MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS 373

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5) La introducción de la muestra más común es aquella que MGA 0316. DETERMINACIÓN DE

emplea presión o vacío, ya que introduce una porción
ENDOTOXINAS BACTERIANAS M
homogénea de la muestra. La reproducibilidad mejora cuando
la introducción se hace empleando un vial con agua en el Las endotoxinas de bacterias Gram negativas, son la causa más
extremo opuesto y empleando presiones de 1 a 2 psi, en vez de común de reacciones tóxicas asociadas a la contaminación de
la menor que acepta el equipo. productos farmacéuticos y artículos médicos. Las endotoxinas
son lipopolisacáridos cuya actividad es mayor que la de otras
6) La detección de los analitos de interés en general se realiza sustancias pirogénicas de estructura diferente.

MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS

en su longitud de onda de máxima absorción (detector La prueba para determinar o cuantificar endotoxinas utiliza el
UV/VIS) o de emisión (detector de fluorescencia) para lo cual lisado de amebocitos de Limulus polyphemus o Tachypleus
se debe de realizar un barrido de cada una de las soluciones tridentatus.
estándar por separado o bien, durante el análisis si se cuenta Existen dos métodos para esta determinación:
con un detector de arreglo de diodos se puede hacer el barrido
Método A: Formación de un gel.
en la región UV/VIS de 190 a 800 nm. El equipo puede
registrar hasta 3 longitudes de onda distintas durante un Método B: Fotométrico, que dependiendo de la forma de
análisis. cuantificación puede ser:
Turbidimétrico (cinético y de punto final), basado en el
7) El voltaje de separación afecta a todos los analitos presentes
desarrollo de turbiedad después de la ruptura de un
por lo que emplear 30 kV disminuye el tiempo de análisis sin
sustrato endógeno.
afectar en gran proporción la resolución, sin embargo, aumenta
Cromogénico (cinético y de punto final), basado en el
la corriente que se genera en el sistema, como ya se mencionó
desarrollo de color después de la ruptura del complejo
hay que evitar corrientes mayores de 200 µA, pues esto origina
sintético péptido-cromógeno.
calentamiento de las soluciones en el capilar y por lo tanto,
falta de reproducibilidad en los tiempos de migración. Si no es En caso de duda o controversia, la decisión final se toma
pertinente bajar la concentración del sistema amortiguador, es basándose en el Método A. Formación de un gel, a menos que
factible disminuir el voltaje aplicado para disminuir la se indique algo diferente en la monografía del producto en
corriente generada. análisis.
MATERIAL Y EQUIPO
8) Durante la separación la corriente generada debe de
Material estable al calor. Debe estar libre de endotoxinas y
permanecer constante con una variación entre 3 y 10 µA
no interferir con la prueba. Utilizar ciclos de despirogenización
durante toda la corrida. Si se emplea el mismo capilar y
con calor seco a 250 °C por lo menos 30 min o las condiciones
electrolito soporte esta corriente será reproducible en cada
establecidas durante la validación del proceso.
análisis. Si la corriente cae a un valor cercano de cero, es
Material desechable. Cuando se utilicen microplacas, puntas
necesario detener la corrida porque es indicio de algún
para pipetas automáticas, jeringas, etc., demostrar que están
problema como pudiera ser:
libres de endotoxinas.
Que algún vial tenga la tapa mojada o alguna solución presente
burbujas, que el capilar está tapado o roto, que la posición de REACTIVOS
los viales con electrolito soporte para la corrida no esté bien Nota: todas las soluciones utilizadas en la prueba deben estar
programado en el método, etc. libres de endotoxina bacteriana.
Control estándar de endotoxina (CEE). Preparación de
9) El lavado entre corridas es muy importante porque debe de endotoxina de Escherichia coli caracterizada y estandarizada
asegurar que la pared interna del capilar quede limpia y lista contra una endotoxina de referencia que ha sido calibrada con
para el siguiente análisis. Si las muestras son simples, un respecto al estándar internacional de endotoxina de la
lavado con el mismo electrolito soporte es suficiente pero si Organización Mundial de Salud. Una Unidad Internacional (UI)
son complejas como extractos vegetales, fluidos biológicos, de endotoxina es equivalente a una Unidad de Endotoxina (UE).
será necesario lavar con agua, NaOH 0.1 M, agua y electrolito Lisado de amebocitos (LAL). El lisado de amebocitos
soporte. Este lavado es parte del desarrollo del método a fin de de Limulus es un extracto acuoso de células sanguíneas
garantizar la reproducibilidad del mismo. (amebocitos) del cangrejo herradura (Limulus
polyphemus), preparado y caracterizado para usarse como
*
La longitud del capilar al detector es menor a la longitud total cuando reactivo. También puede obtenerse de Tachypleus tridentatus.
se emplean detectores espectrofotométricos, tal y como se observa en Éste reactivo se refiere solamente al producto manufacturado
la figura 0312.5. de acuerdo con las regulaciones de la autoridad competente.
+
Comercialmente ya existen capilares adecuados de acuerdo al tamaño (Nota: el reactivo de amebocitos de Limulus también
molecular de los analitos que se desean separar.
§ reacciona con algunos β-glucanos. Hay disponibles Lisados de
Este medio de separación es más fácil de preparar, ya que con presión
se llena un capilar neutro con la solución. amebocitos que no reaccionan con glucanos: Se prepara
**
Si es necesario, usar aditivos como glicerol, surfactantes, urea o removiendo del Lisado el factor G que reacciona con los
soluciones zwitteriónicas. Sin embargo, dependiendo de la glucanos o inhibiéndolo, de esta forma puede ser utilizado para
concentración empleada, la urea causa desnaturalización de proteínas. la prueba de endotoxina en presencia de glucanos).

MGA 0316. DETERMINACIÓN DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

 374 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, duodécima edición.
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Agua libre de endotoxinas (ALE). Es el diluyente de elección Cuando el límite de endotoxina se expresa en la monografía
M y no debe reaccionar con el reactivo de LAL. del producto en términos de masa o unidad del principio
activo, la MDV se calcula mediante la siguiente fórmula:
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Estándar de endotoxina. Para reconstituir y almacenar el
MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS

estándar, seguir las instrucciones del fabricante.

A partir de esta solución concentrada preparar las diluciones de Donde:
prueba, para evitar pérdida de actividad por adsorción usarlas C = Concentración del producto en la solución de prueba o del
en el menor tiempo posible a menos que las condiciones y producto reconstituido de acuerdo a las indicaciones del
periodos de almacenamiento se validen. marbete, expresada en UE/mg o UE/Unidad de actividad
Lisado de amebocitos. Reconstituir el reactivo con agua libre biológica.
de endotoxina (ALE) o solución amortiguadora, siguiendo las
DISPOSITIVOS MÉDICOS
instrucciones del fabricante. Mezclar suavemente, evitando la
La máxima dilución válida para dispositivos médicos se
formación de espuma. Almacenar el lisado reconstituido en
calcula dividiendo el límite de endotoxina entre la sensibilidad
refrigeración o congelación, de acuerdo a las recomendaciones
del reactivo de LAL utilizado:
del fabricante.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Disolver, diluir o extraer la muestra usando ALE. Algunas Para dispositivos médicos el límite de endotoxina no es mayor
sustancias o preparaciones se diluyen o extraen mejor en otras a 20.0 UE/dispositivo, excepto para dispositivos en contacto
soluciones acuosas. El pH de la mezcla del lisado y la solución con el líquido cefalorraquídeo, en este caso el límite se
de prueba debe estar dentro del intervalo especificado por el considera no mayor a 2.15 UE/dispositivo.
fabricante del lisado, usualmente entre 6.0 y 8.0, en caso
necesario, ajustar el ajuste de pH de la solución de prueba, ESTABLECIMIENTO DE LÍMITES DE
utilizar soluciones de ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o la ENDOTOXINAS
solución amortiguadora recomendada por el fabricante del Cuando en la monografía correspondiente el límite de
reactivo de LAL. endotoxina de la muestra no está especificado, emplear la
siguiente fórmula:
Dispositivos médicos. Para artículos médicos emplear de 3 a
10 muestras. Considerando el tamaño y forma de éstos
enjuagar o remojar y agitar con ALE. Colectar el agua de
enjuague o extracción y determinar la concentración de Donde:
endotoxina por cualquiera de los métodos descritos. K = Dosis umbral pirogénica de endotoxina en humanos por
Para dispositivos etiquetados como “catéter no pirogénico” kilogramo de peso corporal y es igual a 5 UE/kg para cualquier
enjuagar las paredes internas del catéter con el líquido de vía de administración, excepto para la intratecal, en donde K es
extracción a una temperatura de 37 ± 1.0 °C. Mantener el igual a 0.2 UE/kg.
líquido de extracción en contacto con la zona crítica del catéter M = Dosis máxima recomendada del producto en humanos por
por lo menos 1 h a temperatura ambiente controlada. Si se kilogramo de peso corporal. Cuando el producto es inyectado a
considera apropiado, mezclar los extractos. intervalos frecuentes o de transfusión continua, M es la dosis
total máxima administrada en un periodo de una hora.
DETERMINACIÓN DE LA MÁXIMA DILUCIÓN
Para radiofármacos que no se administran por vía intratecal, el
VÁLIDA (MDV)
límite se calcula mediante la siguiente fórmula:
La máxima dilución válida es la dilución máxima permitida de
una muestra en la que el límite de endotoxina puede
determinarse.
Cuando el límite de endotoxina se expresa en volumen en la Donde:
monografía del producto, la MDV se calcula mediante la V = Dosis máxima recomendada por mililitro.
siguiente fórmula:
Para radiofármacos que se administran por vía intratecal, el
límite de endotoxina se calcula mediante la fórmula:

Donde:
Límite de endotoxina = Concentración máxima de endotoxina
permitida en un producto, que no produce una respuesta clínica Para formulaciones (por lo general productos oncológicos),
pirogénica cuando se administra a la dosis indicada. que se administran por m2 de superficie corporal, la fórmula
λ = Sensibilidad del lisado indicada en el marbete del reactivo, es:
expresada en UE/mL, o la concentración más baja de la curva
estándar en los ensayos cuantitativos.

MGA 0316. DETERMINACIÓN DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

 MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS 375
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Donde: El punto final se define como el último resultado positivo en la

K = 2.5 UE/kg serie de diluciones de endotoxina. M
M = (dosis máxima /m2/ hora × 1.80 m2) / 70 kg
Cálculos. Calcular la media geométrica de las concentraciones
Dispositivos médicos. del punto final de la siguiente manera:
Para dispositivos médicos el límite de endotoxina no es mayor
a 20.0 UE/dispositivo excepto para dispositivos en contacto
con líquido cefalorraquídeo donde el límite no es mayor a

MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS

2.15 UE/dispositivo. Donde:
El límite de endotoxina para el líquido de enjuague o M= Media geométrica de la concentración del punto final.
extracción se calcula por la siguiente fórmula: ∑e = Suma de logaritmos de las concentraciones del punto
final de la serie de diluciones empleadas.
f = Número de réplicas.
Donde:
K = Cantidad de endotoxina permitida por dispositivo. Si el resultado de la media geométrica se encuentra entre 0.5 y
N = Número de dispositivos evaluados. 2 λ de la sensibilidad indicada en el marbete, el reactivo puede
V = Volumen total del líquido de extracción o enjuague. utilizarse. Véase ejemplo en tabla 0316.1.

PRUEBAS PRELIMINARES Tabla 0316.1. Ejemplo.

La validez de los resultados de la prueba de endotoxinas por
cualquiera de los métodos de formación de gel propuestos, Réplica Concentración de endotoxina
requiere: Sensibilidad = 0.125 UE/mL
0.25 0.125 0.0625 0.031
Verificar la sensibilidad del lisado.
UE/mL UE/mL UE/mL UE/mL
Demostrar la ausencia de factores que interfieran con la
(2 λ ) (1 λ) (0.5 λ ) (0.25 λ)
prueba en la muestra, en su solución, enjuague o
1 + + - -
extracto.
2 + + - -
MÉTODO DE FORMACIÓN DE GEL 3 + + + -
Verificación de la sensibilidad del lisado. Efectuar la prueba 4 + + + -
cada vez que se utilice un nuevo lote del reactivo y/o se
modifiquen las condiciones experimentales.
A partir del control estándar de endotoxina CEE, preparar 4
diferentes concentraciones con un factor de dilución de dos
equivalentes a 2; 1; 0.5 y 0.25 λ y llevar a cabo por lo menos
cuatro réplicas, incluir un control negativo (agua libre de
endotoxina).
En cada tubo de prueba mezclar volúmenes iguales La sensibilidad del reactivo se confirma ya que el resultado de
(generalmente 0.1 mL) del reactivo de LAL y de la solución la media geométrica se encuentra entre 0.5 y 2 λ.
del estándar de endotoxina. Cuando se usen tubos con el
reactivo de LAL liofilizado, añadir directamente la solución de Factores de interferencia. Son factores presentes en la
prueba. Incubar la mezcla en las condiciones señaladas por el muestra que pueden ocasionar resultados falsos positivos o
fabricante (generalmente de 37 ± 1 °C durante 60 ± 2 min), negativos. Repetir la prueba, siempre que se presenten cambios
evitar vibraciones. en alguna de las condiciones que pudieran influir en el
Al finalizar el periodo de incubación, tomar cada tubo e resultado de la misma como por ejemplo, la fuente del
invertirlo 180° con un movimiento suave. Considerar una reactivo, las condiciones de fabricación del producto y/o
prueba positiva cuando el gel permanezca integro al invertir el condiciones experimentales, que incidan en los resultados de la
tubo y una prueba negativa cuando no haya formación de un prueba.
gel firme.
Preparar las soluciones A, B, C y D como se indica en la tabla
La prueba se considera válida si:
0316.2. La solución de prueba se utiliza en una dilución menor
El agua libre de endotoxinas (control negativo) da un a su MDV que no contenga endotoxina detectable. Llevar a
resultado negativo. cabo la prueba de acuerdo al procedimiento descrito en la
En la concentración más baja de CEE el resultado en verificación de la sensibilidad del lisado, y diluir la endotoxina
todas las réplicas es negativo. en solución de prueba o en agua libre de endotoxinas.

MGA 0316. DETERMINACIÓN DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

 376 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, duodécima edición.
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Tabla 0316.2. Preparación de soluciones para la prueba de para la réplica. La muestra en análisis cumple con la prueba,
M interferencia en el método de formación de gel. cuando en la repetición se obtienen resultados negativos en
ambas determinaciones de la solución A. La muestra no
Solución Concentración Réplicas cumple con la prueba si se obtiene un resultado positivo para
final de una o ambas determinaciones repetidas de la solución A.
MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS

endotoxina Si la muestra no cumple con la prueba a una dilución menor de

A Solución de prueba -------- 4 la MDV, repetir la prueba empleando una dilución mayor que
B Solución de prueba 2λ 4 no excede la MDV.
1λ 4 En caso de sospechar la presencia de endotoxina, efectuar una
0.5 λ 4 serie de diluciones con un factor de dilución de dos que no
0.25 λ 4 excedan la MDV y proceder de acuerdo al método 2.
C Agua libre de 2λ 2
endotoxinas Tabla 0316.3. Preparación de soluciones para la prueba límite.
1λ 2
0.5 λ 2 Solución Concentración Réplicas
0.25 λ 2 final de
D Agua libre de -------- 2 endotoxina
endotoxinas A Solución de prueba ---- 2
B Solución de prueba 2λ 2
Solución A = Solución de prueba que no exceda la MDV libre C Agua libre de endotoxina 2λ 2
de endotoxina detectable. D Agua libre de endotoxina ---- 2
Solución B = Solución de prueba adicionada de endotoxina.
Solución C = Control de sensibilidad del lisado.
Solución A = Solución de prueba que no exceda la MDV.
Solución D = Control negativo de agua para la prueba de
Solución B = Control positivo del producto. Solución de
endotoxina.
prueba conteniendo endotoxina a una concentración final de
2 λ.
La prueba se considera válida si:
Solución C = Control positivo de agua.
Solución D = Control negativo de agua.
En las soluciones A y D la reacción es negativa.
El resultado en la solución C confirma la sensibilidad
MÉTODO 2. Método de formación de gel (Prueba
del lisado indicada en el marbete.
semicuantitativa). Preparar las soluciones A, B, C y D como
se muestra en la tabla 0316.4. Realizar la prueba de acuerdo al
Se considera que la muestra no contiene factores de
procedimiento descrito en la verificación de la sensibilidad del
interferencia si el resultado de la media geométrica en la
lisado.
solución B se encuentra entre 0.5 y 2 λ.
La prueba se considera válida si:
En caso contrario repetir la prueba utilizando una dilución
mayor sin exceder a la MDV y/o el uso de un lisado con mayor
Los resultados de la solución D son negativos.
sensibilidad. Para eliminar o disminuir los factores de
Los resultados de la solución B son positivos.
interferencia en la muestra, se pueden emplear métodos como:
dilución, ultrafiltración, ajuste de pH, calentamiento, diálisis,
La media geométrica de la concentración del punto final de la
adición de agentes dispersantes o tensoactivos.
solución C, se encuentra en el intervalo de 0.5 a 2 λ.
DETERMINACIÓN DE ENDOTOXINAS
Cálculos. La concentración de endotoxina en la muestra se
MÉTODO 1. Método de formación de gel (Prueba determina multiplicando la dilución en el punto final
límite). Preparar las soluciones A, B, C y D indicadas en la por λ para cada serie de réplicas. Véase la fórmula para el
tabla 0316.3. Llevar a cabo la prueba de acuerdo al cálculo de la media geométrica en la verificación de la
procedimiento descrito en la verificación de la sensibilidad del sensibilidad del lisado. Si la muestra se diluyó, calcular la
lisado. concentración de endotoxina en la solución original,
La prueba se considera válida si: multiplicando el resultado por la dilución.
Si ninguna de las diluciones de la muestra es positiva, en una
Los resultados en la solución D son negativos. prueba válida, informar la concentración de endotoxina como
En las soluciones B y C los resultados son positivos. menor al valor de λ (si se analizó una muestra diluida,
informar como menor que λ multiplicado por el factor de
La muestra cumple con la prueba, si las réplicas de la solución dilución más bajo de la muestra). Si todas las diluciones son
A dan resultado negativo. positivas, la concentración de endotoxina se informa como
La muestra no cumple con la prueba cuando se obtienen igual o mayor que la mayor dilución multiplicada por λ.
resultados positivos para las réplicas de la solución A. La muestra cumple con los requerimientos de la prueba si la
Repetir la prueba cuando se obtiene un resultado positivo para concentración de endotoxina en ambas réplicas es menor a la
una determinación de la solución A y un resultado negativo especificada en la monografía individual.

MGA 0316. DETERMINACIÓN DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

 MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS 377
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Tabla 0316.4. Preparación de soluciones para la prueba MÉTODOS FOTOMÉTRICOS

semicuantitativa. M
Solución Factor Concentración Réplicas Método turbidimétrico. El método turbidimétrico de punto
de final de final se basa en la relación cuantitativa que existe entre la
dilución endotoxina concentración de endotoxina y la turbiedad (absorbancia o
A Solución de 1 -- 2 transmitancia) de la mezcla de reacción al final de un periodo
prueba de incubación.
Solución de 2 -- 2 El método cinético mide, el tiempo necesario para que la

MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS

prueba mezcla de reacción alcance una absorbancia predeterminada o
Solución de 4 -- 2 el grado de turbiedad desarrollada.
prueba La prueba se lleva a cabo a la temperatura y tiempo de
Solución de 8 -- 2 incubación recomendada por el fabricante del lisado
prueba (normalmente 37 ± 1 ºC).
B Solución de 1 2λ 2
prueba Método cromogénico. En este método se mide el cromóforo
C Agua libre de 1 2 λ 2 liberado de un péptido cromogénico, al reaccionar el lisado
endotoxina 2 1λ 2 con la endotoxina.
4 0.5 λ 2 El método de punto final, se basa en la relación cuantitativa
8 0.25 λ 2 entre la concentración de endotoxina y la cantidad de
D Agua libre de ---- --- 2 cromóforo liberado al final del periodo de incubación.
endotoxina El método cinético mide el tiempo que tarda la reacción en
alcanzar una absorbancia predeterminada o el grado de color
Dispositivos médicos desarrollado.
En el caso de detectarse endotoxina en la prueba límite, La prueba se lleva a cabo en las condiciones recomendadas por
calcular la concentración de acuerdo a la siguiente fórmula: el fabricante del lisado (normalmente 37 ± 1 ºC).

PRUEBAS PRELIMINARES
Donde: Antes de llevar a cabo los métodos fotométricos es necesario:
N = Número de dispositivos evaluados.
V = Volumen total del líquido de extracción o enjuague. Asegurar los criterios para la curva estándar.
Que la solución de prueba no interfiera con el método.
Los dispositivos que no puedan ser analizados por el método
de endotoxina bacteriana por no cumplir con la prueba de Criterios para la curva estándar. La prueba debe realizarse a
factores de interferencia deben cumplir con la prueba de cada lote de reactivo de LAL. A partir de la solución control
pirógenos. estándar de endotoxina (CEE), preparar una curva estándar
Solución A. Solución de prueba a una dilución que no exceda utilizando al menos tres diluciones por triplicado. Efectuar la
la MDV y a la cual cumplió con la prueba de factores de prueba de acuerdo a las recomendaciones del fabricante del
interferencia. Las diluciones subsecuentes de la solución de lisado (relación de volumen, tiempo, temperatura de
prueba no deben exceder la MDV. Utilizar agua libre de incubación, pH, etc.).
endotoxina para preparar la serie de diluciones de 4 tubos Si el intervalo deseado es mayor de 2 log en los métodos
conteniendo la solución de prueba bajo análisis a las cinéticos, se deben incluir estándares adicionales para que cada
concentraciones de con respecto a la aumento logarítmico esté comprendido en el intervalo de la
concentración utilizada en la prueba para factores de curva estándar. El valor absoluto del coeficiente de
interferencia. Si se considera apropiado pueden utilizarse otras correlación, r, debe ser mayor o igual a 0.980 para el intervalo
diluciones mayores a la MDV. de concentraciones de endotoxina utilizadas.
Solución B. Control positivo del producto. Solución A
conteniendo endotoxina estándar a una concentración final de Determinación de factores de interferencia. Seleccionar una
2 λ. concentración de endotoxina igual o cercana a la mitad de la
Solución C. Dos réplicas de agua para la prueba de endotoxina curva estándar.
conteniendo concentraciones de estándar de endotoxina Preparar las soluciones A, B, C y D como se muestra en la
correspondientes a 2, 1, 0.5 y 0.25 λ. tabla 0316.5. Realizar la prueba en las condiciones
Solución D. Control negativo de agua para la prueba de recomendadas por el fabricante del lisado (volumen del lisado
endotoxina. y de la solución de prueba, tiempo, de incubación, etc.).

MGA 0316. DETERMINACIÓN DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

 378 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, duodécima edición.
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La prueba es válida si se cumplen las siguientes condiciones: Tabla 0316.5. Preparación de soluciones para la prueba de
M 1. El valor absoluto del coeficiente de variación de la curva
interferencia en los métodos fotométricos.
estándar generada utilizando la solución C es mayor o igual a Solución Concentración de Réplicas
0.980. endotoxina
A Solución de ----- Al menos 2
MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS

2. El resultado de la solución D no excede el límite del valor prueba

del blanco requerido en la descripción del lisado empleado B Solución de Concentración Al menos 2
como reactivo o es menor que el límite de detección de prueba media de la curva
endotoxina del lisado empleado como reactivo. estándar
Calcular la recuperación media de la endotoxina agregada C Agua libre de Al menos tres Al menos 2
restando la concentración media de endotoxina en la solución, endotoxinas concentraciones la para cada
si la hubiera (solución A, tabla 0316.5), de la que contiene la más baja es λ concentración
endotoxina agregada (solución B, veáse tabla 0316.5). D Agua libre de ------ Al menos 2
Si la solución de prueba está libre de factores de interferencia, endotoxinas
la concentración de la endotoxina adicionada a la solución de Solución A = Solución de prueba, sin exceder la MDV.
prueba está entre 50 y 200 % de la concentración de Solución B = Solución de prueba, adicionada de endotoxina en una
endotoxina adicionada, después de restar cualquier cantidad de concentración igual o cercana a la concentración media de la curva
endotoxina detectada en la solución a la cual no se adicionó estándar.
Solución C = Curva estándar (controles positivos) a las
endotoxina.
concentraciones utilizadas en la validación del método descrito.
Cuando el recobro de endotoxina está fuera del intervalo Solución D = Control negativo de agua para la prueba de endotoxina.
especificado, se considera que la solución de prueba contiene
factores de interferencia. En este caso se debe repetir la prueba
utilizando una dilución mayor que no exceda la MDV. El MGA 0321. DETERMINACIÓN DE
factor de interferencia de la solución de prueba también podría EPINEFRINA
eliminarse con un tratamiento validado como por ejemplo,
Una solución de epinefrina, al adicionar una solución de
filtración, neutralización, diálisis o calentamiento. Para
sulfato ferroso y un amortiguador adecuado, desarrolla un
establecer que el tratamiento elegido elimina la interferencia
color azul-rojizo. La reacción de color es específica para
sin pérdida de endotoxina, realizar la valoración descrita
compuestos que poseen grupos fenólicos en posición orto,
anteriormente usando la preparación a examinar a la que se ha
formándose un complejo epinefrina-ión ferroso. La
agregado endotoxina estándar y se ha sometido posteriormente
absorbancia de esta solución se determina a una longitud de
al tratamiento seleccionado.
onda de 530 nm y es una medida de la cantidad de epinefrina;
el color varía con el pH de la solución y alcanza una intensidad
DETERMINACIÓN DE ENDOTOXINAS POR LOS
máxima a un pH de 8.0 a 8.5.
MÉTODOS FOTOMÉTRICOS
Solución ferrocítrica. Preparar el día que se va a utilizar.
Preparar las soluciones como se indica en la tabla 0316.5. Disolver 1.5 g de sulfato ferroso en 200 mL de agua a la
cual se le ha adicionado 1.0 mL de ácido clorhídrico diluido
Cálculos. Calcular la concentración de endotoxina de cada
(1:12) y 1.0 g de bisulfito de sodio. Disolver 500 mg de citrato
réplica de la solución A utilizando la curva estándar (solución
de sodio en 10 mL de esta solución y mezclar.
C).
Solución amortiguadora. Mezclar en un matraz volumétrico
La prueba se considera válida si: de 50 mL, 4.2 g de bicarbonato de sodio, 5.0 g de bicarbonato
de potasio y 18 mL de agua (no se disuelven todos los sólidos).
El resultado obtenido en la solución D no excede el Por separado adicionar, en 18 mL de agua, 3.75 g de ácido
límite del valor especificado por el fabricante del lisado aminoacético y 1.7 mL de solución de hidróxido de amonio
o es menor que el límite de detección del lisado 6 N, mezclar y disolver, transferir esta solución al matraz
empleado. volumétrico de 50 mL que contiene la otra mezcla. Diluir al
Los resultados obtenidos en la curva estándar (solución volumen con agua y mezclar hasta que la solución sea
C) cumplen con los requerimientos definidos en la completa.
validación. Preparación de referencia. Pesar de 18 mg de la SRef de
La concentración de endotoxina determinada en la bitartrato de epinefrina y transferir a un matraz volumétrico de
solución B, después de restar la cuantificada en la 100 mL con ayuda de 20 mL de solución de bisulfito de sodio
solución A, debe estar en el intervalo entre 50 y 200 %. (1 en 50) diluir al volumen con agua y mezclar. Transferir
5 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 50 mL,
La muestra cumple con la prueba si la concentración media de diluir al volumen con solución de bisulfito de sodio (1 en 500)
endotoxina de las réplicas de la solución A, después de tomar y mezclar.
en cuenta la corrección por dilución y concentración, es menor Nota: hacer la dilución final al efectuar la prueba.
del límite de endotoxina especificado en la monografía del Esta solución tiene una concentración de bitartrato de
producto. epinefrina de aproximadamente 18 µg/mL.

MGA 0321. DETERMINACIÓN DE EPINEFRINA