UNIVERSIDAD SANTO TOMAS

FACULTAD DE SALUD
ESCUELA DE TECNOLOGIA MÉDICA

GUÍA PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

2/2018

Equipo docente: Fotografias:

TM. Boris Barrera Carla Malig
T.M. Ana Maria Salinas Francisca Meneses
T.M. Paulina Meza

1
Índice Págs

Bioseguridad .......................................................................................................3

Control de calidad en Microbiología…………………………………………………5

Género Staphylococcus .....................................................................................9

Género Streptococcus y Enterococcus..............................................................15

Género Haemophilus.........................................................................................26

Género Neisseria ..............................................................................................29

Familia Enterobacteriaceae…………………………………………..………....….31

Familia Vibrionaceae……………………………………………………………...…39

Bacilos Gram negativos No fermentadores…………………………...................41

Bacilos Gram positivos esporulados................................,,,,,,,.......................... 46.

Bacilos Gram positivos NO esporulados........................................................... 47

Diagnóstico Microbiológico enfermedades infecciosas ………………..…..... 48

Diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis ……………………………………..80

Bacterias Anaerobias……………………………………………...……………..….93

Micología……………………………………………………………………………...96

Anexo: Test de Susceptibilidad e Insertos

2
 BIOSEGURIDAD

El trabajo en el laboratorio de microbiología médica debe ser considerado

de alto riesgo para todo el personal de laboratorio, debido al manejo de diferentes
tipos de muestras clínicas (muestras de tejidos, sangre y otros fluidos biológicos)
potencialmente contaminadas con patógenos microbianos y de cultivos de
microorganismos obtenidos a partir de tales muestras clínicas.
Para minimizar este riesgo existe un plan de bioseguridad que usted debe
seguir rigurosamente.

Recomendaciones generales para los alumnos durante el desarrollo de las

actividades prácticas

 El uniforme y la pechera es de uso obligatorio, le protege del material

infeccioso, de reactivos y colorantes entre otros.
 Los alumnos deben asistir con una presentación adecuada al trabajo del
laboratorio, con el pelo tomado y las manos con las uñas cortas
 Todos los artículos personales, como bolsos, útiles y maletines, deben ser
guardados fuera del área de laboratorio
 Deben lavarse las manos periódicamente, cada vez que entren en
contacto con material infeccioso y siempre que se haga abandono del
área del laboratorio (ver técnica del lavado de manos guía básica)
 Se debe evitar tocarse, frotarse o rascarse con las manos las diferentes
partes del cuerpo mientras se permanezca en el laboratorio.

 Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas diariamente e

inmediatamente después de que ocurra algún derrame de material
infeccioso (muestras clínicas o cultivos)
 Esta rotundamente prohibido pipetear con la boca.
 Está prohibido comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el
laboratorio.
 Las agujas y cualquier otro material cortopunzante debe ser descartado
en cajas de material resistente y con tapa( safebox)
 Todos los procedimientos con muestras clínicas y cultivos microbianos
deben ser realizados muy cuidadosamente de manera que se reduzca al
máximo la formación de aerosoles, particularmente en la estriación de
placas, al destapar recipientes conteniendo muestras clínicas y cultivos
microbianos, y al pipetear o centrifugar material infeccioso.

 Cuando alguna persona tenga cortes o lesiones en la piel de las manos

debe vendarse adecuadamente y utilizar guantes protectores en todo su
trabajo en el laboratorio.

3
  Se deben utilizar guantes protectivos cuando sea inevitable el contacto
con material infeccioso o cuando se trabaje en el nivel de bioseguridad 3
 Cada alumno tendrá un puesto en el mesón de trabajo, el cual debe
mantenerse limpio y ordenado. Además será responsable del microscopio
y del material que se le asigne
 En caso de ruptura de tubos o placas conteniendo un cultivo, avise de
inmediato al docente (ver técnica frente a un derrame (1))

(2) NOTA: Frente a un derrame:

Lavado. Primero se recogen y eliminan los restos de cristal en las cajas

de eliminación de cortopunzantes, mientras que el plástico y el agar en un
recipiente para ser autoclavado, después se lavan con abundante agua,
con un detergente acuoso y a continuación se inicia la desinfección. Hay
que tener en cuenta que cualquier sustancia orgánica (agar sangre, restos
de peptona, etc.) es extraordinariamente bloqueante de la capacidad
oxidativa del hipoclorito sódico y de la capacidad de acción de los
iodóforos; por ello, la norma es primero limpiar y después desinfectar.

Desinfección. Se empleará un desinfectante preferentemente líquido.

Los más útiles en el laboratorio son:
1. Hipoclorito sódico (presentación comercial 5% y se diluye a 0.5%
diariamente) De elección para suelos, cerámicas, etc. No debe usarse en
superficies metálicas. Se vierte haciendo un círculo alrededor del
derrame, o mejor sobre papel absorbente, y se deja actuar 20 minutos.
2. Iodóforo. Se utiliza a la dilución indicada por el fabricante. Adecuado en
superficies metálicas.
3. Alcohol etílico al 70%.
4. Productos detergentes desinfectantes, de fácil manejo, no corrosivo, no
irritante, especialmente activo en presencia de materia orgánica y que
cambia de color cuando deja de ser activo ej. Dextran, Metaquat (amonio
cuaternario)

4
 Control de calidad en Microbiología

Tamara González

El control de calidad en un sentido estricto consiste en la evaluación continua y

sistemática del trabajo para asegurar que el producen final se encuentra
conforme a los límites de precisión y de exactitud tolerados (previamente
establecidos) durante todo el proceso diagnóstico.

Componentes de un programa de control de calidad

Un programa básico de control de calidad enumera varios elementos específicos

que se deben considerar al implementar.una nueva técnica o reacción.
Todas las actividades deben estar descritas en el manual de control de calidad
de cada laboratorio en el que se debe detallar:
1. Recolección y trasporte de muestras. Entrega instrucciones claras,
criterios aceptables y de rechazo para las muestras.
2. Manual de procedimientos. Se describen los procesos, sus etapas
preanalítica, analítica y postanalítica, se definen los límites de tolerancia
y aceptación de las muestras, preparación de reactivos, control de
calidad, cálculos, informes y conservación de documentos.
3. Personal. Contar con suficiente personal para el volumen y complejidad
del trabajo, documentar las actividades de educación continua, realizar
evaluaciones regularmente.
4. Control de calidad. Registrar todos los resultados de control de calidad,
acciones correctivas de los controles fuera rango, mantener una revisión
mensual de los registros de control de calidad, realizar informes
estadísticos y conservar los registros de control de calidad durante un
mínimo de 2 años.
5. Informes de pacientes. Informar los resultados sólo al personal
autorizado, notificar al médico solicitante los valores de alerta de forma
inmediata. Evitar dar información verbal, y en caso que sea necesario
registrar el nombre de la persona, la fecha y hora a la que se notificó.
Corregir los errores en los informes de los pacientes en el momento
oportuno.
6. Derivación de muestras. Derivar examenes solo a laboratorios
acreditados o autorizados e indicar esta información en los resultados de
los pacientes.
7. Programas de evaluación. Participar en programas de calidad externos
permite la intercomparación entre los laboratorios y la detección de
errores; además, contribuye a la formación del personal, repercutiendo en
la mejora continua de la calidad. (Ruiz, E. et al. 2014).
Ejemplo: College of American Pathologists, EEUU (CAP), Programa de
Evaluación Externa de la Calidad, Chile (PEEC), etc.
8. Funcionamiento de los instrumentos o equipos. Mantener documentos de
funcionamiento de los equipos, fijar una frecuencia de mantención

5
 adecuada que asegure el correcto funcionamiento del equipo, seguir las
recomendaciones del fabricante, registrar el mantenimiento preventivo de
rutina y conservar dichos registros.

Equipamiento de microbiología
Equipamiento Ejemplo de registros frecuencias Límite de tolerancia
Refrigeradores 2-8ºC
Registro de temperatura Diario o continua
Congeladores -8 a -20ºC
Estufas Registro de temperatura Diario o continua X ±2ºC
Registro de temperatura Diario o dos
Estufas (CO2) 5-10%
Medición de CO2 veces al día
Prueba con tira de espora Sin crecimiento de
Autoclaves (Bacillus Semanalmente esporas en los
stearothermophilus) subcultivos
Prueba con soluciones
Medidores de pH En cada uso ±0,1 unidades de pH
calibradas de pH
Cambio de color de la
Jarras de Tiras con indicador de
En cada uso tira indica baja tensión
anaerobisis azul de metileno
de O2
Gabinetes de Registro de presión
Diaria y anual Según fabricante
Bioseguridad Mantención diaria

9. Medios de cultivo comerciales. Algunos medios de cultivo comerciales

están exentos de pruebas de control de calidad internos. Revisar y
conservar certificado de control de calidad del fabricante. En caso de
discordancias documentar, tomar acciones correctivas y dar aviso a
proveedor.
10. Medios de cultivo no exentos del control de calidad. Registrar la cantidad
preparada, número de lote, método de esterilización, fecha de
elaboración, pH, la fecha de vencimiento y el nombre de quien prepara.
Comprobar en el medio: color, consistencia, profundidad o inclinación,
hemólisis, burbujas y contaminación según corresponda. Realizar
pruebas con los microorganismos de referencia.

Se han creado documentos de consenso que permiten determinar la

frecuencia, tolerancia y microoganismos control que pueden ser utilizados
para permitir la entrega de un resultado confiable. Para esto existen cepas
bacterianas de referencia, que es un cultivo puro, y que se han observado
las pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares correspondientes.

6
 Cepas de referencia disponibles

NCTC National Collection of type Cultures. Londres

CNCM Colection Nationale de Cultures of Microorganismes. Paris, Francia
ATCC American Type Culture Collection. Rockville, EU (más usadas)
CCTM Collection Nationale de Cultures de Microorganismes. Institut Pasteur

NCYC National Collection of Yeast Cultures. Norwik UK

NCIBM National Collections of industrial and Marine Bacteria
CECT Colección española de cultivos tipos

Medios de cultivo microbiología más usados

Medio Microorganismos de control Reacciones esperadas
Crecimiento;
Streptococcus pyogenes ATCC 19615
β-hemolisis
Crecimiento;
Agar sangre Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
α-hemolisis
S. aureus ATCC 25923 Crecimiento
E. coli ATCC 25922 Crecimiento
Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069 o
Crecimiento
Agar chocolate 43070
Haemophilus inluenzae ATCC 10211 Crecimiento
Campylobacter jejuni ATCC 33291 Crecimiento
Agar Campylobacter S. epidermidis ATCC 12228, E. coli ATCC
Inhibición
25922
Crecimiento levemente
E. coli ATCC 25922
inhibido; colonia naranja
Agar entérico de
S. flexneri ATCC 12022 Colonia verde transparente
Hektoen
Salmonella enterica serotype Colonias verde con centro
Typhimuriumk ATCC 14028 negro
E. coli ATCC 25922 Colonias rosada (lactosa +)
Agar MacConkey P. mirabilis ATCC 12453 Colonias incolora
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Sin crecimiento
Movilidad, indol, E. coli ATCC 25922 Mov +; Ind +; Orn +
ornitina K. pneumoniae ATCC 13883 Mov -; Ind -; Orn -
Crecimiento
Streptococcus pyogenes ATCC 19615
Caldo Todd-Hewitt
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Crecimiento

11. Tinciones, reactivos y antisueros. Rotular los envases de los insumos con
la concentración, requisitos de almacenamiento, fecha de apertura, de
preparación y de vencimiento o vida útil. Almacenar según las
recomendaciones del fabricante. Controlar según la frecuencia
establecida y con los microrganismos de referencia recomendados.
Eliminar material de control vencido o que presenten fallas.

7
 Tinciones, reactivos o antisueros de microbiología más usados
Frecuencia control
Cepas de Control Resultado esperado
de calidad
Cada lote, E. coli ATCC 25922 Bacilo gram negativo
Tinción de Gram
semanalmente S. aureus ATCC 25923 Cocácea gram positiva
M. tuberculosis ATCC
Tinción Ziehl- Bacilos rojo
Cada lote, cada uso 25177
Neelsen
E. coli ATCC 25922 Bacilos azules
S. aureus ATCC 25923 Positiva
Coagulasa Cada lote, cada uso S. epidermidis ATCC
Negativa
12228
Catalasa (3% S. aureus ATCC 25923 Positiva
Cada uso, cada lote,
H2O2) S. pyogenes ATCC 19615 Negativa
Candida albicans ATCC
Levaduras fluorescentes
Blanco calcoflúor Cada uso, cada lote 60193
E. coli ATCC 25922 Sin fluorescencia
E. coli ATCC 25922 Positivo
Indol (Kovac) Cada uso, cada lote Ps. aeruginosa ATCC
Negativo
27853
Ps. aeruginosa ATCC
Positivo
Oxidasa Cada uso, cada lote 27853
E. coli ATCC 25922 Negativo

12. Kits comerciales. Establecer frecuencia según las recomendaciones del

fabricante. En caso que existan es recomendable participar en controles
externos como CAP o PEEC.

Referencias:

 Koneman, E., Allen, S. Koneman. 2008. Diagnóstico Microbiológico: Texto y

Atlas en color. Editorial Médica Panamericana, Capítulo 1.

 Garcia, L. 2010. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3ª Edición.

Capítulo 14.2, Quality Control.

 Ruiz, E., et al. 2014. Analisis de resultados del Programa de Control de

Calidad Externo SEIMC, Año 2012. Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica. Volumen 32(1); 1-8.

8
GENERO STAPHYLOCOCCUS

Características generales

Cocáceas Gram positivas de 0,5-1,5 µ de diámetro, agrupados

irregularmente o en racimos, más raramente en pares o tétradas. Son catalasa
positivo, inmóviles, anaerobios facultativos (excepto Staphylococcus
saccharolyticcus, que es anaerobio estricto). Utilizan la glucosa en aerobiosis y
anaerobiosis, siendo esta última una de las características más usadas para
diferenciarlos del género Micrococcus, el cual solamente oxida la glucosa. Son
bacterias halófilas, propiedad que se aprovecha para su aislamiento con altas
concentraciones de NaCl (cloruro de sodio 6-15%).
El género Staphylococcus está constituido actualmente por 47 especies,
siendo las de mayor importancia para el hombre S. aureus, S. epidermidis, S.
saprophyticus y S. lugdunensis.

Características morfológicas

Los Staphylococcus en placa de agar sangre (incubada 18-24 hrs. a 35ºC)

aparecen como colonias redondas, lisas, blancas o amarillas con o sin hemólisis.
Crece bien en medios corrientes, en la tinción de Gram, los Staphylococcus se
observan cocáceas Gram positivas, redondas, de un mismo tamaño, aisladas o
agrupadas en racimo o en cadenas cortas. La especie más frecuentemente
aislada en procesos supurativos en el hombre es Staphylococcus aureus y es un
importante agente de infección intrahospitalaria.

Pruebas convencionales utilizadas en la identificación

 Prueba de la catalasa:
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de
hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno. La mayor parte de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa a excepción
de los Streptococcus. La prueba de la catalasa se utiliza con mucha
frecuencia para diferenciar miembros de la familia Staphylococaceae de
miembros de la familia Streptococaceae.

Procedimiento:
- En un portaobjeto agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3%
- Con una pipeta Pasteur o palillo de madera, transferir parte de una
colonia de cultivo de 18 a 24 horas sobre el peróxido y observar la
formación de burbujas

Resultado:
-La aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia indica
reacción positiva. Existen bacterias que poseen enzimas distintas a
catalasa que pueden descomponer el peróxido, la observación de unas
pocas burbujas después de 20 a 30 segundos no se considera reacción
positiva

9
 Nota: Los eritrocitos poseen catalasa, por esto tener cuidado al realizar la
prueba desde placas de agar sangre (no tocar el agar).

Control de calidad:
-Control positivo: Staphylococcus aureus
-Control negativo: Streptococcus spp.

 Prueba de la coagulasa:
La coagulasa es una proteína, que tiene actividad similar a la
protrombina, es capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, lo que da
como resultado la formación de un coágulo. La prueba de la coagulasa se
utiliza para identificar Staphylococcus aureus y diferenciarlo de otras
especies de estafilococos. La coagulasa se presenta en 2 formas, libre y
unida; y cada una posee diferentes propiedades que requieren el uso de
distintos procedimientos. Coagulasa unida o factor Clumping (prueba en
portaobjeto) y coagulasa libre (prueba en tubo)

Procedimiento:

En Portaobjeto
- En Portaobjeto: con lápiz de cera dibujar 2 círculos.
- Colocar 1 a 2 gotas de suero fisiológico en cada uno.
- En el círculo 1 emulsionar suavemente y sin grumos la colonia a identificar
- Agregar una gota de plasma a ambos círculos y mezclar con rotación
suave.
- Resultados:
Reacción Positiva: formación de grumos dentro de 15 a 30 segundos,
(circulo 1) y sin grumos círculo 2.
Reacción negativa: Sin formación de grumos en círculo 1 y 2.
Si la cepa es autoaglutinable , no se debe efectuar esta prueba

En Tubo:
- Emulsionar una pequeña cantidad de colonia del microorganismo en un
tubo que contenga 0,5 ml de plasma de conejo (o humano).
- Incubar el tubo a 35ºC durante 4 horas y ver formación de coágulo, si no
se observa dejar a Tº ambiente y leer después de 18 hrs.
-
- Resultados:
Reacción Positiva: formación de coagulo en el tubo a las 4 o a las 18
horas.
Reacción negativa: Sin formación de coagulo.

Control de calidad (Se debe realizar control cada vez que se cambie de lote)

-Control positivo: Staphylococcus aureus

-Como control negativo Staphylococcus. epidermidis

10
  Prueba de la Novobiocina:
Los estafilococos coagulasa negativos, se pueden dividir en
sensibles y resistentes a la Novobiocina (5ug), siendo entre las especies
resistentes a novobiocina Staphylococcus saprophyticus, un importante
agente de infecciones del tracto urinario.

Procedimiento:
- Preparar una suspensión del microorganismo en caldo o suero
fisiológico (S.F.) a 0,5 Mac farland
- Con una tórula, distribuir parte de la suspensión sobre la mitad de una
placa de agar sangre
- Colocar un disco de Novobiocina de 5 ug (en forma aséptica) en el centro
del área sembrada
- Incubar en aerobiosis a 35ºC durante 18 a 24 hrs
-
Resultado:
- Resistente: ausencia de halo de inhibición o bien halos de hasta 12 mm.
- Sensible: presencia de halo de inhibición de 16 mm o mayores

Control de calidad:
Control de resistencia: S saprophyticcus
Control de sensibilidad: S. epidermidis

 Prueba de Bacitracina:
El disco de Bacitracina de 0.04 unidades es un método que permite
diferenciar estafilococos de micrococos. Los estafilococos son resistentes
a bacitracina, mientras que los micrococos son sensibles.

Procedimiento:
Preparar una suspensión de la cepa en estudio en S.F, con turbidesz 0,5
Mc Farland.
- Con una tórula, distribuir parte de la suspensión sobre la mitad de la placa
de agar sangre.
- Colocar en forma aséptica un disco de Bacitracina en el centro del área
sembrada. Presionar suavemente el disco sobre la placa e incubar en
aerobiosis a 35ºC durante 18-24 hrs. al cabo de ese tiempo se mide el
halo de inhibición alrededor del disco.

Resultado:
Sensible: Halo de inhibición ≥ 10 mm (cepa sensible)
Resistente: Halo de inhibición < 10 mm (resistente) Staphylococcus

Control de calidad:
Control de resistencia: Staphylococcus spp
Control de sensibilidad: Micrococcus

Nota: existen varios métodos para diferenciar Staphylococcus de Micrococcus

(susceptibilidad a lisostafina, furazolidona etc.) sin embargo el costo y las reacciones
falsas positivas, hacen más recomendable la susceptibilidad a Bacitracina 0.04U.

11
Procedimiento de identificación de Cocáceas Gram positivas

Morfología de colonia
y/o
Tinción de Gram

Cocáceas Gram (+)

Catalasa

Positiva Negativa

Staphylococcus Streptococcus
Micrococcus Enterococcus

Lactococcus
Kocuria spp Gemella
Granulicatella

12
 Staphylococcus
Micrococcus

Bacitracina

Sensible Resistente

Micrococcus Staphylococcus

Coagulasa

Positiva Negativa

S. aureus S. coagulasa (-)

S. pseudintermedius Novobiocina*
S. schleiferi subespecie coagulans

Sensible Resistente
* La prueba de Novobiocina se realiza SOLO
en Staphylococcus aislados de orina

S. coagulasa (-)
S. saprophyticus

Flujograma Familia Micrococacceae

Identificación de Staphylococcus spp. de importancia clínica

Especie COAG PYR ORN UREA VP NOVO TREA MAN MAL

S.aureus + - - d + - + + +

S.epidermidids - - (d) + + - - (+) +

S.haemolyticus - + - - + - + d +

S.ludgunensis - + + d + - + + +

S.saprophyticus - - - + + + + - +

S. schleiferi +* +
subespecie
coagulans

S. schleiferi +** -
subespecie
schleiferi

COAG:Coagulasa; * solo coagulasa en tubo,** solo en portaobjeto; PYR:Pyrrolydonil arylamidasa; ORN: Ornitina; VP
Voges Proskauer; NOVO:Novobiocina; TREA: Trealosa; MAN: Manosa; MAL: Maltosa; d : Débil; ( ) : Muy poco frecuente

13
Diferencias Macroscópicas entre Staphyolococcus aureus y S. coagulasa
negativos

14
GENERO STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS

Características generales:

El género Streptococcus pertenece a la familia Streptococcaceae. Está

conformado por cocáceas Gram positivas, catalasa- negativa que tienden a
crecer en pares o en cadenas, inmóviles, poseen un metabolismo anaeróbico
facultativo. Dentro de la familia el género Streptococcus ocupa un importante rol
como patógeno para el ser humano y animales. Existen otros géneros en la
familia que pueden ser encontrados en infecciones en el hombre tales como los
géneros Peptococcus y Peptostreptococcus. El género Enterococcus, familia
Enterococcaceae, está igualmente conformado por cocáceas Gram positivas,
que se encuentran aisladas, en pares o cadenas cortas, se pueden observar
también, formas cocobacilares provenientes de medios sólidos, algunas
especies de este género son móviles.

Características morfológicas:

Las especies del género Streptococcus son bacterias relativamente

fastidiosas con requerimientos nutricionales que varían según la especies.
Crecen en sangre, algunas especies requieren CO₂ (5-10%). Las colonias
aisladas miden de 0,3 a 2 mm de diámetro, son opacas, blanquecinas, circulares,
y presentan hemólisis variable.
- Los Streptococcus β-hemolíticos de colonia grande pueden ser del grupo A, B,
C o G. Son los denominados Streptococcus β-hemolíticos verdaderos, se
identifican por las pruebas de uso habitual y técnicas de aglutinación.

- Los Streptococcus β-hemolíticos de colonia chica, con olor a caramelo pueden

aglutinar con grupo A, C, G o F y se denominan Streptococcus grupo anginosus
- La especie Streptococcus pneumoniae (Neumococo α- hemolítico) aparecen
en placas de agar sangre y agar chocolate, como colonias pequeñas, grisáceas
y mucoides (claras como el agua), y están rodeadas de una zona verdosa de alfa
hemólisis. La colonias jóvenes de neumococo y de Streptococcus viridans ⍺-
hemolítico aparecen levantadas; sin embargo, después de 24-48 hrs., el centro
de las colonias de neumococo se vuelve deprimido (umbilicado), mientras que
Streptococcus viridans no.

Por su lado las especies de Enterococcus pueden crecer en un amplio

rango de Tº (10-45ºC), crecen en caldo NaCl 6,5% e hidrolizan la esculina en
presencia de sales biliares. Las colonias en agar sangre son lisas, pequeñas,
blanquecinas o grises y de hemólisis variable

15
Pruebas convencionales para su identificación:

 Hemólisis:
El agar sangre de cordero es un medio enriquecido utilizado para
la siembra de la mayoría de las muestras clínicas, permite el crecimiento
de bacterias poco exigentes como exigentes. Este medio permite, además
detectar la producción de hemolisinas, enzimas bacterianas que provocan
la lisis de eritrocitos. Existen 3 tipos de hemólisis: alfa (hemólisis parcial),
beta (hemólisis total) y gamma (no hemólisis), que son especialmente
útiles en el diagnóstico del género Streptococcus.

 Prueba del PYR

Prueba para la identificación rápida presuntiva de Streptococcus
pyogenes y de Enterococcus. Ambos poseen la capacidad de hidrolizar el
sustrato PYR (pirridonil β-naftilamida), debido a que poseen la enzima 1-
piroglutamil aminopeptidasa.
Actualmente existen varios formatos para realizar esta prueba, los
más avanzados se basan en un ahorro de tiempo (10 a 15 minutos), en
las cuales el reactivo PYR se impregna en discos o tiras de papel de filtro
que se siembran con el material a estudiar, la hidrólisis del PYR libera β-
naftilamida, que se detecta por el agregado del reactivo N-
dimetilaminocinnamaldehido. Este reactivo de detección se une a la
naftilamida para formar una base de Schiff roja.

Procedimiento:
Técnica de lectura rápida (leer el inserto)
-Humedecer el disco con S.F.
-Con pipeta Pasteur o palillo, tomar 2 o 3 colonias morfológicamente
similares y colocarlas sobre el disco.
-Esperar 1 minuto y agregar una gota del reactivo PYR

Resultado:
- Reacción positiva Desarrollo de color rojo oscuro dentro del
minuto de agregado el reactivo
Reacción negativa Color amarillo o naranja

Control de calidad:
Control positivo: Enterococcus faecalis o Streptococcus pyogenes
Control negativo: Streptococcus agalactiae

Nota: Antes de realizar la prueba del PYR es necesario comprobar que el

microorganismo en estudio sea un estreptococo, ya que otros microorganismos
no estreptococos pueden dar positivo al PYR.

 Prueba de sensibilidad a Bacitracina y SXT:

La susceptibilidad a bajas concentraciones del antibiótico
bacitracina y a la combinación sulfametoxazol-trimetoprim (SXT)
proporciona un método sencillo y económico para la identificación
presuntiva de los estreptococos β-hemolíticos del grupo A y B.

16
 Los estreptococos del grupo A son sensibles a concentraciones
relativamente bajas de Bacitracina y resistentes a SXT. Los estreptococos
del grupo B son resistentes a ambos antibióticos.

Procedimiento:
Tomar 3 o 4 colonias aisladas de estreptococos β-hemolíticos y estriar el
inóculo hasta el centro de la mitad de una placa de agar sangre
Con una tórula diseminar el inóculo por toda la mitad de la placa
Colocar un disco de Bacitracina (0,04U) y un disco SXT (1,25ug/23,75ug)
sobre el área sembrada
Incubar la placa a 35ºC

Resultado:
Sensible Cualquier tamaño del halo alrededor de cualquiera de los
discos
Resistente Desarrollo hasta el borde del disco

Control de Calidad
Positivo: Streptococcus pyogenes
Negativo: Streptococcus agalactiae
Nota: deben probarse solamente los estreptococos betahemolíticos, ya que muchos
estreptococos alfahemolíticos (incluídos los neumococos) son sensibles a bajas
concentraciones de bacitracina.

 Prueba de CAMP
Esta prueba permite identificar a Streptococcus agalactiae (St. Grupo B)
de los demás Streptococcus β-hemolíticos. Se basa en que los St. Grupo
B producen un factor llamado CAMP que aumenta la zona de hemólisis
producida por un estafilococo productor de β-lisina
Se recomienda usar glóbulos rojos de cordero lavados con SF estéril para
preparar esta placa y con agar soya tripticasa

Procedimiento:
- Estriar en el centro del agar sangre de cordero una colonia de S. aureus
productor de β-lisina.
-Seleccionar 1 colonia β-hemolítica y estríala de manera perpendicular
-Incubar 18 -24 hrs. a 35ºC en aerobiosis

Resultado:
Resultado Positivo: Una reacción positiva se evidencia por la presencia
de una zona de potenciación de la hemólisis en forma de “punta de flecha”
en el lugar donde se contactan las 2 estrías

Control de calidad:
Positivo: Streptococcus agalactiae
Negativo: Enterococcus faecalis

17
Diferencias Macroscopicas entre S. pyogenes y S. agalactiae

18
 Prueba de la sensibilidad a optoquina:
Se realiza con un disco de 6 mm, con 5 ug de optoquina y tiene por
objeto diferenciar las cepas de S. pneumoniae de las de Streptococcus
viridans. El clorhidrato de etilhidrocupreína (optoquina), un derivado de la
quinina, inhiben en forma selectiva el crecimiento de Streptococcus
pneumoniae a muy bajas concentraciones (5 ug/ml o menos). Asimismo
la optoquina puede inhibir otros estreptococos del grupo viridans, pero
sólo a concentraciones mucho más altas.
Es una prueba de screening ya que un resultado negativo no
descarta la presencia de S. pneumoniae

Procedimiento:
-Con un asa seleccionar 3 o 4 colonias bien aisladas del microorganismo
a probar y estriarlas en mitad de la placa
-Colocar un disco de optoquin (Usar discos de taxo P u Optoquina) e incubar a 35ºC
durante 18-24 hrs. en jarra con vela o en estufa con 5-7% de CO₂.
-Lea el halo en mm, registre e interprete los resultados

Resultado:

-Halo de inhibición de 14 mm o mayor Identificación presuntiva

de Streptococcus pneumonaie

-Halo de inhibición menor, se debe realizar solubilidad en bilis

Control de calidad:
Positivo: Streptococcus pneumoniae
Negativo: Enterococcus faecalis

 Solubilidad en Bilis (desoxicolato de sodio al 10%)

Normalmente se realiza cuando los resultados de la prueba de
susceptibilidad a Optoquina no son concluyentes o en aislados de
muestras de sitios estériles. Puede desarrollarse usando el “método en
tubo” o el “método en placa”
Realizar esta prueba frente a una optoquina resistente.

Procedimiento 1 (Tubo)
A partir de una cepa sospechosa alfa hemolítica, realizar una suspensión
en 1 ml de S.F. (Mac Farland 1).
Repartir la suspensión en 2 tubos 0,5 ml c/u. Agregar a uno, 0,5 ml de S.F.
y al otro 0,5 ml de desoxicolato al 10%.
Incubar en estufa a 35ºC durante 2 horas, observando y agitando manual
cada media hora para transparencial el medio.

Resultado:
Reacción positiva Aclaramiento del tubo con desoxicolato
(soluble en bilis) al compararlo con el tubo control de S.F.
Reacción negativa El tubo con desoxicolato permanece
(insoluble en bilis o resistente a bilis) turbio, similar al tubo con S.F.
19
 Procedimiento 2 (Placa)
-Usar un cultivo fresco del microorganismo sospechoso.
-Elegir colonias bien aisladas y sobre ellas directamente, se coloca 1 gota
de desoxicolato al 10%, sin mover la placa, se deja 15 minutos a Tº
ambiente.
-Cuando el reactivo goteado sobre la colonia esté seco, lea, registre e
interprete los resultados.

Resultado:
Las colonias de neumococo son solubles en bilis y pueden desaparecer o
aparecer como colonias aplastadas
Las colonias de estreptococo resistentes a la bilis no se verán afectadas
Nota: Para preparar una solución de sales biliares al 10%, añada 1 g de
desoxicolato de sodio (sales de bilis) a 10 ml de agua estéril

Control de calidad:
Control positivo: Streptococus pneumoniae (trasnparente)
Control negativo: Enterococcus faecalis

Características macroscópicas: Colonia α- hemolítica en este caso de

aspecto mucosa

20
Características Macroscópicas de Enterococcus sp.

 Prueba de tolerancia a la sal:

La capacidad de desarrollarse en presencia de cantidades
variables de cloruro de sodio es una propiedad que ha sido utilizado para
caracterizar varias bacterias. Sin embargo, es de particular utilidad para
la identificación presuntiva del género Enterococcus que posee la
capacidad específica de desarrollarse en presencia de NaCl al 6,5%,
incorporado a medios líquidos o sólidos. El caldo infusión cerebro-corazón
es un caldo nutritivo de uso general que se utiliza para el cultivo de
muchas bacterias. Normalmente contiene 0,5% de NaCl. Si se aumenta
la concentración de NaCl al 6,5% el medio se hace semiselectivo para el
desarrollo de Enterococos. Esta prueba junto con la de agar bilis- esculina
se utiliza para distinguir especies de Enterococcus de los Streptococcus
grupo D (bovis y equinus).

Procedimiento:
- Rotular el tubo que contiene caldo nutritivo con 6.5% de cloruro de Sodio.
-Tomar 2 ó 3 colonias de un cultivo puro de 24 horas de incubación
Sembrar en caldo, incubar hasta alcanzar turbidez y traspasar al caldo sal
3 a 4 gotas
-Incubar a 35ºC por 24 hrs

Resultado:
Reacción positiva Desarrollo bacteriano en el medio se observa
turbidez con cambio de color o sin él, se debe agitar
suavemente el tubo para su lectura.

21
 Control de calidad:
Control positivo: Enterococcus faecalis
Control negativo: Streptococcus bovis

 Limitaciones de la prueba
Un 80% de los Streptococcus grupo B pueden ser tolerantes a la sal.

 Prueba de bilis-esculina
Esta prueba permite identificar los estreptococos del grupo D de los
demás grupos de estreptococos. Se basa en la capacidad de los
estreptococos grupo D de crecer en un medio de cultivo que contiene 40%
de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina, la cual se combina con el
citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro.

Procedimiento:
- Rotular el tubo. Tomar 2 ó 3 colonias de un cultivo puro de 24 horas de
incubación
-Sembrar en tubo e Incubar a 35ºC por 24 hrs

Resultado:
Reacción positiva Desarrollo bacteriano con ennegrecimiento
total o parcial del medio de cultivo.
Reaccion negativa Ausencia de ennegrecimiento

Control de calidad:
Control positivo: Enterococcus faecalis
Control negativo: Streptococcus mitis

Si el microorganismo es bilis-esculina positivo y se desarrolla en caldo

6,5% NaCl, pertenece a una especie de Enterococo
Si es bilis-esculina positiva pero no se desarrolla en el caldo NaCl 6,5%
es un Streptococcus del grupo D

Identificación del Género Streptococcus según su Hemólisis

- Alfa- hemolíticos Streptococcus grupo Viridans

- Beta- hemolíticos Streptococcus Agrupados según Lanscefield
- Gamma- hemolíticos o sin hemólisis

Identificación Streptococcus Grupo Viridans (alfa-hemólisis)

Grupo VP ARG ESC MTOL STOL

Mutans + - + + +
Salivaius + - + - -
Bovis + - + V -
Anginosus + + V V -
Mitis - - - - -
VP:Voges –Proskauer// ARG: Arginina// ESC:Esculina// MTOL: Manitol STOL: Sorbitol //V : 10- 90% cepas +

22
Características diferenciales de Streptococcus del grupo viridans y de
Streptococcus pneumoniae (alfa-hemólisis)

Característica Streptococcus grupo S. pneumoniae

Viridans
Hemólisis Alfa, ninguna Alfa

Prueba de CAMP con S. - -

aureus (ß –lisina)
Resistencia a bacitracina V V
(0.04)

Resistencia a optoquin + -

Resistencia a - -
sulfametoxazol-trimetoprin
Hidrólisis de hipurato V -

Producción de PYR - -

Crecimiento en CTS + 6.5% - -

NaCl
Hidrólisis de esculina en V -
presencia de bilis

+, > o = 90%de las cepas dan un resultado positivo; —.,> o = 90% de las cepas dan un resultado
negativo; v,11-89% de las cepas dan un resultado positivo

Identificación Streptococcus β-hemolíticos

Grupo Tamaño de Especies PYR VP CAMP

Lancefield colonia

A Grande S.pyogenes + - -

A Pequeña S.gr.anginosus - + -

B Grande S.agalactiae - +

C,A Grande S.dysgalactiae - - -

C.F Pequeña S.gr.anginosus - + -

G Grande S.dysgalactiae - - -

G Pequeña S.gr.anginosus - + -

23
Identificación Género Enterococcus spp. más frecuentes aislados en
clínica

Especie NaCl BE ARG SORB RAF ARAB TEL

6.5%
E.faecalis + + +* - - - +

E.faecium + + + - V + -

E.casseliflavus + + +* - + + -*

E.raffinosus + + - + + + -

E.avium + + - + + + -

E.gallinarum + + +* - + + -

BE: Bilis Esculina// ARG: Arginina// SORB: Sorbosa// RAF: Rafinosa// ARAB :Arabinosa// TEL: Telurito
V : 10-90% cepas + // ӿ : muy poco frecuente

 Utilización de Carbohidratos (arabinosa)

Las bacterias se pueden dividir por su habilidad de degradar carbohidratos
anaeróbicamente (fermentadoras) o aeróbicamente (oxidan). La fermentación
es un proceso metabólico en el cual el organismo obtiene como substrato los
aceptores de hidrógenos finales y forman oxígeno. Usualmente el medio
contiene una fuente de proteínas, indicador de pH (rojo fenol), carbohidratos
al 1%.

Procedimiento
-Preparar un inóculo denso McFarland 2,0 en un tubo con 0,25 ml de suero
fisiológico. Añadir con pinzas (previamente flameadas), una tableta de
arabinosa ROSCO.
-Incubar a 35 -37°C por 4 horas.

Resultados
Reacción Positiva: Amarillo, amarillo-naranjo
Reacción Negativa: Rojo, naranjo-rojo

Control de Calidad
Control Positivo: Enterococcus faecium
Control Negativo: Enterococcus faecalis

 Test de Arginina
El test Arginina dihidrolasa es utilizado para detectar la habilidad de
microorganismos de hidrolizar un aminoácido, formando aminos que
alcalinizan el pH.
La arginina dihidrolasa transforma la L-arginina en L-citrulina, la cual es
convertida en L-ornitina, CO2 y NH3, resultando una alcalinización del medio

24
y un cambio de color del indicador de amarillo a rojo. Esta reacción se realiza
en anaerobiosis.

Procedimiento
- Preparar una suspensión densa (McFarland 2,0) de la cepa testeada en
0,25 ml de suero fisiológico en tubo khan
- Agregar una Tableta de Diagnóstico ADH arginina dihidrolasa (ROSCO)
- Agregar 3 gotas de aceite de parafina estéril.
- Cerrar el tubo
- Incubar a 35°C por 4 horas o hasta18-24 horas
Después de 4 horas de incubación
- Test Positivo : Tubo Color Rojo (pH alcalino)
- Test Negativo: Tubo Color Amarillo (pH ácido)
Después de una incubación de 18-24 horas
- Test Positivo : Tubo Color Rojo fuerte
- Test Negativo: Tubo Color Amarillo o Naranjo
- En muchos casos una incubación de 18-24 horas es necesaria

Control de Calidad
1. Control positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212
2. Control negativo: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

 Voges Proskauer (VP)

El test de Voges-Proskauer es utilizado para determinar si los
microorganismos producen acetylmethylcarbinol a partir de la fermentación
de la glucosa, que ayuda en la identificación de bacterias aisladas de
muestras clínicas.
Si está presente el acetylmethylcarbinol es convertido a diacetyl en presencia
de α-naphtol, y de un álcali concentrado (40% KOH), y oxígeno. El α-naphtol
no forma parte del procedimiento original, pero se ha encontrado que actúa
como intensificando el color. El diacetyl y el contenido de guanidina,
compuesto encontrado en las peptonas del medio los condensa formando
una red fucsia de polímeros.

Procedimiento
-Preparar un inóculo denso (2 McFarland) de la cepa en estudio de un cultivo
de 18 a 24 horas en un tubo con 0,25ml de suero fisiológico.
-Agregar una tableta de diagnóstico VP (ROSCO), taponar el tubo e incubar
a 35°C por 4 horas.
-Antes de la lectura añadir 2 gotas de α-naphtol (5% en etanol) y una gota
de de KOH (40%). Mezclar

Resultado
- Test positivo : color Rojo/Rosado
- Test negativo: sin cambio

Control de calidad
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 VP-positivo (rojo)
Staphylococcus aureus ATCC 25923 VP-positivo (rojo)
Escherichia coli ATCC 25922 VP-negativo (no hay cambio)

25
GÉNERO HAEMOPHILUS

Características generales

El género Haemophilus se compone de cocobacilos Gram negativos

anaerobios facultativos. Su crecimiento es generalmente óptimo cuando se
incuba a 33-37°C en una atmósfera con 5-10% de CO2. A la mayoría de las
especies se les considera nutricionalmente fastidiosas porque requieren para su
crecimiento medios enriquecidos con NAD (factorV) y/o hemina (factor X), por lo
que usualmente no crecen en agar sangre, el cual contiene adecuadas
cantidades de hemina pero contiene factor V únicamente dentro de los
eritrocitos. Sin embargo, Haemophilus puede crecer en agar sangre alrededor
de otras bacterias, como Staphylococcus aureus, que proporcionen el factor V.
A este fenómeno se le conoce como satelitismo.
En el género Haemophilus se han descrito nueve especies que se asocian
al ser humano, ya sea como flora normal en el tracto respiratorio superior o como
agentes de infecciones
Las especies que pueden estar asociadas a infecciones en el ser humano
incluyen H. ducreyi, H. parainfluenzae, H. aphrophilus. Sin embargo la especie
más importante desde el punto de vista de las infecciones en el ser humano es
H. influenzae.

Características morfológicas

Las especies de Haemophilus no se desarrollar en placas de agar sangre,

excepto cuando se produce satelitismo, observándose como colonias
puntiformes. Un medio enriquecido que proporciona los factores necesarios para
su crecimiento óptimo es el agar chocolate, en el cual se observan colonias
pequeñas a medianas, lisas, color gris a crema. Microscópicamente son
cocobacilos Gram negativos que pueden presentar además pleomorfismo
celular, dependiendo de la edad del cultivo y el medio que se utiliza. En los
cultivos más viejos se observan con formas bacilares, mientras que en los
cultivos más jóvenes se encuentran formas cocoides o cocobacilares.

Características macroscópicas de Haemophilus sp. en agar chocolate

26
Pruebas convencionales para la identificación de especies

 Prueba de requerimientos de factores X y V

El factor X (hemina) y el factor V (NAD) son necesarios, ya sea en
forma aislada o en combinación, para soportar el desarrollo de diferentes
especies de Haemophilus en medios sólidos. Los discos impregnados con
estos factores se colocan sobre la superficie de un medio deficiente en
ellos (Müeller Hinton, soya tripticasa etc.) que ha sido sembrado en
cesped con el microorganismo a probar.

Procedimiento:
- Preparar una suspensión (Mac Farland 1) de un cultivo puro del
microorganismo a identificar
- Sembrar en césped una placa de agar Mueller Hinton con la
suspensión preparada
- Colocar discos o tiras, uno con el factor V, otro con el factor X y
otro con los dos, en la superficie del agar (alejados unos de otros)
e incubar a 35ºC durante 18 a 24 hrs. con CO₂ al 3-5%
Resultados:
- Inspeccionar la superficie del agar observando la aparición de
desarrollo visible entre o alrededor de uno o más de los discos
- Crecimiento alrededor de factores X y V: Haemophilus influenzae
- Crecimiento alrededor de factor V: Haemophilus parainfluenzae

Control de calidad:
Haemophilus parainfluenzae: requiere solo factor V
Haemophilus influenzae: requiere factores X y V

 Serotipificación para H. influenzae

La cápsula de muchas especies de bacterias es un factor de
virulencia y permite la serotipificación. Las cepas capsuladas de
Haemophilus se pueden identificar por tipificación serológica, en base a
la composición química del polisacárido capsular.

Nota: En el caso particular de H. influenzae, además de su identificación a nivel de

especie, es fundamental realizar una serotipificación utilizando un suero
polivalente, para determinar si la cepa es tipificable o no, y si lo es se continúa con
la serotipificación utilizando sueros específicos para cada uno de los antígenos
capsulares.

27
Características de especies de Haemophilus spp.de importancia clínica

Especie Hemólisis¹ Fermentación de²

Requerimiento de Catalasa
Glu Sac Lac Man
X V CO2
H. influenzae + + + — + — — — +
H. haemolyticus + + — + + — — — +
H. ducreyi + — — — — — — — —

H. parainfluenzae — + V³ — + + — + V
H. — + — + + + — — +
parahaemolyticus
H. segnis — + — — w4 W — — V
H. paraphrophilus — + + — + + + + —

H. aphrophilus — — + — + + + + —
¹ Hemólisis en sangre de caballo. 2 Glu, glucosa; Sac, sacarosa; Lac, lactosa; Man, manosa. ³ V, variab!e. 4. w, reacción
débil

28
 GENERO Neisseria

Características generales

Conjuntamente con los géneros Moraxella (incluyendo Branhamella

catarrhalis, actualmente Moraxella catarrhalis), y Kingella conforman la familia
Neisseriaceae. Las especies de Neisseria se caracterizan por ser de
metabolismo aerobio, inmóviles y el crecimiento de las especies patógenas se
ve favorecido mediante incubación en una atmósfera altamente húmeda y
enriquecida a 5-8% de CO2. Su temperatura de crecimiento es óptima entre los
35-37oC y tienen requerimientos nutricionales complejos.
Las especies patógenas primarias para el ser humano son N.
gonorrhoeae N. meningitidis y Moraxella catarrhalis (colonia seca)
M. catarrhalis es considerada como parte de la flora normal en la vía respiratoria
y se ha relacionado como agente causante de infecciones pulmonares y de oído
medio. Esta es una bacteria no fastidiosa que crece tanto en agar chocolate
como en agar sangre, dando una morfología microscópica similar a las de
Neisseria, pero que puede ser fácilmente diferenciada de las especies de
Neisseria mediante la prueba de DNasa.

Características morfológicas

La colonias difieren dependiendo de la especie, N. gonorrhoeae presenta

colonias pequeñas, de color gris hasta blanco, brillantes y convexas. N
memingitidis presenta colonias de mayor tamaño, convexas, lisas, brillantes y
grisáceas.
El género Neisseria incluye bacterias con morfología de diplococos Gram
negativos arriñonados, con reacción positiva a las pruebas de catalasa y oxidasa.

Características diferenciales de los géneros de la familia Neisseriaceae

Género Características
Morfología celular Ácido a partir de glucosa
Oxidasa Catalasa
Diplococos¹ + + V
Neisseria
Moraxella Diplococos + + —
Kíngella Cocobacilos + — +

¹ N. elongata tiene forma bacilar.

La producción de ácido depende de cada una de las especies del género.

29
 Características de N. gonorrhoeae, N. meningitidis, M catarrhalis y K
denitrificans

Característica
N. gonorrhoeae N meningitidis M. catarrhalis K. denitrificans
Crecimiento en agar sangre — V¹ + +

Morfología colonial en agar Beige a gris, Beige a gris, Rosada, opaca, Beige a gris,
chocolate transparente, lisa, transparente, lisa, seca, 1-3 mm transparente, lisa, 1-
0.5 - 1mm 1-3 mm 2 mm
Ácido a partir de:
Glucosa + + — +

Maltosa — + — —

Lactosa — — — —

Sacarosa — — — —

Fructosa — — — —

NO3 NO2 — — + +

ADNasa — — + —

IDENTIFICACIÓN DE NEISSERIA GONORRHOEAE

30
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

Características generales

Las especies de la familia Enterobacteriaceae se caracterizan por ser

bacilos Gram-negativos que no forman esporas, móviles por flagelos peritricos o
no móviles, crecen aeróbicamente o anaeróbicamente, la glucosa es
metabolizada de forma fermentativa, producen la enzima catalasa, no tienen
actividad de citocromo C oxidasa y reducen los nitratos a nitritos.
De modo típico estos microorganismos producen en agar sangre colonias
relativamente grandes, de color gris opaco, húmedas. La hemólisis en agar
sangre es variable y no es característica de ningún género o grupo en particular.
La apariencia mucoide de las colonias sugieren la presencia de una cápsula de
polisacáridos extracelulares, como en el caso de Klebsiella pneumoniae. Las
colonias que aparecen como una película delgada o como ondas (swarming)
sugieren que el microorganismo es móvil y probablemente sea una especie de
Proteus.

Identificación presuntiva y rápida de bacterias entéricas gramnegativas

Fermentación rápida de lactosa Fermentación lenta Sin fermentar lactosa

de lactosa
Escherichia coli: colonias rojas Edwarsiella, Shigella spp
en Mac Conkey, móviles, no Serratia Inmóvil, no forma gas de
viscosas Citrobacter, glucosa
Aplanadas. Arizona Salmonella spp. móvil
Enterobacter aerogenes: colonia Providencia, Generalmente produce
elevada viscosas, generalmente Erwinia gas y acido de glucosa.
móviles Proteus spp. invasor en
Klebsiella pneumoniae: no móvil, agar, hidroliza la urea
colonias mucoide

Características macroscópicas de Bacilo Gram negativo en agar Sangre

Bacilo Gram negativo

31
Batería Bioquímica para determinar Género en Enterobacterias

Se muestra el Tubo TSI para observar los diferentes resultados que

podemos obtener dependiendo de la utilización de los azúcares y la
producción de H2S y gas.

Se muestra el Tubo LIA para observar los diferentes resultados que

podemos obtener dependiendo si descarboxila, deamina o no utiliza la
Lisina y si produce H2S y gas.

Se muestra el Tubo MIO para obervar Motilidad, producción de Indol, y si

hay descarboxilación o no de Ornitina.

32
Se muestra el Tubo con agar Citrato para observar si el MO utiliza o no el Carbono
de este medio.

Se muestra el Tubo con caldo Urea para observar si utiliza o no este metabolito
(mediante la ureasa del MO).

L(+) L(-)

Se muestra las características macroscópicas de Bacilos Gram (-) en agar McConkey

se observa MO que utilizan o no la Lactosa.

33
Diferenciación del género Citrobacter (TSI A/A o K/A, móvil).

Especie H2S Ornitina descarboxilasa Fermentación de D-Adonitol

C. freundii 78 0 0
C. koserii 0 99 99
C. amalonaticus 5 95 0

Diferenciación del género Escherichia

Especie TSI Lisina Movilidad a Fermentación Fermentación de

descarboxilasa 35ºC de Lactosa D-Sorbitol
E. coli A/A 90 95 95 94
E. coli (inactiva) K/A 40 5 25 75
E. hermannii A/A 6 99 45 0

34
Diferenciación del género Klebsiella (TSI K/A o A/A, no móvil).

Especie Indol Rojo de Voges- Urea Utilización de

metilo Proskauer malonato
K. pneumoniae 0 10 98 95 93
K. oxytoca 99 20 95 90 98
K. ozaenae 0 98 0 0 3
K. rhinoscleromatis 0 100 0 0 95

Diferenciación del género Proteus (TSI A/A o K/A, H2S+, móvil).

Especie Indol Ornitina descarboxilasa Fermentación de Maltosa

P. mirabilis 2 99 0
P. vulgaris 98 0 97
P. penneri 0 0 100

35
Diferenciación del género Shigella (TSI K/A, no móvil)*.

Especie Ornitina descarboxilasa Fermentación de Lactosa

Shigella spp. grupos A, B, C 1 30
Shigella sonnei 98 90
* Se recomienda la identificación de las especies de Shigella por métodos serológicos.

Diferenciación de 3 biotipos de Salmonella enterica (TSI K/A, móvil)*.

Especie H2S Lisina Ornitina Fermentación de
descarboxilasa descarboxilasa L-Arabinosa
S. typhi 95 98 0 0
S. cholerasuis 50 95 100 100
S. paratyphi A 10 0 95 100
* Se recomienda la clasificación de Salmonella por métodos serológicos (Antígenos somáticos y
flagelares)

Diferenciación del género Providencia (TSI A/A o K/A, móvil).

Especie Fermentación de D-Manitol Fermentación de D-Adonitol

P. rettgeri 100 100
P. stuartii 10 5
P. alcalifaciens 2 98

36
Diferenciación del género Serratia (TSI A/A, móvil).

Especie Rojo de Metilo Fermentación de Fermentación de Utilización del

L-Arabinosa Lactosa Malonato
S. marcescens 20 0 2 3
S. licuefaciens 93 98 10 2
S. rubidae 20 1 100 94

Diferenciación del género Yersinia (TSI A/A o K/A, no móvil).

Especie TSI Urea Ornitina Fermentación de Sacarosa

descarboxilasa
Y. enterocolitica A/A 75 95 95
Y. pestis K/A 5 0 0
Ojo TSI en Y. enterocolitica A/A a las 24 horas, si se deja a tº Amb por 24 horas más cambia a K/ A

Diferenciación del género Enterobacter (TSI A/A, móvil).

Especie Lisina Arginina Fermentación de Fermentación de

descarboxilasa dihidrolasa D-Sorbitol Lactosa
E. aerogenes 98 0 100 95
E. cloacae 0 97 95 93
E. gergoviae 90 0 0 55
E. taylorae 0 94 1 10
E. sakazakii 0 99 0 99

37
38
FAMILIA VIBRIONACEAE

Características generales

La familia Vibrionaceae incluye los géneros Vibrio, Aeromonas,

Plesiomonas y Photobacterium. Las diferentes especies de Vibrio y los otros
géneros que se aíslan de muestras clínicas muestran características bioquímicas
similares a las de los géneros de la familia Enterobacteriaceae, Pseudomonas y
otros géneros relacionados.
El medio de aislamiento primario más recomendado para la recuperación
de las especies de Víbrio es el agar TCBS. Las placas de agar TCBS se incuban
hasta por 48 horas antes de descartarlas. Es importante examinar
cuidadosamente el crecimiento y el color de las colonias en las placas de agar
TCBS.
Apariencia en agar TCBS
Organismo Color Crecimiento
V.alginolyticus Amarillo Bueno
V.carchariae Amarrillo Bueno
V. cholerae Amarillo Bueno
V.cincinnatiensis Amarillo Muy malo
V. fluvialis Amarillo Bueno
V.furnissii Amarillo Bueno
V.metschnikovi Amarillo Puede reducirse
V.damsela Verde Reducido a 35oC
V. hollisae Verde Muy malo
V. mimicus Verde Bueno
V. parahaemolyticus Verde Bueno
V. vulnificus Verde Bueno

Usualmente es necesario hacer un enriquecimiento de estas bacterias a

partir de los diferentes tipos de muestras (heces, agua, alimentos) para aumentar
la recuperación en los medios de aislamiento primario. El medio de
enriquecimiento más frecuentemente utilizado es el Agua Peptonada Alcalina
(APA), el cual, una vez inoculado, se incuba a 35oC por 6-12 horas en aerobiosis
antes de realizar los subcultivos en medios de aislamiento primario.

Características Macroscópicas de Vibrio en agar TCBS Sac+ y Sac-

39
 IDENTIFICACIÓN Vibrio cholerae

Deposición o hisopado rectal

Agar Mc Conkey APA

Agar TCBS 6 hrs, 36ºC

Resiembra TCBS

18-24 hrs, 36ºC

Colonias sospechosas
L (-) Mc Conkey,
amarillas en TCBS

Presencia Ausencia

Cultivo negativo a las 48 hrs de

observación
Siembra en agar sangre

18-24 hrs., 36ºC

Prueba de Oxidasa

Positivo Negativo

Identificación Cultivo negativo

automatizada a las 72 hrs. de
y/o ISP* observación

Vibrio Otra bacteria

bbbbbbbacteri
abacteria

 Notificación obligatoria al Instituto de Salud Pública (ISP)

bacteriabacteri
a

40
BACILOS GRAMNEGATIVOS NO FERMENTADORES

Características generales:

Se considera dentro de este grupo a los bacilos gramnegativos no

esporulados, aeróbicos que no utilizan los carbohidratos como fuente de energía
o los degradan por una vía distinta a la fermentación.
Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia y otras
forman parte de este grupo, se distribuyen ampliamente en el suelo y en el agua

.
 Prueba de la oxidasa:
Esta prueba se basa en la capacidad de la enzima citocromo-
oxidasa de oxidar el sustrato tetrametil-para fenildiamina dihidroclórico, (un
aceptor de electrones) en presencia de oxígeno, formando un producto final de
color púrpura oscuro, el indofenol.

Procedimiento
- Tomar una colonia de un cultivo de 18- 24 horas a partir de agar sangre o Muller-
Hinton.
- Agregar una pequeña cantidad de la colonia a un papel impregnado con el
sustrato o a tiras preparadas comercialmente. La reacción tiene un tiempo de
10 segundos.
Resultado: Se observa un cambio de color en lugar de inoculación de la colonia.

Control positivo: Cepa Pseudomonas aeruginosa

Control negativo: Cepa Escherichia coli

 Motilidad:
Es posible observar la motilidad al microscopio tomando una gota
de un cultivo en caldo incubado a 25 ° C por 6-24 horas (lámina y laminilla)

 Producción de pigmento:
Algunas especies como es el caso de P. aeruginosa: producen un
pigmento soluble que difunde al medio, lo que permite reconocer fácilmente
estos microorganismos

41
1,2 Características macroscópicas en PAS Batería Bioquímica de BNF
1

42
Características fenotípicas de especies del género Pseudomonas

Organismo P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri P. pseudo- P. alcaligenes P.diminuta P. versicularis

alcaligenes
Prueba
Oxidasa 100 100 100 100 100 100 100 100
Crecim. en MacConkey 99 100 100 100 93 98 96 26
Crecim. en 42 ºC 100 0 0 90 75 48 19 0
Reducción de nitratos 74 19 0 100 93 61 4 7
Gas en nitratos 60 4 0 100 5 0 0 0
Pioverdina 69 91 82 0 0 0 0 0
Hidrólisis de arginina 99 99 99 0 36 7 0 0
Descarbox. de lisina 0 0 0 0 0 ND 0 0
Desamin de 8 3 2 55 21 20 16 6
fenilalanina
Indol 0 0 0 0 0 0 0 0
Hidrólisis de urea 66 44 43 17 8 21 0 0
Hidrólisis de gelatina 46 100 0 0 3 2 58 38
Hidrólisis de esculina 0 0 0 0 0 ND 0 100
Acido a partir de: 98 100 100 100 19 0 29 57
Glucosa
Fructosa 89 99 99 95 100 0 0 0
Galactosa 81 98 99 91 4 0 0 15
Manosa 79 99 99 89 1 0 0 0
Rhamnosa 22 43 28 23 0 0 0 38
Xylosa 85 97 98 94 8 0 0 11
Lactosa 0 11 13 0 0 0 0 0
Sacarosa 0 47 10 0 0 0 0 0
Maltosa 12 31 19 99 11 0 0 62
Manitol 68 93 17 70 3 0 0 0
Lactosa 14 61 42 0 0 0 0 0
Movilidad 95 100 100 100 90 98 100 98
No. de flagelos 1 >1 >1 1 1 1 1 1

43
Características fenotípicas de especies del género Burkholderia

Organismo B. B. mallei B. cepacia B. gladioli B. picketii

pseudomallei biovar 1 biovar 2 biovar 3
Prueba 100 25 93 0 100 100 100
Oxidasa 100 88 95 100 77 100 100
Crecim. en Mac Conkey 100 6 60 0 26 60 60
Crecim. a 42 ªC 100 100 37 33 87 100 20
Reducción de nitratos 100 0 0 0 84 100 10
Gas de nitratos 100 100 0 0 0 0 0
Hidrólisis de arginina 0 0 92 0 0 0 0
Descarboxi. de ornitina 0 0 66 0 0 0 0
Desamina. de fenilalanina 0 ND 2 0 3 40 0
Hidrólisis de urea 43 12 45 100 100 100 100
Hidrólisis de gelatina 100 0 74 100 77 40 80
Hidrólisis de esculina 57 0 67 0 0 0 0
Acido de: 100 100 100 100 100 100 100
Glucosa
Fructosa 100 ND 100 100 100 100 100
Galactosa 100 ND 100 100 100 100 100
Manosa 100 ND 100 100 100 100 100
Ramnosa 71 ND 0 0 0 0 0
Xilosa 86 12 99 100 100 100 100
Lactosa 100 12 99 0 100 0 100
Sacarosa 86 0 83 0 0 0 0
Maltosa 100 0 98 0 100 0 100
Manitol 100 62 100 100 0 0 100
Lactosa 100 ND 0 98 81 0 100
Movilidad 100 0 99 100 94 96 100
No. de flagelos >1 0 >1 1 1 1 1
Los valores indican el porcentaje de cepas para las diferentes pruebas o reacciones.ND, no determinado.

44
Bacilos Gram-negativos, no fermentadores, oxidasa negativa, indol
negativo¹.

Acinetobacter spp. Flavimonas oryzihabitans Stenotrophomonas

Prueba maltophilia
Movilidad — + +
Pigmento — amarillo Amarillo
Crecim. en MacConkey V + +
Crecim. a 42 ºC V V V
Reduccion de nitratos — — V
Hidrólisis de esculina — — +
Hidrólisis de gelatina V — +
Ureasa V V —
Arginina — — —
ONPG — — +
Acido a partir de:
Glucosa V + +
Maltosa V + +
Sacarosa — V V
Manitol — + —
Xilosa V + V
¹ +, porcentaje de positividad  90%; —, porcentaje positividad 10%; V, porcentaje de positividad
10-90%.

Características fenotípicas de especies de Acinetobacter¹.

A. calcoaceticus A. baumannii A. A. johnsonii A. lwoffi

Prueba haemolyticus
Crecim a 37 ºC 100 100 100 0 100
Crecim a 4l ºC 0 100 0 0 0
Hidrol. de 0 0 96 0 0
gelatina
Acido de glucosa 100 95 52 0 0
Arginina 100 98 96 35 0
Citrato 100 100 91 100 0
Malonato 100 98 0 13 0

45
BACILOS GRAM POSITIVOS ESPORULADOS

Características generales

Los bacilos Gram positivos esporulados corresponden a los géneros

Bacillus y Clostridium. Debido a que forman esporas pueden sobrevivir en el
ambiente por muchos años. El género Bacillus es aerobio, en tanto que el género
Clostridium es anaerobio obligado. La gran mayoría de las especies de ambos
géneros no causan enfermedad, sin embargo existen algunas que causan
enfermedades importantes en el hombre. B. anthracis es el agente causal de
ántrax, Clostridium causa por su parte varias enfermedades graves mediadas
por toxinas: C. tetani (tétanos), C. botulinum (botulismo), C. perfringens
(gangrena gaseosa), C. difficile (colitis pseudomembranosa).

Especie Colonia Movilidad Hemólisis Sensibilidad Presencia de

penicilina cápsula
B. anthracis Bca-gris - - + +
B. cereus Leve tinte + + - -
verde

Baci llus spp.

Colonias gr andes, planas verdosas (gris), irregulares.

46
BACILOS GRAM POSITIVOS NO ESPORULADOS

Características fenotípicas de los géneros Listeria, Erysipelothrix y

Corynebacterium.

Característica Listeria Erysipelothrix Corynebacterium

Morfo1ogía microscópica¹ BG+, cortos, BG+, cortos y/o BG+, ligeramente
individuales o en largos-filamentosos curvos, tipo letra-
cadenas china
Catalasa + — +

Ureasa — — V

Motilidad (25 ºC) + — —

Producción de ácido de glucosa + + +²

Producción de H2S — + —

NO3 NO2 —³ — V
¹ BG+, bacilos Gram-positivos.
² Algunas especies no utilizan la glucosa.
³ L. murrayi reduce nitratos.

Características de algunas de las especies de Listeria

PRUEBA L. monocytogenes L. ivanovii L. seeligeri L. innocua

β hemólisis + ++ + -

Camp
S. aureus + - + -
R. equi - + - -
Producción de ácido
desde:
Ramnosa + - - (+)v
Xilosa - + + -
Manitol - - - -

Test de Sereny + + - -

47
DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Paciente

Historia clínica y exploración

(Sospecha de infección)

Estudio hematológico y bioquímico

(si es necesario)
+
Técnicas de diagnóstico por imagen
(si es necesario)

Localización de la infección
(pulmón, riñón, cerebro, sist. Urinario)
etc.)

Obtención de la muestra

Laboratorio de Microbiología

Métodos de diagnóstico

Métodos directos Métodos indirectos

(Muestra clínica variable) ( Muestra clínica: Suero)

Examen microscópico
Cultivo: Identificación (antibiograma) Pruebas serológicas
Detección de antígenos específicos
Detección de DNA/RNA específico

48
PRINCIPALES SINDROMES INFECCIOSOS

1.- Infecciones de la piel

Los microorganismos pueden penetrar a través de conductos naturales,

como los folículos pilosos o glándulas sebáceas o sudoríparas, para causar
lesiones supuradas, limitadas (foliculitis) o extensas cuando afectan a varios
folículos contiguos (ántrax). En otras ocasiones, los microbios penetran por micro
heridas o traumatismos, produciéndose enrojecimiento de la zona, calor y
tumefacción local por la infiltración, consecuencia del proceso inflamatorio
agudo; en las causadas por estreptococo, se producen vesículas, ampollas o
lesiones características en la dermis, como el impétigo y la erisipela. En otros
casos, se produce linfangitis. Si la infección progresa en profundidad, se afecta
el tejido celular subcutáneo (celulitis) sin o con necrosis. La necrosis puede
afectar a las fascias musculares (fascitis) y al músculo (miositis). Cuando la
necrosis es importante, se habla de gangrena.
La presencia de nódulos subcutáneos granulomatosos (granulomas) de
evolución crónica, que en algún caso pueden fistulizar y acompañarse de
adenomegalias satélites, responden a etiologías muy variadas (bacterias,
hongos, protozoos).

2.- Rinitis

Las infecciones víricas de la mucosa nasal, denominadas rinitis, son muy

frecuentes. Cursan con abundante mucosidad y escasa afectación general,
curando espontáneamente en pocos días.

3.- Infecciones de la faringe (faringitis)

Se caracterizan por presentar dolor faringeo que se exacerba con la

deglución. Se observa una mucosa oro-faringea enrojecida, acompañada de
exudado, que a veces tiene carácter purulento. Pueden palparse ganglios
linfáticos latero cervicales aumentados de tamaño (adenomegalias). También es
muy frecuente en niños la infección del oído medio (otitis), caracterizada por
dolor, fiebre y supuración ótica (otorrea), y, con menor frecuencia, laringitis y
sinusitis, en ocasiones asociadas a una faringitis. La infección de la epiglotis
(epiglotitis) en el niño es muy grave, ya que puede obstruir la vía respiratoria.

4.- Mononucleosis

El síndrome mononucleosico se define por el incremento de las células

linfomonocitarias, a veces atípicas, en la sangre periférica. Esta causado por
diversos microorganismos, como el virus de Epstein-Barr, el citomegalovirus, el
virus de la rubéola, el herpesvirus 6, el virus de la inmunodeficiencia humana y
el toxoplasma. La linfomonocitosis se acompaña de fiebre o febrícula, faringitis
con frecuencia pultácea, exantema, poliadenomegalias y esplenomegalia, según

49
el agente causal. La faringitis estreptocócica también produce angina pultácea,
pero no se asocia al resto de signos y síntomas. En la hepatitis A puede haber
una discreta linfomonocitosis, pero la alteración de las pruebas hepáticas es
mayor.

5.- Neumonia

El cuadro clínico típico de la neumonía bacteriana causada por el

neumococo se inicia con escalofríos, fiebre, tos, dolor toráxico que incrementa
con la inspiración, respiración dificultosa y profunda (disnea) y emisión de un
esputo herrumbroso, en el que se observan hematíes y leucocitos
polimorfonucleares. Existe leucocitosis con desviación a la izquierda, y la imagen
radiológica generalmente revela una infiltración pulmonar unilateral y
circunscrita. En las neumonías de otra etiología (micoplasma, legionella, gripe),
el cuadro clínico, radiológico y biológico varía enormemente según el agente
causal.

6.-Infección Urinaria

Las infecciones urinarias afectan principalmente a la mujer, se producen

de modo ascendente y son causadas por bacterias de flora perineo-uretral
(E.coli y otras) que pueden localizarse únicamente en la vejiga causando cistitis
o alcanzar las vías altas afectando a los uréteres, pelvis y riñón (pielonefritis).
Las infecciones urinarias se acompañan de síntomas caracterizados por la
necesidad de orinar con frecuencia (poliaquiuria), siendo la micción dolorosa
(disuria) y con molestias o dolor hipogástrico, así como de fiebre y dolor lumbar
si hay afección de las vías altas.

7.-Uretritis

La uretritis del varón, generalmente de transmisión venérea y causada por

el gonococo, se caracteriza por disuria y polaquiuria, y se acompaña de
secreción uretral purulenta

8.- Vaginitis y cervicitis

La vaginitis y cervicitis en la mujer se suele acompañar de secreción

abundante, denominada leucorrea, y de prurito genital, pero sus manifestaciones
pueden ser muy diversas según el agente causal (candida, tricomonas,
gonococo, virus del herpes, etc.)

9.- Enteritis

Algunas bacterias, virus y protozoos (Salmonella, Campylobacter,

Rotavirus, Giardia, etc.), así como algunas toxinas de origen bacteriano, afectan
al tubo digestivo y causan un cuadro caracterizado por la emisión frecuente de
heces líquidas o pastosas (diarrea) que, de modo variable, se acompaña de
nauseas, vómitos, dolor cólico abdominal y fiebre.

50
10.- Meningitis

Las meningitis son infecciones de las meninges por localización

metastásica de los microorganismos como meningococo, neumococo o
enterovirus, a través de la sangre, salvo casos excepcionales en que un
traumatismo ha puesto en comunicación el sistema nervioso central con el
exterior. La inflamación de las meninges da lugar a dolor de cabeza (cefalea),
vómitos, molestia por la luz (fotofobia), obnubilación, y signos de irritación
radicular que se manifiestan en forma de rigidez de nuca y posición en gatillo

11.- Infecciones óseas y articulares

Las infecciones de los huesos y articulaciones, osteomielitis y artritis

pueden originarse, bien como consecuencia de una fractura abierta
contaminada, bien secundarias a una intervención quirúrgica sobre un hueso o
articulación. En otras ocasiones se producen por extensión local desde un
proceso supurativo de las partes blandas adyacentes. También se producen
osteomielitis o artritis a consecuencia de una diseminación hematógena de las
bacterias u hongos originada desde un foco distante. En las osteomielitis y artritis
agudas, el dolor y la impotencia funcional suelen ser muy evidentes

12.- Peritonitis

Se trata de una respuesta inflamatoria del peritoneo, que si bien puede

tener múltiples causas, en el caso de las peritonitis infecciosas suele ser
consecuencia de la perforación del tracto gastrointestinal o biliar, por neoplasia
o tras un traumatismo perforante abdominal o por contaminación durante o
después de una intervención quirúrgica. La peritonitis también puede producirse
a partir de infecciones supuradas de los órganos intraabdominales, en particular
del útero y de las trompas. Las peritonitis suelen estar causadas por la flora
intestinal polimicrobiana. En general se trata de procesos graves de instauración
aguda, con fiebre acompañada de dolor abdominal intenso con distensión
progresiva, nauseas, vómitos y estado toxico que puede llevar al shock
En los pacientes cirróticos con ascitis puede producirse una infección del
líquido peritoneal de modo silente o con mínima sintomatología. El agente causal
suele llegar desde el intestino por un proceso de translocación a través de la
pared intestinal, anatómicamente intacta

13.- Septicemia

Las bacterias y hongos que causan infecciones focales pueden pasar a la

sangre causando bacteriemia o fungemia (septicemia). En este proceso, a los
síntomas locales de la infección, se añaden síntomas generales evidentes, como
astenia, taquicardia, calofríos y fiebre (continua o en forma intermitente). Se
habla de shock séptico cuando a este cuadro se asocia taquicardia con un pulso
débil, hipotensión arterial y perfusión tisular inadecuada, palidez, frialdad de la

51
piel y disminución de la diuresis (oliguria, anuria). A] progresar el cuadro, se pro-
duce el fracaso funcional de múltiples órganos, como el riñón, los pulmones y el
corazón, y en ocasiones se desencadena un cuadro de coagulación intravascular
diseminada con petequias y/o equimosis. El cuadro de shock séptico está
causado generalmente por bacterias y raramente por hongos.

I. ETAPAS DEL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

Introducción.
El diagnóstico de las enfermedades infecciosas, se basa en el estudio de los
síntomas y signos clínicos, así como en la demostración de la presencia del
agente etiológico, de sus productos o de la reacción que este ha dejado en su
contacto con el sistema inmune del individuo.
El Laboratorio de Microbiología Clínica tiene como principal objetivo entregar al
médico información relevante para el diagnóstico y tratamiento de un paciente,
como también para que pueda aplicar medidas preventivas.
Desde que el Médico solicita el examen hasta que recibe la información con el
resultado, se realiza una serie de acciones bien definidas las cuales, deben estar
sujetas al control de calidad y constituyen las fases del diagnóstico
microbiológico. Cada integrante del equipo de salud, debe ser responsable de
realizar su trabajo dentro de las normas de eficacia y eficiencia y con la mayor
rapidez de respuesta, procurando minimizar o eliminar los errores.

Existen tres etapas en la generación de los resultados, por el laboratorio

clínico:

i) Fase pre-analítica

Solicitud del examen por parte del Médico. Esta orden debe ser clara y
tener todos los datos demográficos del paciente, el diagnóstico clínico,
examen solicitado y tipo de muestra, tratamiento antibiótico.
-Indicaciones para preparación del paciente.
-Fecha y hora clara de toma de muestra
 Toma de muestra:
La información diagnóstica que el laboratorio de Microbiología puede
proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida.
Una muestra mal tomada, en escasa cantidad o mal transportada,
determinara un posible fallo en la recuperación del agente patógeno,
induciendo errores en el diagnóstico, como también en un tratamiento
inadecuado del enfermo.

Requisitos para obtención de una muestra de buena calidad:

 Indicaciones claras al paciente
 Técnica aséptica
 Cantidad adecuada
 Envase apropiado ( estéril, limpio, protegido de la luz)

52
  Rotulada correctamente
 Representativa del cuadro clínico
 Previa a la terapia antibiótica
 Debe ser transportada rápida y adecuadamente al laboratorio, con la
orden de examen correspondiente.

 Transporte Las muestras recolectadas en tubos estériles sin medio de

transporte, deben ser enviadas al laboratorio, a la brevedad.
Como normativa de bioseguridad, las muestras deben transportarse al
laboratorio, dentro de unidades térmicas, sin hielo o unidad refrigerante, a
excepción de los aspirados nasofaríngeos para pesquisa de virus
respiratorios, deben ser trasladadas en gradillas que permitan mantener los
contenedores en forma vertical para evitar derrames.

Medios de transporte.
El uso de medios de transporte se hace necesario para impedir la desecación
de la muestra, asegurando la viabilidad de la bacteria, sin multiplicación
significativa de los microorganismo existentes, sobre todo si son escasos, a la
vez que impiden el crecimiento exagerado de otra flora bacteriana no
deseada, desde el momento de la obtención de la muestra hasta su posterior
estudio.

Los medios de transporte más frecuentemente utilizados son los de

Stuart, Amies, usados para muestras de secreciones y Cary – Blair, para
coprocultivo.

 Almacenamiento.
-Muestras para virus: en refrigerador, salvo sangre, médula ósea.
-Muestras para hongos: en refrigerador, salvo LCR, piel, pelo, uñas,
vaginal y balano-prepucial.
-Muestras para anaerobios: a Temperatura ambiente.
-Muestras para micobacterias: en refrigerador y protegidas de la luz,
salvo contenido gástrico.

-Muestras para cultivo bacteriológico:

a) A temperatura ambiente: médula ósea, líquidos estériles (pleural,
peritoneal, articular,...), muestras oculares, muestras de cavidad oral,
heridas, abscesos, fístulas, adenopatías, del tracto genital, y biopsias.

b) En refrigerador: orinas, heces, catéteres.

c) En estufa: hemocultivos, LCR, placas y tubos inoculados.

 Recepción laboratorio de Microbiología y registro de datos

Verificar que los datos de la solicitud de examen, la muestra y el
código de barras coincidan. (Datos demográficos - nombre, edad,
sexo, procedencia, Orden de Trabajo, Tipo de muestra)
Registro en el sistema informático o manualmente en libros para tal
efecto

53
  Distribución de las muestras

El laboratorio clínico debe tener instrucciones precisas escritas en un

Manual de toma de muestras y aplicar criterios de rechazo de muestras.

CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA

- Muestras sin orden, con datos incompletos o discordantes
- Muestras derramadas, o rotas,...
- Envase y/o volumen inadecuados
- Muestras sin medio de transporte adecuado.

Fase analítica:

En esta fase es de gran importancia el recurso humano, capacitado y bien

entrenado, los reactivos y los equipos de laboratorio, controlados y calibrados.

El Laboratorio de Microbiología clínica tiene un rol fundamental en la

identificación de bacterias en una muestra determinada.
El análisis microbiológico de una muestra, por lo general sigue la siguiente
secuencia:
a.- Observación Macroscópica y microscópica tanto del cultivo o microscópica
directa de la muestra.
b- Identificación fisiotaxonómica (pruebas bioquímicas o batería bioquímica)
c.- Estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos

La observación directa de la muestra teñida con Gram entrega información sobre

su contenido bacteriano. Es de gran utilidad, sobre todo, en casos de infecciones
graves en las cuales el resultado de la observación orienta al médico para iniciar
tratamiento empírico, a la espera del resultado de los cultivos de la muestra.

Los cultivos permiten observar la morfología de las colonias bacterianas en un

medio determinado. Ambos estudios orientativos se complementarán con los
análisis de identificación del microorganismo (género y especie) mediante
pruebas o baterías bioquímicas y el tratamiento del paciente con un agente
antimicrobiano se orienta con las pruebas de susceptibilidad

Un Laboratorio clínico debe tener instrucciones precisas escritas en un Manual

de procedimientos donde se define paso a paso el correcto desarrollo de las
técnicas del laboratorio, el mantenimiento y calibración de los equipos
utilizados, un programa de control de calidad interno y externo, para la detección
y corrección de los errores analíticos posibles

Fase postanalítica.

 Validación de los resultados

 Informe del laboratorio en el formato establecido
 Puntualidad en la entrega del resultados

54
  Confidencialidad de la información de los resultados.
 Aviso de valor crítico
 Registro de incidentes
 Respaldo de información
 Responsabilidad del Microbiólogo frente al médico, al paciente y las
autoridades sanitarias.
 Almacenamiento de las muestras
 Eliminación de muestras

II. - TOMA DE MUESTRAS DE DIFERENTES LOCALIZACIONES

ANATÓMICAS, PARA ESTUDIO MICROBIOLÓGICO

- Deposición
- Orina
- Sangre
- Piel y tejidos blandos
- Líquidos de cavidades estériles
- Muestras respiratorias: tracto respiratorio superior e inferior
-

COPROCULTIVO.

Los síndromes diarreicos se pueden agrupar según la etiología que

desencadena el cuadro clínico en infecciosas y no infecciosas. Dentro del grupo
de síndromes diarreicos infecciosos, se distinguen etiologías bacterianas,
parasitarias, fúngicas y bacterianas. Aunque la gran mayoría de las diarreas son
autolimitadas, una acción terapéutica puede acortar el curso de enfermedad en
ciertos agentes patógenos. La utilidad de la identificación del agente patógeno
aumenta al tener en cuenta que ciertos agentes patógenos poseen mecanismos
de virulencia que incluyen una capacidad invasiva, y por lo tanto, son potenciales
generadores de cuadros clínicos sistémicos graves. El tratamiento oportuno se
basa en una correcta y oportuna identificación del agente patógeno por medio
del examen de coprocultivo.
En el examen de coprocultivos son varios los estudios que pueden ser
solicitados, de acuerdo a esto es el envío y almacenamiento de la muestra. Los
solicitados en coprocultivos son:
Cultivo corriente de deposiciones incluye estudio de vigilancia de Vibrio sp.
Cultivo para búsqueda de Yersinia sp
Cultivo para búsqueda de ECEH
Cultivo para búsqueda de Salmonella sp y Shigella sp
Cultivo de Hongos: búsqueda de Levaduras.

Recolección, Almacenamiento y Transporte de la Muestra

 Muestra: tórula rectal o deposición recién emitida.

 Medio de transporte Cary –Blair.
 La muestra debe mantenerse a temperatura ambiente, hasta su
siembra.

55
Cultivo
Se realiza en placas con medios de cultivo selectivos Mac Conkey, SS (XLD,
hecktoen).
Después de 24 hrs. de incubación a 35° C, se seleccionan las colonias
sospechosas, para realizar las batería de pruebas bioquímicas, y llegar a
establecer el diagnóstico definitivo.

Salmonella, Shigella, Yersinia, es necesario realizar pruebas adicionales

confirmatorias y serología para su identificación. A las dos últimas además se
le realiza antibiograma.
En el caso de sospecha de ECEH también se realiza detección de serotipos
productores de verotoxinas con serología y se envía al ISP para confirmación.
El cultivo para la búsqueda específica de Vibrio sp., se debe realizar, además
de la siembra habitual, una en agar TCBS, previa incubación de la tórula en
Agua peptonada alcalina, por 6 hrs .Luego continuar con el proceso
establecido según normas.
Considerar que los aislados de estos microorganismos se deben enviar al
ISP para notificar y confirmación del diagnóstico.

Otros exámenes solicitados en muestras de deposiciones, tomados en frasco

limpio y seco, sin aditivos ni medio de transporte son:
- Campylobacter spp., con Tinción VB (Violeta Bicarbonato) Microscópico
- Leucocitos fecales: Directo al fresco
- Rotavirus: Test rápido
- Toxina de Clostridium difficile: determinación en equipo automatizado

Plazo de entrega de resultados:

Se reconocen distintos tiempos de respuesta de los coprocultivos, de acuerdo a
los estudios que se le realizan a la muestra:

 Coprocultivo corriente y estudio de Yersinia sp. 72 hrs.

El informe de las cepas enviadas al ISP será entregado al recibir la
confirmación del Laboratorio de Referencia, más o menos a los 15
días.
 Vibrio sp.: 72 hrs. Confirmación del diagnóstico por ISP. 15 días
 Tinción de Campylobacter: 2 hora
 Toxina de Clostridium difficile: 3 hrs.

56
Agentes etiológicos según características clínicas o epidemiológicas

0:26

57
UROCULTIVO

Son causadas por géneros bacterianos de crecimiento rápido, la

mayoría son miembros de la familia Enterobacteriaceae (Eschericiia coli,
Klebsiella sp., Proteus sp.) y con menos frecuencia:
Enterococcus,Staphylococcus y Bacilos no fermentadores. Pueden
comprometer riñones, uréteres, vejiga y uretra, siendo estas dos últimas las
más frecuentes.
Las infecciones llegan generalmente por vía ascendente desde la
uretra y menos comunes por vía hematógena.

Procesamiento de la muestra para Urocultivo

AGAR CPS SANGRE AGAR CPS

Recolección, almacenamiento y transporte de la muestra

La muestra de orina puede ser obtenida a través de las siguientes

Técnicas de recolección:
 Orina de 2° micción, previo aseo genital con agua y jabón.
 Orina por sondeo vesical
 Recolector pediátrico.
 Orina por punción vesical.
 Nefrostomía
 Ureterostomía

58
Envase: Frasco estéril, boca ancha, tapa rosca

Volumen: Mínimo 3ml.

Examen directo:
Se realiza una preparación en portaobjeto con una gota de orina, para una
eventual tinción de Gram, posterior.

Cultivo:
La muestra se debe homogeneizar mediante agitación suave y sembrar en
estría, con asa calibrada de 1 µl, en agar sangre y agar C.P.S o Mac
Conkey. Incubar por 24 hrs. a 35°.
Las muestras que no pueden ser sembradas antes de 2 horas deberán
guardarse en refrigeración hasta por 24 horas, sin que ello incida en el
recuento de colonias.

Recuento de Colonias e Identificación Presuntiva

Tras la incubación de placas por el periodo correspondiente, el profesional
observa la presencia de desarrollo bacteriano en los agares sembrados,
realizando:
 El recuento de colonias (1 colonia = 1000 UFC/ml).
 La interpretación del resultado, teniendo en cuenta el informe del
sedimento urinario. Identificación del patógeno mediante pruebas
bioquímicas en muestras con recuento >105
 Antibiograma

En caso de un probable contaminante y/o polimicrobiano: se informa como

contaminante. El profesional responsable debe informar al servicio
correspondiente y solicitar nueva muestra.

En los casos de muestras obtenidas por cateterización o procedimientos

invasivos se debe considerar de manera especial y considerara todos los
microorganismos desarrollados.
El urocultivo se relaciona con la solicitud de examen de orina completa o
sedimento urinario, por lo tanto si en estos exámenes se observan una
cantidad de leucocitos superior a lo considerado normal, el cultivo se debe
incubar por un periodo de 48 horas.

Plazo de entrega de Informe del resultado:

 Cultivo Negativo: 24 hrs.
 Cultivo Positivo: 48-72 hrs

Síndromes clínicos asociados a infección del tracto urinario

59
60
61
CULTIVO SECRECIONES GENITALES

Agentes etiológicos de infecciones genitales:

Streptococcus agalactiae,Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes,

Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus, Actinomyces israelii,Chlamydia
trachomatis, Cándida albicans, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis,
Virus herpes simple tipo 1 y 2, Virus papiloma humano, Virus de la
inmunodeficiencia humana, Virus de la hepatitis B, Virus de la hepatitis C.

Recolección, transporte y almacenamiento

Muestras para cultivo bacteriológico:

Secreción endocervical, secreción perianal, secreción uretral, Flujo vaginal: se
toman con tórula y se usa Medio de transporte Stuart o Amies.
En el caso de Flujo vaginal se toma una segunda muestra en S.F. para examen
directo al fresco y un frotis para tinción de Gram.
Transporte:antes de 2 hrs. a temperatura ambiente
Examen microscópico:
- Directo al fresco en Flujo vaginal.
- Tinción de Gram, muy importante, sobre todo en diagnóstico de
N.gonorrhoeae.

Criterios de Nugent: Se obtiene a partir de la lectura del Gram.

En caso de muestras de flujo o Secreción vaginal, definir puntaje de Nugent de
acuerdo a tabla:

Sistema de Puntaje (0 a 10) para diagnóstico de Vaginosis Bacteriana en Tinción de Gram

Puntaje por morfotipo

Cantidad de morfotipo bacteriano (cruces en el gram) → - + ++ +++ ++++

Bacilos Gram (+) largos o medianos - (Lactobacilos) 4 3 2 1 0

Cocobacilos pequeños Gram variables - (Gardnerella) 0 1 2 3 4

Bacilos curvos Gram (-) o gram variables - (Mobiluncos) 0 1 1 2 2

Score 0 – 3 : Morfotipo consistente con flora vaginal normal

Score 4 – 6 : Mezcla de morfotipos consistente con una flora de transición

Score 7 – 10: Mezcla de morfotipos consistente con Vaginosis Bacteriana

62
N. gonorrhoeae en muestra de S. uretral

Cultivo se realiza en:

Placa Agar Sangre, Placa Chocolate (24 a 48 horas), Tubo Sabouraud.
Placa Agar Thayer-Martin. (En caso de solicitud de Gonococo) en estufa de CO2
Streptococcus beta hemolítico grupo B: en caldo Todd Hewit. Incubado por 24
horas y luego se resiembra a agar sangre para incubar por 24 horas más.

Cultivo para Gardnerella vaginalis : Agar chocolate, incubación 48-72 hrs. a

35°, en atmósfera de CO2.
Cultivo de Hongos: Agar Sabouraud,incubación 72 horas hasta 7 días ( según
este establecido). a 35°C
En caso de solicitud de otros cultivos, la muestra se debe sembrar en medios
de cultivo en placa, según corresponda:

Plazo de entrega de Informe de resultados:

Cultivo corriente y Thayer Martin: 72 hrs.

Cultivo corriente Positivo: 48 72 hrs. desde que hubo desarrollo microbiano
Cultivo de Hongos: 5 días.

Otros exámenes para diagnóstico de Infecciones genitales son:

- IFD Chlamydia
- Cultivo de Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum
- Serología para diagnóstico de Sífilis

63
 HEMOCULTIVOS

Clasificación de los hemocultivos

Según tipo de paciente Según la toma de Según tipo de Según la

muestra Microorganismo metodología

Pediátrico B. aeróbicas Manuales

Centrales
Adulto B. anaeróbicas
Semiautomatizados
(lisis centrifugación)
Inmunocompetente Periféricos B. fastidiosas
Automatizados
Inmunodeprimido Micobacterias

Hongos

La infección del torrente sanguíneo o bacteriemia, constituye un cuadro clínico

grave con una incidencia en Chile de 1,8 /1000 egresos hospitalarios. Sin
embargo existe un porcentaje de sub-notificación importante. Actualmente no se
la considera una enfermedad de notificación obligatoria.
El hemocultivo o cultivo microbiológico de la sangre constituye en los casos de
septicemia, el único examen que permite su confirmación. Se define como
hemocultivo al cultivo microbiológico de una muestra de sangre obtenida por una
punción independiente.
En el último tiempo han ocurrido varios cambios, tales como el aumento del
número de pacientes inmunocomprometidos, la necesidad de aislar
microorganismos no habituales y el advenimiento de sistemas automatizados
para los hemocultivos.

INDICACIONES PARA LOS HEMOCULTIVOS

La indicación clásica de obtener hemocultivos, es la sospecha de bacteriemia en
pacientes con o sin foco aparente de infección. Los factores clásicos asociados
a bacteriemia verdadera, son la presencia de calofríos y fiebre mayor a 38.3ºC,
existencia de enfermedades subyacentes severas (usualmente mortales a un
plazo no mayor a 5 años), cuadros de abdomen agudo y el antecedente de
drogadicción intravenosa. También todas aquellas infecciones que producen
bacteriemias continuas, como la endocarditis infecciosa y en general, las
infecciones endovasculares
Con la introducción de la automatización de hemocultivos se produjeron grandes
avances en el procesamiento de los mismos, puesto que se eliminó la necesidad

64
de realizar subcultivos a ciegas, tanto iniciales como terminales, reduciendo el
riesgo de punciones accidentales en el laboratorio, se disminuyó el tiempo
necesario de incubación de las botellas y se mejoró el tiempo de detección de
los hemocultivos positivos. Además, al ser sistemas informatizados presentan
como ventaja adicional, el manejo computarizado de datos epidemiológicos y de
cada paciente individual.

Los hemocultivos se pueden clasificar según:

 El tipo de paciente en: adultos y pediátricos.

 La toma de muestra en: centrales y periféricos
 En cuantitativos o cualitativos
 El tipo de microorganismo investigado: Bacterias Aeróbicas, Bacterias
Anaeróbicas, Bacterias Fastidiosas, Micobacterias y Hongos
 Metodología: Convencionales (manuales) y automatizados.

a) Hemocultivos automatizados

65
Recolección, Almacenamiento y Transporte de la Muestra

Material: Frascos de hemocultivos Adulto ( etiqueta verde) o pediátrico

(etiqueta amarilla)
Técnica de recolección:- Antisepsia de piel con Alcohol 70%, Povidona
o Clorhexidina. Desinfección de tapa con Alcohol al 70%
Muestras: 2 simultáneas, por punción venosa periférica, de distintos sitios
de punción
Volumen de muestra: Adultos……..10 ml
Niños……..3 -5 ml
R.N………0.5- 1ml
Importante mantener la relación 1: 10, con el medio líquido
Idealmente antes de iniciar terapia antibiótica.

Transporte: Antes de 2 hrs. a temperatura ambiente. Rotular claramente

cada frasco. Nota: No escribir sobre el código de barras

Registro, incubación y descarga

Registrar los datos del paciente en el equipo.

Ingresar los frascos al equipo automatizado

La descarga de frascos hemocultivos desde el equipo se produce cuando un

frasco ha cumplido su periodo de incubación manteniéndose como negativo,
o bien, se ha hecho positivo y es necesaria su descarga para el pertinente
análisis diagnóstico,

Procesamiento de frascos positivos

Se debe realizar:
- Tinción de Gram. Dar aviso, por teléfono, del resultado al Médico,
Enfermera o Matrona que esté a cargo del paciente
- Subcultivos (resiembras) en placas de Agar sangre, agar chocolate y Agar
Mac Conkey, Agar Sabouraud, en el caso que se haya solicitado cultivo de
Hongos por parte del clínico.
Incubar las placas por 24 hrs. a 35°

El profesional encargado hace la revisión de los cultivos y procede a la

identificación y antibiograma del agente patógeno.

Plazo de entrega de Informe de resultados:

 Hemocultivos Negativos: 5 días

 Hemocultivos Positivos: 48 a 72 hrs. desde que fue detectado positivo, 72
hrs. o más en bacterias de difícil desarrollo.
 Hemocultivos Negativos con diagnóstico de Endocarditis: 14 días
 Hemocultivos con diagnóstico de Brucelosis: 21 días

66
b) Hemocultivos cuantitativos pareados.

Recolección, Almacenamiento y Transporte de la Muestra

Material: 2 jeringas heparinizadas y 2 tapas estériles

Técnica de recolección: Antisepsia de piel y catéter con Alcohol al 70%

Muestra: 2ml por aspiración periférica y 2ml por aspiración de catéter

Idealmente antes de iniciar terapia antibiótica.

Transporte: Inmediato a temperatura ambiente

Nota: Indicar claramente procedencia de la muestra.

Siembra de la muestra y análisis del resultado del cultivo:
Agitar suavemente las jeringas y sembrar 0.5 ml de cada jeringa en placa de
agar sangre.
Incubar en estufa a 35° por 72hrs.
El profesional revisa diariamente las placas. En caso de haber desarrollo
microbiano procede a la identificación, recuento de colonias y antibiograma del
agente patógeno.

Plazo de entrega de Informe

 Cultivos negativos: 72 hrs.

 Cultivos positivos: 24 hrs. desde detección de desarrollo

67
Cultivo semicuantitativo de punta de catéter o Técnica de Maki

Toma de Muestra:
Consiste en retirar el catéter con técnica aséptica. Cortar 5 cm distal. Enviar,
inmediatamente al laboratorio, en tubo estéril hermético.

Siembra
Se realiza depositando la punta de catéter, con material estéril, en una placa de
agar sangre, se hace rodar por la superficie del agar. Incubación en estufa a 35°
por 72 hrs., en ambiente aerobio.
Se revisa el cultivo diariamente. Si hay desarrollo microbiano se hace el recuento
de Unidades formadoras de colonias, se informa sobre 15 U.F.C.
Se procede a la identificación y antibiograma de agente patógeno.

Siembra Cultivo

Plazo de entrega de Informe de resultado:

Cultivo Negativo: 48hrs.

Cultivo Positivo: Identificación y sensibilidad, 48 hrs. desde que se hizo
positivo.

68
SECRECIONES Y LÍQUIDOS DE CAVIDADES ESTÉRILES

a) Muestra de Piel y Tejidos blandos:

 Abscesos
 Lesiones abiertas: Herida operatoria y traumática
 Úlceras y escaras
 Pie diabético

Agentes etiológicos: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella multocida,
Anaerobios estrictos.

Recolección, transporte y almacenamiento.

Toma de muestra: Siempre con aseo previo

- Heridas, aseo con Suero Fisiológico estéril. Remover tejido necrótico y

pus superficial. Tipos de muestras son: Biopsia, curetaje, aspirado,
torulado. Se puede realizar estudio aerobio. Estudio anaerobio, solo si hay
clara sospecha clínica y en muestras apropiadas para este estudio.

- Abscesos, aseo con antiséptico. Aspirar más de 1ml de contenido, con

jeringa o muestra de pared del absceso. Se puede realizar estudio aerobio
y anaerobio.

Transporte y almacenamiento:

- Heridas: Tórula en medio de transporte Stuart. Enviar antes de 2 horas. a

temperatura ambiente.

- Curetaje y trozo de pared de absceso: Frasco estéril, boca ancha y tapa

rosca .Enviar entre 15- 30 minutos a temperatura ambiente.

- Aspirado de contenido: medio de transporte anaerobio. Antes de 2 hrs. a

temperatura ambiente.
Medio de transporte alternativo: Jeringa con tapa estéril, SIN AGUJA. , 15
a 30 min. A temperatura ambiente.
- Pie diabético: Muestra de tejido viable en medio de transporte Stuart. 2
hrs. a temperatura ambiente

- Úlceras y escaras decúbito: No se deben cultivar por las siguientes

razones:
Por la necrosis la llegada de antibióticos es nula.
Existe colonización polimicrobiana
Es reservorio de cepas intrahospitalarias
Bacteremia es poco frecuente.

69
Si existe compromiso óseo, enviar muestra de hueso.

-Examen microscópico: Tinción de Gram directo de la muestra.

-Siembra: Se realiza en placas de agar sangre, agar chocolate ( si corresponde)
MacConkey, Thioglicolato.
-Interpretación del cultivo: En Muestras de tejidos y aspirados se informan
todos los microorganismos aislados.
-En torulados se debe hacer “sceening” de calidad de la muestra, en la Tinción
de Gram ver la relación células epiteliales y leucocitos.

-Plazo entrega de Informe de resultados:

Cultivo corriente Negativo: 72 hrs.

Cultivo corriente Positivo: 48 hrs. desde que hubo desarrollo microbiano.
Cultivo de anaerobios Negativo: 5 días
Cultivo de anaerobios Positivo:4 a 5 días desde que hubo desarrollo.

b) Secreción ocular
Las infecciones oculares se pueden clasificar en:
 Las que afectan las estructuras externas del ojo como los párpados, sistema
lacrimal y tejido periorbitario produciendo conjuntivitis, queratitis o
infecciones externas de piel y glándulas.
 Conjuntivitis
- Conjuntivitis viral producida por Adenovirus, diagnóstico por IFD.
- Conjuntivitis bacteriana (purulenta), agentes más frecuentes: S. aureus,
- S pneumoniae. pyogenes y Haemophilus sp.Otros más graves son:
N. gonorrhoeae y N. meningitidis. Diagnóstico por Cultivo bacteriológico
- Conjuntivitis aguda por Chlamydia trachomatis. Diagnóstico por IFD

 Queratitis bacteriana
Principal factor de riesgo es el uso de lentes de contacto
Agentes más frecuentes son S. aureus, P. aeruginosa y Enterobacterias
como E. coli, K. pneumoniae, Serratia sp.
El diagnóstico se basa en la tinción de Gram y cultivo del raspado corneal

 Infecciones profundas como uveítis, endoftalmitis y retinitis

Son infecciones graves que pueden ser producidas por bacterias, hongos o
parásitos, según el caso. Las muestras que se toman para el diagnóstico
pueden ser raspado corneal, humor vítreo, humor acuoso.

La toma de muestra para cultivo corriente y de Hongos ensecreción ocular se

hace con tórula estéril, dirigida hacia el ángulo interno del ojo, rotándola
suavemente,previa separación del párpado inferior con el pulgar de la otra
mano.
Se usa medio de transporte Stuart.
Si el examen solicitado, es IFD de Chlamydia trachomatis, la muestra debe ser
tomada y depositada inmediatamente en la lámina especial para este estudio.

70
El procedimiento para el diagnóstico corresponde al establecido en general
para las muestras para estudio bacteriológico.

Plazo de entrega de Informe de resultados:

Cultivo corriente Negativo: 72 hrs.

Cultivo corriente Positivo: 48 hrs. desde que hubo desarrollo microbiano
Cultivo de Hongos:14 días
IFD de Chlamydia trachomatis, en secreción ocular:durante el día

c) Líquidos de cavidades estériles.

Ascítico, Articular, Amniótico, Bilis, Pericárdico, Peritoneal, Pleural, Sinovial.

Recolección, transporte y almacenamiento

Toma de muestra: Localizar sitio a puncionar

Desinfectar la piel con alcohol al 70%
Puncionar con técnica aséptica

Volumen: 1 - 2ml

Envase: Tubo estéril o Frasco de hemocultivos

Transporte: Inmediato, antes de 2 hrs. a temperatura ambiente.

Examen microscópico: Tinción de Gram directo de la muestra,

Siembra: Se realiza en agar sangre,MacConkey, agar chocolate (si

corresponde) Thioglicolato, Sabouraud (solo si solicita cultivo de Hongos)

El procedimiento para el diagnóstico corresponde al establecido en general

para las muestras para estudio bacteriológico, es decir, examen directo,
cultivo y Antibiograma.

Plazo de entrega de Informe de resultados:

Cultivo corriente Negativo: 72 hrs.

Cultivo corriente Positivo: 48 hrs. desde que hubo desarrollo microbiano
Cultivo de Hongos: 14 días

Si la muestra fue tomada en frasco (Vial) de hemocultivos, el tiempo de

respuesta es:
Cultivo Negativo: 5 días
Cultivos Positivos: 48 a 72 hrs. desde que fue detectado positivo.

71
Infecciones del Sistema Nervioso Central

Muestra: Líquido Cefalorraquídeo (LCR).

El sistema nervioso puede infectarse por diferentes microorganismos, incluyendo

bacterias, virus, hongos, protozoos y helmintos. La presentación clínica de estas
infecciones puede ser aguda, subaguda o crónica dependiendo de la etiología,
la virulencia del microorganismo y la localización del proceso infeccioso. En
ocasiones se afecta un único órgano o compartimiento como en el caso del
absceso cerebral o la meningitis, y en otros se afectan varios de ellos como en
las encefalomielitis olas meningoencefalitis. Los agentes infecciosos pueden
invadir los órganos diana a partir de un foco infeccioso cercano como una otitis,
por vía hematógena, siguiendo diversas vías nerviosas, o bien ayudados por la
existencia de sistemas de derivación del líquido cefalorraquídeo (LCR)
colocados en intervenciones de neurocirugía.

El diagnóstico y tratamiento precoz es crítico en la evolución. Son diversos los

agentes según la edad y patologías asociadas (Inmunocompromiso) y múltiples
técnicas para el diagnóstico

RN: Streptococcus agalactiae, Escherichia coli (K1), Listeria monocytogenes

Niños: Streptococcus pneumoniae, Neisseria menigitidis, Haemophilus
influenzae
Adultos: Streptococcus. pneumoniae, Neisseria menigitidis
Meningoencefalitis virales: Enterovirus, HSV
VIH: Cryptococcus neoformans, Treponema pallidum

Estudio microbiológico del LCR

Estudio básico:
a) Citoquímico
b) Cultivo corriente
c) Gram
d) Aglutinación: Test de Latex
TBC: Baciloscopía, Cultivo de Koch, ADA, PCR
Virus: PCR VHS, Enterovirus, VVZ
Hongos: Cultivo de Hongos, Tinta China, Ag. CryptococcusSífilis:
V.D.R.L
Estudios especiales: Micoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae
Virus parotiditis, Virus influenza, CMV
Cultivo: Se realiza siembra en agar Sangre, Agar chocolate (se incuban
en atmósfera de CO2), agar Mac Conkey, Thioglicolato, tubo de
Sabouraud. Incubación a 35°.

El procedimiento para el diagnóstico corresponde al establecido en general para

las muestras para estudio bacteriológico

72
Plazo de entrega de Informe de resultados

Test de Látex: 2 hrs.

Cultivo corriente Negativo: 4 dias.
Cultivo corriente Positivo: 48 hrs. desde que hubo desarrollo microbiano
Cultivo de Hongos: 14 días
Baciloscopía: 48 hrs.
Cultivo de Koch Negativo: 30 días, informe parcial
60 días, informe final

Se debe recordar guardar muestra en casos difíciles

 4°C por 24-48 hrs.
 - 20° para estudio de antígenos o serología
 - 70° para estudios moleculares

CULTIVO DE MUESTRAS RESPIRATORIAS

Las infecciones respiratorias se clasifican de cuerdo a:

a) Su presentación: en Infecciones respiratorias agudas y crónicas

b) Su localización en: Infecciones de la vía aérea superior e inferior.

Infecciones de vía aérea superior (Altas): Resfrío común Faringitis, Sinusitis,

Otitis, Síndromes laríngeos y otras como: Difteria, Coqueluche.
Afectan desde fosas nasales hasta laringe
Agentes etiológicos: Streptococcus grupo A, Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae, Enterobacterias, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Bordetella pertusis,
Mycobacterium sp, Pneumocystis jiroveci, Chlamydias pneumoniae,
Mycoplasma pneumoniae, Adenovirus, Virus herpes simple, Citomegalovirus,
Hongos filamentosos

Recolección y transporte de la muestra

Transporte
Tipo de muestra Forma de obtención Envase Tiempo
Secreción nasal Torulado Tubo estéril con < 2 h,TA
(Portación) Medio de transporte
Secreción faríngea Torulado Tubo estéril con < 2 h,TA
Medio de transporte
Aspirado nasofaríngeo Aspirado Tubo estéril en que < 2 h,TA
(IF) se toma la muestra
Cavidades paranasales Aspirado Frasco Hemocultivo < 2 h,TA
pediátrico

73
Infecciones de vía aérea inferior (Bajas): Bronquitis, Bronquiolitis, Neumonía
aguda, Neumonía crónica y asociada a pacientes inmunocomprometidos.
Afectan bajo laringe hasta alvéolos.

Recolección y transporte de la muestra

Transporte
Tipo de muestra Forma de obtención Envase Tiempo
Expectoración Tos profunda Frasco boca ancha < 2 hrs, TA

Aspirado endotraqueal Aspirado Tubo estéril < 2 hrs, TA

(CCAET) (Sin diluir)
Lavado broncoalveolar Vía endoscópica Frasco boca ancha Inmediato
(LBA)
Cepillo protegido (CP) Vía endoscópica Frasco boca ancha < 2 hrs, TA

Muestra de expectoración.

Obtención fácil y económica. Se debe dar instrucciones al paciente para

adecuada recolección:
- Mediante tos profunda,
- A primera hora de la mañana.
- Aseo bucal con agua pura
- Envase protegido de la luz, para Baciloscopía y Cultivo de Koch.

Evaluar la calidad de la muestra:

 10 células epiteliales, sin leucocitos por campo: Muestra de mala calidad

solicitar nueva muestra

 <10 células epiteliales, <25 leucocitos por campo, muestra útil en

pacientes inmunosuprimidos

 < 10 células epiteliales por campo, > 25 leucocitos por campo,

muestra óptima

74
 Muestra de mala calidad Muestra de buena calidad

Cultivo corriente: Siembra en placas Agar sangre, Agar Chocolate y

MacConkey..

Informe de resultados en 72 hrs.

75
 CULTIVO CUANTITATIVO DE ASPIRADO ENDOTRAQUEAL

Es el cultivo microbiano en que se realiza recuento de colonias de patógenos

respiratorios aislados de una muestra de aspirado endotraqueal procedente de
un paciente intubado o con invasión de vía aérea. Este método diagnóstico se
utiliza principalmente para identificar agentes causales de neumonía asociada a
ventilación mecánica en paciente con sospecha de NAVM (conexión a
ventilación mecánica > 48 hrs y presencia de criterios clínicos-radiológicos) una
complicación frecuente en pacientes de servicios críticos que precisan
respiración artificial. Es un método no invasivo y presenta un valor diagnóstico
similar al de Lavado broncoalveolar broncoscópico, método invasivo que es más
caro y no está exento de complicaciones.

Procesamiento Cultivo de Aspirado Endotraqueal:

Muestra AE Gram Directo Dilución de muestra

Homogeneizar en Vórtex Dilución y Siembra en 2 series de placas A y B

Recuento de U.F.C.

76
 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

Materiales y Reactivos: perlas de vidrio, asa de platino o pipeta Pasteur,

guantes de procedimiento, reactivos para tinción de gram, tubos estériles, porta-
objetos, agar sangre cordero al 5% (PAS), agar chocolate (CHOC), agar Mc
Conkey (MC).

Equipos: Campana de Bioseguridad clase IIA, estufa de cultivo a 35ºC, estufa

de CO2, refrigerador, vórtex, microscopio, lupa estereoscópica, turbidímetro,
mechero de Bunsen, micropipeta graduada.
Procesamiento: realice examen de Gram directo de la muestra

Prepare una dilución 1:2: Agregue a la muestra un volumen similar de

solución fisiológica estéril o NaCl 9% estéril
Agregue perlas de vidrio estériles al tubo y mezcle en agitador vórtex por 2 min.
Prepare dilución 1:100: tome100 μl de la dilución 1:2 y diluya con 9,9 ml
solución fisiológica estéril o NaCl 9% (dilución final 1:200). Agite en vortex Esta
es la dilución madre que se utilizará para sembrar las placas A y B.
Siembre de la siguiente forma:

 Placas A: tome 100 μl (0,1 ml) de la dilución y siembre en 1 PAS y en 1de Mc

Conkey y 1 CHO (dilución final placas A 1:2000)
 Placas B: tome 10 μl (0,01ml) de la dilución madre y siembre en 1 PAS y en
1de Mc Conkey y 1CHO (dilución final placas B 1:20000)

La siembra debe hacerse diseminando el inóculo en forma pareja sobre las

placas con una bagueta de vidrio o pipeta Pasteur doblada

Medio Incubación Interpretación

Previo a la siembra de los cultivos se debe realizar una evaluación de la

muestra. Evaluar si es representativa del tracto respiratorio superior (Score Q).
100 l de la
Placas A dilución PAS y ACHO CO2 1 en 2.000
100 l de la
dilución MC AEROBIO
10 l de la
Placas B dilución PAS y ACHO CO2 1 en 20.000
10 l de la
dilución MC AEROBIO

77
Incubación
- Incube el MC en aerobiosis a 35 °C hasta 72 horas.
- Incube PAS y CHO en estufa de CO2 a 35°C hasta 72 horas.

Lectura
- Realice la lectura de las placas diariamente. Si no hay crecimiento bacteriano
a las 48 o 72 horas, informe: “No hubo desarrollo microbiano”.
- En cultivos positivos:
- Cuente cada morfotipo de colonia en forma individual y anote el recuento en
la hoja de trabajo.
- Multiplique el recuento de cada morfotipo de colonia presente en las placas
B por 20.000. Ejemplo: 4 colonias corresponderán a 80.000 UFC/ml o 104
UFC/ml
- Si el crecimiento es muy numeroso como para contar colonias individuales,
asumir que hay más de 100 colonias en la placa y anotar >10 6. (> 2.000.000)
- Si no hubiese desarrollo en las placas B, realice el recuento en las placas A,
multiplicando el número de colonias de cada morfotipo por 2.000. Ejemplo: 4
colonias corresponderán a 8.000 UFC/ml o 103 UFC/ml
- La ausencia de colonias equivale a recuentos de < 103 UFC/ml
- La presencia de ≥ 50 colonias en las placas B equivale a recuento de > 10 6
- Realice identificación y estudio de susceptibilidad a todos los
microorganismos aislados EXCEPTO los que se señalan a continuación
porque representan colonización:

 Streptococcus grupo viridans

 Neisseria spp. (excepto N. gonorrhoeae y N.
meningitidis)
 Difteroides
 Rothia
 Eikenella
 Actinobacillus
 Capnocytophaga
 Staphylococcus coagulasa negativaSi se trata de cultivo
 Enterococcus puro pueden ser
patógenos
Informe:
- Tinción de Gram: señale la presencia de polimorfonucleares (PMN) como 25
ó <25, presencia de células epiteliales (CE) como >10 ó 10 y morfología
bacteriana con recuento semicuantitativo (escasa, regular o abundante
cantidad) Calcular score Q.
- Informe el número de colonias de cada microorganismo patógeno estudiado
en UFC/ml, su identificación y estudio de susceptibilidad.
- En caso de desarrollo de microorganismos colonizantes (señalados arriba),
informe “hubo desarrollo de flora comensal orofaríngea”, SIN RECUENTO y
sin detallar los microorganismos aislados.
- En caso de desarrollo de Candida albicans y no albicans, informe este
microorganismo SIN RECUENTO. A pesar de tratarse de un microorganismo

78
 generalmente colonizante, debe informarse su presencia, ya que ésta se
utiliza en clínica como indicador de candidiasis sistémica, en algunas
ocasiones

BIBLIOGRAFÍA
- Consenso “Neumonía asociada a ventilación mecánica”. Rev Chil Infect v.18
suplemento 2, 2001.
- Manual de Microbiología Clínica. Murray. Ed. 2004. , 2nd edition.

Técnicas y plazo de entrega de los resultados

- Cultivo corriente y Antibiograma: 72 hrs.

- Cultivo de Hongos: 7 días

- Baciloscopía: 24 hrs.

- Cultivo de Koch: 30 días informe preliminar y 60 días, informe final.

- Test rápidos (Test pak) STGA y Virus respiratorios: 2 hrs.

- IFD para Virus respiratorios. Durante el día

- IFD para Bordetella pertusis: 24 hrs.

- Antígeno urinario de Legionella pneumophila y Streptococcus

pneumoniae: 2 hrs.

79
 MICOBACTERIAS

TM Juan Carlos Román

Las Micobacterias son microorganismos de forma bacilar, aerobios estrictos,

intracelulares facultativos, inmóviles, no productores de toxinas, resisten el frio y
la desecación, de lenta multiplicación (tg 20 Horas) que se traduce en un lento
desarrollo en los medios de cultivo (hasta 60 días), requieren medios especiales
para su desarrollo, 40 - 60% de su peso seco son lípidos, se transmiten
principalmente por la vía aérea y su principal característica es que son bacilos
acido alcohol resistente.

La pared de las Micobacterias está constituida por:

1.- Estructura covalente de 2 polímeros: Peptidoglicano y micolato de arabino

galactano y ácido micólico, característico de Micobacterium, Nocardia y
Corynebacterium, lo cual les confiere la característica de ser acido alcohol
resistentes.

2.- Micosidos, que son un conjunto de lípidos superficiales con características

antigénicas y de patogenicidad.

Virulencia:

 Pared celular gruesa rica en lípidos.

 Estado de latencia de días o años (bacilos durmientes

(bacteriostasis)).
 Multiplicación intracelular.
 Producción de ureasa y Glutamino sintetasa (alcalinizan el medio)
y evitan acción de lisosomas que requiere Ph ácido para actuar
(4,5), así se evita la unión fagosoma- lisosoma.

80
  Trehalosa 2 sulfato (glicoproteína de pared), que evita la
maduración del lisosoma.

Clasificación:

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX

• M. tuberculosis
• M. bovis
• M. africanum
• M. microti (no en humanos) TUBERCULOSIS
• M.canetti
• M.pinnipedi
• M.caprae

MYCOBACTERIUM LEPRAE LEPRA

MYCOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS (MOTT)

• M. avium – intracelullare
• M. scrofulaceum MICOBACTERIOSIS
• M. marinum
• Otras Micobacterias

Manifestaciones clínicas de la tuberculosis:

 Pulmonar
 Ganglionar
 Renal
 Diseminada (miliar)
 Meningoencefalitis
 Osteoarticular
 Piel
 Otros (endometrial, intestinal, ocular, etc).

Paciente bacilifero en promedio infecta a 10-15 personas anualmente, de los

cuales el 5 -15% desarrolla la enfermedad en algún momento de su vida.

50% Pacientes no tratados fallecen.

25% se hace crónico
25% desarrolla cura espontánea

81
SINTOMAS DIAGNOSTICOS (SOSPECHA)

 Tos y expectoración con más de 2 semanas de evolución

 Cuadros febriles prolongados
 Baja de peso
 Compromiso del estado general
 Lesiones óseas, Hematuria, Derrame pleural
 Imagen radiológica pulmonar patológicas

Muestras:

 Expectoración
 L.B.A.
 Líquidos:
LCR, Pleural, Pericárdico, Articular.
 Contenido gástrico
 Orina (6 muestras para BK y CK)
 Sangre (Hemocultivo para Micobacterias).
 Tejidos, biopsias.
 Deposición, Secreciones.

Métodos de Diagnóstico:

 OBSERVACION MICROSCOPICA (TINCIONES)

 ESTUDIO HISTOLOGICO
 ESTUDIO RADIOLOGICO
 CULTIVOS IDENTIFICACION
 SENSIBILIDAD
 DETECCION DE ANTIGENOS/ANTICUERPOS

82
  TECNICAS MOLECULARES (PCR rt, Probe, Etc.)
 TEST ID RAPIDOS (a partir de cultivos)
 OTRAS: PPD, ADA

Diagnóstico de Laboratorio.

Tinción de ZIEHL-NEELSEN.

Es una técnica sencilla, rápida y de bajo costo. Consiste en la observación

microscópica de una muestra clínica (expectoración, líquidos, tejidos o
secreciones). Esta técnica es capaz de diferenciar los bacilos Acido Alcohol
Resistentes (BAAR).
La técnica de Ziehl-Neelsen fuerza la penetración de la fucsina básica en la
pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan
la fluidez de la capa de ácidos micólicos: el calor “derrite” el componente ceroso
y el fenol actúa a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante básico
que se une a los ácidos micólicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicación
de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared
recupera su consistencia cerosa, pero las moléculas de fucsina quedan
atrapadas en su espesor, para posterior decoloración con alcohol ácido
(clorhidrico) y finalmente la aplicación de un colorante de contraste como es azul
de metileno.
Los bacilo acido alcohol resistentes se observan de color fucsia en un fondo azul.
La sensibilidad de la técnica varía según el tipo de muestra y la cantidad de
Micobacterias presentes en la muestra. Se requiere como mínimo una cantidad
de 5.000 – 10.000 bacilos/mL de muestra.

La tinción de Auramina –Rodamina (tiñe el DNA) es más sensible pero más cara
y debe confirmarse con Ziehl-Neelsen.

Procedimiento técnico para tinción de Ziehl-neelsen:

 Depositar muestra en lámina portaobjeto.

 Fijar extendido
 Agregar Carbol fucsina x 5’ (Aplicar calor, pero solo hasta emitir vapores
2 – 3 veces máximo).
 Lavar con abundante agua.
 Decolorar con alcohol ácido 2-3’
 Lavar con abundante agua.
 Agregar Azul de metileno 1- 2’
 Lavar y secar

83
En el caso de la Tinción de Kinyoun no se debe calentar la lámina.

Fijar Fucsina (calentar) Lavar

Decolorar (alcohol acido) Azul de metileno Lavar

Observación en microscopio con aumento 100X

Lectura Baciloscopia

(-): No se observan BAAR en 100 campos observados.

+: <1 BAAR x campo en 100 campos observados
++: 1–10 BAAR x campo en 50 campos observados
+++: >10 BAAR x campo en 20 campos observados

En baciloscopias cualitativas el informe es Positivo o Negativo.

En caso de encontrar hasta 3 BAAR se debe rechequear, ya sea aumentando a

200 campos, tiñendo otra lámina, etc.

84
 Cultivo de Micobacterias

Se considera el método de referencia porque permite la confirmación de

género/especie y estudio susceptibilidad a drogas.

Cultivo puede realizarse en medios sólidos y medios líquidos.

El cultivo en medio sólido (Löwenstein Jensen) es el más tradicional y

puede demorar 30-60 días hasta positividad.

Incubación 35 – 37 °C.

Muestras sitios estériles siembra directa

Muestras no estériles descontaminar y sembrar

Otros medios de cultivo utilizados son:

Solidos: 7H10, 7H11
Líquidos: 7H9.

Ventaja:
Sensibilidad: 1.000 bacilos/ml muestra

85
Revisión de los cultivos sólidos:

La primera observación se hace a las 48 – 72 horas. Esto permite detectar

contaminación por flora asociada. Si esta alteración se presenta en todos los
tubos sembrados se solicita nueva muestra.
Las siguientes revisiones se hacen una /dos veces por semana.
En caso de mantenerse negativo, a los 60 días se hace la última revisión y el
informe definitivo.

Middlebrook 7H11
Lowenstein jensen

86
El informe se hace basándose en la suma de los recuentos de las colonias
desarrolladas en todos los tubos sembrados. Las colonias típicas de M.
tuberculosis son secas, rugosas y con una leve coloración marfil.
- De 1 a 50 colonias: Se informa el número exacto de colonias desarrolladas.
- Colonias no confluentes: Más de 50 colonias.
- Colonias confluentes: Incontables colonias.
- Ausencia de colonias: Se informa negativo.
- Contaminados todos los tubos: Se informa muestra contaminada, solicitar
nueva muestra.

Identificación de especie de Micobacterias a partir de cultivos positivos.

Pruebas/Especie M.tuberculosis M.bovis

Niacina + V
Nitrato + -
Catalasa a 68° C - -

87
88
89
  Secuenciación.
 RFLP.
 Cromatografía de alta resolución.
 MALDI-TOF (Análisis proteínas por espectrometría de masas).

DETECION DE ANTIGENOS O ANTICUERPOS

Test ELISA IgM, IgG, IgA.

Quantiferon:
Detección de producción de interferón (TBC latente).

PPD (prueba de la tuberculina):

Se utiliza derivado proteico purificado, test cutáneo, con lectura a las 48-72 Hrs.
(+) >10mm en pacientes sin riesgo conocido.

Esta técnica tiene muchas limitaciones (operador, antígeno, reacciones

cruzadas, lectura, interpretación, disponibilidad del test).

90
 Estudios de susceptibilidad.

• A partir de cultivo positivo en medio sólido (Dilución, E-test, Etc.).

• A partir de cultivos positivos en medios líquidos detectados en equipos

automatizados (MGIT 960, Etc.).

• Detección de genes de resistencia, a partir de

muestra directa del paciente o de una cepa
de un cultivo positivo.

Protocolo Standard de tratamiento antiTBC:

 Primera fase:
Fase intensiva, diaria (2 meses)
Cuatro medicamentos:
Isoniacida, rifampicina, pirazinamida y etambutol o estreptomicina.

 Segunda fase:
Fase consolidación (4 meses)
Isoniacida y rifampicina 2 veces a la semana.

91
Medidas de Bioseguridad en el laboratorio para el manejo de TBC:

En los laboratorios donde sólo se realiza microscopía de frotis (Sin

centrifugación), no se necesita protección respiratoria personal (por ejemplo
respiradores).

Los laboratorios que trabajan con suspensiones líquidas de M.tuberculosis

deben estar equipados con un gabinete de bioseguridad de clase I o II.

La protección respiratoria personal no se recomienda si el gabinete de

bioseguridad funciona adecuadamente y el trabajo con suspensiones líquidas se
lleva a cabo en el gabinete.
PCNT 2005

92
 BACTERIAS ANAEROBIAS

Características generales

Las bacterias anaerobias son microorganismos que no necesitan oxigeno

molecular para vivir y multiplicarse, por lo que su cultivo “in vitro” requiere de
medios específicos enriquecidos y de un sistema anaeróbico de incubación que
contenga 85% N₂, 10% H₂ y 5-6% de CO₂ para desarrollarse. A nivel de género
las podemos clasificar en bacterias esporuladas y no esporuladas. Las bacterias
anaerobias esporuladas o Clostridium spp. se encuentran ampliamente
distribuidas en el suelo, agua dulce y salada, intestino del hombre y animales.
Las bacterias anaerobias no esporuladas se encuentran principalmente en la
cavidad oral, tracto genital femenino y tracto intestinal de hombre y animales.

Requerimientos de la muestra para búsqueda de anaerobios

 Selección de la muestra:
Las muestras apropiadas para estudio de anaerobios son:
- Material aspirado: pus, abscesos, etc.
- Tejidos: biopsias, muestras quirúrgicas, autopsias, etc.
- Líquidos: sangre, LCR, L. ascítico, L. pleural, etc.
93
 - Heces: SOLO para estudio de toxina y cultivo de C.
difficile, C. botulinum, C. perfringens (este último
en caso de intoxicación alimentaria)

 Condiciones de la muestra:
Las muestras para estudio de bacterias anaeróbicas deben ser
extraídas por personal idóneo, evitando la contaminación con la
flora normal y minimizando la exposición de ésta al oxígeno.

 Método de recolección:
Realizada por personal idóneo (tabla 1)

 Transporte de la muestra
El transporte se realiza utilizando medios de transporte comerciales
tales como: Port a germ (Bio Merieux), Anaport vials (Scott), Bio
Bag (Marian Scientific Corp.)

 Criterios de preservación y almacenamiento de las muestras

Lo más importante es que la muestra llegue rápido al laboratorio,
de lo contrario que sea transportada en condiciones anaeróbicas a
Tº ambiente.

94
 Siembra
Con excepción de la muestra para búsqueda de C. difficile, las
muestras se siembran en:

- Placa de agar sangre anaerobia

MEDIOS SÓLIDOS - Placa de agar sangre anaerobia/kanamicina
- Placa de agar sangre corriente

- Caldo tioglicolato de sodio, con

glucosa, sin indicador; enriquecido
MEDIO LÍQUIDO con vitamina K1-hemina y
regenerado a baño maría, hirviendo
10 min.
 Incubación
Con excepción de las placas de CO₂ que se incuban en jarra con
vela, el resto de las placas y caldo Tioglicolato se incuba en sistema
anaeróbico por un mínimo de 48 hrs. a 35ºC

El sistema anaeróbico debe tener:

- Generador de hidrogeno y dioxido de carbono
(mezcla de gas que contiene 10% de H₂, 85% de N₂ y 5% de CO₂)
- Indicador de anaerobiosis
- Catalizador

95
 MICOLOGÍA

Características generales:

Los hongos presentan una gran variedad de colonias que van desde
colonias similares a las bacterianas, producidas por el crecimiento de levaduras
hasta colonias muy algodonosas capaces de cubrir toda la superficie de cultivo.

Las características morfológicas de la colonia fúngica son en muchos

casos particulares a determinados hongos, así la correcta interpretación del
análisis de la colonia es un paso importante en el proceso de identificación. Sin
embargo, la colonia de muchos hongos filamentosos puede variar
considerablemente entre un medio y otro.

Conocer las colonias de hongos patógenos es importante para

identificarlos en cultivos polimicrobianos, obtenidos frecuentemente en micosis
superficiales y cutáneas

Características macroscópicas:

1. Textura: determinada por la longitud del micelio aéreo y el número de

conidios presente : glabra, pulverulenta, granular, aterciopelada, vellosa,
algodonosa, mucosa, cremosa, cérea membranosa

2. Aspecto: Brillante o húmeda, opaca o seca

3. Topografía o superficie: lisa, rugosa, plana, convexa, umbilicada,

plegada, cerebriforme, verrucosa,

4. Color: blanco, crema, verde, salmón, negro, etc.

5. Pigmento: presente o ausente. Si está presente, definir el color y difusión

en el medio o está restringido a la colonia.

6. Bordes: regulares, irregulares, radiados

Características microscópicas:

Las células fúngicas presentan morfología variable, inclusive dentro de los

organismos de una misma especie y cepa, mostrando gran diversidad en las
estructuras de propagación, dispersión y fructificación, tanto en su forma como
en tamaño.

 Bastoconidio: Organismo unicelular, globoso a elipsoide que se origina por

gemación a partir de una célula madre

96
  Pseudohifa: Secuencia de gemaciones de levaduras alargadas u unidas,
generando estructura de paredes no pasarelas con punto de constricción
entre las células y con gemaciones laterales que nacen a partir del punto de
constricción

 Hifa cenocítica: Estructura tubular de paredes paralelas, dividida en

compartimientos a través de septos parciales completos o perforados. Estas
son hialinas o dematiáceos

 Artroconidio: Células rectangulares de paredes gruesas formadas por

fragmentación de estructuras tubulares de los hongos

 Clamidioconidios: Estructura de resistencia, producida como respuesta a

las condiciones adversas del medio. Son células globosas u ovoides, de
pared doble y gruesa, localizándose a nivel Terminal. Proximal o intercalar

 Cápsula: Estructura de mucopolisacáridos localizada externamente al

blastoconidio. Esta estructura es característica de las levaduras del género
Cryptococcus spp.

Procesamiento del material clínico

1. Recolección de muestras:

El procedimiento de recolección varía según la sospecha clínica, región

afectada y tipo de material clínico procesado. La calidad de la muestra está
directamente relacionada con la sensibilidad del examen

El material clínico:
- Debe ser procesado en el menor tiempo posible
- Debe haber cantidad suficiente de muestra para realizar el o los
exámenes
- Debidamente identificada, con datos generales, sospecha clínica,
enfermedad de base, tratamiento actual, etc.

Resumen de muestras según tejido afectado y recomendación para su

transporte

Secas Pelo, piel y uñas Placa de petri, portaobjetos o papel

Húmedas Mucosas, vesículas y Tubo con suero fisiológico estéril
secreciones
Líquidas Orina, lavado bronquial, LCR, LS Frasco o tubo estéril
Coagulables Sangre y médula ósea Hemocultivo o anticoagulante
Tejido Biopsia y necrosis Tubo con suero fisiológico estéril
LCR: líquido céfaloraquídeo
LS: líquido sinovial

97
Examen microscópico directo

El examen microscópico directo (EMD) es uno de los procedimientos más

baratos, simples y útiles para el diagnóstico de las micosis, otorgando un
resultado rápido al emitirlo como Informe preliminar, que permitirá al clínico
iniciar la terapia antifúngica.

El EMD puede ser realizado en frotis, fijándose la muestra al portaobjetos

y usando a tinción de Gram o Giemsa, para poder observar con la objetiva de
inmersión (100X). Lo más frecuente, es la preparación a fresco con soluciones
clarificadoras con o sin colorantes como KOH 10 o 20% con o sin tinta Quinck-
Parker permanente. Además, se emplea la tinta de China o Nankin o India para
observar la presencia de cápsula en levaduras del género Cryptococcus,
observándose con objetivas de 10 y 40 X de aumento. En muestras de tejido,
además puede solicitarse examen histopatológico donde se verá además la
reacción tisular en preparaciones teñidas con hematoxilina eosina, mientras que
el hongo se evidencia con PAS y principalmente con Gomori-Grocott.

Identificación de levaduras

La identificación de levaduras, se basa principalmente en la sospecha por la

observación macroscópica y la observación directa.
Posteriormente se realiza identificación a través de pruebas tales como:
- Tubo Germinativo
- Crecimiento en cromoagar
- Identificación por pruebas de asimilación
- Identificación por equipos automatizados
- Microcultivo
- Espectro fotometría de masas (Maldi Tof)
- Presencia de pigmentos
- Presencia de capsula (Cryptococcus)

98
Identificación de hongos filamentosos

Se basa en la observación de las características macro y microscópicas

del cultivo.

CULTIVO

Morfología macroscópica Morfología microscópica

(preparados por disgregación, con cinta
adhesiva o microcultivo)

Textura  Aspecto de las

Topografía hifas(hialinas/pigmentadas,
Pigmentación septadas/no)

Bordes  Conidios (forma, tamaño,

origen, tipo de agrupación, etc.)
Veloc. de crecimiento

Procedimiento:

1. Cultivo en placa de petri. Inocular el hongo en estudio en el centro de

una placa de agar Sabouraud glucosado para observación del desarrollo
de la colonia, velocidad de crecimiento, textura, etc.

2. Observación directa. del desarrollo de la colonia y las características

macroscópicas

3. Observación Macroscópica. Se puede apreciar estructura

reproductoras de hongos que se desarrollan en la superficie del vidrio al
observar directamente bajo objetivo menos del microscopio

4. Montajes directos. Usando técnica estéril realizar un preparado por

disgregación mediante 2 asas sacar una porción de la colonia a investigar,
incluyendo una pequeña porción del agar. Colocar en una gota de
lactofenol con o sin colorante, entre lámina y laminilla. Presionar
suavemente y examinar con 40X

5. Montaje con cinta adhesiva transparente (scotch). Este método

mantiene intactas las estructuras fúngicas. El preparado se realiza
tomando un trozo de cinta adhesiva y presionarlo suavemente sobre la
colonia, levantando una porción del micelio aéreo. Montarlo en un
portaobjetos con una gota de lactofenol y examinar con objetivo de 40X

6. Cultivo en lámina o microcultivo. Permite la observación continua del

hongo, la formación de conidios y su disposición sin alteraciones por
traumatismo

99
Características de los principales dermatofitos y otros hongos
filamentosos

Macro y microconidios de Trichophyton

100
101
 Morfología de algunos tipos de macro y microconidios

Localización de los dermatofitos en piel y anexos

PIEL PELO UÑAS

Microsporum ++ ++ raro

Trichophyton + + ++

Epidermophyton ++ - +/raro

(+): presente (-): ausente

102
Características Macroscópicas de Hongos filamentosos y Levaduras en agar Sangre
y Sabouraud.
Asper gillus spp/ Penicillium spp M icr ospor um ca nis

103
 Ca ndida a lbica ns: colonias en agar
Tr icophy ton r ubr um Saboureaud

M icr ospor um gy pseum

Tr icophy ton m enta gr ophy tes

BIBLIOGRAFIA

1. ELMER KONEMAN: “Diagnostico Microbiológico” 6° Ed. Editorial Médica

Panamericana
2. OMS, CDC, USAID: “Manual de laboratorio para la identificación y prueba
de susceptibilidad a los antimicrobianos de patógenos bacterianos de
importancia para la salud pública en el mundo en desarrollo” (2003)
3. MONTIEL F., LAM M.,: Manual de Microbiología Clínica” (2001)
4. GARCÍA P., PEREZ C.,: “ Apuntes de hemocultivos” P.U.C. (2001)
5. SOCHINF: Consenso “ Síndrome diarreico agudo: Recomendaciones
para el diagnóstico microbiológico” (2002)
6. SOCHINF: “Recomendaciones para el diagnóstico microbiológico de la
infección urinaria” (2001)
7. Curso Internacional de Micología Médica “Manual práctico” (2005)
8. Manual de bacteriología Clínica. Costa Rica
9. VALENZUELA M.,: “Apuntes de Bacterias anaerobias” ISP
10. PRATS G., “Microbiología clínica” Ed. Panamericana (2006)
11. MURRAY P. Clinical Microbiology .(2006).
12.Cumitech 2009.

104
ANEXOS

Estudio de Susceptibilidad por Difusión en el Laboratorio

TM Patricia Rojo
El laboratorio de microbiología juega un rol muy importante en la elección de
una terapia adecuada utilizando antimicrobianos, mediante la realización precisa
del estudio de susceptibilidad.
Los métodos disponibles para el estudio de susceptibilidad son cualitativos,
Difusión (Kirby Bauer) y cuantitativos determinando CIM (Concentración
Inhibitoria Mínima)
El laboratorio puede usar el test de difusión, que es uno de los métodos más
utilizados alrededor del mundo. Esta técnica es fácil de realizar y se puede
determinar la susceptibilidad de una serie de antimicrobianos a la vez.
El test de difusión por discos se puede utilizar en un gran número de bacterias,
teniendo las consideraciones necesarios con respecto al medio de cultivo a
elección, la atmosfera y tiempo de incubación. Ademas se deben seguir las
estandarizaciones descritas en el documento M100 del CLSI (Clinical Laboratory
Standards International).
Realizar este test en forma correcta es la única forma de poder interpretar los
resultados.
Test de susceptibilidad por difusión:
 Contar con microorganismos puro y fresco (no más de 48 horas de
incubación)
 Preparación del inóculo.
 Estandarización del inóculo.
 Inoculación de las placas.
 Incubación.
 Medida de las zonas de inhibición.
 Interpretación de resultados.

Además:
 Control de calidad
 Modificaciones para la prueba de difusión para microorganismos
fastidiosos.

Recuerde tomar todas las precauciones para la manipulación de

microorganismos infecciosos.

 Preparación del inóculo

El primer paso en la realización del test de difusión es la preparación del inóculo.

Se utiliza el patrón de turbidez 0,5 de la escala de McFarland, para asegurar
que el número apropiado de bacterias esté en la suspensión.
Se puede obtener el estándar 0,5 de la escala de McFarland de kits comerciales
o preparándolo en el laboratorio; vea documento M2 del CLSI, para detalles de
preparación y control de calidad del estándar. Se debería utilizar el estándar de
McFarland en tubos del mismo diámetro que aquellos que va a utilizar para la
preparación del inóculo.

105
Cuando la turbidez del inóculo concuerda con la turbidez del estándar 0,5 de
McFarland, el inoculo posee aproximadamente 1,5x 10 8 UFC/ml.
El patrón de turbidez deberá mantenerse sellado a temperatura (T° ) ambiente y
en la oscuridad.
Para la preparación del inóculo pueden utilizarse dos métodos:
 Método de crecimiento previo.
 Método de suspensión a partir de una colonia

Independiente del método que se utilice, se recuerda trabajar siempre con el

microorganismo aislado en la placa de agar.
 Método de crecimiento previo:
Este es utilizado cuando hay pocas colonias disponibles o cuando la placa
tiene más de 24 horas.
Para el método de crecimiento previo, seleccione 3 a 5 colonias de la
misma morfología, tocando la parte superior de cada colonia con un asa
en argolla. Transfiera estas colonias a un tubo que contenga 4 a 5 ml de
caldo por ejemplo: caldo Tripticasa Soya. Luego incube el caldo a 35°C.
Continúe incubando hasta que la turbidez del caldo alcance o supere al
estándar de turbidez 0,5 McFarland; lo que usualmente lleva de 2 a 6
horas
 Método de suspensión directa a partir de una colonia:
Este método debe ser utilizado para:
 Organismos con 18 a 24 horas de incubación
 Staphylococcus spp., para detectar cepas con resistencia a
Oxacilina
 Organismos fastidiosos que no crecen en forma predecible en
caldo, como ejemplo: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
spp., Neisseria gonorrhoeae.
Para este método deben seleccionarse las colonias directamente
de la placa de agar y suspenderlas en caldo para llegar a la
turbidez 0,5 McFarland.
Recordar que no es necesario incubar el caldo con este método.

 Estandarización del Inóculo.

El siguiente paso es la estandarización del inóculo, para esto se necesita un tubo

con el estándar de turbidez de 0,5 McFarland y una hoja blanca con líneas
negras gruesas.
Homogenizar bien el tubo con el estándar y el tubo con la suspensión. Después
simplemente tomar ambos tubos juntos y con buena luz, examinar las líneas
negras a través de los tubos y comparar si se ven con la misma intensidad,
entonces la turbidez de la suspensión en estudio es satisfactoria.
Si las líneas negras se observan menos nítidas a través del tubo de la
suspensión, entonces, ésta estaría muy densa, por lo que se debería diluirla
con caldo hasta alcanzar la turbidez de 0,5 McFarland.
Si en cambio las líneas negras se vieran más nítidas a través del tubo con la
suspensión que a través del estándar, entonces no estaría suficientemente
denso, por lo tanto, tendría que reincubar, si está utilizando el método de

106
crecimiento previo, ó agregar más inoculo si es que se utilizó el método de
suspensión directa de colonias.
 Inoculación de las placas

Una vez que se ha estandarizado la suspensión, se debe continuar con la

inoculación de las placas dentro de los siguientes 15 minutos. Utilizar agar
Müeller-Hinton solo o enriquecido que se puede preparar en el laboratorio a partir
de polvo deshidratado o utilizar placas comerciales.
Asegurarse de conservar las placas hechas en bolsas de plástico y refrigeradas
y que debieran estar a T° ambiente al momento de inocularlas.
Si se trabaja con microorganismos no fastidiosos como Escherichia coli ó
Staphylococcus spp utilizar Müeller-Hinton sin suplementar; si en cambio se
trabaja con microorganismos fastidiosos, utilizar Müeller-Hinton con sangre de
cordero al 5% u otros productos de sangre.
Homogenizar el inóculo, introduzca la tórula estéril en el líquido y luego rótelo
por las paredes del tubo, para eliminar el exceso de líquido.
Luego siembre con la tórula en toda la superficie del agar y rote en 65°, vuelva a
sembrar, rote la placa en 65° nuevamente y siembre en toda la superficie por
tercera vez. Esto le dará una mejor distribución al inóculo.

Control de calidad de los medios de cultivos

El pH debe estar controlado por la persona encargada de preparar las placas y
debe tener valores de entre 7,2- 7,4.
La altura del agar debe ser de 4 mm y deben obtenerse resultados satisfactorios
al realizarse las pruebas con cepas estándar (ATCC: American Type Culture
Collection) para el control de calidad.
Antes de inocular las placas, inspeccionar bien la superficie del agar para
asegurarse de que estén secas. Si se observan gotas de agua visibles, se
pueden colocar las placas en una estufa a 35°C, con la tapa apenas abierta
durante 10 a 30 minutos.

 Aplicación de los sensidiscos.

El siguiente paso es la aplicación de los sensidiscos de antimicrobianos, esto se

debe realizar dentro de los siguientes 15 minutos posteriores a la inoculación de
las placas.
Para aplicar los discos en la superficie de la placa agar, puede utilizar:
 Una pinza para sacarlos del tubo y presionar con ella el disco sobre la
superficie del agar
 Utilizar un multidispensador automático y luego presionar con pinza
suavemente los discos para asegurarse que se fijen bien sobre el agar.

Considerar: Para la elección de los sensidiscos de antimicrobianos a trabajar,

utilizar listado con los agentes antimicrobianos que se encuentran descritos en
el CLSI, que además estén incluidos en el laboratorio de su institución.
Utilizar sensidiscos que contengan la concentración de droga específica descrita
en el documento M100 del CLSI. Estas tablas proveen una guía específica de
cuales antimicrobianos probar frente a diversos microorganismos.
Los sensidiscos vienen dispuestos en paquetes herméticos que contienen un
desecante para protegerlos de la humedad, debemos mantener estas

107
condiciones en laboratorio ya que de lo contrario podemos reducir la potencia
antimicrobiana.
Verifique la fecha de vencimiento del producto impresa por el fabricante, y no
utilice discos que hayan vencido.
Mantener los discos en cajas o paquetes sellados y refrigerados, o en un freezer
a -20 ó -40°C, y asegurarse quel freezer no se autodescongele. Sacar los discos
de la refrigeración y llevarlos a T° ambiente, una o dos horas antes de ser
utilizados.
Existen dispensadores automáticos comerciales disponibles en el mercado.
Para evitar que las zonas de inhibición se superpongan no deben dispensarse
más de 5 discos en las placas de 100mm y no más de 12 discos en las placas
grandes de 150mm. Una vez que se coloca el disco sobre el agar inoculado, no
se debe mover, ya que una vez que el antimicrobiano entra en contacto con el
agar comienza a difundir inmediatamente.
Conservar el dispensador con los cartuchos de discos abiertos, junto con un
desecante. Recordar que puede guardar el recipiente con los discos en uso y el
desecante durante al menos una semana en refrigeración a 4 - 8°C
aproximadamente.

 Incubación de la placa

Luego de 15 minutos de colocados los discos, pueden incubarse las placas

invertidas en estufa a 35°C. Si los organismos testeados fueran Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus spp., o Neisseria gonorrhoeae, las placas deben
incubarse en estufa con un 5-7% de CO2. Para mayoría de los organismos, el
tiempo de incubación de las placas es de 18-24 hrs.

 Medición de las zonas de inhibición

Previo a las lecturas de las zonas de inhibición se debe asegurar que el

crecimiento del organismo haya sido el adecuado.
El crecimiento debe ser confluente y las zonas de inhibición deben ser uniformes
y circulares.
Para medir las zonas de inhibición, sostener la placa invertida y a unos pocos
centímetros de altura de una superficie oscura y antirreflejo, utilizando una regla
o vernier (pie de metro) y sosteniéndolo sobre la placa. Se debe leer el diámetro
del halo de inhibición y nunca el radio.
Para la lectura de las placas de Müeller-Hinton, suplementadas con sangre de
cordero, modifique el procedimiento; primero retirar la tapa de la placa, luego
utilizando el reflejo de la luz medir las zonas de inhibición por sobre la superficie
del agar. Es importante tener la precaución cuando se prueba bacterias
hemolíticas, de medir la zona de inhibición del crecimiento y no el halo de
hemólisis.

 Interpretación de resultados

Para interpretar los resultados, utilizar conjuntamente las medidas obtenidas y la

tabla que acompaña el documento M100 CLSI 2018.
Esta tabla se actualiza una vez por año. Las categorías de interpretación son:
Sensible (S), Intermedio (I), Resistente (R). Por ejemplo si el diámetro de la zona

108
de inhibición de Cefalotina es 18mm esta debe interpretarse como sensible. Si
junto al nombre del antibiótico aparece un superíndice, este indica que hay una
nota al pie de página que debe tenerse en cuenta para la interpretación. En el
ejemplo la nota indica que la interpretación obtenida para Cefalotina, puede
extrapolarse a otras Cefalosporinas de 1° Generación, las cuales están incluidas
en la nota.
Cuando el resultado de la interpretación es Susceptible, esto indica que la
infección podría ser tratada con el antibiótico mencionado, en una dosis
adecuada de acuerdo al microorganismo y a la infección.
Cuando es Resistente seguramente el microorganismo no será inhibido por las
dosis habituales del antibiótico.
Cuando el resultado es Intermedio, deben manejarse de otra forma. Algunas
infecciones del tracto urinario pueden ser tratadas exitosamente con antibióticos
Intermedio, si éstos se concentran en orina. Antibióticos Intermedios pueden
llegar a ser útiles si pueden ser administrados en altas dosis.

 Control de calidad

El propósito del control de calidad es monitorear la exactitud y la precisión del

procedimiento, la performance de los reactivos y al microbiólogo.
Para el control de calidad de rutina, utilizar las cepas recomendadas para el
control de calidad del documento M100 del CLSI. Esta tabla contiene los valores
de las zonas de inhibición esperadas para cada cepa patrón con los diferentes
antibióticos.
Cada laboratorio debe llevar un registro con los datos de control de calidad que
incluyan:
 Día del test
 Iniciales de profesional que realizó el test
 Los N° de lote y fecha de vencimiento de los discos y del medio utilizado
 Valores de las zonas de inhibición para cada cepa control con los
antibióticos

Los laboratorios realizan control de calidad una vez por semana.

109
Antimicrobianos

El diagnóstico y tratamiento de un paciente son muy complejos. Desde su llegada

a un recinto hospitalario hasta que este es dado de el alta reciben un numero
importante de prestaciones de muchos profesionales de la salud. Esto a su vez
genera diferentes procesos, siendo el laboratorio de microbiología uno de los
más importantes. Para que los resultados de laboratorio sean útiles en el manejo
del paciente, debemos asegurar la confiabilidad y validez de éstos. Es necesario
entonces, asegurar el cumplimiento adecuado de todos los pasos involucrados,
desde la solicitud del tipo de examen y muestra, su transporte, procesamiento,
la emisión de un resultado, y la adecuada interpretación de éste. De un examen
solicitado y mal orientado, se obtendrá una muestra inadecuada y por tanto una
información errónea. El control de estos procesos es lo que se conoce como
programa de garantía de calidad. Para ello, es necesario contar con Normas que
marquen las pautas y estandaricen las técnicas entre los diferentes laboratorios.
La resistencia bacteriana es un tema de importancia en salud pública. Su
extensión a nivel mundial, el desarrollo de resistencia a nuevos agentes
antimicrobianos, le dan el carácter de problema prioritario. Por ello, el
conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana debe orientar a la
elaboración de esquemas de tratamiento más eficaces y además, la información
proporcionada por la vigilancia debe servir como herramienta para la elaboración
de un programa de uso racional de antibióticos.
Considerando estos aspectos, se desprende que la vigilancia de la resistencia
antimicrobiana es necesaria, como también es fundamental asegurar la calidad
de los resultados del laboratorio de microbiología, siendo indispensable por
tanto, estandarizar cada uno de los procedimientos, lo cual involucra desarrollar
normas técnicas y manuales, capacitar al personal de los laboratorios y
supervisar y participar en un programa de control de calidad externo.

110
ANTIMICROBIANOS (Sensidiscos) A PROBAR DE LAS ESPECIES BACTERIANAS MAS
FRECUENTES

Staphylococcus spp

SENSIDISCOS RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

Cefoxitin 30 Ug (1) Sensible  22 (S. aureus) y S. lugdunensis (2)
Sensible  25 (SCoN)
Gentamicina ≤12 13-14 >15
Eritromicina (3) (4) ≤13 14-22  23
Clindamicina (3) (4) ≤14 15-20  21
Sulfatrimetoprim ≤10 11-15  16
Rifampicina (6) ≤16 17-19  20
Tetraciclina ≤14 15-18  19
Vancomicina (7) PROBAR SOLO POR CIM
Ciprofloxacino ≤15 16-20  21
Nitrofurantoína (6) ≤14 15-16  17
Novobiocina (5) - - >16
Linezolid (7) < 20 - > 21
Tigeciclina E TEST

1. Informar Cefoxitin como cloxacilina.

2. S lugdunensis informar con lectura de halos o CIM igual que S. aureus
3. No informar en muestras de orina.
4. Los discos de Clindamicina y Eritromicina deben ser puestos adyacentes para
interpretar el D Test, separados por 26 mm de borde a borde. Cuando el D test es
positivo informar como resistente a Clindamicina y Eritromicina.
5. La Novobiocina no se informa. Solo se usa para diagnóstico diferencial entre
Staphylococcus saprophyticus (resistente) y ScoN (sensible).
6. Solo informar en muestras de orina
7. En caso de detectar resistencia en cualquier cepa de Staphylococcus resistente a
Vancomicina o Linezolid se debe confirmar la identificación y la susceptibilidad. De
mantenerse R, debe enviarse la cepa al ISP

111
Otros Staphylococcus spp

112
Enterococcus spp

SENSIDISCOS RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

Ampicilina (2) (3) ≤16 -  17

Vancomicina ≤14 15-16  17

Teicoplanina ≤10 11-13  14

Gentamicina 120 ≤6 7-9  10

Ciprofloxacino (1) ≤15 16-20  21

Nitrofurantoína (1) ≤14 15-16  17

Linezolid (4) ≤20 21-22  23

1. Sólo informar en muestras de orina.
2. La susceptibilidad a Ampicilina predice a amoxicilina, amoxicilina/clavulánico,
ampicilina/sulbactam, piperacilina/tazobactam en enterococos no productores de beta
lactamasa.
3. Si se trata de hemocultivos o LCR y la cepa es sensible a Ampicilina, SIEMPRE hacer
prueba de beta lactamasa (con disco de cefinasa). Si la cepa es Beta lactamasa (+)
informar como resistente a Ampicilina. (independiente del resultado del sensidisco).
4. Informar en todos los VANCOMICINA RESISTENTE. Si da LINEZOLID RESISTENTE
enviar al ISP.

Streptococcus spp B hemolíticos

INFORMAR RESISTENTE
SENSIDISCOS RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE
Penicilina (1) (2) - -  24
Eritromicina (3) ≤15 16-20  21
Clindamicina (3) ≤15 16-18  19

1. Penicilina puede ser probada por disco en cepas de Streptococcus B hemolítico.

2. No se han descrito cepas de Streptococcus pyogenes o S. agalactiae resistentes a
Penicilina. Si se observa un halo de Penicilina < 24 mm, repetir por E-test y reidentificar.
En caso de confirmarse resistencia, enviar cepa a centro de referencia ISP

E-test SENSIBLE(mcg/mL)
Penicilina ≤ 0.12

3. Hacer D-Test igual que Staphylococcus,

113
Streptococcus grupo viridans

INFORMAR RESISTENTE
SENSIDISCOS RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE
Penicilina (1) Solo por Etest
Eritromicina (2) (3) ≤15 16-20  21
Clindamicina (2)(3) ≤15 16-18  19
Cefotaxima (4) ≤25 26-27 28

E-test SENSIBLE INTERMEDIO RESISTENTE

(mcg/mL) (mcg/mL) (mcg/mL)

Penicilina ≤ 0.12 0.25-2 > 4

Cefotaxima ≤ 1 2 > 4

1. Penicilina solo debe ser probada por E-Test.

2. No informar en muestras de orina
3. Hacer D-Test igual que Staphylococcus, pero con una distancia entre bordes de
sensidiscos de 12 mm.
4. Si Cefotaxima R confirmar por E-test

Streptococcus pneumoniae

INFORMAR RESISTENTE
SENSIDISCOS RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE
Oxacilina (1) (2) (4) ≤19 -  20
Eritromicina (3) (6) ≤15 16-20  21
Sulfatrimetoprim (6) ≤15 16-18  19
Levofloxacino (6) ≤13 14-16  17
Clindamicina (3) (6) ≤15 16-18  19
Cloranfenicol (3) (6) ≤20 -  21
Vancomicina (5) - - >17

1. Oxacilina se informa como Penicilina.

2. Cuando la cepa tenga un halo de oxacilina menor o igual a 19, no informar por disco
y hacer E- Test de penicilina y cefotaxima.
3. No informar en muestras de orina
4. En cepas aisladas de líquidos estériles y hemocultivos, en vez de probar la oxacilina
con disco, hacer E-test. Los puntos de corte son los siguientes:

114
E-TEST SENSIBLE SENSIBILIDAD RESISTENTE COMENTARIOS
(MCG/ML) INTERMEDIA (MCG/ML)
(MCG/ML)

En cepas de otras
Penicilina < 2 4 > 8
localizaciones
Penicilina < 0.06 - > 0.12 En cepas de LCR
En cepas de otras
Cefotaxima < 1 2 > 4
localizaciones
Cefotaxima < 0.5 1 > 2 En cepas de LCR
Meropenem < 0.25 0.5 > 1 En cepas de LCR

5. Informar sólo en líquidos estériles y hemocultivos.

6. No informar en LCR. Solo informar Penicilina, si Penicilina R informar Cefotaxima,
vancomicina y meropenem

Interpretación de Optoquina

MARCA HALO (MM) INTERPRETACIÓN

BBL >14 Sensible
Difco >15 Sensible
Oxoid >16 Sensible

115
Enterobacterias pacientes hospitalizados (no aplica a Salmonella y
Shigella)
SENSIDISCOS RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLES
Ampi/sulbactam < 19 20 - 22 > 23
Cefotaxima (1) < 22 23 – 25 > 26
Imipenem (2) (3) < 19 20 – 22 > 23
Meropenem (2) (3) < 19 20 – 22 > 23
Ertapenem (2) (3) < 18 19 – 21 > 22
Cotrimoxazol < 10 11 – 15 > 16
Gentamicina < 12 13 – 14 > 15
Amikacina < 14 15 – 16 > 17
Ciprofloxacino < 15 16 - 20 > 21
Tigeciclina (4) (5) < 14 15 - 18 > 19
Cefazolina < 19 20 - 22 > 23
Piperacilina/Tazobactam < 17 18 - 20 > 21
Nitrofurantoina (6) < 14 15 - 16 >17
Colistin (4) (5) (7) SIN PUNTOS DE CORTE PARA DISCOS
INFORMAR PRESENCIA DE BLEE

R I S
CEFTOLOZANO
TAZOBACTAM (10) C/T < 17 18-20 >21
CEFTAZIDIMA
AVIBACTAM (10) CZA < 20 - >21

1. Informar RESISTENTE todas las cefalosporinas si BLEE POSITIVO

2. Informar los carbapenémicos (S/I/R). Si carbapenémicos RESISTENTE o
INTERMEDIO enviar al ISP
3. Si alguno carbapenemico es R o I hacer:
a. Si Test Carba NP (+)
i. Informar carbapenémicos con CIM e interpretación siempre
Resistente . Agregar nota “Cepa productora de Carbapenemasa”
ii. Aviso teléfónico inmediato a Comité de IAAS y enviar mail con
datos del paciente y de la cepa al Comité de IAAS
b. Si Test Carba NP(-)
i. Informar carbapenémicos con interpretación (S/I/R) y poner nota
“Screening negativo para producción de carbapenemasas”
4. Informar Colistin y Tigeciclina siempre si Imipenem o Meropenem
RESISTENTE o INTERMEDIO o bien las cepa presenta Carba NP positivo. En
el caso de Colistin no existen puntos de corte para enterobacterias por lo
que se debe informar solo la CIM sin interpretación.
5. Si RESISTENTE repetir e informar por E-Test excepto en :
a. Proteus, Providencia y Morganella SIEMPRE ES RESISTENTE A
TIGECICLINA
b. Proteus, Providencia, Serratia son INTRINSECAMENTE RESISTENTES A
COLISTIN
6. Informar sólo en muestras de ORINA
.

116
Enterobacterias pacientes ambulatorios

En pacientes ambulatorios el antibiograma se efectúa en su totalidad por difusión

SENSIDISCOS RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE
Ampicilina ≤13 14 - 16 17
Cefalotina (1) ≤14 15 – 18 18
Cefuroximo ≤ 14 15 - 22 23
Cefpodoxima (2)(3) ≤ 17 18 - 20 > 21
Ciprofloxacino ≤ 15 16 - 20 21
Sulfatrimetoprim ≤ 10 11 – 15 16
Gentamicina ≤ 12 13 – 14 15
Nitrofurantoína (1) ≤ 14 15 - 16 17

FOSFOMICINA (5) ≤ 12 13 - 15 >16

1. Solo informar en ORINA.
2. No informar en Morganella spp (no hay punto de corte para este agente).
3. Si CEFPODOXIMA RESISTENTE, hacer esquema de segunda línea que
incluye BLEE ya que punto de corte Resistente coincide con límite para
el tamizaje. En caso de no disponer de Cefpodoximo, reemplazar por
Cefotaxima y evaluar BLEE según puntos de sospecha BLEE .

Antibiograma adicional

SENSIDISCOS SIGLA RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

Cefotaxima CTX < 22 23 – 25 > 26
Ertapenem (4) ERT < 18 19 – 21 > 22
Piperacilina/Tazobactam TAZ < 17 18 - 20 > 21
Amikacina AK < 14 15 – 16 > 17
ESTUDIO DE BLEE
4. Si ERTAPENEM Intermedio o Resistente seguir estudio como
enterobacteria hospitalizado.
5. Solo informar en E. coli aislada de urocultivos

117
Pseudomonas aeruginosa

SENSIDISCOS R I S
Amikacina <14 15-16 > 17
Gentamicina <12 13-14 >15
Ceftazidima <14 15-17 >18
Piperacilina/Tazobactam <14 15-20 >21
Meropenem (3) <15 16-18 19
Imipenem (3) <15 16-18 >19
Ciprofloxacino <15 16-20 >21

INFORMAR POR ELUCION SOLO CIM

SIGLA CIM (ug/ml)
ANTIBIOTICO R (>) I S (<)
COLISTÍN (2) CL 4 - 2

1. En pacientes hospitalizados informar siempre. En pacientes ambulatorios

informar solo si carbapenémicos RESISTENTES
2. En caso de cepas Resistentes a colistin hacer E-Test de colistin P aeruginosa
CIM >8=Resistente 4=Intermedio <2= Sensible.
3. En las cepas con algún carbapenémico Intermedio o Resistente hacer TEST
CARBA NP
a. Si Carba NP (+) Poner Nota que indique que la cepa es sospechosa
productora de carbapenemasa. Se informa carbapenemicos resistente
independiente de la interpretación y debe agregarse la CIM
a. Si Carba NP (-)no hacer nada especial.

118
Acinetobacter spp

SENSIDISCOS R I S
Amikacina <14 15-16 > 17
Gentamicina <12 13-14 >15
Cefoperazona-Sulbactam (1) <15 16-20 >21
Ampicilina-Sulbactam <11 12-14 >15
Ceftazidima <14 15-17 >18
Imipenem (4) <13 14-15 >16
Meropenem (4) <13 14-15 16
Ciprofloxacino <15 16-20 >21
Tigeciclina (2) (3) SOLO POR CIM
Colistín (2) (3) SOLO POR CIM
2. No existen halos CLSI para este antimicrobiano.
3. Informar solo si algún carbapenémico RESISTENTE
4. En caso de RESISTENTE probar por E-Test:
COLISTIN < 2 = Sensible > 4 = Resistente
TIGECICLINA < 2 = Sensible, 4 = Intermedio, > 8 = Resistente

5. En las cepas con algún carbapenémico Intermedio o Resistente hacer TEST

CARBA NP
a. Si Carba NP (+) Poner Nota que indique que la cepa es sospechosa
productora de carbapenemasa. Se informa carbapenemicos resistente
independiente de la interpretación y debe agregarse la CIM
b. Si Carba NP (-) no hacer nada especial

119
 Burkholderia cepacia y Stenotrophomonas maltophilia

INFORMAR RESISTENTE
SENSIDISCOS RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE
Ceftazidima (1) <17 18-20 >21
Meropenem (1) <15 16-19 20
Levofloxacino (2) <13 14-16 17
Trimetoprim-sulfa (1)(2) <10 11-15 16
1. Antimicrobianos a informar en B. cepacia
2. Antimicrobianos a informar en S. maltophilia

Salmonella spp y Shigella spp

INFORMAR RESISTENTE
SENSIDISCOS RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE
Ampicilina ≤13 14 - 16 17
Sulfatrimetoprim < 10 11 – 15 > 16
Cloranfenicol (1) ≤ 12 13-17  18
Ciprofloxacino (copro) < 15 16 - 20 > 21
Ciprofloxacino (extra int.) < 20 19 - 30 > 31
Cefotaxima (1) < 22 23 – 25 > 26
Acido Nalidíxico (2) ≤ 13 14-18  19
1. No informar cefotaxima en coprocultivos. Cefotaxima y CAF solo debe
informarse en Hemocultivos y líquidos estériles.
2. Ácido Nalidíxico solo testear en orinas y salmonelosis extrainstestinal

Vibrio spp.
El estudio de susceptibilidad de realiza en agar Muller Hinton, lo importante es que el inoculo
se prepara y ajusta siempre con Suero fisiológico, no usar caldo Muller.

SENSIDISCO RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

Ampicilina ≤13 14 - 16  17
Cotrimoxazol ≤10 11 - 15  16
Cloramfenicol ≤12 13 - 17  18
Ciprofloxacino ≤15 14 - 20  21
Cefotaxima (1) ≤22 23 - 25  26
1. Solo probar en casos de Vibrio extraintestinales

Aeromonas spp y Plesiomonas shigelloides

SENSIDISCO RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

Ampi/sulbactam ≤11 12 - 14  15
Cotrimoxazol ≤10 11 - 15  16
Ciprofloxacino ≤15 14 - 20  21
Cefotaxima ≤22 23 - 25  26

120
Haemophilus influenzae y parainfluenzae (En agar HTM)

SENSIDISCO RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

Ampicilina (1) (2) ≤18 19-21  22
Amoxi/clanv ≤19  20
Sulfatrimetoprim ≤10 11-15  16
Cloranfenicol ≤25 26-28  29
Cefuroximo (2) ≤16 17-19  20
Cefotaxima (1) (3) - -  26
Levofloxacino (3) - - >17
Meropenem (3) (4) - -  20
Informar Cefotaxima, ampicilina, cloramfenicol sólo en Hemocultivos y Líquidos estériles.
Meropenem informar solo en caso de resistencia a otros antibióticos.

1. La SENSIBILIDAD a ampicilina predice SENSIBILIDAD a amoxicilina

2. En cepas Ampicilina Resistente, realizar prueba de CEFINASA, si cefinasa (-) informar
Cefuroximo resistente aunque se lea sensible
3. Ampi R  Cefinasa (+)  Cefuroximo R o S (según se lea)
4. Ampi R  Cefinasa (-)  Cefuroximo R (aunque se lea S, es cepa rara)
5. No se han reportado cepas resistentes a Cefalosporinas de 3ª generación,
levofloxacino ni meropenem, si se detecta resistencia confirmar identificación y repetir
susceptibilidad
6. Solo probar en Líquido cefaloraquídeo

Neisseria gonorrhoeae (Agar GC)

SENSIDISCO RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

Penicilina (1) ≤26 27-46  47
Tetraciclina ≤30 31 - 37  38
Ciprofloxacino (2) ≤21 28 - 40  41
Cefotaxima - -  31

1. Informar CIM y Beta-lactamasa (Cefinasa)

2. Confirmar con CIM (E-test) en caso de I o R

Moraxella catarrhalis

En general la susceptibilidad de Moraxella catarrhalis es predecible. Casi siempre productora

de betalactamasas por lo que es resistente a penicilinas y aminopenicilinas. No se ha descrito
resistencia a cefalosporinas de tercera generación, macrolidos ni quinolonas. El antibiograma
se realiza al en agar MH. No se puede realizar por Vitek

SENSIDISCO SIGLA RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

Amoxi/cla AMC ≤23 -  24
Cotrimoxazol STX ≤10 11 - 12  13

121
Corynebacterium spp y especies relacionadas (Arcanobacterium, Brevibacterium,
Cellulomonas, Dermabacter, Leifsonia, Microbacterium, Oersovia, Rothia y Turicella .)

El método de referencia es dilución en caldo suplementado con sangre. Aquí que describen
los puntos de corte para ser interpretados por E test en placas de agar MH sangre.

E test SIGLA RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

(ug/mL) (ug/mL) (ug/mL)
Cefotaxima CTX >4 2 <1
Vancomicina VA NO HAY RESISTENTES <2

Listeria monocytogenes

No se ha descrito resistencia de este agente a penicilina o ampicilina, por lo que la

susceptibilidad a Penicilina se prueba solo con fines de vigilancia o en casos de falla de
tratamiento conocidas.

122
 Detección mecanismos de resistencia

Test-D

El D-test se realiza en agar Müeller- Hinton en el caso de Staphylococcus y en

Müeller -Hinton con sangre de cordero en el caso de Streptococcus.
En ambos podemos detectar fenotipo MLSb (Macrólidos, Lincosamidas, y
Streptograminas del tipo b).
Para esta prueba debemos utilizar un disco de Eritromicina (15 ug) y
Clindamicina (2 ug), colocarlos a una distancia de 15 - 26mm en Staphylococcus
y 12 mm para Streptococcus
Se observa un D-test positivo al observar un halo de clindamicina distorsionado
(achatado) que detecta la presencia del gen erm
Fenotipo MLSb(c), MLSb (i). Modificación del sitio de unión RNAr 23S por
metilasa codificada por el gen ermB, que puede ser constitutivo (c) o inducible
(i).
Fenotipo M: Expulsión activa del ATB codificada por el gen mefA actúa sobre
macrólidos de 14 y 15C pero no en los de 16C ni lincosamidas ni
streptograminas.

Müeller – Hinton Sólo (Staphylococcus) y Müeller-Hinton sangre Cordero

(Streptococcus)

MRSA Detección

Detección de la Meticilino Resistencia en Staphylococcus aureus.

 El gen mecA codifica la proteína de unión a las penicilinas ( Síntesis de

peptidoglican- trasnpeptidasas) PBP2a →R a todos los β-lactámicos

123
  β-lactámicos incluyendo cefalosporinas carbapenémicos y
monobactámicos
 Utilización de Cefoxitin 30ug es más sensible para la determinación de la
resistencia en MRS
 Puntos de corte para S.aureus y S.ludgunensis es el mismo ≥22 S y
≤21R
 Punto de corte para Staphylococcus coagulasa (-) es ≥25 S y ≤24 R
El reporte de oxacilina está basado en el resultado de Cefoxitina

VISA GISA

Detección de Resistencia Intermedia a Vancomicina (Glicopéptido) en

Staphylococcus aureus.
 Se han descrito 2 tipos de expresión de resistencia a glicopéptidos en
Staphylococcus aureus

 Homogénea CIM a Vanco: 8-16 ug/ml I

 Heterogénea CIM a Vanco: 1-4 ug/ml S

Por esta razón a partir del año 2009 según CLSI ya no existen
puntos de corte para vancomicina por difusión. Sólo existen para
CIM (concentración inhibitoria mínima)

S.aureus: ≤ 2 S 4-8 I ≥16 R

S.Coag. (-): ≤ 4 S 8-16 I ≥ 32 R

 Por último en USA se han descrito cepas con Resistencia de alto nivel a
glicopéptidos por adquisición del gen vanA posiblemente provenientes
de cepas de Enterococcus Resistentes a Vancomicina

Fenotipo VAN

 Realizar concentración inhibitoria mínima (CIM), a vancomicina y

teicoplanina por técnica de macrodilución en agar. (ug/ml).

 En el laboratorio de rutina se realiza por técnica de E-test en agar Müeller-

Hinton.

 Van A : Vanco 64 - >1024 R ; Tei 16 -512 R

 Van B : Vanco 4 - 1024 S, I, R ; Tei ≤ 0.5 S

 Van C : Vanco 2 - 32 S, I, R ; Tei ≤ 0.5 S

 Van D : Vanco 128 R ; Tei 4 S

 Van E : Vanco 16 I ; Tei 0,5 S

124
 Test BLEE

El test BLEE se realiza en enterobacterias (Ejemplos E.coli, Klebsiella

pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis) se sospecha cuando
observamos en el estudio de susceptibilidad que el punto de corte para las
cefalosporinas de 3° generación es ≤22 mm para Ceftazidima (CAZ) y ≤27 mm
para cefotaxima (CTX).
En el test BLEE se utiliza sensidiscos de una cefalosporina de 3° Generación
(cefotaxima CTX, ceftazidima CAZ) y un sensidisco de la cefalosporina más un
inhibidor de BLEE, como es Ácido clavulánico.

Una diferencia de 5 ó más milímetros es positivo. Interpretación de

resultados

1 - Cuando no se confirma la presencia de BLEE, utilizar los puntos de

corte generales para enterobacterias, independientemente del género
aislado.
2 - Cuando se confirme fenotípicamente la presencia de BLEE, deberán
informarse resistentes a todas las penicilinas, cefalosporinas y
aztreonam.
3 - Las combinaciones de beta-lactámicos con IBL* pueden ser activas
in vitro, pero su eficacia clínica es discutida y depende de la localización
de la infección, particularmente cuando el microorganismo se encuentra
en altas concentraciones.

*IBL:Inhibidores de beta-lactámicos

125
 Test Carbapenemasas

Test de Hodge modificado

TM Tamara González

Se realiza como screening para detectar mecanismo de resistencia frente a carbapenémicos,

debido a la presencia de enzimas (carbapenemasas). Se realiza en aislados no sensible a uno o
más carbapenémicos.

Este test se basa en la capacidad de la enzima para hidrolizar el carbapenémico, lo que permite el
desarrollo de una cepa sensible a ese antimicrobiano debido a su inactivación.

 Preparar una suspensión 0,5 Mac Farland de la cepa E. coli ATCC 25922
 Diluir la suspensión 1/10 en solución salina o agua destilada
 Inocular una placa de agar Mueller-Hinton según técnica de difusión
 Dejar secar de 3 a 10 minutos
 En el centro de la placa colocar un disco de meropenem o ertapenem (10 µg)
 Realizar una estría desde el borde del disco (sin tocarlo) hacia el borde de la placa (cepa
sospechosa de producir carbapenemasas, control positivo K. pneumoniae ATCC BAA-1705
y control negativo K. pneumoniae ATCC BAA-1706)
 Incubar en aerobiosis a 35±2ºC por 16 a 24 horas.

Interpretación de los resultados:

Crecimiento de E. coli ATCC
25922. Las
Cepa en estudio carbapenemasas
Test de Hodge producidas por
negativo K.pneumoniae ATCC BAA-
1705 inactiva el
carbapenémico que difundió
al medio. Por lo tanto, ya no
hay suficiente ertapenem
aquí para inhibir E. coli
ATCC 25922 y se observa
una hendidura
Cepa de E. coli
ATCC 25922

Inhibición de
cepa de E. coli
ATCC 25922 por K. pneumoniae ATCC
ertapenem BAA-1706. No hay
crecimiento de E. coli ATCC
25922 al interior del halo de
inhibición
Referencia:

Clinical and Laboratory Standards Institute.2014. M100-S4:. Performance Standards for

Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Supplement

126
Test de hodge con triton X-100
XA-48-like)
TRITON HODGE TEST (THT) - Detección de carbapenemasas mediante test de Hodge
mejorado
El siguiente método requiere de TritonX-100 (detergente de origen comercial) y placa de Mueller-
Hinton agar (MHA, 4 mm de espesor).

Procedimiento (método de inundación o “flooding”)

1. Elimine la humedad superficial de la placa de MHA por evaporación en incubador a 35º (tiempo
requerido aprox. < 15´).
2. Agregue 50 microlitros de TritonX-100 en la superficie de la placa de MHA. Rápidamente
distribuya mediante un hisopo el TritonX-100 sobre toda la superficie de la placa hasta su
absorción completa (generalmente requiere entre 4 -6 hisopados en todas las direcciones). Nota
1: las placas de MHA suplementadas con TritonX-100 podrán ser preparadas con anterioridad al
ensayo y almacenadas a 4ºC por lo menos 2 meses hasta su uso. Nota 2: alternativamente al
método de inundación, el TritonX-100 puede ser directamente agregado durante la preparación
del MH, previo a la esterilización por calor (concentración final de TritonX-100: 0.1 % vol/vol)
3. Elimine nuevamente la humedad superficial de la placa por evaporación a 35º (tiempo
requerido aprox. < 15´).
4. Realice una suspensión de turbidez equivalente al 0.5 Mac Farland de la cepa indicadora
(Escherichia coli ATCC® 25922)
5. Mediante un hisopo extienda el inóculo de la cepa indicadora sobre la superficie de la placa,
siguiendo las recomendaciones del CLSI para el método del 6. Coloque en el centro de la placa
un disco de carbapenen. El carbapenem indicado varía según la especie bacteriana de la cepa
incógnita:
• Klebsiella y Enterobacter spp: meropenem
• Enterobacterias distintas de Klebsiella y Enterobacter spp: ertapenem
• BNNF: podrá utilizarse indistintamente ertapenem o meropenem.
7. Con un ansa estéril tome de 3 a 5 colonias de un cultivo fresco de la muestra objeto de estudio
y realice una estría desde el borde del disco hacia la periferia de la placa (la longitud puede ser de
20-25mm aprox.). Podrán ensayarse simultáneamente hasta 4 cepas incógnitas por placa.
8. Incube la placa en aerobiosis a 35ºC durante 16-18 horas.
9. Interpretación:
THT positivo: se observara un sobrecrecimiento de la cepa indicadora hacia el disco de
carbapenem en la intersección de la estría con la zona de inhibición.
• THT negativo: se observara la zona de inhibición inalterada en su intersección con la estría de
la cepa incógnita.
• THT indeterminado: se observara una zona clara a lo largo de la estría de la cepa incógnita. Esto
se debe a que algunas cepas pueden producir sustancias que inhiben el crecimiento de E. coli
ATCC® 25922.

127
Interpretación

Bibliografía:
1. Pasteran F, Gonzalez LJ, Albornoz E, Bahr G, Vila AJ, Corso A. Triton Hodge Test:
Improved protocol for Modified Hodge Test for enhanced detection of NDM and
other carbapenemase producers. J. Clin. Microbiol. 2016 Mar;54(3):640-9.

128
Test Carba NP (Nordman-Poirel) para la detección de Carbapenemasas

TM Juan Carlos Román

Introducción:

Las enterobacterias resistentes a los Carbapenemicos son una amenaza mayor tanto en
países desarrollados y en desarrollo, debido a su diseminación a través del mundo.
Es considerado un problema de salud pública debido a su impacto en términos de
morbilidad, mortalidad, costos y cambios epidemiológicos.
La detección temprana e intervención (como las medidas en el control de infecciones) en
un hospital o región son muy importantes a fin de controlar la propagación de la infección
y resultado de una bacteria endémica en una región especifica.
El primer aislamiento de enterobacterias (K.pneumoniae) resistente a Carbapenemicos
debido a una cepa KPC, fue reportado en Chile en Abril 2012.

Protocolo detección de Carbapenemasas a partir de cepa pura.

El test Carba NP se utiliza en enterobacterias con susceptibilidad disminuida a algún

Carbapenémico (Imipenem, Meropenem, Ertapenem).
1.- Incubar bacteria en estudio overnight en placa Agar Sangre, Agar Mueller- Hinton,
Agar Tripticasa soya o la mayoría de los medios de screening para Carbapenemasas.
Nunca usar a partir de Mc Conkey.
2.- Agregar 100 ul de buffer B-PER II a 2 tubos eppendorf de 1,5 ml.
3.- Marcar un tubo con Imipenem y el otro sin Imipenem.
4.- Agregar y resuspender una cantidad de bacterias a cada tubo, equivalente a 3-5
colonias aisladas o 1/4 -1/3 de un asa calibrada de 10 ul. También podría usarse colonias
recuperadas directamente de la placa de antibiograma, desde el interior del halo de
inhibición del Carbapenemico.
5.- Chequear que las bacterias han sido correctamente resuspendidas. Si es necesario se
debe mezclar con pipeta.
6.- Agregar 100 ul de Solución A (Rojo phenol) en el primer tubo y 100 ul de Solución
A (Rojo Phenol) + Imipenem 6mg/ml en el segundo tubo.
7.- Mezclar con vortex.
8.- Incubar a 37 °C por un máximo de 2 Horas. (Se debe chequear cambios cada 30
minutos). La lectura se realiza ópticamente por cambio de color.

Interpretación:

Cambio de color (Naranja o Amarillo): POSITIVO. Producción de

Carbapenemasas.
Sin cambio de color: NEGATIVO. No hay producción de Carbapenemasas.

129
 Tubo Sin antibiotico Tubo Con Imipenem
Carbapenemasa Negativo Rojo Rojo
Carbapenemasa Positivo Rojo Naranja/ Amarillo
No interpretable Amarillo Amarillo

Tiempo de obtención de resultados:

1. Productor de KPC: 2-30 min.

2. Productor de Metallo betalactamasas (NDM, IMP, VIM): 15 min a 1 Hora.
3. Productor de Oxa 48: 20 min a 1 Hora.

Control (+) Control (-)

Preparación de reactivos.

1. - Preparación y conservación de solución A.

 Preparar una solución concentrada de Rojo phenol 0.5% w/v (0,5 gr de polvo en
100 ml de Agua).
 Mezclar 2 ml de la solución concentrada de Rojo phenol (voltear fuertemente antes
de pipetear para resuspender correctamente la suspensión) en 16.6 ml de agua
destilada. Debe ser de color amarillo (pH +/- 3.2)
 Ajustar pH a 7.8 agregando NaOH (1N) gota a gota. A Ph 7.8 debe ser rojo.
 Agregar 180 ul de ZnSO4 10 mM para obtener una concentración final de 0.1
mM.

130
  Solución diluida de Rojo phenol es estable a temperatura ambiente por 1
semana (no más de 2 semanas) y puede conservarse por varios meses a
-20 ° C.

2.- Solución A + Imipenem debe estar preparado en el momento.

 Imipenem puede ser pesado y puesto previamente en un tubo Eppendorf.

Puede mantenerse hasta 2 semanas a 4ºC sin la solución A.

INSTRUCTIVO PREPARACIÓN DE REACTIVOS TEST CARBA NP DIRECTO.

Preparación y conservación de solución A

 Preparar solución concentrada de rojo fenol al 0.5% p/v (0.5 grs de
polvo de rojo fenol en 100 ml de agua destilada).
 Mezclar 2 ml de solución concentrada de rojo fenol (agitar bien antes de
usar) en
16.6 ml de agua destilada, esta debe ponerse de un color amarillo
anaranjado (corresponde a un pH aproximado de +/- 3.0).
 Agregar 180 ul de ZnSO4 10 mM a la solución de rojo fenol pH 7.8 para
obtener una concentración de ZnSO4 0.1 mM.
 Agregar en la solución anterior, 100 microlitros de Triton X-100
(concentración final 0.1% vol/vol). Nota: la formación de espuma no
afecta a la solución ni el desarrollo posterior del test.
 Ajustar a pH 7.8 agregando NaOH 1 N gota a gota hasta alcanzar el
pH requerido y la solución debe quedar de color roja.
 La solución diluida de rojo fenol es estable a temperatura ambiente por una
semana y un mes si se conserva a 4º C.

Preparación y conservación de solución B

 Pesar 6 mg de imipenem en polvo (Tienam®, el cual tiene Imipenem y

Cilastatina 1:1, por lo cual se debe pesar 6 mg para poder tener 3 mg de
imipenem) y agregarlo a un tubo eppendorf de 1.5 ml estéril.
 Agregar 1 ml de solución A a este tubo con imipenem y vortear hasta disolver
el antibiótico. (esta corresponde a la solución B).
 Esta solución B debe ser preparado en el momento de realizar el test y alcanza
para realizar 8 determinaciones mas el control positivo y negativo.
 El imipenem en polvo puede ser alicuotado previamente en los tubos
Eppendorf y mantenerse hasta 2 semanas a 4º C sin la solución A.

TEST CARBA NP DIRECTO.

El test de Carba NP Directo permite determinar la actividad Carbapenemasa en
enterobacterias y Bacilos no fermentadores con susceptibilidad disminuida y
resistencia según los puntos de corte de carbapenémicos que se describen en la
sección correspondiente.

131
PROCEDIMIENTO
o Se requiere cepa fresca (incubación a 37º 18 a 24 hrs.) en placa de
agar sangre o muller Hinton (nunca Mac Conkey y cromo agares).
o Cada Test contempla 2 tubos Eppendorf: Tubo A (sin imipenem) y
tubo B (con imipenem), se debe incluir cada vez que se realiza el test
un control negativo (E. coli ATCC 25922) y un control positivo (K.
pneumoniae ATCC BAA1705).
o Al tubo A agregar 100 ul de Solución A (Rojo fenol + zinc + Triton X-100).
o Al tubo B agregar 100 ul de solución B (solución A + imipenem)
o A cada tubo eppendorf (A y B) agregar una asada (1 a 2 colonias) de la
cepa en estudio, resuspender y vortear por 5 seg.

o Incube a 37º C y realizar inspecciones visuales 15, 30, 45, 60 y 120 minutos.

Interprete el resultado según tabla a continuación.

Color tubo control Color tubo reacción Interpretación
(Sin Imipenem) (Con imipenem)
Rojo Naranja Carbapenemasa Positivo
Rojo Amarillo Carbapenemasa Positivo
Naranja Amarillo Carbapenemasa Positivo
Rojo Rojo Carbapenemasa Negativo
Naranja Naranja Carbapenemasa Negativo
Amarillo Rojo o Naranja o amarillo Test Invalido
El tiempo de reacción usualmente requerido es distinto:
• KPC: 2 a 30 minutos
• MBLs (NDM, VIM, IMP, SPM): 30 min a 1 hora
• OXAs: 1 a 2 horas

Método modificado de Inactivación de Carbapenemes (mCIM – modified

Carbapenem Inactivation Method)
Reactivos y Materiales:
- Caldo Tripticasa soya (TSB) en alícuotas de 2ml.
- Discos de meropenem (MER-10µg)
- Ansas de 1 y 10µl
- Caldo nutritivo (TSB, MH, etc) o solución fisiológica en alícuotas de 3-5ml.
- Placas con agar MH con el volumen adecuado para antibiograma.
- Cepa indicadora sensible a meropenem: E. coli ATCC 25922.
Procedimiento:
1. Para cada aislamiento a evaluar, disolver una ansada de 1μl de un cultivo
fresco proveniente de agar sangre, en 2 ml de TSB.
2. Mezclar con vortex 10-15 seg.
3. Agregar al tubo de TSB un disco de meropenem. Asegurarse que todo el disco
quede sumergido en la suspensión.
4. Incubar a 35ºC ± 2ºC, en aerobiosis, durante 4 hs. ± 15 min.
5. Justo antes o inmediatamente a continuación de la incubación de la
suspensión con el disco de meropenem, preparar una suspensión de 0.5 de Mc
Farland de E. coli ATCC 25922 en caldo nutritivo o solución fisiológica.
6. Inocular una placa con agar MH con la suspensión de E. coli ATCC 25922, de
igual manera que durante la rutina de las pruebas de sensibilidad. Asegurarse
que tanto la preparación del inóculo, como la inoculación de la placa, se realicen
132
en no más de 15 min. Dejar secar las placas por 3-10 min antes de agregar el
disco de meropenem.
7. Remover el disco de meropenem de la suspensión de la cepa a evaluar
utilizando un ansa de 10µl y ayudándose con las paredes del tubo para levantar
el disco de meropenem. Con cuidado presionar contra las paredes del tubo para
remover el exceso de líquido del disco. Colocar el disco en la placa de MH
previamente inoculada con la cepa ATCC. No colocar más de 4 discos de
meropenem en las placas de 100mm y 8 discos en las placas de 150mm. Ver
figura 1. 8. Invertir la placa e incubar a 35ºC ± 2ºC, en aerobiosis, durante 18-24
hs.
9. Luego de la incubación, medir la zona de inhibición como en la rutina de las
pruebas de sensibilidad
Interpretación:
1. Carbapenemasa positivo: zonas de inhibición entre 6-15mm o presencia de
colonias dentro de zonas de inhibición de entre 16-18mm. Si el aislamiento a
evaluar produce carbapenemasa, el disco de meropenem será hidrolizado
durante la incubación y no habrá inhibición o limitación del crecimiento para E.
coli ATCC 25922 sensible a meropenem.
2. Carbapenemasa negativo: zonas de inhibición ≥19mm. Si el aislamiento a
evaluar no produce carbapenemasa, el disco de meropenem no será hidrolizado
durante la incubación y podrá inhibir el crecimiento de E. coli ATCC 25922
sensible a meropenem.
3. Indeterminado: Zonas de inhibición entre 16-18mm (sin la presencia de
colonias intra halo). La presencia o ausencia de carbapenemasa no puede ser
confirmada.
Informe:
mCIM POSITIVO: Informar “carbapenemasa detectada”
mCIM NEGATIVO: informar “carbapenemasa no detectada”
mCIM INDETERMINADO: Informar “Prueba no concluyente para determinar la
presencia de carbapenemasa. Comuníquese con el laboratorio”
Figuras
Fig 1

Fig 2
Resultado de K. pneumoniae ATCC BAA-1706TM (negativo), y K. pneumoniae
ATCC BAA- 1705TM (positivo). Un pequeño anillo de crecimiento alrededor del
disco de meropenem no debe tenerse en cuenta (es el resultado del arrastre de
la suspensión bacteriana).

133
Cambios realizdos por el CLSI 2018 en el estudio de susceptibilidad a
Colistin
a) Se incorporó un Punto de corte Epidemiológico (Epidemiological Cutoff Value
– ECV) de CIM para Colistín vs Enterobacter aerogenes, E. cloacae, Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae y Raoultella ornithinolytica (solo aplica para Colistin
y no para Polimixina-B)
b) Se eliminó el punto de corte de difusión de colistin y polimixina-B en
Pseudomonas aeruginosa.
c) Se eliminó la categoría Intermedio de CIM para COL en Pseudomonas
aeruginosa.
d) Se eliminaron los puntos de corte de CIM de ambos polipetídicos (COL y POL)
de los bacilos negativos no fermentadores distintos de Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia y
Burkholderia cepacia.

Punto de corte epidemiológico (Epidemiological Cutoff Value – ECV) para

Colistin.
El concepto de “Punto de corte” (PC) y de “Punto de corte epidemiológico” (ECV)
es diferente. Los PC se establecen utilizando las distribuciones de CIM, los datos
farmacocinéticos/farmacodinámicos (PK/PD), y los datos de evolución clínica
(como se describe en el documento M23 del CLSI). Teniendo en cuenta que los
PC se basan en múltiples bases de datos farmacológicos y clínicos, se considera
que 2 Servicio Antimicrobianos - Laboratorio Nacional de Referencia en
Resistencia a los Antimicrobianos – INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” son
predictores robustos de los resultados clínicos. Por el contrario, los ECV son
valores de CIM que separan las poblaciones bacterianas sin mecanismos de
resistencia (resistencia (salvajes o wild-type - WT) de aquellas que si lo poseen
(no salvajes o non-wild-type - NWT), basados en los fenotipos de CIMs. Por lo
tanto, los ECV se basan únicamente en información in vitro. Los ECVs se utilizan
principalmente para señalizar la emergencia o la evolución de cepas no salvajes.
Los ECVs NO son PC clínicos, y por lo tanto la relevancia clínica de éstos no ha
sido identificada o aprobada por el CLSI u otra agencia regulatoria.
“El CLSI establece PC para interpretar el resultado de las pruebas de
sensibilidad (S, I, R, SDD) y provee ECVs cuando los PC no están disponibles.”

134
Polipéptidos y Pseudomonas aeruginosa
En la edición 2017 del CLSI eliminó el punto de corte de difusión para predecir
sensibilidad a polipéptidos en P. aeruginosa, es decir que la única metodología
aceptada para evaluar esta combinación droga-bacteria es la CIM.
Asimismo, eliminó la categoría “Intermedio” en la CIM de colistín.

Se incorporó además el siguiente comentario: “El colistín (metanosulfonato)

debería ser generalmente administrado con una dosis de carga a las dosis
máximas recomendadas, y en combinación con otros agentes”.
Polipéptidos vs Acinetobacter spp.
Se incorporó el mismo comentario que en P. aeruginosa respecto a la
dosificación de colistín y la siguiente aclaración: “Los puntos de corte para
colistín ≤2 µg/ml sensible - ≥ 4µg/ml resistente sólo aplican al complejo A.
baumannii”.
Polipéptidos vs otras no-Enterobacteriaceae
Se eliminó el punto de corte de CIM para colistín y polimixina-B de los otros
bacilos negativos no fermentadores (BNNF) distintos de P. aeruginosa, A.
baumannii, Burkholderia cepacia y Stenotrophomonas maltophilia.

Rapid polymixyn NP
El fundamento de la técnica Rapid polymixyn NP es detectar la metabolización
de la glucosa asociada con el crecimiento bacteriano en presencia de una
concentración definida de colistín o polimixina B. La formación ácidos, por el
metabolismo de los carbohidratos en Enterobacteriaceae, se evidencia por un
cambio de color (naranja a amarillo) de un indicador de pH (fenol rojo).
Para la determinación de Rápido polymixyna NP se requirieron de dos
soluciones:
(1) Solución madre del antibiótico de polimixina B: Para la preparación de la
solución madre del antibiótico se requiere de 100 ml de caldo de MHB-CA, se
pesa 2,1 gr MHB-CA en polvo el que se diluye en 90 ml de agua bidestilada.
Esta solución se autoclava a 121°C por 15 min (autoclave vertical monofásico
100 Lts,LS-B100L) y una vez enfriado, se agrega por filtración y bajo campana,
0,02g de polimixina B (o sulfato de colistín) disuelto en 10 ml de agua estéril,
para obtener una concentración final de 0,2 mg/ml (21). Estos se dispensa en
tubos de vidrios estériles y se conserva a -20°C (estabilidad de 1 año).
(2) Solución de la técnica Rapid polymixyn NP: Para preparar 250 ml de
solución, se mezcla 6,25 g de MHB-CA en polvo con 12,5 mg de rojo fenol en
225 ml de agua bidestilada. El pH final de la solución debe ser de 6,7 el que se
ajustar con HCL 1 M. La solución se autoclava a 121°C por 15 min. Una vez
enfriado la solución se añade, por filtración y bajo campana, 25 ml de glucosa
anhidra al 10% (4). Esto se dispensa en frasco de vidrio estéril, con estabilidad
de 1 semana a 4°C y 1 años a -20°C.

135
Una vez preparada ambas soluciones madres, se deben preparar soluciones de
trabajo en tubos de vidrios de la siguiente forma:

Solución Solución de la técnica Solución madre del

Rapid polymixyn NP antibiótico de
polimixina B

A 5 ml -

B 5ml 125 µl

Preparación del inóculo bacteriano

Se realiza un inóculo bacteriano de las cepas en estudio en 4 ml de suero
fisiológico 0.85% ajustandpo a un Mc Farland 3.0-3.5, (concentración final de
bacterias es de ≈10 8 CFU / mL).
Materiales y reactivos
Solución A
Solución B
Cepas Controles (Sensible y resistente a colistin)
Inóculos bacterianos a estudiar.
Microplaca de polietileno de 96 pocillos
Micropipeta P200, P1000 y puntas estériles.

Procedimiento de la técnica

 Fila A: 150 μL de solución A.

 Fila B: 150 μL de la solución B.
 Columna 1: Se añade 50 μl de NaCl al 0,85% (control de reactivos).
 Columna 2: Se añade 50 μl de la suspensión de aislamiento susceptible
a colistín (control negativo).
 Columna 3: Se añade 50 μL de la suspensión de aislamiento resistente
a colistín (control positivo).
 Columna 4: Se añade 50 μL de la suspensión aislada (cepa en estudio).
La bandeja inoculada se incuba por 2 horas a 35 ± 2 °C.
Lectura
Se inspecciona visualmente la bandeja después de 10 min y luego cada media
hora durante 2 h. Considerando positivo el resultado de la prueba si el
aislamiento resistente a colistin crece en presencia de este (color amarillo) y
negativo si el aislamiento susceptible a colistin no crece en presencia de de este
(color rojo a naranja). Se debe considerar que la prueba es interpretable si se
cumplen las siguientes 4 condiciones:
1) Los pocillos A1 y B1 con NaCl al 0,85% sin suspensión bacteriana
permanecen naranja, lo que indica ausencia de contaminación del medio.

136
2) Los pocillos A2, A3 y A4 con suspensión bacteriana y libre de colistín
pasaron de naranja a amarillo, confirmando el metabolismo de la glucosa por los
aislamientos.
3) Los pocillos A2 y B2 con la suspensión bacteriana de referencia
susceptible de colistín (control negativo) dieron resultados negativos.

4) Los pocillos A3 y B3 con la suspensión bacteriana de referencia resistente

a colistín (control positivo) dieron resultados positivos.

Fila A: Solución A sin colistín, Fila B: Solución B con colistín. Columna 1: Control reactivo.
Columna 2: Control negativo, Columna 3: Control positivo, Columna 4: Muestra.

137
 Instituto de salud publica
La Sección Bacteriología actúa como Laboratorio Nacional de Vigilancia de Laboratorio de
la Red de Laboratorios del país público como privados. En sus laboratorios se reciben cepas
bacterianas y muestras (algunos laboratorios que no tienen capacidad de respuesta,
sospechosos de patógenos de notificación obligatoria). Además se reciben los datos de los
aislamientos bacterianos correspondientes a notificación obligatoria.

Esta función se basa en el Decreto Supremo 158 de 2004:

ARTICULO 1º.- Se considerarán enfermedades de notificación obligatoria las que a

continuación se indican, con su correspondiente periodicidad:
a) De Notificación Inmediata La sospecha de casos de Botulismo, Brucelosis, Carbunco,
Cólera, Dengue, Difteria, Enfermedad invasora por Haemophilus influenzae, Enfermedad
Meningocócica, Fiebre Amarilla, Fiebre del Nilo Occidental, Leptospirosis, Malaria, Peste,
Poliomielitis, Rabia humana, Sarampión, SARS, Síndrome Pulmonar por Hantavirus,
Triquinosis.
La ocurrencia de toda agrupación de casos relacionados en el tiempo y en el espacio, donde
se sospeche una causa infecciosa transmisible, incluidos los Brotes de Enfermedades
Transmitidas por Alimentos.
La ocurrencia de fallecimientos de causa no explicada, en personas previamente sanas,
cuando se sospeche la presencia de un agente infeccioso transmisible.

b) De Notificación Diaria
Coqueluche, Enfermedad de Chagas (Tripanosomiasis Americana), Fiebre Tifoidea y
Paratifoidea, Gonorrea, Hepatitis viral A, B, C, E, Hidatidosis, Lepra, Parotiditis, Psitacosis,
Rubéola, Rubéola Congénita, Sífilis en todas sus formas y localizaciones, Síndrome de
Inmunodeficiencia Adquirida (VIH/SIDA), Tétanos, Tétanos neonatal, Tuberculosis en todas
sus formas y localizaciones, Tifus Exantemático Epidémico.
c) Notificación exclusiva a través de establecimientos centinelas Las siguientes
enfermedades corresponden a las que deben ser notificadas obligatoriamente sólo por los
centros y establecimientos definidos como centinelas por la autoridad sanitaria:
i) Influenza
i) Infecciones Respiratorias Agudas
iii) Diarreas
iv) Enfermedades de Transmisión Sexual (excepto Gonorrea, Sífilis y VIH/SIDA)
v) Varicela
La vigilancia a través de establecimientos centinelas involucra el apoyo de laboratorio para
el diagnóstico.

ARTICULO 2º.-Frente a la sospecha de las enfermedades de notificación obligatoria

señaladas en la letra a) del artículo 1º, se deberá comunicar en forma inmediata por
cualquier medio a la autoridad sanitaria correspondiente, desde el lugar en que fue
diagnosticada, sin perjuicio de que con posterioridad, dentro del plazo de 24 horas se
proceda a llenar el formulario respectivo.
La autoridad sanitaria deberá, a su vez, comunicarlo al Ministerio de Salud, por la vía más
expedita (correo electrónico, fax, teléfono u otro).
ARTICULO 3º.-Las enfermedades de declaración obligatoria, contempladas en la letra b)
del artículo 1º, deberán ser notificadas, una vez confirmado el diagnóstico, por el respectivo
establecimiento asistencial, enviándose el formulario correspondiente, el mismo día de la
confirmación a la autoridad sanitaria competente, desde donde se remitirá al Ministerio de
Salud una vez por semana.
ARTICULO 4º.-La notificación de enfermedades contempladas en las letras a) y b) del
artículo 1º, se hará por escrito en un formulario que contendrá la siguiente información: -
Identificación del establecimiento y del Servicio de Salud al que corresponde notificar.-
Apellidos, Nombre, RUT, ficha clínica, domicilio, teléfono, edad, sexo del enfermo. -
Diagnóstico de la enfermedad objeto de la denuncia, su confirmación, fecha de inicio de los

138
síntomas, lugar de aislamiento, exámenes practicados, antecedentes epidemiológicos y de
vacunación.- En caso de TBC indicar si se trata de un caso nuevo o recaída y localización.-
Identificación del profesional que notifica, RUT y su firma.
Tratándose de enfermedades de transmisión sexual, podrá omitirse el nombre y apellidos
del paciente, indicándose en su reemplazo el RUT, así como su domicilio, consignándose
en este caso sólo la comuna que corresponda.
ARTICULO 5º.- Las enfermedades de declaración a través de establecimientos centinelas,
contempladas en la letra c) del artículo 1º, deberán ser notificadas en cuanto al número de
casos semanales, según sexo y grupos de edad, una vez confirmado el diagnóstico en el
respectivo establecimiento centinela, enviándose el o (los) formulario(s) correspondiente(s)
semanalmente, incluyendo los datos de laboratorio, a la autoridad sanitaria competente,
desde donde se remitirán al Ministerio de Salud con igual periodicidad.
ARTICULO 6º.- Será obligación de todos los médicos cirujanos, que atienden enfermos en
establecimientos asistenciales, sean públicos o privados en que se proporcione atención
ambulatoria, notificar las enfermedades de declaración obligatoria en la forma que se
establece en el presente reglamento.Si éstos pertenecieren a la dotación de
establecimientos asistenciales públicos o privados de atención abierta o cerrada, dicha
notificación será responsabilidad del Director del mismo y se realizará por la persona a quién
este haya designado para ello, quién servirá como vinculo oficial de comunicación entre la
autoridad sanitaria y el establecimiento. El Director deberá comunicar a la autoridad sanitaria
el nombre de la persona designada y cualquier cambio que se produzca en su designación.
ARTICULO 7º.- Si el enfermo fuese atendido por médicos particulares en su domicilio o
consulta, la notificación se efectuará a través de los formularios que para estos efectos
proporcionarán la autoridad sanitaria.El profesional médico deberá despachar la notificación,
a la autoridad sanitaria dentro de cuya jurisdicción se encuentra ubicada su consulta
particular.
ARTICULO 8º.-Los laboratorios clínicos públicos y privados en que se efectúen exámenes
que confirmen algunas de las enfermedades establecidas en el artículo 1º, deberán
notificarlas a la autoridad sanitaria correspondiente, con los siguientes datos: nombre,
apellidos, edad, sexo y domicilio de la persona a quién se le practicó el examen; tipo de
examen, sin perjuicio de que su resultado sea enviado al profesional o institución que lo
solicitó.
En el caso de exámenes que confirmen una enfermedad de transmisión sexual, se podrán
omitir las menciones a que se refiere el inciso segundo del artículo 4º, en la forma indicada.
ARTICULO 9º.- Se les considerará objeto de vigilancia de laboratorio a los siguientes
agentes microbiológicos causales de enfermedad:
_ Escherichia coli productor de toxina de shiga (0157 y otros)
_ Chlamydia psittaci
_ Leptospira spp
_ Coxiella burnetii
_ Trypanosoma cruzi _ Treponema pallidum
_ Streptococcus pyogenes (grupo A, enfermedad invasora)
_ Streptococcus pneumoniae (enfermedad invasora)
_ Enteropatógenos: Vibrio paraehemolyticus, Vibrio cholerae, Campylobacter spp, Yersinia
spp, Salmonella spp, Shigella spp.
_ Virus Hepatitis B (Antígeno de superficie) Virus Hepatitis C
_ VIH _ Legionella spp.
_ Ehrlichia spp.
_ Listeria monocytogenes (enfermedad invasora)
_ Streptococcus agalactiae (enfermedad invasora)
ARTICULO 10.-Los laboratorios clínicos y los bancos de sangre públicos y privados en que
se identifiquen los agentes causales mencionados en el artículo anterior, estarán obligados
a notificarlos semanalmente al Instituto de Salud Pública mediante formularios provistos para
este fin, en los que se deben registrar los siguientes antecedentes: - Identificación del
paciente - Diagnóstico. - Naturaleza de la(s) muestra(s); tipo de muestra (Ej.: orina, sangre,
etc.) - Institución solicitante. Los establecimientos mencionados deberán enviar las muestras
o cepas correspondientes, al Instituto de Salud Pública el que realizará el estudio del agente

139
y notificará de ello al Ministerio de Salud y a la autoridad sanitaria correspondiente, en forma
mensual.
ARTICULO 11º.-Serán objeto de vigilancia para la resistencia de los antimicrobianos los
siguientes agentes _ Streptococcus pneumoniae _ Mycobacterium tuberculosis _ Shigella
spp. _ Salmonella spp. _ Haemophilus influenzae tipo b _ Staphylococcus aureus (VISA-
VRSA) _ Neisseria meningitidis _ Neisseria gonorrhoeae _ Agentes aislados de infección
nosocomial, según disposiciones de la norma técnica existente en la materia
La vigilancia deberá ser realizada en todos los establecimientos hospitalarios, públicos y
privados, que efectúen aislamiento microbiano por sus propios medios o con el apoyo del
Instituto de Salud Pública, de acuerdo a como lo dispone la norma técnica correspondiente.
Los establecimientos hospitalarios deberán remitir mensualmente al Instituto de Salud
Pública la información de los resultados de la vigilancia. A su vez, dicho Instituto informará
semestralmente al Ministerio de Salud los resultados de esta vigilancia.
ARTICULO 12º.- El tratamiento de los datos obtenidos como el resultado de las
notificaciones y comunicaciones a que alude el presente reglamento, se regirán por las
normas de la ley Nº 19.628, sobre protección de la vida privada.
ARTICULO 13º.- Cualquier infracción a las disposiciones del presente reglamento, será
sancionada de acuerdo a lo dispuesto en el Libro X del Código Sanitario.
- Colaborar con el Ministerio de Salud en el estudio microbiológico de las enfermedades
infecciosas y su impacto en la Salud Pública.
- Caracterizar los microorganismos fenotípica y genéticamente, con el fin de entregar
herramientas que permitan tomar medidas más eficaces de control y prevención.
- Participar con los Laboratorios y Epidemiología del Minsal en la resolución de brotes,
epidemias u otras situaciones de emergencia sanitaria de etiología bacteriana.
- Actuar como Laboratorio Nacional de Referencia para los casos de zoonosis humanas a
fin de evitar las infecciones e intoxicaciones alimentarias, dependiendo del agente.
Las áreas de trabajo en que se divide esta actividad en la Sección son:
1) Laboratorio de Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA): incluye la vigilancia y
paracterización de Salmonella spp. de origen clínico y Salmonella spp. de origen no clínico,
Shigella spp., Yersinia spp., Campylobacter spp , Vibrio spp., E.coli productor de toxina de
shiga (0157 y otros).
2) Laboratorio de Infecciones intrahospitalarias y resistencia a antimicrobianos: incluye la
detección y caracterización de cepas provenientes de brotes intrahospitalarios y de la
comunidad.
3) Laboratorio de Cocaceas grampositivas: Vigilancia de Streptococcus pyogenes (grupo
A, enfermedad invasora) y Streptococcus agalactiae (enfermedad invasora) y Vigilancia de
la resistencia de Enterococcus vancomicina resistentes y Vigilancia de la susceptibilidad de
Staphylococcus aureus (VISA-VRSA).
4) Laboratorio de Meningitis: incluye la vigilancia y caracterización de Neisseria
meningitidis, Haemoplilus influenzae tipo b, Listeria monocytogenes, S.peumoniae
(enfermedad invasora).
5) Laboratorio de Enfermedades de Transmisión sexual: incluye la vigilancia y
caracterización cuando corresponda de Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia psittaci, y
Treponema pallidum.
6) Laboratorio de Bacterias Emergentes y Zoonóticas: incluye la vigilancia y
caracterización de Leptospira spp., Bordetella.
7) Laboratorio de Biología molecular: incluye la vigilancia de laboratorio con técnicas
moleculares para Coxiella burnetii, Chlamydia psittaci, Legionella spp., Ehrlichia spp.

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