La técnica ELISA de tipo sándwich identifica y cuantifica antígenos mediante el uso de dos anticuerpos (de captura y detección) que reconocen dos epítopos diferentes del antígeno. Es crítico seleccionar los pares de anticuerpos evaluando su afinidad, especificidad y título. El procedimiento implica tapizar placas con el anticuerpo de captura, agregar la muestra, luego el conjugado y finalmente un sustrato para detectar la presencia de inmunocomplejos.
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La técnica ELISA de tipo sándwich identifica y cuantifica antígenos mediante el uso de dos anticuerpos (de captura y detección) que reconocen dos epítopos diferentes del antígeno. Es crítico seleccionar los pares de anticuerpos evaluando su afinidad, especificidad y título. El procedimiento implica tapizar placas con el anticuerpo de captura, agregar la muestra, luego el conjugado y finalmente un sustrato para detectar la presencia de inmunocomplejos.
La técnica ELISA de tipo sándwich identifica y cuantifica antígenos mediante el uso de dos anticuerpos (de captura y detección) que reconocen dos epítopos diferentes del antígeno. Es crítico seleccionar los pares de anticuerpos evaluando su afinidad, especificidad y título. El procedimiento implica tapizar placas con el anticuerpo de captura, agregar la muestra, luego el conjugado y finalmente un sustrato para detectar la presencia de inmunocomplejos.
La técnica ELISA de tipo sándwich identifica y cuantifica antígenos mediante el uso de dos anticuerpos (de captura y detección) que reconocen dos epítopos diferentes del antígeno. Es crítico seleccionar los pares de anticuerpos evaluando su afinidad, especificidad y título. El procedimiento implica tapizar placas con el anticuerpo de captura, agregar la muestra, luego el conjugado y finalmente un sustrato para detectar la presencia de inmunocomplejos.
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La técnica de ELISA tipo sándwich identifica y cuantifica los antígenos entre dos
capas de anticuerpos (anticuerpos de captura y anticuerpos de detección) que
necesariamente deberá reconocer dos epítopos diferentes de dicho antígeno a fin de no interferir entre ellos en la unión al mismo. Lo critico es seleccionar correctamente los pares de anticuerpos que se usaran en el ensayo ya que es necesario evaluar tanto la afinidad y especificidad como el título de los mismos. PROCEDIMIENTO Se van a usar placas de microtitulación 1. Preparar la placa, tapizándola con el anticuerpo de captura. Lo cual se logra de la siguiente manera: - Se va a transferir el anticuerpo de captura (anticuerpo monoclonal) en los micropocillos de la placa, posteriormente se deja incubando a temperatura ambiente con el fin de que queden fijados en la placa. - Posteriormente, se extrae el sobrenadante y se procede a realizar 3 lavados para eliminar aquellos anticuerpos que no lograron adherirse a la placa - El siguiente paso es bloquear los pocillos, este proceso permite bloquear todos aquellos espacios que han quedado sin unir en el pocillo, evitando que posteriormente se unan otras moléculas que puedan intervenir con el resultado. Generalmente se utiliza sustancias que no reaccionen con los anticuerpos o con los reactivos a utilizar. Habitualmente se usa la albumina serica bovina. - Se añade la sustancia bloqueante y se incuba el tiempo necesario para que se fije en la placa - A continuación, se elimina el sobrenadante y se procede a realizar el lavado. Una vez tapizada la placa con el anticuerpo de captura, comienza el procedimiento del ensayo. 2. Se añade la muestra a los pocillos correspondientes y se incuba la placa a temperatura ambiente. En caso de que los antigenos buscados se encuentren en la muestra, estos se unen a los anticuerpos fijados en los pocillos. Una vez incubado se procede a retirar el sobrenadante y se realizan tres lavados con el tampon adecuado. 3. El siguiente paso consiste en añadir el conjugado (conjugado: anticuerpo unido a una enzima), y se procede a incubar. En donde el conjugado se unirá al inmunocomplejo formado en el paso anterior. Se elimina el sobrenadante y se realiza 3 lavados. 4. Para saber si existe la presencia de inmunocomplejos se utiliza una mezcla con el sustrato de la enzima (peróxido de hidrogeno H2O2) y un cromógeno (OPD; ortofenilendiamina). Se añade esta mezcla a los pocillos, durante la incubación el sustrato se rompe liberando oxigeno provocando que el OPD se oxide y cambie de color 5. Para detener la reacción se añade acido (H2SO4: acido sulfúrico) a los pocillos, el cual desnaturaliza la enzima y estabiliza el color. La reacción es positiva cuando pasa de un amarillo pálido a un marrón Mayor especificidad por el uso de dos anticuerpos primarios dirigidos al antígeno (el antígeno es específicamente capturado y detectado) Existe otra variante de la técnica conocida como ELISA de sándwich indirecta, donde se utilizan tres anticuerpos, debido a que el segundo anticuerpo especifico contra el antigeno no esta directamente conjugado con la enzima, sino que utiliza un tercer anticuerpo antiinmunoglobulina humana, que si esta conjugado con la enzima para que se una al segundo anticuerpo. Los ensayos sándwich doble antígeno, son usados para la detección de anticuerpos y son muy útiles para la evaluación de la respuesta inmune inducida por vacunas; en estos ensayos, al igual que en los indirectos, los antígenos capturan los anticuerpos, pero en esta ocasión en lugar de un conjugado anti-inmunoglobulina-enzima, usamos antígeno- enzima, de esta forma se alcanza la máxima sensibilidad y detectabilidad al no ser necesario diluir las muestras; sin embargo, detectamos todas las clases de inmunoglobulinas, lo que en ocasiones no es conveniente. En el ELISA tipo sándwich el antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de captura y otro de detección también conocidos como pares de anticuerpos, que se unirán a dos epítopos distintos de un mismo antígeno. Toda prueba de ELISA tiene en común los siguientes componentes: un antigeno o un anticuerpo especifico marcado con una enzima, un soporte, un sustrato que será transformado por la enzima en un producto detectable y un sistema para detectarlo. TAPON DE LAVADO: Esta solución ayuda a mantener las características morfológicas de los anticuerpos y sus respectivos epítopos para facilitar en enlace específico necesario en una reacción inmunohistoquímica.
Los mejores pares de anticuerpos se seleccionarán en función de: la intensidad de la
señal, la sensibilidad, el ruido de fondo. El buffer de bloqueo rellena los espacios que no han sido ocupados por las proteínas o los anticuerpos inmovilizados en la fase solida y con la función de prevenir uniones no especificas de los anticuerpos y evitar así falsos positivos y/o problemas de ruido de fondo. https://www.abyntek.com/tips-para-elegir-el-buffer-de-bloqueo/ MATERIALES: - Placas de micropocillos - Pipetas de diversos volúmenes - Puntas de pipeta - Lector de microplacas - Buffer de lavado - Diluyentes - Sistema de detección - Pareja de anticuerpos validada - Solución stop https://www.abyntek.com/seleccionar-pares-de-anticuerpos/
