después de haber incorporado los candidatos a probióticos

durante 30 días en el alimento de los camarones (L. vannamei).

Tabla 8. Efecto de la adición de los candidatos probióticos en los indicadores productivos del
camarón blanco L. vannamei.
Indicadores productivos
Tratamiento
IT (cm) IP (g) GMD (gd-1) CA
a ab ab
RL8 4,47 4,17 0,13 1,23bc
N7 4,41ab 4,18ab 0,13ab 1,34b
a ab ab
Strep 4,50 4,23 0,14 1,26b
Lact 3,91bcd 3,89b 0,12b 1,42b
cd b b
Lact-Strep 3,81 3,89 0,12 1,41b
BMix 3,83cd 3,86b 0,12b 1,37b
abc a a
BMix-Strep 4,29 4,70 0,15 1,03c
Mix 3,59d 3,13c 0,10c 1,69a
abc b b
Control 4,14 3,89 0,12 1,38b
*** *** ***
EE± 0,89 0,99 0,03 0,40***
a,b,c,d
Medias con letras diferentes en cada columna difieren a P<0,05 (Tukey, 1949).
***
P<0,001.

Aunque no hubo diferencias significativas, los grupos tratados con Streptomyces sp. N7,

Streptomyces sp. RL8 y su combinación (Strep) mostraron mejores indicadores productivos

(IT, IP, GMD, CA) que los grupos tratados con Lact, BMix y el grupo control; con excepción

de los grupos RL8 y Strep, los cuales mostraron un incremento en la talla significativamente

mayor que los grupos tratados con Lact y BMix (tabla 8, P<0,05). La combinación de

Streptomyces spp. con Bacillus spp. (BMix-Strep) mejoró significativamente (P<0,05) los

indicadores productivos IP, GMD y CA en relación con los grupos tratados con Lact, BMix y

el grupo Control. Sólo el IT de este grupo no fue significativamente superior que dichos

controles. La combinación de Streptomyces con Lactobacillus (Lact-Strep) y con

76
 Capítulo IV
Lactobacillus más Bacillus (Mix) no dio lugar a ninguna mejora de los parámetros

productivos. De hecho, la combinación de todas las cepas probióticas (grupo Mix) mostró

indicadores productivos significativamente peores que el control y los demás grupos tratados

(P<0,05). No hubo mortalidad asociada a los tratamientos probióticos durante los 30 días del

experimento.

En general, los indicadores productivos mejoraron cuando los animales recibieron el alimento

enriquecido con cepas de Streptomyces solas, combinadas entre sí (Strep) o combinadas con

Bacillus spp. (BMix-Strep); aunque los mejores resultados correspondieron al grupo tratado

con BMix-Strep. La mejora en los indicadores productivos obtenida con la aplicación de

cepas de Streptomyces spp. (N7 y RL8) coincide con trabajos previos que mostraron un

incremento significativo en el crecimiento del camarón tigre negro Penaeus monodon, con

alimento enriquecido con 1 % de biomasa de Streptomyces durante 15 días de tratamiento

(Das et al., 2010). Resultados similares se obtuvieron en peces ornamentales (Xiphophorus

helleri) con el reemplazo de un 30-40 % del alimento con cepas de Streptomyces después de

50 días de experimentación (Das et al., 2010 y Dharmaraj y Dhevendaran, 2010).

En otros estudios previos se ha demostrado por igual que, con la adición de Bacillus spp. en el

alimento y en el agua de cultivo, se mejoran los indicadores productivos de L.vannamei (Liu

et al., 2009 y Silva et al., 2013). Esto puede ser debido a la producción de enzimas

extracelulares tales como proteasas, lipasas, amilasas, así como a factores de

crecimiento producidos por el probiótico, que mejoran los procesos de digestión del camarón

(Mohapatra et al., 2012 y Zokaeifar et al., 2012). Otro argumento que apoya y sustenta los

resultados del presente estudio, es que los actinomicetos son capaces de producir diferentes

enzimas extracelulares que descomponen la materia orgánica tales como almidón, celulosa,

proteínas y lípidos (Prakash et al., 2013); y como se ha demostrado anteriormente, las cepas

de Streptomyces spp. N7 y RL8 producen varias de estas enzimas, según resultados del

77
 Capítulo IV
capítulo II. Estos resultados coinciden también con el mejoramiento de los indicadores

productivos obtenidos con estas cepas en los ostiones C. sikamea y C. corteziensis, en el

capítulo III. Por lo antes expuesto, es altamente probable que las cepas de actinomicetos

aisladas y seleccionadas durante el desarrollo de la presente investigación hayan desempeñado

un papel relevante en la mejora del crecimiento registrada durante el cultivo experimental de

juveniles de camarón blanco L. vannamei.

Análisis bacteriológico y conteo de hemocitos

El recuento de vibrio en el agua de cultivo se redujo en una unidad logarítmica en los

tratamientos que incluyeron la adición de la cepa RL8 y el tratamiento Mix que incluye

Streptomyces spp., aunque no hubo diferencias significativas con respecto al grupo Control.

En el grupo tratado con BMix-Strep, el conteo de vibrio en agua se redujo en 4 unidades

logarítmicas con diferencias significativas (P<0,05) respecto al grupo Control (tabla 9).

También se logró una reducción significativa (P<0,05) de aproximadamente 4 unidades

logarítmicas en la cuenta de Vibrio spp en hepatopáncreas de L. vannamei, en todos los

tratamientos que contienen Streptomyces spp. (RL8, N7, Strep, Lact-Strep y BMix-Strep), a

excepción del grupo (Mix), con respecto al grupo control.

78
 Capítulo IV
Tabla 9. Conteo de heterótrofos totales, vibrio y hemocitos después del tratamiento de

camarón L. vannamei con cepas candidatas a probiótico.

Agua (Log UFC mL-1) Hepatopáncreas (Log UFC g-1) CTH

Tratamiento
Vibrio Heterótrofos Vibrio Heterótrofos (Célx106)
Media R Media R Media R Media R Media R
de a bcd cde
RL8 4,7 21,3 6,2 77,0 3,8 41,0 6,5 32,0 4,0 22,0c
N7 6,1 59,0abc 5,8 59,0abc 3,3 15,9d 7,5 68,0ab 5,9 48,0abc
a cf cd abcd
Strep 6,4 77,0 4,8 14,0 3,6 32,0 7,0 50,0 10,6 70,3a
Lact 5,9 50,0abcd 5,6 50,0abcd 4,2 50,0abcd 6,8 41,0bcde 3,9 22,0c
ab def d e
Lact-Strep 6,2 68,0 5,3 23,0 3,2 7,7 6,0 8,0 4,1 27,0bc
bcd bcde abc de
BMix 5,8 41,0 5,5 41,0 4,4 59,0 6,1 20,0 7,7 61,0ab
BMix-Strep 1,6 5,0f 4,3 5,0f 3,4 18,0d 6,0 14,0e 8,4 59,6ab
de cdef ab abc
Mix 4,6 15,7 5,4 32,0 5,1 68,0 7,2 59,0 4,5 42,5abc
Control 5,7 32,0cde 5,9 68,0ab 7,0 77,0a 7,6 77,0a 2,8 16,5c
Signif. *** *** *** *** ***
M: Medias, R: Rangos medios.
Rangos medios en la misma columna con letras diferentes difieren a (P<0,05), según
pruebas de Kruskal Wallis / Mann-Whitney ***P<0,001

No se observó diferencias significativas con respecto al conteo de bacterias heterótrofas

marinas totales en el agua de cultivo del camarón, para los tratamientos monoespecíficos con

cepas de Streptomyces y los grupos tratados con mezclas de bacterias (Lact y BMix) con

respecto al grupo Control no tratado. Todas las demás combinaciones de bacterias

mostraron de manera significativa (P<0,05) un menor recuento de heterótrofos marinos

totales, que el grupo Control (tabla 9). Sólo los grupos tratados con N7, Strep y Mix no

mostraron reducción significativa con relación al conteo de heterótrofos en hepatopáncreas

del camarón, mientras que en todos los demás grupos se obtuvieron conteos

significativamente menores (P<0,05) que el grupo Control (tabla 9). A pesar de que todos los

grupos que recibieron alimento enriquecido con bacterias durante 30 días mostraron valores

mayores en el conteo de hemocitos que el grupo control, esta diferencia fue sólo significativa

para los grupos tratados con Strep, BMix y BMix-Strep (tabla 9).

En las granjas, las bacterias heterótrofas juegan un papel importante en la descomposición y

mineralización de la materia orgánica, mientras que varias especies de Vibrio pueden producir

brotes de enfermedades y alta mortalidad (Nimrat et al., 2012). La modulación de la

79
 Capítulo IV
microbiota asociada a especies cultivadas, así como en el agua de cría, es posible si se

propicia el mantenimiento de una comunidad bacteriana diversa y beneficiosa y se reducen

simultáneamente las especies no deseadas. Esto es un atributo clave de los probióticos, ya que

debido a su acción benéfica pueden reducir a los patógenos y mejorar la calidad del agua

(Mohapatra et al., 2013). En lo que se refiere al presente estudio, las cepas seleccionadas de

Streptomyces, solas o en combinación con otras especies, fueron capaces de reducir la cuenta

total de Vibrio spp en hepatopáncreas de los camarones en aproximadamente 4 unidades

logarítmicas. A pesar de que estas cepas también redujeron el recuento de bacterias

heterótrofas marinas totales, esta reducción fue sólo de 0,1 a 1,6 unidades logarítmicas con

respecto al control. Por lo tanto, la capacidad experimentalmente confirmada de las cepas de

Streptomyces spp. (N7 y RL8), de excluir especies de Vibrio spp. manteniendo una alta carga

de herótrofos en hepatopáncreas del camarón, es de suma importancia por su potencial para

mantener un buen estado de salud en el camarón cultivado y prevenir enfermedades asociadas

a la infección por Vibrio spp.

Un patrón similar de reducción de vibrios y de heterótrofos, de casi 4 y 1,6 unidades

logarítmicas en el agua de cultivo, se logró en los camarones tratados con BMix-Strep. En

consecuencia, esta combinación de Streptomyces y Bacillus es ideal para mantener al mismo

tiempo bajos niveles de Vibrio spp. y altos niveles de heterótrofos en los camarones y en su

entorno. Esta exclusión selectiva de Vibrio spp., manteniendo un recuento estable de bacterias

heterótrofas totales, también ha sido reportado para las cepas de Streptomyces

rubrolavendulae M56 y Streptomyces fradiae de origen marino (Aftabuddin et al., 2013 y

Augustine et al., 2015). Por todo lo anteriormente expuesto, es posible asumir que las cepas

de Streptomyces inicialmente aisladas a partir de sedimentos marinos de Cuba, y

posteriormente seleccionadas mediante estudios in vitro según resultados obtenidos en el

80
 Capítulo IV
capítulo II, son benéficas, tienen propiedades probióticas, y son buenas candidatas para su

uso en el control biológico de bacterias patógenas en instalaciones acuícolas y como agentes

moduladores de la microbiota bacteriana usualmente presente en la acuicultura del camarón.

Actividad SOD en camarón L. vannamei

De los grupos tratados únicamente con cepas individuales de Streptomyces spp., el grupo

tratado con Streptomyces sp. RL8 mostró mayor actividad SOD, pero con diferencias no

significativas con respecto al grupo control. El grupo tratado con Streptomyces sp. N7 mostró

una actividad SOD significativamente menor que el grupo Control (figura 10).

a,b,c
Columnas con letras diferentes difieren para (P<0,05) (Tukey, 1949).
(EE±3,27, ***P<0,001).

Figura 10. Actividad de la enzima SOD en el tejido del camarón blanco L. vannamei tratados
con cepas de Streptomyces spp. (RL8 y N7), BMix y Lactobacillus sp. RL5
después del reto con V. parahaemolyticus.

La combinación de Streptomyces spp. RL8 y N7 (Strep) no dio como resultado un aumento o

disminución de la actividad SOD con respecto al grupo control. Los demás tratamientos

bacterianos evaluados mostraron una actividad SOD significativamente mayor que el grupo

81
 Capítulo IV
control después de retar a los camarones con la bacteria patógena Vibrio parahaemolyticus

CAIM 170.

La modulación del sistema inmune, mediante la activación de varios efectores sistémicos y

locales de la respuesta inmune, es uno de los beneficios más comúnmente atribuidos a los

probióticos (Nayak, 2010). En invertebrados, los hemocitos juegan un papel importante en la

respuesta inmune innata, que incluye liberación de péptidos antimicrobianos y lisozima,

activación del sistema profenoloxidasa, fagocitosis, formación de nódulos y cicatrización de

heridas (Bachère et al., 2004 y Jiravanichpaisal et al., 2006). Cuando los hemocitos fagocitan

a los microorganismos se genera una serie de sustancias antimicrobianas para matar a los

patógenos. Esto incluye diferentes EROs que debido a que también pueden causar graves

daños al hospedero, estas deben ser eliminadas rápidamente mediante mecanismos

antioxidantes, incluyendo la enzima SOD, que neutralizan al anión superóxido (Holmblad y

Söderhäll, 1999 y Bogdan et al., 2000). Por ello, durante la presente investigación se utilizó el

conteo de hemocitos y la actividad SOD como estimadores de la inmunomodulación asociada

a la inclusión en la dieta de Streptomyces spp. N7 y RL8, solas o combinadas con otras cepas

bacterianas. A pesar de que estas cepas no aumentaron significativamente el recuento de

hemocitos al utilizarse como agentes individuales, estos exhibieron un conteo de hemocitos

significativamente mayor que el grupo control cuando se combinaron entre sí y con Bacillus

spp. En los camarones retados con V. parahaemolyticus se registró una estimulación de la

actividad SOD en la mayoría de los grupos tratados con bacterias probióticas, a excepción de

los tratamientos con Streptomyces sp. N7 y Strep. En este sentido, los tratamientos con

Streptomyces sp. RL8 y la combinación de Streptomyces spp. con cepas de lactobacilos y

bacilos fueron capaces de estimular la actividad de la SOD en los camarones retados. Como

consecuencia, se asume que estos tratamientos pueden proteger a los camarones de las EROs

generadas durante los brotes de enfermedades infecciosas.

82
 Capítulo IV
Se ha demostrado que varios probióticos han aumentado la respuesta inmune y por lo tanto la

resistencia a las infecciones en camarones. Diversos estudios con diferentes cepas de

Lactobacillus plantarum han demostrado que se puede lograr un incremento del CTH, la

fenoloxidasa, la actividad SOD, así como la profenoloxidasa en L. vannamei (Chiu et al.,

2007 y Kongnum y Hongpattarakere, 2012). La adición de Bacillus cereus a una

concentración de 0,4 % fue eficiente en la estimulación de CTH, fenoloxidasa, estallido

respiratorio y actividad de la lisozima de Penaeus monodon (NavinChandran et al., 2014). La

cepa de Bacillus subtilis S12 mejoró de forma significativa los niveles de hemocitos, la tasa

de fagocitosis, la lisozima, la fenoloxidasa y la actividad SOD en L. vannamei (Liu et al.,

2014). La cepa de Bacillus licheniformis administrada a L. vannamei aumentó la inmunidad

en cuanto al CTH, la actividad SOD y la actividad de la fenoloxidasa (Li et al., 2007).

En esta investigación hemos demostrado por primera vez que cepas de Streptomyces spp.

tienen efectos inmunomoduladores sobre camarones, principalmente cuando se utiliza en

combinación con otras cepas. En este sentido, el grupo tratado con BMix-Strep mostró la

mayor actividad inmunomoduladora, aumentando significativamente tanto el CTH como la

actividad SOD, mientras que en los grupos tratados con Strep, Lact-Strep y Mix sólo se

estimuló uno de estos parámetros.

Supervivencia de L. vannamei después del reto con V. parahaemolyticus

La supervivencia fue evaluada después del reto con V. parahaemolyticus a las 96 horas, todos

los grupos tratados con cepas bacterianas, excepto los grupos N7 y Strep, exhibieron tasas de

supervivencia más altas que el grupo control (P<0,05, figura 11). Los grupos tratados con

Streptomyces sp. RL8 y BMix-Strep exhibieron las tasas de supervivencia más altas con un

95 %. Sólo los grupos tratados con Streptomyces sp. N7 y Strep, con una supervivencia de

50 % y 45 %, respectivamente, mostraron una tasa de supervivencia cercana a la del grupo

control (30 %).

83
 Capítulo IV

a,b
Columnas con letras diferentes difieren para (P<0,05) (Tukey, 1949).
(EE±11,98 P<0,001).

Figura 11. Supervivencia de los juveniles de Litopenaeus vannamei tratados con cepas de
Streptomyces spp. (RL8 y N7), BMix y Lactobacillus sp. RL5 después del reto
con V. parahaemolyticus .

Estos resultados concuerdan con Das et al. (2010), quienes mostraron que la cepa de

Streptomyces CLS-28 aumentó la tasa de supervivencia de Penaeus monodon desafiado

con Vibrio harveyi. Aunque estos autores atribuyeron este efecto protector a la capacidad

bien conocida por parte de Streptomyces de origen marino para producir compuestos

antibacterianos, durante el desarrollo del presente estudio se demostró que las cepas RL8 y

N7, aisladas de sedimentos marinos de Cuba, tienen también un efecto positivo sobre el

sistema inmunológico del camarón blanco del Pacífico L. vannamei.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, la combinación de Streptomyces spp. con

Bacillus spp. (BMix-Step), surge como una fórmula probiótica combinada con gran potencial

para la acuicultura del camarón, seguida por la fórmula monoespecífica constituida por

Streptomyces sp. RL8. De hecho, el grupo tratado con la mezcla BMix-Strep mostró un

84
 Capítulo IV
aumento en la mayoría de los indicadores de crecimiento, conteo de hemocitos, actividad

SOD y tasa de supervivencia de los camarones, así como una disminución de vibrios en el

agua de cultivo y en hepatopáncreas. Del mismo modo, Streptomyces sp. RL8 mejoró algunos

indicadores productivos, la actividad SOD, la tasa de supervivencia de los camarones y

disminuyó el conteo de vibrios en agua y hepatopáncreas de L. vannamei.

El efecto sinérgico de la combinación de Streptomyces spp. con Bacillus spp. encontrado en el

presente estudio es consistente con estudios previos en el sentido de que los “consorcios

bacterianos” constitudos por múltiples especies probióticas, pueden ser más eficaces que

cuando se usan por separado (Timmerman et al., 2004 y Kesarcodi-Watson et al., 2012). Si

bien la actividad probiótica notable del grupo BMix-Strep puede ser debida a una multitud de

efectos beneficiosos asociados a estos dos géneros bacterianos, es necesario destacar la

extraordinaria capacidad de Streptomyces spp. para producir varias enzimas y antibióticos

extracelulares (Berdy, 2005 y Chater et al., 2010) y a que pueden ejercer algunos efectos

inmunomoduladores. Las especies del género Streptomyces, al igual que algunas especies

del género Bacillus, poseen una reconocida capacidad para mejorar el crecimiento, la

actividad enzimática digestiva, la respuesta inmune y en general, la resistencia del camarón

a diversos patógenos bacterianos y virales, y por ende, a sus enfermedades asociadas (Nimrat

et al., 2013 y Zokaeifar et al., 2014).

De las tres cepas no hemolíticas seleccionadas, las cepas RL8 y N7 sobresalieron por encima

de V4 en el tamizaje in vitro (capítulo II), lo cual se corroboró posteriomente en los ensayos

in vivo realizados en las dos especies de ostiones evaluadas (capítulo III). En este capítulo, sin

embargo, se demuestra que Streptomyces RL8 presenta aún mejores atributos que la cepa de

Streptomyces N7 en L. vannamei. Esto sugiere un gran potencial probiótico para la cepa RL8,

además de que la facilidad para producir una sola especie es mayor que producir varias cepas

bacterianas con diferentes requerimientos nutricionales y condiciones de cultivo.

85
 Capítulo IV

4.4. Conclusiones parciales

1. Se demostró que la cepa de Streptomyces sp. RL8 y la mezcla BMix-Strep mejoran el

crecimiento, los parámetros inmunológicos y microbiológicos, y la supervivencia de

L. vannamei en condiciones de laboratorio.

2. Se comprobó que la cepa de Streptomyces sp. RL8 y su combinación con bacilos

(BMix-Strep) como cepa individual y fórmula multicepas, respectivamente, poseen el

mayor potencial probiótico entre todos los agentes ensayados para ser utilizados en la

acuicultura del camarón L. vannamei.

86
 CAPÍTULO V
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
COMPUESTOS QUÍMICOS PRODUCIDOS POR
LA CEPA DE STREPTOMYCES SP. RL8
 Capítulo V

CAPITULO V: OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS

QUÍMICOS PRODUCIDOS POR LA CEPA DE STREPTOMYCES SP. RL8

5.1. Introducción

Los resultados de los capítulos III y IV de la presente tesis evidencian que las cepas de

Streptomyces spp. RL8 y N7 ejercen varios efectos benéficos en la salud de los ostiones C.

sikamea y C. corteziensis así como del camarón L. vannamei. Por tanto, estas cepas tienen un

gran potencial para ser utilizadas como agentes probióticos en la acuicultura de estos

organismos y probablemente de otros invertebrados marinos de interés comercial. Aunque

ambas cepas son buenas candidatas, la cepa de Streptomyces spp. RL8 es la más consistente

en el número de efectos positivos en ostiones y camarones, y por tanto, es la más promisoria

de las dos. Teniendo en cuenta que uno de los mecanismos de acción de los probióticos es la

producción de compuestos con actividad antimicrobiana frente a microorganismos patógenos

(Lazado et al., 2015), este capítulo tuvo como objetivo aislar, elucidar la estructura y

determinar la actividad biológica de los compuestos con propiedades antimicrobianas a partir

de la cepa de Streptomyces sp. RL8, que pudieran explicar en parte su buen comportamiento

como agente probiótico en los organismos acuáticos estudiados.

5.2. Materiales y métodos

Fermentación, extracción y aislamiento

La cepa de Streptomyces sp. RL8 se seleccionó por sus propiedades probióticas demostradas

tanto en estudios in vitro, como en evaluaciones in vivo realizadas en juveniles de ostión (C.

sikamea, C. corteziensis) y camarón (L. vannamei). La cepa se inoculó en 100 mL de medio

87
 Capítulo V
TSB con 3 % (p/v) de NaCl e incubada con agitación durante 3 días a 30 °C. Seis matraces de

2.8 L con muelles en su interior y 1 L de medio de producción SGG (Goodfellow y Fiedler,

2010), modificado mediante la adición de 3 % (p/v) de NaCl en lugar del 0,1

% (p/v) recomendado, se inocularon con 10 mL de una suspensión de la cepa RL8, y se

incubaron a 30 °C en un agitador orbital a 200 rpm durante 10 días. El cultivo fue extraído

con acetato de etilo (6 L por duplicado) y se evaporó bajo presión reducida hasta obtener un

extracto de color carmelita. El extracto crudo se separó en 4 fracciones con resina HP20

(Diaion) usando un gradiente de elución escalonado de agua-metanol. La fracción activa (100

% metanol) se procesó en una columna de Sephadex LH-20 y se eluyó con diclorometano-

metanol en una proporción de 30:70. Las fracciones activas se combinaron y se separaron por

cromatografía CombiFlash con columna C18 (RediSep, 43 g), utilizando un gradiente

acetonitrilo/agua (conteniendo 0,1 % de ácido fórmico) desde 0-100 %. Las fracciones

activas se separaron por HPLC (con un gradiente acetonitrilo/agua de 42~52 (conteniendo 0,1

% de ácido fórmico) hasta obtener lo que al parecer serían dos nuevos compuestos con

potencial antibiótico producidos por la cepa RL8: el compuesto #1 (0,8 mg) y el

compuesto #2 (3,6 mg).

Procedimiento experimental

La estructura de los compuestos se confirmó a través de Resonancia Magnética Nuclear 1-D y

2-D en un instrumento Bruker AVIII a 700 MHz (Billerica, MA, EUA.), equipado con una

criosonda y dimetilsulfóxido deuterado. Los corrimientos químicos fueron reportados en ppm

en relación con el tetrametilsilano, usando la señal residual del solvente como señal interna.

Los espectros de masas de alta resolución se obtuvieron utilizando un espectrómetro de masas

híbrido Thermo Fisher-XL-Orbitrap (Thermo-Fisher, Bremen, Alemania), equipado con un

electrospray operando en modo ión positivo.

88
 Capítulo V

Actividad biológica de los compuestos obtenidos

Las pruebas de sensibilidad contra bacterias y levaduras se realizó en caldo Mueller-Hinton

ajustado con cationes para bacterias, y RPMI 1640 para levaduras, siguiendo las normas de

microdilución en caldo M7-A9 y M27-A3 según las directrices de la CLSI, respectivamente

(CLSI, 2006). Se evaluaron microorganismos Gram positivos (Enterococcus faecium ATCC

19434, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus CMRSA-1,

Staphylococcus aureus CMRSA-2, Staphylococcus aureus CMRSA-3), microorganismos

Gram negativos (Acinetobacter baumanii ATCC 17987, Enterobacter aerogenes ATCC

13048, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 33495, Pseudomonas

aeruginosa PAO1, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802, Vibrio alginolyticus ATCC 17749,

Vibrio harveyi ATCC 14126, Vibrio parahaemolyticus CAIM 170, Vibrio alginolyticus CAIM

57) y levaduras (Candida albicans ATCC 90028, Candida parasilopsis ATCC 90018).

La CIM fue definida como la concentración más baja que inhibe el crecimiento visible de los

microorganismos de ensayo. Los pocillos con los valores de CIM, 2xCIM y 4xCIM se usaron

para inocular el medio sólido libre de antibiótico para determinar la CBM, que se definió

como la menor concentración de los compuestos capaz de matar ≥99.9 % del inóculo inicial

de los microorganismos de ensayo.

5.3. Resultados y discusión

Determinación de la estructura de los compuestos

El primer compuesto se denominó Lunalipin A y se aisló como un polvo de color amarillo. El

grupo de iones moleculares ESI-MS a m/z 552/554 [M+H]+ (3:1) indicó la presencia de cloro.

La fórmula molecular de Lunalipin A se determinó como C27H18NO10Cl a través de HR-ESI-

MS: 552,0690 [M+H]+ (calc. 552,0697) (anexo5). La absorción UV a λmax (logε) 215, 257,

306, 332 y 385 sugirió la presencia de un esqueleto del compuesto “Lysolipin” en Lunalipin

89
 Capítulo V
A (Fischer et al., 2007). El análisis de los espectros de RMN 1D de Lunalipin A mostró la

presencia de dos carbonilos, 17 carbonos cuaternarios sp2, tres metinos, un metanotriílo

oxigenado, un metanodiílo oxigenado, un metoxilo y un metilo (anexo 6). Exceptuando una

señal hidroxilo (δ 11,78; s) en lugar de un protón aromático (δ 6,91), y una señal de hidrógeno

(δ 5,22, br s) en lugar de la señal de metoxilo (δH 3,35 y 57,6 δC), los espectros de RMN -1H

y -13C de Lunalipin A fueron similares a los del compuesto CBS40 (Fischer et al., 2007),

sugiriendo que sus estructuras son similares.

Una comparación más exhaustiva de los espectros de RMN-13C del compuesto Lunalipin A

con los de CBS40 revelaron efectos de corrimiento químico a -17,7; -10,0; -1,9; -7,3; -1,9; -

6.7 y +22,8 ppm para C-16 y C-22, respectivamente, mostrando que el compuesto Lunalipin

A es el derivado 18-demetil-22-hidroxilo del compuesto CBS40. Esta deducción tiene como

soporte la correlación HMBC existente entre 16-OH (δ 5,22; br s) y C-15 (δ 75,7; CH),

entre C-16 (δ 61,8; CH) y C-17 (δ 129,0; qC), entre H-16 (δ 5,37; br s) y C-17 (δ 129,0; qC),

y entre C-18 (δ 111,6; qC) y C-22 (δ 138,7; qC) (anexo 6).

La fórmula molecular del segundo compuesto, Lunalipin B, se determinó como C27H18NO9Cl

de acuerdo con HR-ESI-MS: m/z 536,0739 [M+H]+ (calculado 536.0743) (anexo 7). La

absorción UV a λmax (logε) 215, 257, 306, 333 y 390 sugirió que Lunalipin B comparte el

esqueleto con el compuesto Lunalipin A. Salvo por una señal CH2 (δC 29,3; δH 3,63; 2,40) en

lugar de un CH-OH (61,8 δC, δH 5,37 (CH); 5,22 (OH)), los espectros de RMN-1H y RMN-
13
C de Lunalipin B fueron básicamente idénticos a los de Lunalipin A. Además, se observaron

correlaciones HMBC claves entre H-16 (δH 3,63; 2.40) y C-15 (δ 72,4; CH), C-17 (δ 129,9;

qC), C-18 (δ 112,3; qC) (anexo 6). Por todo lo antes expuesto, el compuesto Lunalipin B se

identificó como el derivado 16-de-oxígeno de Lunalipin A.

90
 Capítulo V
Los compuestos Lunalipin A y B están estrechamente relacionados con otros compuestos de

naturaleza similar (Lysolipin y Xantholipin), que se describieron con anterioridad al

presente estudio (Drautz et al., 1975 y Terui et al., 2003), que corresponden a dos xantonas

policíclicas que tienen una estructura fusionada angular hexacíclica. El núcleo xantona de tres

anillos, contiene un átomo de cloro y un O-metilo en la posición 1 y 6 así como un grupo

hidroxilo en la posición 11, en los compuestos Lunalipin A y B (figura 12).

Figura 12. Estructura de dos nuevos compuestos (Lunalipin A y Lunalipin B), obtenidos a

partir de la cepa de Streptomyces sp. RL8, aislada de sedimentos marinos de Cuba.

Por consiguiente, las diferencias estructurales entre estos compuestos se basan de manera

particular y específica, en los diferentes sustituyentes que éstos exhiben en los otros tres

anillos que forman el ángulo del esqueleto hexacíclico. La única diferencia estructural entre

Lunalipin A y Lunalipin B es un grupo hidroxilo adicional en la posición 16 en Lunalipin A

(figura 12). Esta diferencia no influye en su fuerte actividad bactericida contra bacterias

91
 Capítulo V
Gram positivas que exhiben ambos compuestos, pero sí tiene una influencia en su actividad

contra bacterias Gram negativas, excepto el género Vibrio y levaduras. De hecho, Lunalipin A

exhibió una fuerte actividad antimicrobiana contra bacterias Gram positivas, pero una menor

actividad contra levaduras, en comparación con Lunalipin B (tabla 10).

Tabla 10. Actividad antimicrobiana de Lunalipin A y B.

Cepas Lunalipin A (µg mL-1) Lunalipin B (µg mL-1)

CIM CBM CIM CBM
Acinetobacter baumanii ATCC 17987 1 2 4 8
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 8 8 >32 -
Escherichia coli ATCC 25922 2 2 >32 -
Klebsiella pneumoniae ATCC 33495 2 4 >32 -
Pseudomonas aeruginosa PAO1 >32 - >32 -
Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 0,25 0,5 0,0625 0,0625
Vibrio alginolyticus ATCC 17749 0,5 1 0,125 0,25
Vibrio harveyi ATCC 14126 1 2 0,0625 0,125
Vibrio parahaemolyticus CAIM 170 0,5 1 0,0625 0,0625
Vibrio alginolyticus CAIM 57 0,5 1 0,125 0,25
Enterococcus faecium ATCC 19434 0,004 0,004 0,002 0,002
Staphylococcus aureus ATCC 29213 0,002 0,002 0,0078 0,0078
Staphylococcus aureus CMRSA-1 0,004 0,004 0,0078 0,0078
Staphylococcus aureus CMRSA-2 0,002 0,002 0,0078 0,015
Staphylococcus aureus CMRSA-3 0,002 0,002 0,015 0,015
Candida albicansATCC 90028 32 >32 0,05 0,05
Candida parasilopsis ATCC 90018 >32 - 1 2

Drautz et al. (1975) demostraron que Lysolipin exhibe una fuerte actividad antibacteriana

frente a bacterias Gram positivas y la mayoría de las bacterias Gram negativas y levaduras. En

este sentido, el espectro de actividad antimicrobiana de Lunalipin A y Lunalipin B, es

diferente al mostrado por Lysolipin, ya que Lunalipin A mostró una actividad débil contra

levaduras, y Lunalipin B contra la mayoría de bacterias Gram negativas estudiadas, excepto

frente a especies patógenas del género Vibrio que afectan a peces, moluscos y crustáceos de

interés acuícola comercial. Prem Anand et al. (2011) reportaron que el 59,4 % de aislados

de actinobacterias produjeron compuestos antibacterianos contra patógenos de peces tales

92
 Capítulo V
como Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus y Aeromonas hydrophila. Trabajos previos

señalan que los actinomicetos marinos como Streptomyces sp. LCJ94 tienen actividad

antagonista contra V. harveyi, V. alginolyticus y V. vulnificus (patógenos de mariscos),

donde la CIM de sus extractos crudos de acetato de etilo presentaron valores de 250, 500 y

250 μg mL-1, respectivamente (Mohanraj y Sekar, 2013).

En el presente estudio, el compuesto Lunalipin B mostró una fuerte actividad frente a

patógenos que afectan a peces, moluscos y crustáceos. En este sentido se demostró que el

género Streptomyces es capaz de producir una gran variedad de compuestos químicos con

amplio espectro de actividad antimicrobiana (LohTeng-Hern et al., 2016). Esta cualidad junto

a otras propiedades inherentes a este género justifican la búsqueda de nuevos probióticos a

partir del mismo. Por tanto, esta capacidad de Streptomyces sp. RL8 de producir antibióticos

de amplio espectro así como varias enzimas extracelulares avalan su gran potencial para ser

utilizado como probiótico en la acuicultura de peces e invertebrados marinos. Thirumurugan

y Vijayakumar (2015) demostraron la actividad de un compuesto denominado N-

isopentiltridecanamida, producido por Streptomyces sp. ECR77, frente a patógenos acuícolas.

Otros autores reportaron que Xantholipin, compuesto análogo estructural más cercano a

Lunalipin A y B, tiene también actividad antimicrobiana e inhibe varias líneas celulares de

cáncer, así como la expresión del gen de la proteína de choque térmico 47 (Terui et al., 2003 y

Zhang et al., 2012).

Los compuestos Lunalipin A y B están relacionados también con otras xantonas hexacíclicas

tales como albofungina, actinoplanonas, kigamicina y simaomicina (Gurevich et al., 1972;

Kobayashi et al., 1988; Lee et al., 1989 y Kunimoto et al., 2003), las cuales poseen una

tetrahidroxantona en lugar del anillo xantona clásico, con diferentes sustituyentes a lo largo

del núcleo hexacíclico. Estos antibióticos también poseen un amplio rango de actividades

biológicas, incluyendo actividad antibacteriana, antifúngica, anticancerígena, citotóxica,

93
 Capítulo V
anticoccidiana, y son además, agentes promotores de apoptosis y respuesta inmunitaria celular

(Tebiakina y Chaikovskaia, 1960; Kobayashi et al., 1988; Lu et al., 2004; Masuda et al.,

2006 y Koizumi et al., 2009).

A pesar de que es evidente, que diferentes sustituyentes en las xantonas pueden influir en la

diversidad de actividades biológicas que éstas presentan (Shen et al., 2010), no se han llevado

a cabo estudios sobre el mecanismo de acción de los análogos de xantonas tan extensamente,

en comparación con la gran diversidad de compuestos derivados de xantonas existentes

(Na, 2009). Por ejemplo, el modo de acción de Xantholipin es desconocido, y aunque

Lysolipin parece inhibir la biosíntesis de la pared celular bacteriana a través de la interacción

con lípidos (Drautz et al., 1975), es obvio que su modo de acción está lejos de conocerse

completamente. En consecuencia, nuevos estudios sobre los mecanismos de acción

adicionales de Lunalipin A y B pueden generar información de frontera sobre el verdadero

potencial de estos nuevos compuestos.

En resumen, se ha demostrado que la cepa Streptomyces sp. RL8 produce dos nuevos

compuestos (Lunalipin A y B), lo cual corrobora uno de los mecanismos de acción de los

probióticos que es la producción de metabolitos con actividad antagónica frente a

microorganismos patógenos. Aunque Streptomyces sp. RL8 y N7 comparten los mismos

atributos de producir sideróforos, enzimas extracelulares, etc, la producción de estos dos

compuestos con fuerte actividad antimicrobiana puede explicar en parte los mejores

resultados de protección contra la infección encontrados con Streptomyces sp. RL8 en L.

vannamei.

94
 Capítulo V

5.4. Conclusiones parciales

1. Se obtuvieron dos nuevas xantonas hexacíclicas, denominadas Lunalipin A y B, a

partir de la cepa de Streptomyces sp. RL8.

2. Lunalipin A tiene una fuerte actividad contra bacterias Gram positivas, Vibrios y

levaduras y débil actividad contra otras bacterias Gram negativas. Lunalipin B, en

cambio, presenta una fuerte actividad contra bacterias Gram positivas y Vibrios, una

actividad moderada contra bacterias Gram negativas y una débil actividad contra

levaduras.

3. Los compuestos Lunalipin A y B secretados por la cepa de Streptomyces sp. RL8 de

origen marino inhiben el crecimiento de cepas patógenas de Vibrio spp., lo que explica

uno de los mecanismos de acción de este probiótico en el cultivo de ostiones y

camarones.

95
CAPÍTULO VI
DISCUSIÓN GENERAL
 Capítulo VI

CAPITULO VI. DISCUSIÓN GENERAL

El aislamiento de 31 cepas de actinomicetos, a partir de sedimentos marinos de las costas de

Cuba, constituyó el punto de partida de la presente investigación. La realización de pruebas

antagónicas frente a cepas de Vibrio spp. permitió seleccionar cinco de estos aislados, luego

se realizó la prueba de hemólisis y se seleccionaron tres cepas (V4, N7 y RL8) que fueron no

hemolíticas. La determinación de la hidrofobicidad, como método indirecto para determinar la

capacidad de adherencia al TGI, la producción de sideróforos, de enzimas extracelulares,

tolerancia a pH ácidos y tolerancia a altas concentraciones de NaCl, propició la selección in

vitro de los microorganismos candidatos a probióticos y con el empleo de técnicas

moleculares, secuenciación del gen del ARNr16S se confirmó la identidad de las cepas

seleccionadas como Streptomyces spp. Este género es considerado como inocuo y

Generalmente Reconocido como Seguro, características esenciales que deben cumplir los

candidatos a probióticos según la FAO/WHO (2002). Además, el mismo ha sido reconocido

por la producción de metabolitos secundarios (Lee et al., 2011 y LohTeng-Hern et al., 2016)

incluyendo antibióticos (Lee et al., 2011), agentes anticancerígenos, antiparasitarios y

enzimas (Manivasagan et al., 2013); lo cual le confiere gran utilidad como agente probiótico

en la acuicultura.

En este estudio se demostró que las cepas bacterianas seleccionadas del género Streptomyces

spp. favorecieron el incremento en los parámetros medibles de crecimiento en camarón L.

vannamei y en dos especies de ostiones C. sikamea y C. corteziensis. Esto sugiere que estas

96
 Capítulo VI
cepas de Streptomyces spp. secretan enzimas hidrolíticas que pueden mejorar la actividad

amilolítica y proteolítica en el tracto digestivo de estos organismos, favoreciendo la

asimilación y el uso más eficiente del alimento proporcionado. Esto se confirmó mediante los

estudios realizados in vitro donde se observó que las cepas de Streptomyces spp. (RL8 y N7)

producen enzimas extracelulares. Estos resultados permiten asumir que estas cepas tienen en

definitiva la capacidad de actuar como agentes probióticos. Los probióticos pueden aplicarse

solos o en combinación (Kesarcodi-Watson et al., 2008; 2012). De acuerdo con estudios

previos, el uso de mezclas probióticas puede ser más conveniente que emplear las cepas

aisladas, tal como se observó en el presente estudio, al evaluar el tratamiento con BMix-Strep

en camarones L. vannamei. Los probióticos multi cepas o multi especies pueden actuar en

sinergia al incluir bacterias con modos de acción diferentes y complementarios, lo cual

incrementa el efecto protector de la mezcla o consorcio bacteriano (Timmerman et al., 2004 y

Avella et al., 2010).

En la presente investigación se demostró que los juveniles de camarón blanco L. vannamei

tratados con Streptomyces RL8 y BMix-Strep, presentaron una mayor respuesta y efectiva

protección durante el reto frente a V. parahaemolyticus, con un 95 % de supervivencia

comparado con el grupo control.

Las cepas de Streptomyces spp. (N7 y RL8) tuvieron un efecto modulador en la microbiota

del ostión kumamoto C. sikamea cuando se añadieron al agua de cultivo a una concentración

de 1 x 106 UFC.mL-1. Adicional a lo anterior, se obtuvo una mayor riqueza y diversidad de

especies bacterianas asociadas a la microbiota de la especie, lo cual permite comprender el rol

de las bacterias en diversos procesos fisiológicos básicos, tales como la digestión y la

protección contra patógenos, que pueden ayudar a mejorar los rendimientos y las ganancias

económicas en el cultivo, aumentando la productividad acuícola industrial y la inocuidad de

los productos cosechados para el consumo humano.

97
 Capítulo VI
Debido a los resultados obtenidos tanto in vitro como in vivo con la cepa de Streptomyces sp.

RL8 en camarones y ostiones; la misma fue seleccionada para realizar estudios de producción,

extracción, separación y purificación de compuestos antibacterianos. Se obtuvieron dos

nuevos compuestos que fueron denominados “Lunalipin A” y “Lunalipin B”, e identificados

como xantonas hexacíclicas estrechamente relacionadas con los compuestos ya conocidos y

denominados Lysolipin y Xantholipin (Drautz et al., 1975 y Terui et al., 2003). El compuesto

Lunalipin B, mostró una fuerte actividad frente a diferentes especies patógenas de Vibrio, las

cuales producen enfermedades en peces, moluscos y crustáceos de interés acuícola comercial;

por lo que queda demostrado que la cepa de Streptomyces sp. RL8 puede ser empleada como

agente probiótico para combatir enfermedades infecciosas que causan pérdidas económicas en

la acuicultura a nivel mundial.

En su conjunto, los resultados de esta investigación confirmaron la hipótesis de trabajo, ya

que se demostró que los actinomicetos aislados de sedimentos marinos de Cuba tienen acción

probiótica y potencial aplicación en el cultivo de juveniles de ostiones y camarones marinos.

Disponer de estas cepas en Cuba permite su utilización como probióticos en la acuicultura de

ostiones y camarones marinos, para mejorar la salud e incrementar la eficiencia productiva de

estas especies Por otra parte, se debe señalar que con este estudio se inician nuevos proyectos

de investigación donde se debe profundizar en aspectos tales como, el diseño de medios de

cultivo económicos para la obtención de biomasa de Streptomyces y evaluaciones económicas

que demuestren la factibilidad que pudiera tener el empleo de Streptomyces como probióticos

en la producción acuícola nacional.

98
CONCLUSIONES
GENERALES
 Conclusiones

CONCLUSIONES GENERALES

1. Los sedimentos marinos de Cuba tienen potencialidad para el aislamiento y selección

de microorganismos con actividad probiótica.

2. La inclusión de cepas de Streptomyces spp. (N7 y RL8) en el cultivo de juveniles de

ostión kumamoto C. sikamea y de ostión de placer C. corteziensis, produjo respuesta

de tipo probiótica en indicadores de salud y crecimiento animal.

3. Streptomyces spp. (N7 y RL8) tienen un efecto modulador de la microbiota asociada a

C. sikamea, al incrementar la diversidad de especies microbianas, disminuir la

población de Vibrio spp. y favorecer la proliferación de bacterias depredadoras del

género Bacteriovorax.

4. La adición de Streptomyces sp. RL8 y BMix-Strep en el alimento del camarón blanco

L. vannamei, incrementó los índices productivos, indujo una respuesta

inmunoestimulante y una mayor resistencia ante la infección con V. parahaemolyticus,

con lo cual se comprobó su efecto probiótico y uso potencial en la producción de L.

vannamei.

5. Streptomyces sp. RL8 produce dos nuevos compuestos con acción antimicrobiana,

denominados Lunalipin A y Lunalipin B, con una comprobada actividad frente a

bacterias Gram positivas, Gram negativas y levaduras, con lo cual se demuestra uno de

los mecanismos de acción de los probióticos para ejercer su acción.

99
RECOMENDACIONES
 Recomendaciones

RECOMENDACIONES

1. Realizar la identificación a nivel de especie de las cepas de Streptomyces mediante

taxonomía polifásica.

2. Evaluar el potencial efecto probiótico de nuevas mezclas de Streptomyces con otros

microorganismos benéficos, en diferentes dosis/proporción, en otras especies de

interés acuícola comercial, para confirmar su efecto benéfico en materia de salud y

crecimiento animal.

3. Diseñar medios de cultivo económicos para la producción experimental de biomasa de

Streptomyces; con fines de investigación, así como su validación y escalamiento

productivo en bioreactores prototipo que permitan obtener la biomasa suficiente para

uso industrial, como nuevos agentes probióticos en la acuicultura de moluscos,

camarón y peces marinos.

4. Realizar estudios económicos que confirmen la factibilidad comercial del uso de las

cepas de Streptomyces resultantes de la presente investigación, como agentes

probióticos en la producción acuícola nacional de moluscos, camarones y peces

marinos.

5. Divulgar los resultados de esta tesis e incorporarlos en la formación académica de

estudiantes de pregrado y posgrado.

100
 REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
 Referencias bibliográficas

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aagesen, A. M. & Häse, C. C. 2014. Seasonal effects of heat shock on bacterial populations,
including artificial Vibrio parahaemolyticus exposure, in the Pacific oyster,
Crassostrea gigas. Food Microbiol. 38: 93-103.

Abasolo‐Pacheco, F.; Saucedo, P. E.; Mazón‐Suástegui, J. M.; Tovar‐Ramírez, D.; Araya, R.;
Ramírez‐Orozco, J. M. & Campa‐Córdova, Á. I. 2015. Isolation and use of beneficial
microbiota from the digestive tract of lions‐paw scallop Nodipecten subnodosus and
winged pearl oyster Pteria sterna in oyster aquaculture. Aquac. Res. 1-10.

Acinas, S. G.; Sarma-Rupavtarm, R.; Klepac-Ceraj, V. & Polz, M. F. 2005. PCR-induced

sequence artifacts and bias: insights from comparison of two 16S rRNA clone libraries
constructed from the same sample. Appl. Environ. Microbiol. 71: 8966-8969.

Aftabuddin, S.; Kashem, M. A.; Kader, M. A.; Sikder, M. N. A. & Hakim, M. A. 2013. Use
of Streptomyces fradiae and Bacillus megaterium as probiotics in the experimental
culture of tiger shrimp Penaeus monodon (Crustacea, Penaeidae). AACL Bioflux 6:
253-267.

Aguilar‐Macías, O. L.; Ojeda‐Ramírez, J. J.; Campa‐Córdova, A. I. & Saucedo, P. E. 2010.

Evaluation of natural and commercial probiotics for improving growth and survival of
the pearl oyster, Pinctada mazatlanica, during late hatchery and early field culturing.
J. World Aquacult. Soc. 41: 447-454.

Alavandi, S.; Vijayan, K.; Santiago, T.; Poornima, M.; Jithendran, K.; Ali, S. & Rajan, J.
2004. Evaluation of Pseudomonas sp. PM 11 and Vibrio fluvialis PM 17 on immune
indices of tiger shrimp, Penaeus monodon. Fish Shellfish Immun. 17: 115-120.

Allsopp, M.; Johnston, P. & Santillo, D. 2008. Challenging the aquaculture industry on
sustainability. 2nd Ed. Part. 1. Amsterdam, Netherlands. 5 p.

Altschul, S. F. Gish; W., Miller; W., Myers; E. W. & Lipman, D. J. 1990. Basic local
alignment search tool. J. Mo.l Biol. 215: 403-410.

Anderson, R.S. 2001. Reactive oxygen species and antimicrobial defenses of invertebrates: a
bivalve model. In Phylogenetic perspectives on the vertebrate immune system, 131-
139: Springer. New York.

Andersson, A. F.; Lindberg, M.; Jakobsson, H.; Backhed, F.; Nyren, P. & Engstrand, L. 2008.
Comparative analysis of human gut microbiota by barcoded pyrosequencing. PLoS
One 3: e2836.
 Referencias bibliográficas
Angelakis, E.; Merhej, V. & Raoult, D. 2013. Related actions of probiotics and antibiotics on
gut microbiota and weight modification. Lancet Infect. Dis. 13: 889-899.

Arafah, S.; Kicka, S.; Trofimov, V.; Hagedorn, M.; Andreu, N.; Wiles, S.; Robertson, B. &
Soldati, T. 2013. Setting up and monitoring an infection of Dictyostelium discoideum
with mycobacteria. Methods Mol. Biol. 983: 403-417.

Augustine, D. 2014. Actinomycete isolates from arabian sea and bay of bengal: biochemical,
molecular and functional characterization. Thesis in Microbiology. Faculty of Marine
Ciences. Cochin University of Science and Technology. India. 47 p.

Augustine, D.; Jacob, J. C. & Philip, R. 2015. Exclusion of Vibrio spp. by an antagonistic
marine actinomycete Streptomyces rubrolavendulae M56. Aquac. Res. 1-10. doi:
10.1111/are.12746.

Austin, B.; Stuckey, L.; Robertson, P.; Effendi, I. & Griffith, D. 1995. A probiotic strain of
Vibrio alginolyticus effective in reducing diseases caused by Aeromonas salmonicida,
Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii. J. Fish. Dis. 18: 93-96.

Avella, M. A.; Gioacchini, G.; Decamp, O.; Makridis, P.; Bracciatelli, C. & Carnevali, O.
2010. Application of multi-species of Bacillus in sea bream larviculture. Aquaculture
305: 12-19.

Awad, W.A.; Ghareeb, K. & Böhm, J. 2010. Effect of addition of a probiotic micro-organism
to broiler diet on intestinal mucosal architecture and electrophysiological parameters.
J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 94: 486-494.

Bachère, E.; Destoumieux, D. & Bulet, P. 2000. Penaeidins, antimicrobial peptides of shrimp:
a comparison with other effectors of innate immunity. Aquaculture 191: 71-88.

Bachère, E.; Gueguen, Y.; Gonzalez, M.; De Lorgeril, J.; Garnier, J. & Romestand, B. 2004.
Insights into the anti‐microbial defense of marine invertebrates: the penaeid shrimps
and the oyster Crassostrea gigas. Immunol. Rev. 198: 149-168.

Bachère, E.; Mialhe, E.; Noel, D.; Boulo, V.; Morvan, A. & Rodriguez, J. 1995. Knowledge
and research prospects in marine mollusc and crustacean immunology. Aquaculture
132: 17-32.

Balbi, F.; Rosas, J.; Velásquez, A.; Maneiro, C. & Cabrera, T. 2005. Aclimatación a baja
salinidad de postlarvas del camarón marino Litopenaeus vannamei (Boone, 1931)
provenientes de dos criaderos comerciales. Rev. Biol. Mar. Oceanog. 40: 109-115.

Balcázar, J. L.; de Blas, I.; Ruiz-Zarzuela, I.; Cunningham, D.; Vendrell, D. & Muzquiz, J. L.
2006. The role of probiotics in aquaculture. Vet. Microbiol. 114: 173-186.

Balcázar, J. L.; Rojas-Luna, T. & Cunningham, D. P. 2007. Effect of the addition of four
potential probiotic strains on the survival of pacific white shrimp (Litopenaeus
vannamei) following immersion challenge with Vibrio parahaemolyticus. J. Invertebr.
Pathol. 96: 147-150.
 Referencias bibliográficas
Baltz, R. H. 2008. Renaissance in antibacterial discovery from actinomycetes. Curr. Opin.
Pharmacol. 8: 557-563.

Barka, E.A. Vatsa, P., Sanchez, L., Gaveau-Vaillant, N., Jacquard, C., Klenk, H. P., Clément,
C., Ouhdouch, Y. & Wezel, G. P. 2016. Taxonomy, physiology, and natural products
of Actinobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80: 1–43.

Berdy, J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. (Tokyo) 58: 1-26.

Berkhoff, H. & Vinal, A. 1986. Congo red medium to distinguish between invasive and non-
invasive Escherichia coli pathogenic for poultry. Avian. Dis. 30: 117-121.

Betanzos Vega, A.; Rivero Suárez, S. & Mazón-Suástegui, J. M. 2014. Factibilidad

económico-ambiental para el cultivo sostenible de la ostra de mangle Crassostrea
rhizophorae (Güilding, 1828), en Cuba. Lat. Am. J. Aquat. Res. 42: 1148-1158.

Bezkorovainy, A. 2001. Probiotics: determinants of survival and growth in the gut. Am. J.
Clin. Nutr. 73: 399S-405S.

Bogdan, C.; Röllinghoff, M. & Diefenbach, A. 2000. Reactive oxygen and reactive nitrogen
intermediates in innate and specific immunity. Curr. Opin. Immunol. 12: 64-76.

Boone, L. 1931. Anomuran, macruran Crustacea from Panama and Canal Zone. Bull. Am.
Mus. Nat. Hist. 63: 137-189.

Boyd, C. E.; Thunjai, T. & Boonyaratpalin, M. 2002. Dissolved salts in water for inland low-
salinity shrimp culture. Global Aquaculture Advocate 5: 40-45.

Bull, A. T. & Stach, J. E. 2007. Marine actinobacteria: new opportunities for natural product
search and discovery. Trends Microbiol. 15: 491-499.

Cabello, F. C.; Godfrey, H. P.; Tomova, A.; Ivanova, L.; Dölz, H.; Millanao, A. &
Buschmann, A. H. 2013. Antimicrobial use in aquaculture re-examined: its relevance
to antimicrobial resistance and to animal and human health. Environ. Microbiol. 15:
1917-1942.

Cáceres-Martínez, J. & Vásquez-Yeomans, R. 2013. Enfermedades, parásitos y episodios de

mortalidad de ostiones de importancia comercial en México y sus implicaciones para
la producción. Ciencia Pesquera 21: 5-48.

Cáceres-Martínez, J. & Vásquez-Yeomans, R. 2014. Manual de Buenas Prácticas de Manejo

para el Cultivo de Moluscos Bivalvos. Organismo Internacional Regional de Sanidad
Agropecuaria (OIRSA) - Organización del Sector Pesquero y Acuícola del ISTMO
Centroamericano (OSPESCA).

Cáceres-Martínez, J.; Vásquez-Yeomans, R. & Padilla-Lardizábal, G. 2010. Parasites of the

pleasure oyster Crassostrea corteziensis cultured in Nayarit, Mexico. J. Aquat. Anim.
Health 22: 141-151.
 Referencias bibliográficas
Campa-Córdova, A. I; González-Ocampo, H.; Luna-González, A.; Mazón-Suástegui, J. M. &
Ascencio, F. 2009. Growth, survival, and superoxide dismutase activity in juvenile
Crassostrea corteziensis (Hertlein, 1951) treated with probiotics. Crecimiento,
supervivencia y actividad superoxido dismutasa en juveniles de Crassostrea
corteziensis (Hertlein, 1951) tratados con probióticos. Hidrobiológica 19: 151-157.

Cao, H.; Hou, S.; He, S.; Lu, L. & Yang, X. 2014. Identification of a Bacteriovorax sp. isolate
as a potential biocontrol bacterium against snakehead fish-pathogenic Aeromonas
veronii. J. Fish. Dis. 37: 283-289.

Clinical Laboratory Standards Institute. 2006. Method for dilution antimicrobial susceptibility
test for bacteria that grow aerobically; Approved Standard-Seventh Edition. M7-A7
(CLSI, Wayne, NJ, USA).

Cole, J. R.; Chai, B.; Farris, R. J.; Wang, Q.; Kulam, S.; McGarrell, D. M.; Garrity, G. M. &
Tiedje, J. M. 2005. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for
high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 33: D294-D296.

Cole, J. R.; Wang, Q.; Cardenas, E.; Fish, J.; Chai, B.; Farris, R. J.; Kulam-Syed-Mohideen,
A. S.; McGarrell, D. M.; Marsh, T.; Garrity, G. M. & Tiedje, J. M. 2009. The
Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis.
Nucleic. Acids Res. 37: D141-145.

Cowan, S. T. & Steel, L. J. 1993. Manual for the Identification of Medical Bacteria.
Cambridge University Press, Third edition. Cambridge, UK. 331p.

Crossman, L. C.; Chen, H.; Cerdeno-Tarraga, A. M.; Brooks, K.; Quail, M. A.; Pineiro, S. A.;
Hobley, L.; Sockett, R. E.; Bentley, S. D.; Parkhill, J.; Williams, H. N. & Stine, O. C.
2013. A small predatory core genome in the divergent marine Bacteriovorax marinus
SJ and the terrestrial Bdellovibrio bacteriovorus. ISME J. 7: 148-160.

Cruz, P.; Ibañez, A.; Hermosillo, O. A. & Saad, H. C. R. 2012. Use of probiotics in
aquaculture. ISRN Microbiol. Volume 2012, doi:10.5402/2012/916845.

Cha, J. H.; Rahimnejad, S.; Yang, S. Y.; Kim, K. W. & Lee, K. J. 2013. Evaluations of
Bacillus spp. as dietary additives on growth performance, innate immunity and disease
resistance of olive flounder (Paralichthys olivaceus) against Streptococcus iniae and
as water additives. Aquaculture 402: 50-57.

Chang, C. I. & Liu, W. Y. 2002. An evaluation of two probiotic bacterial strains,

Enterococcus faecium SF68 and Bacillus toyoi, for reducing edwardsiellosis in
cultured European eel, Anguilla anguilla L. J. Fish Dis. 25: 311-315.

Chater, K. F.; Biro, S.; Lee, K. J.; Palmer, T. & Schrempf, H. 2010. The complex
extracellular biology of Streptomyces. FEMS Microbiol Rev. 34: 171-198.

Chen, H.; Young, S.; Berhane, T. K. & Williams, H. N. 2012. Predatory Bacteriovorax
communities ordered by various prey species. PLoS One 7: e34174.
 Referencias bibliográficas
Chiu, C.-H.; Guu, Y.-K.; Liu, C.-H.; Pan, T.-M. & Cheng, W. 2007. Immune responses and
gene expression in white shrimp, Litopenaeus vannamei, induced by Lactobacillus
plantarum. Fish Shellfish Immunol. 23: 364-377.

Chythanya, R.; Karunasagar, I. & Karunasagar, I. 2002. Inhibition of shrimp pathogenic

vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture 208: 1-10.

Das, S.; Lyla, P. & Ajmal Khan, S. 2006. Application of Streptomyces as a probiotic in the
laboratory culture of Penaeus monodon (Fabricius). Israeli J Aquacult. – Bamid. 58:
198-204.

Das, S.; Ward, L. R. & Burke, C. 2008. Prospects of using marine actinobacteria as probiotics
in aquaculture. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81: 419-429.

Das, S.; Ward, L. R. & Burke, C. 2010. Screening of marine Streptomyces spp. for potential
use as probiotics in aquaculture. Aquaculture 305: 32-41.

Davis, D. A.; Samocha, T. M. & Boyd, C. 2004. Acclimating Pacific white shrimp,
Litopenaeus vannamei, to inland, low-salinity waters. Southern Regional Aquaculture
Center Stoneville, Mississippi.

De, B. C.; Meena, D.; Behera, B.; Das, P., Mohapatra; P. D. & Sharma, A. 2014. Probiotics in
fish and shellfish culture: immunomodulatory and ecophysiological responses. Fish
Physiol. Biochem. 40: 921-971.

de Lima Procópio, R. E.; da Silva, I. R.; Martins, M. K.; de Azevedo, J. L. & de Araújo, J. M.
2012. Antibiotics produced by Streptomyces. Braz. J. Infect. Dis. 16: 466-471.

Destoumieux, D.; Bulet, P.; Loew, D.; Van Dorsselaer, A.; Rodriguez, J. & Bachère, E. 1997.
Penaeidins, a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus
vannamei (Decapoda). J. Biol. Chem. 272: 28398-28406.

Devaraja, T. N.; Yusoff, F. M. & Shariff, M. 2002. Changes in bacterial populations and
shrimp production in ponds treated with commercial microbial products. Aquaculture
206: 245-256.

Dharmaraj, S. 2010. Marine Streptomyces as a novel source of bioactive substances. World J.

Microb. Biot. 26: 2123-2139.

Dharmaraj, S. 2011. Antagonistic potential of marine Actinobacteria against fish and shellfish
pathogens. Turk. J. Biol. 35: 303-311.

Dharmaraj, S. & Dhevendaran, K. 2010. Evaluation of Streptomyces as a probiotic feed for

the growth of ornamental fish Xiphophorus helleri. Food Technol. Biotech. 48: 497-
504.

Diana, J. S.; Egna, H. S.; Chopin, T.; Peterson, M. S.; Cao, L.; Pomeroy, R.; Verdegem, M.;
Slack, W. T.; Bondad-Reantaso, M. G. & Cabello, F. 2013. Responsible aquaculture in
2050: valuing local conditions and human innovations will be key to success.
BioScience 63: 255-262.
 Referencias bibliográficas
Donia, M. & Hamann, M. T. 2003. Marine natural products and their potential applications as
anti-infective agents. Lancet Infect. Dis. 3: 338-348.

Douillet, P. A. & Langdon, C. J. 1994. Use of a probiotic for the culture of larvae of the
Pacific oyster (Crassostrea gigas Thunberg). Aquaculture 119: 25-40.

Drautz, H.; Keller-Schierlein, W. & Zahner, H. 1975. Metabolic products of microorganisms,

149. Lysolipin I, a new antibiotic from Streptomyces violaceoniger (author's transl).
Arch. Microbiol. 106: 175-190.

Dudonne, S.; Vitrac, X.; Coutiere, P.; Woillez, M. & Mérillon, J. M. 2009. Comparative study
of antioxidant properties and total phenolic content of 30 plant extracts of industrial
interest using DPPH, ABTS, FRAP, SOD, and ORAC assays. J. Agr. Food Chem. 57:
1768-1774.

Edgar, R. C.; Haas, B. J.; Clemente, J. C.; Quince, C. & Knight, R. 2011. UCHIME improves
sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 27: 2194-2200.

Ellis, R.; Parry, H.; Spicer, J.; Hutchinson, T.; Pipe, R. & Widdicombe, S. 2011.
Immunological function in marine invertebrates: responses to environmental
perturbation. Fish Shellfish Immun. 30: 1209-1222.

Ezziyyani, M.; Sánchez, C. P.; Requena, M. E.; Rubio, L. & Castillo, M. E. C. 2004.
Biocontrol por Streptomyces rochei -Ziyani-, de la podredumbre del pimiento
(Capsicum annuum L.) causada por Phytophthora capsici. An. Biol. 26: 69-78.

FAO/WHO (Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health

Organization). 2001. Health and nutritional properties of probiotics in food including
powder milk with live lactic acid bacteria. Report of a joint FAO/WHO expert
consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food
including powder milk with live lactic acid bacteria in food. October 1-4. Cordoba,
Argentina. Disponible en:
http://www.who.int/foodsafety/publications/fs_management/en/probiotics.pdf

FAO/WHO (Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health

Organization). 2002. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Report of a
joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics
in food. April 30 and May 1. London Ontario, Canada. Disponible en:
http://www.who.int/foodsafety/fs_management/en/probiotic_guidelines.pdf FAO
2012. Global Aquaculture Production. Organización de las Naciones Unidas para la
Alimentación y la Agricultura. Roma.

FAO 2014. El estado mundial de la pesca y la acuicultura. (Departamento de Pesca y

Acuicultura. Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura). Roma.

Farzanfar, A. 2006. The use of probiotics in shrimp aquaculture. FEMS Immunol. Med
Microbiol. 48: 149-158.
 Referencias bibliográficas
Felix, N. & Sudharsan, M. 2004. Effect of glycine betaine, a feed attractant affecting growth
and feed conversion of juvenile freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.
Aquacult. Nutr. 10: 193-197.

Fernandez-Piquer, J.; Bowman, J. P.; Ross, T. & Tamplin, M. L. 2012. Molecular analysis of
the bacterial communities in the live Pacific oyster (Crassostrea gigas) and the
influence of postharvest temperature on its structure. J. Appl. Microbiol. 112: 1134-
1143.

Fgaier, H. & Eberl, H. J. 2011. Antagonistic control of microbial pathogens under iron
limitations by siderophore producing bacteria in a chemostat setup. J. Theor. Biol.
273: 103-114.

Fischer, C.; Hornung, A.; Holzenkaempfer, M.; Pelzer, S.; Priefert, H.; Renner, U. D.;
Vierling, S. & Wohlert, S. E. 2007. Procedures for the production of new lysolipin
derivatives. (Ed G. Offen.). Germany.

Franco, R.; Martín, L.; Arenal, A.; Santiesteban, D.; Sotolongo J.; Cabrera H.; Mejías, J.;
Rodríguez, G.; Moreno, A. G.; Pimentel, E. & Castillo, N. M. 2016. Evaluation of two
probiotics used during farm production of white shrimp Litopenaeus vannamei
(Crustacea: Decapoda). Aquac. Res. 1-15.

Fridovich, I. 1998. Oxygen toxicity: a radical explanation. J. Exp. Biol. 201: 1203-1209.

Fuller, R. 1989. A review: probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66: 365-378.

García de la Cruz, M. T.; Vinjoy Campa, M. & Muñoz Calderón, D. C. 2012. Uso de
PROBICID como potenciador probiótico en Tilapia roja (Oreochromis spp.) y su
repercusión en la salud piscícola. Acuacuba 14: 23-28

Garnier, M.; Labreuche, Y.; Garcia, C.; Robert, M. & Nicolas, J. L. 2007. Evidence for the
involvement of pathogenic bacteria in summer mortalities of the Pacific Oyster
Crassostrea gigas. Microb. Ecol. 53: 187-196.

Gatesoupe, F. J. 1999. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture 180: 147-165.

Gibson, L.; Woodworth, J. & George, A. 1998. Probiotic activity of Aeromonas media on the
Pacific oyster, Crassostrea gigas, when challenged with Vibrio tubiashii. Aquaculture
169: 111-120.

Gildberg, A.; Mikkelsen, H.; Sandaker, E. & Ringø, E. 1997.Probiotic effect of lactic acid
bacteria in the feed on growth and survival of fry of Atlantic cod (Gadus morhua). In
Asia-Pacific Conference on Science and Management of Coastal Environment.
Springer: 279-285.

Giraffa, G.; Chanishvili, N. & Widyastuti, Y. 2010. Importance of lactobacilli in food and
feed biotechnology. Res. Microbiol. 161: 480-487.

Giri, S. S.; Sen, S. S. & Sukumaran, V. 2012. Effects of dietary supplementation of potential
probiotic Pseudomonas aeruginosa VSG-2 on the innate immunity and disease
 Referencias bibliográficas
resistance of tropical freshwater fish, Labeo rohita. Fish Shellfish. Immun. 32: 1135-
1140.

Gomez-Gil, B.; Roque, A. & Turnbull, J. F. 2000. The use and selection of probiotic bacteria
for use in the culture of larval aquatic organisms. Aquaculture 191: 259-270.

González, I.; Ayuso‐Sacido, A.; Anderson, A. & Genilloud, O. 2005. Actinomycetes isolated
from lichens: evaluation of their diversity and detection of biosynthetic gene
sequences. FEMS Microbiol. Ecol. 54: 401-415.

González, M. & Arenas, G. 2002. Characterization of immune response of the North scallop
Argopecten purpuratus (Lamarck 1819) (Mollusca: Bivalvia). Cienc. Mar. 28: 247-
255.

Goodfellow, M. & Fiedler, H. P. 2010. A guide to successful bioprospecting: informed by

actinobacterial systematics. Antonie van Leeuwenhoek 98: 119-142.

Gopalakrishnan, S.; Ranga Rao, G.; Ratna Kumari, B.; Vijayabharathi, R.; Srinivas, V. &
Gowda, C. 2013. Development of broad-spectrum Actinomycetes for biocontrol and
plant growth promotion of food crops. Recent Advances in Biofertilizers and
Biofungicides (PGPR) For Sustainable Agriculture. In: Proceedings of 3rd Asian
Conference on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) and other Microbials
Manila, Philippines.

Granados‐Amores, A.; Campa‐Córdova, Á. I.; Araya, R.,;Mazón‐Suástegui, J. M. & Saucedo,

P. E. 2012. Growth, survival and enzyme activity of lions‐paw scallop (Nodipecten
subnodosus) spat treated with probiotics at the hatchery. Aquac. Res. 43: 1335-1343.

Green, T. J. & Barnes, A. C. 2010. Bacterial diversity of the digestive gland of Sydney rock
oysters, Saccostrea glomerata infected with the paramyxean parasite, Marteilia
sydneyi. J. Appl. Microbiol. 109: 613-622.

Gunasundari, V.; Kumar, T. A.; Ghosh, S. & Kumaresan, S. 2013. An ex vivo loom to
evaluate the brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae in clownfish aquaculture with
special reference to Amphiprion percula (Lacepede, 1802). Turk. J. Fish. Aquat. Sc
13: 389-395.

Gurevich, A. I.; Karapetyan, M. G.; Kolosov, M. N.; Omelchenko, V. N.; Onoprienko, V. V.;
Petrenko, G. I.; & Popravko, S. A. 1972. The structure of albofungin. Tetrahedron
Lett. 13: 1751-1754.

Harley, J. P. & Prescott, L. M. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. 5th ed.The

McGraw Hill Companies. New York.

Harris, J. M. 1993. The presence, nature, and role of gut microflora in aquatic invertebrates: a
synthesis. Microb. Ecol. 25: 195-231.

Hieu, N. X.; Thuan, L. T. N.; Matsumoto, M. & Miyajima, I. 2011. Identification and
characterization of Actinomycetes antagonistic to pathogenic Vibrio spp. isolated from
 Referencias bibliográficas
shrimp culture pond sediments in Thua Thien Hue-Viet Nam. J. Fac. Agr. Kyushu U
56: 15-22.

Hinsa, S. M.; Espinosa‐Urgel, M.; Ramos, J. L. & O'Toole, G. A. 2003. Transition from
reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas
fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol.
Microbiol. 49: 905-918.

Hirsch, R.; Ternes, T.; Haberer, K. & Kratz, K. L. 1999. Occurrence of antibiotics in the
aquatic environment. Sci. Total Environ. 225: 109-118.

Hodges, T. W.; Slattery, M. & Olson, J. B. 2012. Unique actinomycetes from marine caves
and coral reef sediments provide novel PKS and NRPS biosynthetic gene clusters.
Mar. Biotechnol. 14: 270-280.

Holmblad, T. & Söderhäll, K. 1999. Cell adhesion molecules and antioxidative enzymes in a
crustacean, possible role in immunity. Aquaculture. 172: 111-123.

Hoseinifar, S. H.; Mirvaghefi, A. & Merrifield, D. L. 2011. The effects of dietary inactive
brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus on the growth,
physiological responses and gut microbiota of juvenile beluga (Huso huso).
Aquaculture 318: 90-94.

Huse, S. M.; Dethlefsen, L.; Huber, J. A.; Welch, D. M.; Relman, D. A. & Sogin, M. L. 2008.
Exploring microbial diversity and taxonomy using SSU rRNA hypervariable tag
sequencing. PLoS Genet 4: e1000255.

Inouye, K.; Miwa, S.; Oseko, N.; Nakano, H.; Kimura, T.; Momoyama, K. & Hiraoka, M.
1994. Mass mortalities of cultured kuruma shrimp Penaeus japonicus in Japan in
1993: electron microscopic evidence of the causative virus. Gyobyo Kenkyu= Fish
Pathology 29: 149-158.

Irianto, A. & Austin, B. 2002. Probiotics in aquaculture. J. Fish. Dis. 25: 633-642.

Islas-Olivares, R.; Gendrop-Funes, V. & Miranda-Aguilar, M. 1978. Infraestructura básica

para la obtención de larvas (semilla) de ostión japonés (Crassostrea gigas) y ostión
europeo (Ostrea edulis) en Baja California. Cienc. Mar. 5: 73-86.

Jaime-Ceballos, B.; Galindo-López, J.; Laria-Lamela, E.; Cupul-Magaña, F. & Vega-

Villasante, F. 2008. Traslado de postlarvas de Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) a
diferentes tiempos, salinidades y densidades y su efecto en la supervivencia y algunos
marcadores bioquímicos. Rev. Biol. Mar. Oceanog. 43: 681-686.

Jensen, P. R.; Gontang, E.; Mafnas, C.; Mincer, T. J. & Fenical, W. 2005. Culturable marine
actinomycete diversity from tropical Pacific Ocean sediments. Environ. Microbiol. 7:
1039-1048.

Jerbi, M. A.; Ouanes, Z.; Besbes, R.; Achour, L. & Kacem, A. 2011. Single and combined
genotoxic and cytotoxic effects of two xenobiotics widely used in intensive
 Referencias bibliográficas
aquaculture. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis
724: 22-27.

Jiravanichpaisal, P.; Lee, B. L. & Söderhäll, K. 2006. Cell-mediated immunity in arthropods:

hematopoiesis, coagulation, melanization and opsonization. Immunobiology 211: 213-
236.

Jory, D. & Dixon, H. M. 1999. Shrimp: Shrimp whitespot virus in the western hemisphere.
Aquaculture Magazine-Arkansas 25: 83-91.

Kalatzis, P. G.; Bastías, R.; Kokkari, C. & Katharios, P. 2016. Isolation and characterization
of two lytic bacteriophages, φSt2 and φGrn1; phage therapy application for biological
control of Vibrio alginolyticus in aquaculture live feeds. PLoS One 11(3): e0151101.

Kesarcodi-Watson, A.; Kaspar, H.; Lategan, M. J. & Gibson, L. 2008. Probiotics in

aquaculture: the need, principles and mechanisms of action and screening processes.
Aquaculture 274: 1-14.

Kesarcodi-Watson, A.; Miner, P.; Nicolas, J.-L. & Robert, R. 2012. Protective effect of four
potential probiotics against pathogen-challenge of the larvae of three bivalves: Pacific
oyster (Crassostrea gigas), flat oyster (Ostrea edulis) and scallop (Pecten maximus).
Aquaculture 344: 29-34.

Kimura, M. 1980. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions
through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16: 111-120.

Kobayashi, K.; Nishino, C.; Ohya, J.; Sato, S.; Mikawa, T.; Shiobara, Y.; & Kodama, M.
1988. Actinoplanones C, D, E, F and G, new cytotoxic polycyclic xanthones from
Actinoplanes sp. J. Antibiot. 41: 741-750.

Koizumi, Y.; Tomoda, H.; Kumagai, A.; Zhou, X. P., Koyota, S., & Sugiyama, T. 2009.
Simaomicin α, a polycyclic xanthone, induces G1 arrest with suppression of
retinoblastoma protein phosphorylation. Cancer Sci. 100: 322-326.

Kongnum, K. & Hongpattarakere, T. 2012. Effect of Lactobacillus plantarum isolated from

digestive tract of wild shrimp on growth and survival of white shrimp (Litopenaeus
vannamei) challenged with Vibrio harveyi. Fish Shellfish Immun. 32: 170-177.

Kumar, S. S.; Philip, R. & Achuthankutty, C. 2006. Antiviral property of marine

actinomycetes against white spot syndrome virus in penaeid shrimps. Current Science
91: 807-811.

Kunimoto, S.; Someno, T.; Yamazaki, Y.; Lu, J.; Esumi, H., & Naganawa, H. 2003.
Kigamicins, Novel Antitumor Antibiotics: II. Structure Determination. J. Antibiot. 56:
1012-1017.

Kwon, H. C.; Kauffman, C. A.; Jensen, P. R. & Fenical, W. 2006. Marinomycins AD,
antitumor-antibiotics of a new structure class from a marine actinomycete of the
recently discovered genus “Marinispora”. J. Am. Chem. Soc. 128: 1622-1632.
 Referencias bibliográficas
Labella, A.; Gennari, M.; Ghidini, V.; Trento, I.; Manfrin, A.; Borrego, J. & Lleo, M. 2013.
High incidence of antibiotic multi-resistant bacteria in coastal areas dedicated to fish
farming. Mar. Pollut. Bull. 70: 197-203.

Lakshmi, B.; Viswanath, B. & Sai Gopal, D. V. 2013. Probiotics as antiviral agents in shrimp
aquaculture. J. Pathog. 2013: 424123.

Lakshmi, N. & Rosamma, P. 2008. Marine Actinomycetes as source of antiviral agents and as
probionts for Penaeus monodon culture systems. Thesis Cochin University of Science
and Technology.

Lalloo, Rajesh, Moonsamy, G.; Ramchuran, S.; Görgens, J. & Gardiner, N. 2010.
Competitive exclusion as a mode of action of a novel Bacillus cereus aquaculture
biological agent. Letters in applied microbiology 50: 563-570.

Lanoot, B. 2005. Improved taxonomy of the genus Streptomyces. PhD thesis, Faculty of
Sciences, Ghent University, Ghent, Belgium. 42 p.

Lara-Flores, M. 2011. The use of probiotic in aquaculture: an overview. International Res. J.

Microbiol. 2: 471-478.

Lara-Flores, M. & Aguirre-Guzmán, G. 2009. The use of probiotic in fish and shrimp
aquaculture. A review. Probiotics: production, evaluation and uses in animal feed.
Res. Signpost Kerala: 75-89.

Lara-Flores, M.; Olivera-Castillo, L. & Olvera-Novoa, M. A. 2010. Effect of the inclusion of

a bacterial mix (Streptococcus faecium and Lactobacillus acidophilus), and the yeast
(Saccharomyces cerevisiae) on growth, feed utilization and intestinal enzymatic
activity of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). International Journal of Fisheries and
Aquaculture 2: 93-101.

Lara-Flores, M.; Olvera-Novoa, M. A.; Guzmán-Méndez, B. Z. E. & López-Madrid, W. 2003.

Use of the bacteria Streptococcus faecium and Lactobacillus acidophilus, and the
yeast Saccharomyces cerevisiae as growth promoters in Nile tilapia (Oreochromis
niloticus). Aquaculture 216: 193-201.

Lazado, C. C.; Lacsamana, J. I. & Caipang, Ch. M. A. 2015. Mechanisms of probiotic actions
in shrimp: Implications to tropical aquaculture. Biotechnological Advances in Shrimp
Health Management in the Philippines. Ed. Research Signpost, Kerala. p. 89-114.

Lee, E. J.; Hwang, K. Y.; Lee, H. S. Chung, N. 2011. Characterization of a new Streptomyces
sp. A1022 as a potential biocontrol agent. J. Kor. Soc. Appl. Biol. Chem. 54: 488-493.

Lee, R.; Lovatelli, T. & Ababouch, A. 2008. Bivalve depuration: fundamental and practical
aspects., FAO, Fisheries Technical Paper, Food and Agriculture Organization, Rome,
N° 551. pp. 11–39.

Lee, T. M.; Carter, G. T. & Borders, D. B. 1989. Structure determination of simaomicins α

and β, extremely potent, novel anticoccidal agents produced by Actinomadura. J.
Chem. Soc. Chem. Comm. 22: 1771-1772.
 Referencias bibliográficas
Leiva, S.; Yáñez, M.; Zaror, L.; Rodríguez, H. & García-Quintana, H. 2004. Actividad
antimicrobiana de actinomycetes aislados desde ambientes acuáticos del sur de Chile.
Rev. Med. Chile 132: 151-159.

Lemaitre, B. & Hoffmann, J. 2007. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev.
Immunol. 25: 697-743.

León, J.; Aponte, J. J.; Cuadra, D´L.; Galindo, N.; Jaramillo, L.; Vallejo, M. & Marguet, E.
2016. Actinomicetos aislados de Argopecten purpuratus productores de enzimas
extracelulares y con actividad inhibitoria de patógenos marinos. Rev. Biol. Mar.
Oceanog. 51: 69-80.

León, J.; Pellón, F.; Unda, V.; David, J.; Anaya, C. & Mendoza, V. 2000. Producción de
enzimas extracelulares por bacterias aisladas de invertebrados marinos. Rev. Per. Biol.
7: 202-210.

Leveau, J. & Bouix, M. 2000. Microbiología industrial. Los microorganismos de interés

industrial. Ed. Acribia. S. A., Zaragoza. p. 525.

Li, K.; Zheng, T.; Tian, Y.; Xi, F.; Yuan, J.; Zhang, G. & Hong, H. 2007. Beneficial effects of
Bacillus licheniformis on the intestinal microflora and immunity of the white shrimp,
Litopenaeus vannamei. Biotechnol. Lett. 29: 525-530.

Lightner, D. & Redman, R. 1998. Shrimp diseases and current diagnostic methods.
Aquaculture 164: 201-220.

Lightner, D. V. 1996. A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for

diseases of cultured penaeid shrimp.The World Aquaculture Society. Batoa. Rouge,
Lousiana.

Liu, C. H.; Chiu, C. S.; Ho, P. L. & Wang, S. W. 2009. Improvement in the growth
performance of white shrimp, Litopenaeus vannamei, by a protease‐producing
probiotic, Bacillus subtilis E20, from natto. J. Appl. Microbiol. 107: 1031-1041.

Liu, H.; Li, Z.; Tan, B.; Lao, Y.; Duan, Z.; Sun, W. & Dong, X. 2014. Isolation of a putative
probiotic strain S12 and its effect on growth performance, non-specific immunity and
disease-resistance of white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immun. 41:
300-307.

Lo, C.; Leu, J.-H.; Ho, C.; Chen, C.; Peng, S.; Chen, Y.; Chou, C.; Yeh, P.; Huang, C. &
Chou, H. 1996. Detection of baculovirus associated with white spot syndrome
(WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction. Dis. Aquat. Organ. 25:
133-141.

Lobo, C.; Moreno-Ventas, X.; Tapia-Paniagua, S.; Rodríguez, C.; Moriñigo, M. A. & de La
Banda, I. G. 2014. Dietary probiotic supplementation (Shewanella putrefaciens
Pdp11) modulates gut microbiota and promotes growth and condition in Senegalese
sole larviculture. Fish Physiol. Biochem. 40: 295-309.
 Referencias bibliográficas
LohTeng-Hern, T.; Kok-Gan, Ch.; Learn-Han, L. & Bey-Hing, G. 2016. Streptomyces
Bacteria as Potential Probiotics in Aquaculture. Front Microbiol. 7: 79.

Lokmer, A. y Wegner, M. K. 2015. Hemolymph microbiome of Pacific oysters in response to

temperature, temperature stress and infection. ISME J. 9: 670-682.

Longeon, A.; Peduzzi, J.; Barthelemy, M.; Corre, S.; Nicolas, J. L. & Guyot, M. 2004.
Purification and partial identification of novel antimicrobial protein from marine
bacterium Pseudoalteromonas species strain X153. Mar. Biotechnol. 6: 633-641.

Lovatelli, A.; Farías, A. & Uriarte, I. 2008. Estado actual del cultivo y manejo de moluscos
bivalvos y su proyección futura. Factores que afectan su sustentabilidad en América
Latina. FAO Actas de Pesca y Acuicultura (FAO).

Lu, J., Kunimoto, S., Yamazaki, Y., Kaminishi, M. & Esumi, H. 2004. Kigamicin D, a novel
anticancer agent based on a new anti-austerity strategy targeting cancer cells' tolerance
to nutrient starvation. Cancer Sci. 95: 547-552.

Luis-Villaseñor, I. E.; Macías-Rodríguez, M. E.; Gomez-Gil, B.; Ascencio-Valle, F. &

Campa-Córdova, Á. I. 2011. Beneficial effects of four Bacillus strains on the larval
cultivation of Litopenaeus vannamei. Aquaculture 321: 136-144.

Mahajan, G. B. & Balachandran, L. 2011. Antibacterial agents from actinomycetes-a review.

Front Biosci. (Elite edition) 4: 240-253.

Manivasagan, P.; Venkatesan, J. Sivakumar, K. & Kim, S. K. 2013. Marine actinobacterial

metabolites: current status and future perspectives. Microbiol. Res. 168: 311-332.

Marzouk, M.; Moustafa, M. & Mohamed, N. M. 2008. Evaluation of immunomodulatory

effects of some probiotics on cultured Oreochromis niloticus. In 8th International
symposium on tilapia in aquaculture Vol. 1043.

Masuda, T.; Ohba, S.; Kawada, M.; Iijima, M.; Inoue, H.; Osono, M. & Kunimoto, S. 2006.
Augmentation of cellular immunity by kigamicin D. J. Antibiot. 59: 215-219.

Mattos-Guaraldi, A. L.; Formiga, L. C. & Andrade, A. F. 1999. Cell surface hydrophobicity

of sucrose fermenting and nonfermenting Corynebacterium diphtheriae strains
evaluated by different methods. Curr. Microbiol. 38: 37-42.

Mazón-Suástegui, J. M. 2005. Biología y cultivo de la almeja catarina Argopecten ventricosus

(Sowerby II, 1842). Tesis presentada en opción al grado de Doctor en Biología.
Universitat de Barcelona. Barcelona, España. 217 p.

Mazón-Suástegui, J. M.; Parres-Haro, A.; Ruíz-Ruíz, K.; Rodríguez-Jaramillo, C. & Saucedo

P. E. 2009. Influence of hatchery diets on early grow-out of the Cortez oyster
Crassostrea corteziensis in Sinaloa, México. Aqua. Res. 40:1908−1914.

Mazón-Suástegui, J. M.; Ruiz-Ruiz, K. M.; Parres-Haro, A. & Saucedo P. E. 2008. Combined

effects of diet and stocking density on growth and biochemical composition of spat of
the Cortez oyster Crassostrea corteziensis at the hatchery. Aquaculture 284:98−105.
 Referencias bibliográficas
Merrifield, D. L.; Dimitroglou, A.; Foey, A.; Davies, S. J.; Baker, R. T.; Bøgwald, J.; Castex,
M. & Ringø, E. 2010. The current status and future focus of probiotic and prebiotic
applications for salmonids. Aquaculture 302: 1-18.

Meurer, F.; Hayashi, C.; Costa, M.; Mauerwerk, V. L. & Freccia, A. 2006. Utilização de
Saccharomyces cerevisiae como probiótico para tilápias-do-nilo durante o período de
reversão sexual submetidas a um desafio sanitário. Rev. Bras. Zootecn. 35: 1881-
1886.

Mincer, T. J.; Fenical, W. & Jensen, P. R. 2005. Culture-dependent and culture-independent

diversity within the obligate marine actinomycete genus Salinispora. Appl. Environ.
Microbiol. 71: 7019-7028.

Mohanraj, G. & Sekar, T. 2013. Antagonistic activity of marine Streptomyces sp LCJ94

against the shrimp pathogens. Annals Biol. Res. 4: 224-227.

Mohapatra, S.; Chakraborty, T.; Kumar, V.; Deboeck, G. & Mohanta, K. 2013. Aquaculture
and stress management: a review of probiotic intervention. J. Anim. Physiol. An. N
97: 405-430.

Mohapatra, S.; Chakraborty, T.; Prusty, A. K.; Das, P.; Paniprasad K. & Mohanta, K. N.
2012. Use of probiotics in the diet of rohu, Labeo rohita fingerlings: effects on growth
nutrient digestibility, retention digestive enzyme activities and intestinal microflra.
Aquaculture Nutrition 18: 1-11.

Moriarty, D. J. 1997. The role of microorganisms in aquaculture ponds. Aquaculture 151:

333-349.

Mountzouris, K. C.; Tsirtsikos, P.; Kalamara, E.; Nitsch, S.; Schatzmayr, G. & Fegeros, K.
2007. Evaluation of the efficacy of a probiotic containing Lactobacillus,
Bifidobacterium, Enterococcus, and Pediococcus strains in promoting broiler
performance and modulating cecal microflora composition and metabolic activities.
Poultry Sci 86, 309-317.

Muyzer, G.; de Waal, E. C. & Uitterlinden, A. G. 1993. Profiling of complex microbial

populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain
reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59: 695-
700.

Na, Y. 2009. Recent cancer drug development with xanthone structures. J. Pharm. Pharmacol.
61: 707-712.

Nadell, C. D., Xavier, J. B. & Foster, K. R. 2009. The sociobiology of biofilms. FEMS
Microbiol. Rev. 33: 206-224.

NavinChandran, M.; Iyapparaj, P.; Moovendhan, S.; Ramasubburayan, R.; Prakash, S.;
Immanuel, G. & Palavesam, A. 2014. Influence of probiotic bacterium Bacillus cereus
isolated from the gut of wild shrimp Penaeus monodon in turn as a potent growth
promoter and immune enhancer in P. monodon. Fish Shellfish Immun. 36: 38-45.
 Referencias bibliográficas
Nayak, S. 2010. Probiotics and immunity: a fish perspective. Fish Shellfish Immun. 29: 2-14.

Neissi, A.; Rafiee, G.; Nematollahi, M. & Safari, O. 2013. The effect of Pediococcus
acidilactici bacteria used as probiotic supplement on the growth and non-specific
immune responses of green terror, Aequidens rivulatus. Fish Shellfish Immun. 35:
1976-1980.

Nemutanzhela, M. E.; Roets, Y.; Gardiner, N. & Lallo, R. 2014. The use and benefits of
Bacillus based biological agents in aquaculture. En: Hernandez-Vergara, M. (ed.)
Sustainable aquaculture techniques. Murcia, Spain.

Newaj-Fyzul, A.; Al-Harbi, A. H. & Austin, B. 2014. Review: Developments in the use of
probiotics for disease control in aquaculture. Aquaculture 431: 1-11.

Newaj-Fyzul, A. & Austin, B. 2014. Probiotics, immunostimulants, plant products and oral
vaccines, and their role as feed supplements in the control of bacterial fish diseases. J.
Fish Dis. 38: 937-955.

Nimrat, S.; Suksawat, S.; Boonthai, T. & Vuthiphandchai, V. 2012. Potential Bacillus
probiotics enhance bacterial numbers, water quality and growth during early
development of white shrimp (Litopenaeus vannamei).Vet. Microbiol .159: 443–450

Nimrat, S.; Tanutpongpalin, P.; Sritunyalucksana, K.; Boonthai, T. & Vuthiphandchai, V.

2013. Enhancement of growth performance, digestive enzyme activities and disease
resistance in black tiger shrimp (Penaeus monodon) postlarvae by potential probiotics.
Aquacult. Int. 21: 655-666.

Olafsen, J. A. 2001. Interactions between fish larvae and bacteria in marine aquaculture.
Aquaculture 200: 223-247.

Panigrahi, A. & Azad, I. 2007. Microbial intervention for better fish health in aquaculture: the
Indian scenario. Fish Physiol. Biochem. 33: 429-440.

Park, S. C.; Shimamura, I.; Fukunaga, M.; Mori, K.-I. & Nakai, T. 2000. Isolation of
bacteriophages specific to a fish pathogen, Pseudomonas plecoglossicida, as a
candidate for disease control. Appl Environ Microbiol 66: 1416-1422.

Patil, R., Jeyasekaran, G., Shanmugam, S. & Shakila, R. J. 2001. Control of bacterial
pathogens, associated with fish diseases, by antagonistic marine actinomycetes
isolated from marine sediments. Indian J Mar. Sci 30: 264-267.

Payne, S. M. 1994. Detection, isolation, and characterization of siderophores. Method

Enzymol. 235: 329-344.

Pérez‐Sánchez, T.; Ruiz‐Zarzuela, I.; Blas, I. & Balcázar, J. L. 2014. Probiotics in

aquaculture: a current assessment. Rev. Aquacult. 6: 133-146.

Pisano, M.; Sommer, M. & Lopez, M. 1986. Application of pretreatments for the isolation of
bioactive actinomycetes from marine sediments. Appl. Microbiol. Biotechnol. 25:
285-288.
 Referencias bibliográficas
Prado, S.; Romalde, J. L. & Barja, J. L. 2010. Review of probiotics for use in bivalve
hatcheries. Vet. Microbiol. 145: 187-197.

Prakash, D.; Nawani, N.; Prakash, M.; Bodas, M.; Mandal, A.; Khetmalas, M. & Kapadnis, B.
2013. Actinomycetes: a repertory of green catalysts with a potential revenue resource.
Biomed. Res. Int. 2013: 264020.

Prem Anand, T.; Chellaram, C.; Kumaran, S. & Shanthini, F. 2011. Screening for antibiotic
producing marine bacteria against fish pathogens. International J. Pharm. and Biol.
Sciences 2: 314-325.

Prieur, D.; Mevel, G.; Nicolas, J.-L.; Plusquellec, A. & Vigneulle, M. 1990. Interactions
between bivalve molluscs and bacteria in the marine environment. Oceanogr. Mar.
Biol. Annu. Rev. 28: 277-352.

Programa Mexicano de Sanidad de Moluscos Bivalvos. 1992. Guía técnica para el control
sanitario de moluscos bivalvos. 1-144 p.

Pruzzo, C.; Gallo, G. & Canesi, L. 2005. Persistence of vibrios in marine bivalves: the role of
interactions with haemolymph components. Environ. Microbiol. 7: 761-772.

Ramos, M.; Weber, B.; Goncalves, J.; Santos, G.; Rema, P. & Ozorio, R. 2013. Dietary
probiotic supplementation modulated gut microbiota and improved growth of juvenile
Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Comparative Biochemistry and Physiology
Part A: Molecular & Integrative Physiology 166: 302-307.

Rattanachuay, P.; Kantachote, D.; Tantirungkij, M.; Nitoda, T. & Kanzaki, H. 2010.
Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by extracellular compounds from a proteolytic
bacterium Pseudomonas sp. W3. Electron. J. Biotechn. 13: 8-9.

Reen, J. F.; Gutiérrez-Barranquero, J. A.; Dobson, A. D.; Adams, C. & O’Gara, F. 2015.
Emerging concepts promising new horizons for marine biodiscovery and synthetic
biology. Mar. Drugs 13: 2924-2954.

Reid, R. T.; Livet, D. H.; Faulkner, D. J. & Butler, A. 1993. A siderophore from a marine
bacterium with an exceptional ferric ion affinity constant. Nature 366:455-458.

Ringø, E. & Birkbeck, T. 1999. Intestinal microflora of fish larvae and fry. Aquac. Res. 30:
73-93.

Ringø, E.; Løvmo, L.; Kristiansen, M.; Bakken, Y.; Salinas, I.; Myklebust, R.; Olsen, R. E. &
Mayhew, T. M. 2010. Lactic acid bacteria vs. pathogens in the gastrointestinal tract of
fish: a review. Aquac. Res. 41: 451-467.

Ringø, E.; Sperstad, S.; Myklebust, R.; Refstie, S. & Krogdahl, Å. 2006. Characterization of
the microbiota associated with intestine of Atlantic cod (Gadus morhua L.): the effect
of fish meal, standard soybean meal and a bioprocessed soybean meal. Aquaculture
261: 829-841.
 Referencias bibliográficas
Romalde, J. L.; Diéguez, A. L.; Lasa, A. & Balboa, S. 2013. New Vibrio species associated to
molluscan microbiota: a review. Front Microbiol. 4: 131-141.

Romano, G.; Costantini, M.; Sansone, C.; Lauritano, C.; Ruocco, N. & Ianora, A. 2016.
Marine microorganisms as a promising and sustainable source of bioactive molecules.
Mar. Environ. Res.: 1-12.

Rosenberg, M.; Gutnick, D. & Rosenberg, E. 1980. Adherence of bacteria to hydrocarbons: a

simple method for measuring cell-surfasanidadce hydrophobicity. FEMS Microbiol.
Lett. 9: 29-33.

Rosenberg, M. & Kjelleberg, S. 1986. Hydrophobic interactions: role in bacterial adhesion.

Advances in Microbial Ecology 9: 353-393.

Rudi, K.; Skulberg, O. M.; Larsen, F. & Jakobsen, K. S. 1997. Strain characterization and
classification of oxyphotobacteria in clone cultures on the basis of 16S rRNA
sequences from the variable regions V6, V7, and V8. Appl. Environ. Microbiol. 63:
2593-2599.

Sahu, m. K.; Murugan, M.; Sivakumar, K.; Thangaradjou, T. & Kannan, L. 2007. Occurrence
and distribution of Actinomycetes in marine environs and their antagonistic activity
against bacteria that is pathogenic to shrimps. Israeli. J. Aquacult. – Bamid 59:155-
161.

Saitou, N. & Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406-425.

Sajeevan, T.; Philip, R. & Singh, I. B. 2006. Immunostimulatory effect of a marine yeast
Candida sake S165 in Fenneropenaeus indicus. Aquaculture 257: 150-155.

Salame, M. & Salame, A. 2002. Inland shrimp farming in Ecuador-The Inacua Experience.
Global Aquaculture Advocate 5: 48-49.

Sambrook, J.; Fritsch, E. F. & Maniatis, T. 1989. Molecular cloning. New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press.

Sanchez, L. M.; Wong, W. R.; Riener, R. M.; Schulze, C. J. & Linington, R. G. 2012.
Examining the fish microbiome: vertebrate-derived bacteria as an environmental niche
for the discovery of unique marine natural products. PLoS One 7: e35398.

Saoud, I. P.; Davis, D. A. & Rouse, D. B. 2003. Suitability studies of inland well waters for
Litopenaeus vannamei culture. Aquaculture 217: 373-383.

Schloss, P. D.; Westcott, S. L.; Ryabin, T.; Hall, J. R.; Hartmann, M.; Hollister, E. B.;
Lesniewski, R. A.; Oakley, B. B.; Parks, D. H.; Robinson, C. J.; Sahl, J. W.; Stres, B.;
Thallinger, G. G.; Van Horn, D. J. & Weber, C. F. 2009. Introducing mothur: open-
source, platform-independent, community-supported software for describing and
comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 75: 7537-7541.
 Referencias bibliográficas
Scholz, U.; Diaz, G. G.; Ricque, D.; Suarez, L. C.; Albores, F. V. & Latchford, J. 1999.
Enhancement of vibriosis resistance in juvenile Litopenaeus vannamei by
supplementation of diets with different yeast products. Aquaculture 176: 271-283.

Schrezenmeir, J. & de Vrese, M. 2001. Probiotics, prebiotics, and synbiotics approaching a

definition. Am. J. Clin. Nutr. 73: 361s-364s.

Sharma, K. K.; Soni, S. S. & Meharchandani, S. 2006. Congo red dye agar test as an indicator
test for detection of invasive bovine Escherichia coli. Veterinarski arhiv. 76: 363-366.

Sheeja, M. S.; Selvakumar, D. & Dhevendaran, K. 2011. Antagonistic potential of

Streptomyces associated with the gut of marine ornamental fishes. Middle-East J. Sci.
Res. 7: 327-334.

Sheikhzadeh, N.; Heidarieh, M.; Pashaki, A. K.; Nofouzi, K.; Farshbafi, M. A. & Akbari, M.
2012. Hilyses®, fermented Saccharomyces cerevisiae, enhances the growth
performance and skin non-specific immune parameters in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Fish Shellfish Immun. 32: 1083-1087.

Shen, R.; Wang, P. & Tang, N. 2010. Cytotoxic activity and DNA-binding properties of
xanthone derivatives. J. Fluoresc. 20: 1287-1297.

Silva, E. F.; Soares, M. A.; Calazans, N. F.; Vogeley, J. L.; do Valle, B. C.; Soares, R. &
Peixoto, S. 2013. Effect of probiotic (Bacillus spp.) addition during larvae and
postlarvae culture of the white shrimp Litopenaeus vannamei. Aquac. Res. 44: 13-21.

Singh, S. B. & Pelaez, F. 2008. Biodiversity, chemical diversity and drug discovery. Prog.
Drug Res. 65: 141-174.

Sokal, R. R. & Rohlf, F. 1995. Biometry (3d edn). New York: WH Feeman and Company. p.
98.

Son, N. T. & Fleet, G. H. 1980. Behavior of pathogenic bacteria in the oyster, Crassostrea
commercialis, during depuration, re-laying, and storage. Appl. Environ. Microbiol. 40:
994-1002.

Song, Z. F.; An, J.; Fu, G. H. & Yang, X. L. 2011. Isolation and characterization of an aerobic
denitrifying Bacillus sp. YX-6 from shrimp culture ponds. Aquaculture 319: 188-193.

Sridevi, K. & Dhevendaran, K. 2014. Evaluation of Streptomyces as probiotics against

vibriosis and health management of prawn larvae Macrobrachium rosenbergii.
African Journal of Microbiology Research 8: 3595-3603.

Sritunyalucksana, K. & Söderhäll, K. 2000. The proPO and clotting system in crustaceans.
Aquaculture 191: 53-69.

Stickney, R. R. 2009. Aquaculture: An introductory text. Cabi. 2nd ed. Cambridge University,
Cambridge.
 Referencias bibliográficas
Suffett, I. H.; Corado, A.; Chou, D.; McGuire, M. J. M. & Butterworth, S. 1996. AWWA taste
and odor survey. J. Am. Water Works Assoc. 88: 168–180.

Sullivan, D. J. 2001. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria. J. Agr.
Food Chem. 49: 1751-1760.

Sun, Z.; Huang, L.; Kong, J.; Hu, S.; Zhang, X. & Kong, W. 2012. In vitro evaluation of
Lactobacillus crispatus K313 and K243: high-adhesion activity and anti-inflammatory
effect on Salmonella braenderup infected intestinal epithelial cell. Vet. Microbiol.
159: 212-220.

Sweet, S. P.; MacFarlane, T. W. & Samaranayake, L. P. 1987. Determination of the cell

surface hydrophobicity of oral bacteria using a modified hydrocarbon adherence
method. FEMS Microbiol. Lett. 48: 159-163.

Sylvia, D. M.; Fuhrmann, J. J.; Hartel, P. & Zuberer, D. A. 2005. Principles and applications
of soil microbiology. 2nd Ed. Prentice-Hall, Upper Saddle River, New Jersey.

Tamura, K.; Stecher, G.; Peterson, D., Filipski. A. & Kumar, S. 2013. MEGA6: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30:2725–2729.

Tebiakina, A. E. & Chaikovskaia, S. M. 1960. Biological characteristics and a method for the
determination of activities of a new anti-fungal antibiotic albofungin. Antibiotiki. 5:
26-29.

Terui, Y.; Yiwen, C.; Jun-ying, L.; Ando, T.; Yamamoto, H.; Kawamura, Y.; Tomishima, Y.;
Uchida, S.; Okazaki, T.; Munetomo, E.; Seki, T.; Yamamoto, K.; Murakami, S. &
Kawashima, A. 2003. Xantholipin, a novel inhibitor of HSP47 gene expression
produced by Streptomyces sp. Tetrahedron Lett. 44: 5427-5430.

Thaker, N. M.; García, M.; Koteva K.; Waglechner, N.; Sorensen, D.; Medina, R. & Wright,
G. D. Biosynthetic gene cluster and antimicrobial activity of the elfamycin antibiotic
factumycin. Med. Chem. Commun. 3: 1020-1026.

Thirumurugan, D. & Vijayakumar, R. 2015. Characterization and structure elucidation of

antibacterial compound of Streptomyces sp. ECR77 isolated from East Coast of India.
Curr. Microbiol. 70: 745-755.

Timmerman, H.; Koning, C.; Mulder, L.; Rombouts, F. & Beynen, A. 2004. Monostrain,
multistrain and multispecies probiotics—a comparison of functionality and efficacy.
Int. J. Food Microbiol. 96: 219-233.

Tinh, N. T. N.; Linh, N. D.; Wood, T. K.; Dierckens, K.; Sorgeloos, P. & Bossier, P. 2007.
Interference with the quorum sensing systems in a Vibrio harveyi strain alters the
growth rate of gnotobiotically cultured rotifer Brachionus plicatilis. J. Appl.
Microbiol. 103: 194-203.

Tovar, D.; Infante, J. Z.; Cahu, Ch.; Gatesoupe, F. J.; Vázquez-Juárez, R. 2004. Influence of
dietary live yeast on European sea bass (Dicentrarchus labrax) larval development.
Aquaculture 234: 415-427.
 Referencias bibliográficas
Tovar, D.; Zambonino, J.; Cahu, C.; Gatesoupe, F.; Vázquez-Juárez, R. & Lésel, R. 2002.
Effect of live yeast incorporation in compound diet on digestive enzyme activity in sea
bass (Dicentrarchus labrax) larvae. Aquaculture 204: 113-123.

Trabal-Fernández, N.; Mazón-Suástegui, J. M.; Vázquez-Juárez, R.; Asencio-Valle, F.;

Morales-Bojorquez, E. & Romero, J. 2012. Molecular analysis of bacterial microbiota
associated with oysters (Crassostrea gigas and Crassostrea corteziensis) in different
growth phases at two cultivation sites. Microb. Ecol. 64: 555-569.

Trabal-Fernández, N.; Mazón-Suástegui, J. M.; Vázquez-Juárez, R.; Ascencio-Valle, F. &

Romero, J. 2014. Changes in the composition and diversity of the bacterial microbiota
associated with oysters (Crassostrea corteziensis, Crassostrea gigas and Crassostrea
sikamea) during commercial production. FEMS Microbiol. Ecol. 88: 69-83.

Treece, G. 2002. Inland shrimp farming in west Texas. Global Aquaculture Advocate 5: 46-
47.

Tresner, H. D.; Hayes, J. A. & Backus, E. J. 1968. Differential tolerance of Streptomycetes to

sodium chloride as a taxonomic aid. Appl. Microbiol. 16: 1134-1136.

Tukey, J. 1949. Comparing Individual Means in the Analysis of Variance. Biometrics. 5: 99-
114.

Tuong, N. T. C.; Hà L. T. T.; Nguy H. & Thu A. 2016. Characterization of Actinomycetes

antagonistic to Vibrio parahaemolyticus isolated from shrimp pond sediment. VNU
Journal of Science: Earth and Environmental Sciences 32: 1-9.

Tuong, N. T. C.; Nguyen Xuan, H.; Le Thi Nam, T.; Masaru, M. & Ikuo, M. 2011.
Identification and characterization of actinomycetes antagonistic to pathogenic Vibrio
spp. isolated from shrimp culture pond sediments in Thua Thien Hue–Viet Nam. J.
Fac. Agr. Kyushu U 56: 15-20.

Ullah, I.; Arshad, M.; Chuadhry, M. J. I.; Noureen, U.; Jadoon, W. A. & Jadoon, M. A. 2012.
Actinomycetes screening for bioactive potential isolated from the moist forest soils of
Pakistan. Rec. Zool. Surv. Pakistan 21: 10-13.

Valli, S.; Suvathi, S. S.; Aysha, O.; Nirmala, P.; Vinoth, K. P. & Reena, A. 2012.
Antimicrobial potential of Actinomycetes species isolated from marine environment.
Asian Pac. J. Trop. Med. 2: 469-473.

Vargas-Albores, F.; Guzmán, M.-A. & Ochoa, J.-L. 1993. An anticoagulant solution for
haemolymph collection and prophenoloxidase studies of penaeid shrimp (Penaeus
californiensis). Comp. Biochem. Phys. A. 106: 299-303.

Velmurugan, S.; John, S. T.; Nagaraj, D. S.; Ashine, T. A.; Kumaran, S. & Pugazhvendan, S.
2015. Isolation of Actinomycetes from shrimp culture pond and antagonistic to
pathogenic Vibrio spp. and WSSV. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. 4: 82-92.
 Referencias bibliográficas
Venkat, H. K.; Sahu, N. P. & Jain, K. K. 2004. Effect of feeding Lactobacillus-based
probiotics on the gut microflora, growth and survival of postlarvae of Macrobrachium
rosenbergii (de Man). Aquac. Res. 35: 501-507.

Verschuere, L.; Heang, H.; Criel, G.; Sorgeloos, P. & Verstraete, W. 2000a. Selected bacterial
strains protect Artemia spp. from the pathogenic effects of Vibrio proteolyticus
CW8T2. Appl. Environ. Microbiol. 66: 1139-1146.

Verschuere, L.; Rombaut, G.; Sorgeloos, P. & Verstraete, W. 2000b. Probiotic bacteria as
biological control agents in aquaculture. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 655-671.

Vieira, F. D. N.; Pedrotti, F. S.; Buglione Neto, C. C.; Mouriño, J. L. P.; Beltrame, E.;
Martins, M. L.; Ramirez, C. & Arana, L. A. V. 2007. Lactic-acid bacteria increase the
survival of marine shrimp, Litopenaeus vannamei, after infection with Vibrio harveyi.
Braz. J. Oceanogr. 55: 251-255.

Villamil, L. & Mártínez-Silva, M. A. 2009. Probióticos como herramienta biotecnológica en

el cultivo de camarón: reseña. Bol. Invest. Mar. Cost. 38: 165-187.

Vine, N. G.; Leukes, W. D. & Kaiser, H. 2006. Probiotics in marine larviculture. FEMS
Microbiol. Rev. 30: 404-427.

Wang, G. L.; Yuan, S. P. & Jin, S. 2005. Nocardiosis in large yellow croaker, Larimichthys
crocea (Richardson). J. Fish Dis. 28: 339-345.

Wang, L.; Chen, Y.; Huang, H.; Huang, Z.; Chen, H. & Shao, Z. 2015. Isolation and
identification of Vibrio campbellii as a bacterial pathogen for luminous vibriosis of
Litopenaeus vannamei. Aquac. Res. 46: 395-404.

Wang, Q.; Garrity, G. M.; Tiedje, J. M. & Cole, J. R. 2007. Naive Bayesian classifier for
rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl. Environ.
Microbiol. 73: 5261-5267.

Wang, W.; Chi, Z.; Chi, Z.; Li, J. & Wang, X. 2009. Siderophore production by the marine-
derived Aureobasidium pullulans and its antimicrobial activity. Bioresource Technol.
100: 2639-2641.

Wang, Y.; Hassan, M.; Shariff, M.; Zamri, S. & Chen, X. 1999. Histopathology and
cytopathology of white spot syndrome virus (WSSV) in cultured Penaeus monodon
from peninsular Malaysia with emphasis on pathogenesis and the mechanism of white
spot formation. Dis. Aquat. Organ. 39: 1-11.

Warner, H. R. 1994. Superoxide dismutase, aging, and degenerative disease. Free Radic. Biol.
Med. 17: 249-258.

Williams, S. & Vickers, J. 1986. The ecology of antibiotic production. Microb. Ecol. 12: 43-
52.

Wu, S.; Wang, G.; Angert, E. R.; Wang, W.; Li, W. & Zou, H. 2012. Composition, diversity,
and origin of the bacterial community in grass carp intestine. PLoS One 7: e30440.
 Referencias bibliográficas
Xi, L.; Ruan, J. & Huang, Y. 2012. Diversity and biosynthetic potential of culturable
actinomycetes associated with marine sponges in the China seas. Int. J. Mol. Sci. 13:
5917-5932.

Xia, Z., Zhu, M. & Zhang, Y. 2014. Effects of the probiotic Arthrobacter sp. CW9 on the
survival and immune status of white shrimp (Penaeus vannamei). Lett. Appl.
Microbiol. 58: 60-64.

Yang, S. P.; Wu, Z. H.; Jian, J. C. & Zhang, X. Z. 2010. Effect of marine red yeast
Rhodosporidium paludigenum on growth and antioxidant competence of Litopenaeus
vannamei. Aquaculture 309: 62-65.

You, J.; Cao, L.; Liu, G.; Zhou, S.; Tan, H. & Lin, Y. 2005. Isolation and characterization of
actinomycetes antagonistic to pathogenic Vibrio spp. from nearshore marine
sediments. World J. Microb. Biot. 21: 679-682.

You, J.; Xue, X.; Cao, L.; Lu, X.; Wang, J.; Zhang, L. & Zhou, S. 2007. Inhibition of Vibrio
biofilm formation by a marine actinomycete strain A66. Appl. Microbiol. Biotechnol.
76: 1137-1144.

Zhang, L.; Mai, K.; Tan, B.; Ai, Q.; Qi, C.; Xu, W.; Zhang, W.; Liufu, Z.; Wang, X. & Ma, H.
2009. Effects of dietary administration of probiotic Halomonas sp. B12 on the
intestinal microflora, immunological parameters, and midgut histological structure of
shrimp, Fenneropenaeus chinensis. J. World Aquacult. Soc. 40: 58-66.

Zhang, W.; Wang, L.; Kong, L.; Wang, T.; Chu, Y.; Deng, Z. & You, D. 2012. Unveiling the
post-PKS redox tailoring steps in biosynthesis of the type II polyketide antitumor
antibiotic xantholipin. Chem. Biol. 19: 422-432 .

Zhang, X.; Xiaoling, S. & Jie, H. 2016. Impact of Vibrio parahaemolyticus and white spot
syndrome virus (WSSV) co-infection on survival of penaeid shrimp Litopenaeus
vannamei. Chin. J. Oceanol. Limn. 34: 1-9.

Zheng, F.; Liu, H.; Sun, X.; Qu, L. & Liu, J. 2012. Selection, identification and application of
antagonistic bacteria associated with skin ulceration and peristome tumescence of
cultured sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Aquaculture 334: 24-29.

Zokaeifar, H.; Balcázar, J. L.; Saad, C. R.; Kamarudin, M.S.; Sijam, K. & Arshad, A. 2012.
Effects of Bacillus subtilis on the growth performance, digestive enzymes, immune
gene expression and disease resistance of white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish
Shellfish Immunol. 33: 683–689.

Zokaeifar, H.; Babaei, N.; Saad, C. R.; Kamarudin, M. S.; Sijam, K. & Balcázar, J. L. 2014.
Administration of Bacillus subtilis strains in the rearing water enhances the water
quality, growth performance, immune response, and resistance against Vibrio harveyi
infection in juvenile white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immun. 36:
68-74.
ANEXOS
 Anexos

ANEXOS

Anexo 1. Actividad antimicrobiana del aislado RL8 contra Vibrio harveyi (a), Vibrio

parahaemolyticus (b) y Vibrio vulnificus (c).

Anexo 2. Diseño experimental de ostiones C. sikamea tratados con diferentes cepas de

Streptomyces.
 Anexos

Anexo 3. Histograma de la longitud de secuencias obtenidas durante la pirosecuenciación de

amplicones del gen del ARNr 16S de la microbiota asociada a Crassostrea sikamea.

Anexo 4. Curva de rarefacción de las secuencias del gen del ARNr 16S bacteriano de

ostiones tratados con las cepas de Streptomyces spp. (N7 y RL8). Las UTOs fueron

identificadas usando un punto de corte del 97%.

 Anexos

Anexo 5. Espectro de Masa de Alta Resolución de Lunalipin A.

Anexo 6. Datos de RMN 1H y 13C de los compuestos Lunalipin A y B.

Lunalipin A (1) Lunalipin B (2)

posición δC δH(mult, J in Hz) δC δH(mult, J in Hz)
1 133,1 133,1
2 125,4 7,59 (d, 8,7) 125,4 7,59 (d, 8,7)
3 120,8 7,95 (d, 8,7) 120,8 7,94 (d, 8,7)
4 120,6 120,6
5 149,5 149,7
6 144,5 144,5
8 142,1 142,2
9 107,8 108,0
10 181,1 181,2
11 150,4 150,6
12 112,4 112,5
13 128,9 126,8
14 130,5 130,5
15 75,7 4,95 (d, 2,8) 72,4 4,93 (dd, 4,9, 12,9)
16 61,8 5,37 (br s) 29,3 3,63 (dd, 4,9, 12,9)
2,40 (dd, 12,9, 12,9)
17 129,0 129,9
18 111,6 112,3
19 151,8 151,9
20 110,2 109,1
21 132,9 132,2
22 138,7 138,5
23 100,5 6,72 (s) 100,3 6,69 (s)
24 137,9 137,9
 Anexos
26 166,7 166,7
27 18,8 2,28 (s) 18,9 2,28 (s)
28 90,5 5,67 (d, 5,7 ) 90,8 5,68 (d, 5,9 )
5,49 (d, 5,7 ) 5,45 (d, 5,9 )
6-OMe 61,4 4,10 (s) 61,4 4,10 (s)
11-OH 13,36 (s) 13,38 (s)
16-OH 5,22 (br s)
19-OH 12,67 (s) 12,69 (s)
22-OH 11,84 (br s) 11,78 (br s)
25-NH 8,76 (br s) 8,74 (br s)

Anexo 7. Espectro de Masa de Alta Resolución de Lunalipin B.