6.

Proteínas catalíticas-enzimas

J. Fujii

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Tras leer este capítulo, el lector debe ser capaz de:

■ Describir las características de las reacciones enzimáticas

desde el punto de vista de la energía libre, el equilibrio y la
cinética.
■ Explicar la estructura y la composición de las enzimas,
incluido el papel de los cofactores, así como los estados
que afectan a las reacciones enzimáticas.
■ Describir la cinética enzimática según la ecuación de
Michaelis-Menten y la importancia de la constante de
Michaelis (Km).
■ Describir los elementos de la estructura enzimática
que explican su especificidad de sustrato y su actividad
catalítica.
■ Describir los mecanismos reguladores que afectan a las
reacciones enzimáticas, incluida la regulación por efectores
alostéricos y la modificación covalente. Fig. 6-1  Perfil de reacción en las reacciones enzimáticas y no
■ Diferenciar los principales tipos de inhibición enzimática enzimáticas. Los principios básicos de una reacción que está catali-
según la cinética enzimática. zada por una enzima son los mismos que los de cualquier reacción
■ Discutir la utilización terapéutica de los inhibidores química. Cuando ocurre una reacción química, el sustrato debe
enzimáticos y la utilidad diagnóstica de los análisis clínicos adquirir una energía de activación hasta un punto denominado
«estado de transición de la reacción», que posee un nivel de energía
enzimáticos.
máximo. Dado que el estado de transición de la reacción catalizada
por la enzima tiene una energía menor que en la reacción no catali-
zada, aquélla puede ocurrir más rápidamente. Complejo ES: complejo
enzima-sustrato; complejo EP: complejo enzima-producto.

INTRODUCCIÓN REACCIONES ENZIMÁTICAS

Casi todas las funciones biológicas se realizan gracias a reac-
ciones químicas catalizadas por catalizadores biológicos lla- Factores que afectan a las reacciones
mados enzimas. Un metabolismo eficaz está controlado por enzimáticas
unas vías metabólicas ordenadas, secuenciales y ramificadas.
Las enzimas sólo pueden acelerar reacciones bajo condiciones
fisiológicas, a 37 °C y con un pH neutro. Sin embargo, una
Efecto de la temperatura
enzima no puede alterar el equilibrio de una reacción, sólo En el caso de un catalizador inorgánico, la velocidad de reac-
puede acelerar la velocidad de la misma por disminución de ción aumenta con la temperatura del sistema y la tempera-
la energía de activación de la reacción (fig. 6-1). La regula- tura elevada puede utilizarse para acelerar una reacción.
ción de las actividades enzimáticas permite al metabolismo Por contraste, las enzimas normalmente funcionan como
adaptarse rápidamente a los cambios. Aunque casi todas las catalizadores a una temperatura constante (ambiente o cor-
enzimas son proteínas, algunas moléculas de ácido ribonu- poral). Sin embargo, en ensayos in vitro, la actividad enzimá-
cleico (denominadas ribozimas) presentan también actividad tica aumenta con la temperatura, pero luego disminuye con
catalítica (cap. 32). Según el análisis del genoma humano, una temperatura más alta. Por tanto, las enzimas muestran una
se estima que aproximadamente una cuarta parte de los temperatura óptima in vitro. Esto sucede porque las enzimas,
genes humanos codifican enzimas que catalizan reacciones igual que todas las proteínas, se desnaturalizan a temperatura
metabólicas. alta y pierden actividad.

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60 Proteínas catalíticas-enzimas

Efecto del pH hígado en la biosíntesis del colesterol. La actividad específica de

una enzima es útil para calcular su pureza; a mayor actividad
Toda enzima tiene un pH óptimo, puesto que en las reacciones específica de una enzima, mayor es su pureza u homogeneidad.
catalíticas participan aminoácidos ionizables (como histidina,
glutamato y cisteína). Las enzimas citosólicas tienen un pH
óptimo en el intervalo de pH 7-8. La pepsina, secretada por las La especificidad de reacción
células gástricas y que actúa en el jugo gástrico, tiene un pH
óptimo de 1,5-2,0; la tripsina y la quimiotripsina tienen un
y la especificidad de sustrato están
pH óptimo alcalino, compatible con su actividad digestiva en determinadas por la estructura
el jugo pancreático alcalino; las enzimas lisosomales tienen un del centro activo
pH óptimo ácido. La sensibilidad al pH de las enzimas se debe La mayoría de las enzimas son muy específicas tanto para el
al efecto del pH sobre la carga iónica de las cadenas laterales de tipo de reacción que catalizan como para el tipo de sustrato. La
aminoácidos de las enzimas. Diversos solutos, como sustratos, especificidad de reacción (es decir, la reacción catalizada por
productos, iones metálicos y moléculas reguladoras, también la enzima) está determinada químicamente por los residuos
afectan a la velocidad de las reacciones enzimáticas. aminoácidos que se encuentran en el centro catalítico de la
enzima. En general, el centro activo de la enzima está formado
por el lugar de fijación del sustrato y por el centro catalítico.
Definición de actividad enzimática La especificidad de sustrato está determinada por el tamaño, la
estructura, las cargas, la polaridad y el carácter hidrófobo de
A efectos de estandarización, la actividad de una enzima se mide su lugar de fijación. Esto se debe a que, como primer paso de
bajo condiciones definidas (temperatura, pH, concentración de la reacción, el sustrato debe fijarse al centro activo y preparar
tampón, sustrato y coenzima). La tasa o velocidad (v) de una así la catálisis. Las enzimas muy específicas (p. ej., la catalasa
reacción enzimática bajo estas condiciones se define como la y la ureasa, que degradan el H2O2 y la urea, respectivamente)
velocidad de conversión del sustrato en producto por unidad de catalizan sólo una reacción química específica, pero algunas
tiempo. Una unidad de enzima es una medida de la cantidad de enzimas tienen una especificidad de sustrato más amplia. Las
enzima. La unidad internacional (UI) utilizada habitualmente serina proteasas constituyen un ejemplo característico de este
para una enzima es la cantidad que cataliza la conversión de un grupo de enzimas. Se trata de una familia de enzimas estrecha-
micromol de sustrato en producto por minuto (1 UI = 1  mmol/ mente relacionadas (p. ej., enzimas pancreáticas, quimiotrip-
min). El katal es una unidad internacional para la cantidad de sina, tripsina y elastasa) que en el centro catalítico contienen
enzima que cataliza la conversión de 1 mol de sustrato en 1 mol un residuo de serina reactivo. Estas enzimas catalizan la hidró-
de producto por segundo (1  kat = 1  mol/s). Dado que el katal lisis de los enlaces peptídicos de la proteína, cuando el lado
generalmente es una cifra muy pequeña, como unidad estándar carboxilo del enlace es aportado sólo por determinados ami-
de actividad se utiliza con mayor frecuencia la unidad interna- noácidos. Aunque tienen unas estructuras y mecanismos cata-
cional, una cifra mucho mayor. líticos similares, a causa de los rasgos estructurales del centro
La actividad específica de una enzima, una medida de la acti- de fijación del sustrato, sus especificidades de sustrato son muy
vidad por cantidad de proteína, se expresa en mmol/min/mg distintas (fig. 6-2).
de proteína o UI/mg de proteína. La actividad específica de las Las isoenzimas son enzimas que catalizan la misma reacción,
enzimas es muy variable entre los tejidos, depende de su función pero tienen una estructura primaria y/o composición subuni-
metabólica. Por ejemplo, las enzimas para la síntesis del coleste- taria diferentes. En el suero se determinan para diagnóstico las
rol tienen una actividad específica (UI/mg de tejido) más elevada concentraciones de algunas enzimas e isoenzimas específicas de
en el hígado que en el músculo, lo que coincide con el papel del tejidos (fig. 6-3 y tabla 6-1).

Fig. 6-2  Características de los centros de

fijación del sustrato en la quimotripsina,
tripsina y elastasa (serina proteasas). En
la quimotripsina, un bolsillo hidrófobo se fija
a residuos de aminoácidos aromáticos como
la fenilalanina (Phe). En la tripsina, en el cen-
tro de fijación del sustrato la carga negativa
del residuo aspartato favorece la escisión
en el lado carboxilo de residuos de arginina
(Arg) y de lisina (Lys) cargados positivamente.
En la elastasa, las cadenas laterales de valina
y treonina bloquean el centro de fijación del
sustrato y permiten la fijación de aminoácidos
de cadenas laterales pequeñas o sin cadena
lateral como la glicina (Gly).
 Reacciones enzimáticas 61

Fig. 6-3 Patrones densitométricos de las isoenzimas de la LDH en el suero de pacientes con diagnóstico de infarto de miocardio o de
hepatitis aguda. Las isoenzimas (que difieren ligeramente de carga) son separadas por electroforesis en acetato de celulosa, visualizadas mediante
un sustrato cromogénico y cuantificadas por densitometría. En estos pacientes también aumenta la actividad total de la LDH sérica. La hemólisis libera
LDH de los hematíes y repercute sobre el diagnóstico, por lo que las muestras de sangre han de manejarse con cuidado. La determinación de la LDH
para el diagnóstico del infarto de miocardio ha sido sustituida actualmente por análisis de las concentraciones plasmáticas de troponina.

Algunas enzimas utilizadas en el diagnóstico Clasificación de las enzimas

clínico de enfermedades
Clase Reacción Enzimas
Enzima Tejido Uso diagnóstico
1. Oxidorreductasas Ared + Box→Aox + Bred Deshidrogenasas,
AST Corazón, Hepatopatía peroxidasas
músculo
2. Transferasas A—B + C→A + B—C Hexocinasa,
esquelético,
transaminasas
hígado, cerebro
3. Hidrolasas A—B + H2O→ Fosfatasa alcalina,
ALT Hígado Hepatopatía (p. ej., hepatitis)
A—H + B—OH tripsina
(ALT > AST)
4. Liasas (sintasas) A(XH)—B→ Anhidrasa carbónica,
Amilasa Páncreas, Pancreatitis aguda, obstrucción
A—X + B—H deshidratasa
glándulas biliar
salivales 5. Isomerasas A ⇌ ISO—A Triosa-fosfato-
isomerasa,
CK Músculo Distrofia muscular, infarto de
fosfoglucomutasa
esquelético, miocardio
corazón, cerebro 6. Ligasas (sintetasas) A + B + ATP→ Piruvato-carboxilasa,
A—B + ADP + Pi ADN-ligasa
GGT Hígado Hepatitis, cirrosis

LDH Corazón, Linfoma, hepatitis Tabla 6-2 Clasificación de las enzimas. Principales clases de enzimas.
hematíes hígado

Lipasa Páncreas Pancreatitis aguda, obstrucción

biliar
© ELSEVIER. Fotocopiar sin autorización es un delito.

número de clasificación enzimática (EC, enzyme classification) de

Fosfatasa alcalina Osteoblasto Enfermedad ósea, tumores óseos
cuatro dígitos. El primer dígito indica una de las seis principales
Fosfatasa ácida Próstata Cáncer de próstata clases de enzimas de la tabla 6-2. Los dos dígitos siguientes indi-
can subclases y subsubclases de sustratos; el cuarto dígito indica
ALT: alanina aminotransferasa; AST: aspartato aminotransferasa; CK: creatina el número de serie de la enzima específica. La transferencia de
fosfocinasa; GGT: gamma-glutamil-transferasa; LDH: lactato deshidrogenasa. equivalentes de reducción de un sistema redox (oxidorreduc-
ción) a otro está catalizado por oxidorreductasas (clase 1). La
Tabla 6-1 Algunas enzimas utilizadas en el diagnóstico clínico de
transferencia de otros grupos funcionales de un sustrato a otro
enfermedades.
está catalizado por transferasas (clase 2). Las hidrolasas (clase 3)
catalizan la transferencia de grupo, pero la molécula aceptora
es exclusivamente una molécula de agua. Las reacciones rela-
Nomenclatura de las enzimas cionadas con la adición o extracción de H2O, NH3 o CO2 son
Para sistematizar las diferentes enzimas que catalizan los miles catalizadas por liasas (clase 4), denominadas también sintasas.
de reacciones que ocurren en el organismo es necesario con- Las isomerasas (clase 5) catalizan las reacciones de isomeri-
tar con una clasificación. A todas las enzimas se les asigna un zación recolocando los átomos de una molécula, por lo que no
62 Proteínas catalíticas-enzimas

 SPECIFICIDAD HÍSTICA DE LAS

E  ROPORCIÓN DE GENES
P
ISOENZIMAS DE LA LACTATO DE ENZIMAS EN EL GENOMA
DESHIDROGENASA HUMANO COMPLETO

Una mujer de 56 años ingresa en la unidad de cuidados inten- Aproximadamente una cuarta parte de los genes codifica enzi-
sivos. La paciente ha presentado febrícula durante 1 semana, mas. En el total de 26.383 genes humanos, los nombres de los
con dolor torácico y disnea durante las últimas 24 horas. No se grupos de enzimas con número y proporción (porcentaje en
aprecian alteraciones en la radiografía de tórax ni en el electro- paréntesis) fueron los siguientes: transferasa, 610 (2,0); sintasa
cardiograma. Sin embargo, un análisis de sangre muestra los y sintetasa, 313 (1,0); oxidorreductasa, 656 (2,1); liasa, 117
siguientes resultados: leucocitos, 12.100/mm3 (valor normal, (0,4); ligasa, 56 (0,2); isomerasa, 163 (0,5); hidrolasa, 1.227
4.000-9.000/mm3); hematíes, 240 × 104/mm3; hemoglobina, (4,0); cinasa, 868 (2,8), y enzima de ácido nucleico, 2.308
8,6 g/dl, y lactato deshidrogenasa (LDH) = 1.400 UI/l (valor nor- (7,5). Aquí se citan datos originales (Venter et al, Science
mal, 200-400 UI/l). Las concentraciones de otras enzimas son 2001;291:1335), por lo que la clasificación no coincide exacta-
normales. Según estos resultados, el perfil de isoenzimas de mente con la nomenclatura de la tabla 6-2.
LDH y otros datos, finalmente se diagnostica un linfoma
maligno.

Comentario. La LDH es una enzima tetramérica formada por

dos subunidades diferentes de 35 kDa. El corazón contiene ISOENZIMAS
principalmente la subunidad tipo H, y el músculo esquelético
y el hígado contienen sobre todo la subunidad tipo M; estas
En el laboratorio clínico se determinan con frecuencia las isoen-
subunidades están codificadas por genes distintos. A partir de
zimas con objeto diagnóstico (v. fig. 6-3). La definición de las
estas subunidades pueden formarse cinco tipos de isoenzimas
isoenzimas a menudo es operacional, es decir, se basa en unos
tetraméricas: H4 (LDH1), H3M1 (LDH2), H2M2 (LDH3), H1M3
métodos de análisis simples y reproducibles que en ocasiones
(LDH4) y M4 (LDH5). Dado que las distribuciones de las isoen-
no requieren hacer un análisis preciso de la estructura de la
zimas difieren entre los distintos tejidos, es posible diagnosti-
enzima. El término «isoenzima» se utiliza a menudo para refe-
car la lesión de un tejido haciendo un análisis de la LDH total
rirse a: (1) variantes genéticas de una enzima; (2) proteínas
seguido de la determinación de isoenzimas (fig. 6-3).
genéticamente independientes y con escasa homología;
(3) heteropolímeros de dos o más cadenas polipeptídicas no
unidas por enlaces covalentes; (4) enzimas no relacionadas que
catalizan reacciones similares (p. ej., enzimas conjugadas con
afectan a la composición atómica del sustrato. Las ligasas, tam- diferentes grupos prostéticos o que requieren coenzimas o
bién llamadas sintetasas (clase 6), utilizan ATP para catalizar cofactores distintos), y (5) formas diferentes de una cadena
reacciones de síntesis dependientes de energía. En general, las polipeptídica única, por ejemplo, por variación de la composi-
enzimas se citan por su nombre común, como ribonucleasa pan- ción de hidratos de carbono, desaminación de aminoácidos o
creática bovina, pero los números de la EC son fundamentales modificación proteolítica.
para algunos fines, por ejemplo, para obtener información en
bancos de datos de proteínas (cap. 2) y para investigar relaciones
estructura-función. de las coenzimas se describe en capítulos sucesivos. Los grupos
prostéticos están firmemente unidos a una enzima, a menudo de
forma covalente, y permanecen asociados a la enzima durante
Funciones de las coenzimas todo el ciclo catalítico. Para su actividad, algunas enzimas nece-
sitan iones inorgánicos (metálicos) denominados con frecuencia
Las moléculas facilitadoras conocidas como coenzimas desem- cofactores, por ejemplo, las enzimas de la coagulación sanguínea
peñan un cometido esencial en las reacciones catalizadas por que requieren Ca2+ y las oxidorreductasas, que a su vez utilizan
enzimas. Las enzimas con coenzimas unidas mediante enlace hierro, cobre y manganeso.
covalente o no covalente se denominan holoenzimas. Una
holoenzima sin coenzima se denomina apoenzima. Hay dos clases
de coenzimas. Las coenzimas solubles se unen de forma reversible CINÉTICA ENZIMÁTICA
a la fracción proteica de la enzima. Con frecuencia se modifican
durante la reacción enzimática, después se disocian de la enzima
y son recicladas por otra enzima; las oxidorreductasas (descritas Ecuación de Michaelis-Menten: un modelo
en el cap. 9) tienen coenzimas que pueden ser oxidadas por una simple de una reacción enzimática
enzima, y después reducidas y recicladas por otra. Las coenzimas,
como la coenzima A, ayudan en el transporte de intermediarios de Las reacciones enzimáticas tienen múltiples pasos y com-
una enzima a otra durante una secuencia de reacciones. La mayo- prenden varias reacciones parciales. En 1913, mucho antes de
ría de coenzimas son derivados de las vitaminas. Los derivados de conocerse la estructura de las proteínas, Michaelis y Menten
las vitaminas B (niacina y riboflavina) actúan como coenzimas en elaboraron un modelo simple para examinar la cinética de
las reacciones de las oxidorreductasas. La estructura y la función las reacciones catalizadas por enzimas (fig. 6-4). El modelo de
 Cinética enzimática 63

Por tanto, el valor de v se obtiene así:

Puesto que kcat [E]t corresponde a la velocidad máxima, Vmax,

que se alcanza a altas concentraciones de sustrato, obtenemos la
ecuación de Michaelis-Menten:

El análisis de las ecuaciones anteriores indica que la constante

de Michaelis (Km) se expresa en unidades de concentración y que
corresponde a la concentración de sustrato en que v es el 50% de
1
la velocidad máxima, es decir, [ES] = ​ __
2 ​[E]t y v = Vmax/2.
Fig. 6-4 Propiedades de la glucocinasa y de la hexocinasa. La glu- El modelo de Michaelis-Menten se basa en las siguientes
cocinasa y la hexocinasa catalizan la misma reacción: la fosforilación suposiciones:
de la glucosa a glucosa-6-fosfato (Glc-6-P). Las enzimas presentan
diferencias en sus propiedades cinéticas y tienen distribuciones hísticas
■ E, S y ES están en un equilibrio rápido.
y funciones fisiológicas diferentes. ■ Aparte de E y ES, no hay otras formas presentes de la enzima.
■ La conversión de ES en E + P es un paso irreversible y
limitante. Si bien todas las reacciones catalizadas por enzimas
Michaelis-Menten supone que el sustrato S se une a la enzima en teoría son reversibles, normalmente las velocidades
E, formando un intermediario esencial, el complejo enzima-sus- iniciales se miden, es decir, cuando la concentración de
trato (ES), que luego reacciona en la superficie de la enzima y se producto y, por tanto, la reacción inversa, es insignificante.
descompone en E + producto (P). El modelo presupone que E, S y
ES se encuentran todos en equilibrio rápido uno respecto a otro, ISOENZIMAS: GLUCOCINASA
que se alcanza rápidamente una concentración estacionaria de Y HEXOCINASA
ES y que la descomposición del complejo ES en E + P es el paso
limitante de la velocidad de catálisis. La hexocinasa cataliza en todas las células el primer paso del
La constante catalítica, kcat (conocida también como número metabolismo de la glucosa, la reacción de fosforilación de la
de recambio) es una constante de velocidad que describe la glucosa por el trifosfato de adenosina (ATP) para formar glu-
rapidez con que una enzima cataliza una reacción. La kcat se cosa-6-fosfato (Glc-6-P):
define como el número de moléculas de sustrato que pueden
convertirse en producto por molécula de enzima y por unidad de glucosa+ATP →glucosa   6-fosfato+ADP
tiempo. La proporción de ES, en relación con el número total de Esta enzima tiene una baja Km para la glucosa (0,2 mmol/l) y
moléculas de enzima [E]t, es decir, la relación [ES]/[E]t, limita la es inhibida alostéricamente por su producto, Glc-6-P. Puesto
velocidad (v) de una enzima, de manera que: que las concentraciones normales de glucosa en sangre son de
aproximadamente 5 mmol/l y las concentraciones intracelulares
de 0,2-2 mmol/l, la hexocinasa cataliza de modo eficaz esta
reacción (50-90% de Vmax) bajo condiciones normales (p. ej.,
Puesto que E, S y ES se encuentran todos en equilibrio quí-
en el músculo).
mico, la enzima alcanza una velocidad máxima (Vmax) a concen-
Los hepatocitos (que almacenan glucosa en forma de glucó-
traciones de sustrato [S] muy elevadas (saturantes), cuando
geno) y las células b del páncreas (que regulan el consumo de glu-
[ES] ≈ [E]t. Por tanto:
cosa en los tejidos y su almacenamiento en el hígado mediante la
secreción de insulina), contienen una isoenzima denominada glu-
© ELSEVIER. Fotocopiar sin autorización es un delito.

cocinasa. La glucocinasa cataliza la misma reacción que la hexoci-

Para la disociación del complejo ES, la ley de acción de masas nasa, pero tiene una Km más alta para la glucosa (10 mmol/l) y no
implica: está inhibida por la Glc-6-P. Dado que la glucocinasa tiene una Km
muy superior a la hexocinasa, a medida que las concentraciones
de glucosa en sangre aumentan después de una comida, la glu-
cocinasa fosforila la glucosa de un modo cada vez más eficaz
(v. fig. 6-4). Una de las funciones fisiológicas de la glucocinasa en el
Teniendo en cuenta que: hígado es proporcionar Glc-6-P para la síntesis de glucógeno (una
forma de almacenamiento de la glucosa). En las células b del pán-
creas, la glucocinasa funciona como sensor de glucosa y deter-
mina el umbral de secreción de la insulina. Los ratones que no
puede demostrarse que: tienen glucocinasa en las células b pancreáticas mueren a causa
de hiperglucemia profunda durante los primeros 3 días tras nacer
(su páncreas no secreta insulina; v. también cap. 21).
64 Proteínas catalíticas-enzimas

Se han desarrollado modelos cinéticos similares para describir

la cinética de enzimas con múltiples sustratos y productos.  ETERMINACIÓN DE LA
D
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
EN MUESTRAS CLÍNICAS
Utilización de las representaciones de
Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee para En los laboratorios clínicos, la actividad enzimática se mide en
calcular la Km y la Vmax presencia de concentraciones saturantes sustrato(s) y de coen-
zima. Se registran las velocidades iniciales para minimizar los
En una gráfica de la velocidad de reacción frente a la concen- errores que resultan de la reacción inversa. Bajo estas condicio-
tración de sustrato, la primera se acerca a la velocidad máxima nes v ≈ Vmax, la actividad enzimática es directamente propor-
(Vmax) de modo asintótico (fig. 6-5A), por lo que es difícil obtener cional a la concentración de enzima. La cantidad de enzima
unos valores precisos para Vmax y, por tanto, de Km (concentra- (actividad enzimática) se expresa habitualmente en UI/ml de
ción de sustrato requerida para obtener la mitad de la actividad plasma, suero o líquido cefalorraquídeo, más que por mg de
máxima) por extrapolación simple. Para solucionar este pro- proteína. Para las comparaciones interlaboratorio, deben estan-
blema, se han desarrollado varias transformaciones lineales de darizarse las condiciones del análisis enzimático (p. ej., las con-
la ecuación de Michaelis-Menten. centraciones utilizadas de sustrato y coenzima, el tampón y su
concentración, los iones y la fuerza iónica, el pH y la tempera-
tura). La mayor parte de las muestras clínicas se recogen en
Representación de Lineweaver-Burk ayunas, lo que asegura la constancia en la determinación de
La representación de Lineweaver-Burk (o de dobles ­recíprocos) sustancias cuya concentración pueda variar durante el día o de
se obtiene tomando la ecuación recíproca de la ­ecuación otros (glucosa, lípidos) cuyas concentraciones varían según sea
de Michaelis-Menten en estado estacionario (fig. 6-5B). la ingestión de alimentos. Las muestras lipémicas son turbias y
Reorganizando la ecuación, obtenemos: pueden ofrecer datos no fiables por fluorometría o espectro-
metría. Para evitar estos problemas, pueden extraerse los lípi-
dos de las muestras clínicas con un disolvente orgánico.

Esta ecuación proporciona una línea recta (y  =  mx +  b), con

y = 1/v, x = 1/[S], m, pendiente; b, intersección con y. Por tanto,
una curva de 1/v frente a 1/[S] (fig. 6-5B) tiene una pendiente de
Km/Vmax, una intersección 1/v de 1/Vmax, y una intersección 1/[S]
de –1/Km. Aunque la representación de Lineweaver-Burk se uti-
En este caso, la curva de v frente a v/[S] tiene un eje de y (inter-
liza mucho en el análisis cinético de las reacciones enzimáticas, el
sección de v) de Vmax, una intersección del eje de x (v/[S]) de
hecho de calcular los valores recíprocos de los datos induce a que
Vmax/Km y una pendiente de –Km. La representación de Eadie-
un pequeño error experimental, especialmente a concentraciones
Hofstee no comprime los datos a concentraciones elevadas de
de sustrato bajas, puede provocar un gran error en los valores de
sustrato.
Km y de Vmax determinados gráficamente. Una desventaja adicio-
nal es que los datos importantes obtenidos a altas concentraciones
de sustrato se concentran en una región estrecha cerca del eje 1/v.
MECANISMO DE ACCIÓN
Representación de Eadie-Hofstee
ENZIMÁTICA
Una segunda forma lineal muy utilizada de la ecuación de El mecanismo de acción de las enzimas varía significativamente.
Michaelis-Menten es la representación de Eadie-Hofstee (fig. 6-5C), En algunos casos, la catálisis se realiza sobre el sustrato ligado,
que se describe mediante la siguiente ecuación: sin una interacción covalente estable entre enzima y sustrato.

Fig. 6-5 Curvas de cinética enzi-

mática. Representaciones cinéticas
de las propiedades enzimáticas.
(A) Representación de Michaelis-
Menten de velocidad (v) frente
a concentración de sustrato [S].
(B) Representación de Lineweaver-
Burk. (C) Representación de Eadie-
Hofstee.
 Inhibición enzimática 65

En otros casos se forma, y luego se libera, un intermediario proteasas, este residuo de serina forma parte de una «tríada
covalente con la enzima y en otros toda la acción tiene lugar en catalítica», en el caso de la quimiotripsina: Asp102, His57 y Ser195
una coenzima que forma un enlace covalente con el sustrato. En (fig. 6-6). Las interacciones concertadas de los enlaces de hidró-
otros capítulos del libro se describen los mecanismos de acción geno entre estos aminoácidos aumentan la nucleofilicidad del
de varias enzimas. residuo de serina para que pueda atacar al átomo de carbono
Las serina proteasas (v. fig. 6-2) son un ejemplo de enzimas carbonilo del enlace peptídico del sustrato. La quimiotripsina es
que forman un intermediario covalente con sus sustratos. Estas específica para la escisión en el lado carboxilo de los enlaces pep-
enzimas escinden los enlaces peptídicos en las proteínas y, como tídicos que contienen aminoácidos aromáticos, como la fenila-
sucede en todas las reacciones enzimáticas, en la reacción cata- lanina. En la figura 6-7 se presenta el mecanismo de la reacción
lizada por enzimas participan grupos funcionales en las cadenas enzimática, que muestra la formación y escisión de un interme-
laterales de aminoácidos. En la familia de las serina proteasas, diario ligado a una enzima.
un residuo de serina en el centro activo cataliza la escisión del La tripsina y la elastasa, otras dos enzimas digestivas con
enlace peptídico. El grupo funcional en la serina, un alcohol diferentes especificidades de aminoácidos, son similares a la
primario, no es uno de los grupos funcionales más reactivos quimiotripsina en muchos sentidos. Alrededor del 40% de las
en química orgánica. Para potenciar su actividad en las serina secuencias de aminoácidos de las tres enzimas son idénticas y
sus estructuras tridimensionales son muy similares. Las tres
enzimas contienen la tríada catalítica aspartato-histidina-serina
y son inactivadas por la reacción de fluorofosfatos con el residuo
de serina activo. El gas neurotóxico (diisopropilfluorofosfato)
forma un éster serina-diisopropilfosfato estéricamente obstacu-
lizado, que es hidrolizado muy lentamente.

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Las enzimas pueden inhibirse

de diferentes formas
Entre las numerosas sustancias que afectan a los procesos
metabólicos, los inhibidores enzimáticos tienen una especial
importancia. Naturales o sintéticos, muchos fármacos actúan
como inhibidores enzimáticos. Además, los metabolitos de estos
compuestos también pueden inhibir la actividad enzimática.
Aunque la mayor parte de los inhibidores enzimáticos tienen
una acción reversible, también existen inhibidores irreversibles
que modifican permanentemente las enzimas diana. Mediante
las representaciones de Lineweaver-Burk es posible distinguir
Fig. 6-6 Modelo esquemático de una tríada catalítica de una serina tres formas de inhibición reversible: competitiva, acompetitiva y
proteasa. no competitiva.
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Fig. 6-7 Mecanismo de acción de la quimiotripsina. El residuo de serina del centro activo ataca al grupo carbonilo del enlace peptídico en el
lado carboxilo de un residuo de fenilalanina. El péptido carboxiterminal se libera y el péptido aminoterminal sigue siendo un intermediario ligado a
la enzima, el péptido aminoterminal unido con la fenilalanina carboxiterminal esterificada al centro activo del residuo de serina. El enlace éster es
hidrolizado en el segundo paso de la reacción para liberar el péptido aminoterminal y regenerar enzima activa.
66 Proteínas catalíticas-enzimas

Los inhibidores competitivos producen un del acceso del sustrato al centro activo. El esquema de reacción
aumento aparente de la Km, sin modificar de la inhibición competitiva es:
la Vmax
Una enzima puede ser inhibida competitivamente por sustancias
cuya estructura química es similar a la del sustrato. Estos com-
puestos se unen en el centro activo y compiten con el sustrato
por el centro activo de la enzima; causan un aumento aparente
en Km, pero ningún cambio en Vmax (fig. 6-8). La inhibición no
es el resultado de un efecto sobre la actividad enzimática, sino

 RATAMIENTO DE LA
T
HIPERTENSIÓN CON UN INHIBIDOR
DE LA ENZIMA CONVERSORA DE
ANGIOTENSINA (ECA)

Un hombre de 50 años acude al hospital con fatiga general, ri-

gidez de hombro y cefalea. Mide 1,80 m y pesa 84 kg. La pre-
sión arterial es de 196/98 mmHg (valor normal, inferior a 140/90
mmHg; valor óptimo, inferior a 120/80 mmHg) y la frecuencia
del pulso de 74. Se diagnostica hipertensión y se administra
captopril (un IECA). A los 5 días de tratamiento la presión arte-
rial es casi normal.

Comentario. En el riñón, la renina convierte el angiotensi-

nógeno en angiotensina I, que luego es escindida proteo-
líticamente a angiotensina II por la enzima convertidora de
angiotensina (ECA). La angiotensina II aumenta la retención de
fluidos renales y de electrólitos, lo que contribuye a la apari-
Fig. 6-8  Inhibición enzimática competitiva. (A) Representación de
ción de hipertensión. En consecuencia, la inhibición de la acti-
velocidad frente a concentración de sustrato. (B) Mecanismo de la inhi-
vidad de la ECA es un objetivo importante del tratamiento de bición competitiva. (C) Representación de Lineweaver-Burk en presen-
la hipertensión. El captopril inhibe competitivamente la ECA y cia de un inhibidor competitivo. (D) Representación de Eadie-Hofstee
reduce la presión arterial (v. también cap. 23). en presencia de un inhibidor competitivo. K’m es la Km aparente en
presencia del inhibidor.

 A INTOXICACIÓN POR METANOL PUEDE TRATARSE

L
MEDIANTE LA ADMINISTRACIÓN DE ETANOL

Un hombre de 46 años acude a urgencias 7 h después de haber lentamente a formaldehído, que, a continuación, es metaboli-
consumido una gran cantidad de alcohol ilegal. No ve con clari- zado con rapidez a formato gracias a la alcohol-deshidrogenasa.
dad y presenta dolor abdominal y dorsalgia. Las pruebas de Durante la intoxicación por metanol se acumula formato, que es
laboratorio indican acidosis metabólica grave, osmolalidad sérica el responsable de la acidosis metabólica observada en los esta-
de 465 mmol/kg (intervalo de referencia, 285-295 mmol/kg), y dios más precoces. A causa de la inhibición de la respiración por
concentración sérica de metanol, 4,93 g/l (156 mmol/l). Mediante el formato, en estadios posteriores también puede acumularse
un tratamiento enérgico (goteo de etanol, bicarbonato y hemo- lactato. El etanol es metabolizado por la alcohol-deshidrogenasa,
diálisis) sobrevive y recupera la visión. que se fija al etanol con una afinidad mucho mayor que el meta-
nol o el etilenglicol. Por tanto, el etanol es un agente útil para
Comentario. La intoxicación por metanol es infrecuente aunque conseguir una inhibición competitiva e impedir que el metanol y
muy peligrosa. La intoxicación por etilenglicol es más habitual y el etilenglicol sean metabolizados a compuestos tóxicos. El meta-
presenta unas características clínicas similares. En la intoxicación nol y el etilenglicol no metabolizados se excretan gradualmente
por metanol, el síntoma inicial más importante son los trastornos por la orina. Así, junto con la administración de álcalis para com-
visuales. En estos pacientes, los resultados de laboratorio consis- batir la acidosis y la hemodiálisis para eliminar el metanol y sus
ten en acidosis metabólica grave y del aumento de la concentra- metabolitos tóxicos, el tratamiento precoz con etanol se asocia a
ción plasmática de soluto (metanol). El metanol es metabolizado un buen pronóstico.
 Inhibición enzimática 67

La constante de inhibición (Ki) es la constante de disociación del

complejo enzima-inhibidor (EI) y cuanto menor es la Ki, más efi- INHIBICIÓN ENZIMÁTICA:
ciente es la inhibición de la actividad enzimática. Sin embargo, INHIBICIÓN DEL ESTADO DE
independientemente de la Ki, la velocidad de la reacción catali- TRANSICIÓN Y SUSTRATO
zada por una enzima en presencia de un inhibidor competitivo SUICIDA
puede aumentar al incrementarse la concentración de sustrato,
porque el sustrato, a una concentración más alta, compite de
forma más eficaz con el inhibidor. Las enzimas catalizan reacciones induciendo el estado de tran-
sición de la reacción. Por tanto, debe ser posible construir
moléculas que se fijen muy fuertemente a la enzima simulando
En la inhibición acompetitiva disminuyen el estado de transición del sustrato. Los estados de transición
tanto la Km como la Vmax en sí no pueden aislarse, puesto que no constituyen una distri-
bución estable de átomos y porque algunos enlaces sólo se
Un inhibidor acompetitivo se fija al complejo enzima-sustrato, forman o se rompen parcialmente. Sin embargo, en el caso de
pero no a la enzima libre. La siguiente ecuación muestra el algunas enzimas pueden sintetizarse unos análogos que son
esquema de reacción de la inhibición acompetitiva. En este caso, estables y que presentan aún algunos de los rasgos estructura-
Ki es la constante de disociación para el complejo enzima-sus- les del estado de transición.
trato-inhibidor (ESI). La penicilina (fig. 6-9) es un buen ejemplo de un análogo del
estado de transición. La penicilina inhibe la transpeptidasa que
entrecruza las tiras de peptidoglucanos de la pared bacteriana
(el último paso de la síntesis de la pared celular de las bacterias).
Posee un anillo lactámico de 4 miembros que simula el estado de
transición del sustrato normal. Cuando la penicilina se fija al cen-
El inhibidor causa una disminución de la Vmax, puesto que
tro activo de la enzima, se abre su anillo lactámico y se forma un
una fracción del complejo enzima-sustrato es desviada por el
enlace covalente con un residuo de serina presente en el centro
inhibidor hacia el complejo ESI inactivo. La unión del inhibidor
activo. La penicilina es un potente inhibidor irreversible de la sín-
y el aumento del complejo ESI también pueden afectar a la diso-
tesis de la pared bacteriana y hace que las bacterias sean osmóti-
ciación del sustrato, causando un descenso aparente de la Km, es
camente frágiles e incapaces de sobrevivir en el organismo.
decir, un aumento aparente de la afinidad por el sustrato.

En la inhibición no competitiva disminuye

la Vmax
Un inhibidor no competitivo puede fijarse tanto a la enzima libre
como al complejo enzima-sustrato. Por tanto, la inhibición no
competitiva es más compleja que otros tipos de inhibición. La
siguiente ecuación muestra el esquema de reacción observada
para la inhibición no competitiva.

Fig. 6-9 Estructura de la penicilina que muestra el enlace peptí-

dico reactivo del anillo b-lactámico y la estructura central de las
cefalosporinas. Las penicilinas contienen un anillo b-lactámico junto
con un anillo de tiazolidina. Asimismo, las cefalosporinas son otra
clase de compuestos que contienen el anillo b-lactámico fusionado
con un anillo dihidrotiazínico de seis miembros. Debido a su eficacia y
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a la ausencia de toxicidad, los compuestos b-lactámicos se utilizan con

frecuencia como antibióticos. Las bacterias con b-lactamasa (que des-
Muchos fármacos y venenos inhiben truye el anillo b-lactámico) son resistentes a estos antibióticos.
las enzimas de modo irreversible
Las prostaglandinas son unos mediadores fundamentales de la
inflamación. Bajo condiciones de inflamación, su síntesis es ini- El disulfiram es un fármaco que se usa en el tratamiento del alco-
ciada por una oxidación (mediada por la ciclooxigenasa) y pos- holismo. El alcohol es metabolizado en dos pasos hasta convertirse
terior ciclación de araquidonato (cap. 40). Los compuestos que en ácido acético. La primera enzima, la alcohol-deshidrogenasa,
inhiben la ciclooxigenasa presentan actividad antiinflamatoria. produce acetaldehído, que es convertido en ácido acético por la
El ácido acetilsalicílico, uno de los fármacos más conocidos, aldehído-deshidrogenasa. Esta última enzima tiene un residuo de
inhibe la actividad de la ciclooxigenasa acetilando la Ser530, lo cisteína en el centro activo que es modificado irreversiblemente por
cual bloquea el acceso del araquidonato al centro activo de la el disulfiram, provocando una acumulación de alcohol y de acetal-
enzima. Otros antiinflamatorios no esteroideos (AINE), como la dehído en la sangre. Los pacientes que toman disulfiram se encuen-
indometacina, inhiben a la ciclooxigenasa de modo reversible tran mal a causa de la acumulación de acetaldehído en la sangre y
bloqueando el lugar de unión del araquidonato. los tejidos, lo que les lleva a evitar el consumo de alcohol.
68 Proteínas catalíticas-enzimas

Los reactivos alquilantes, como la yodoacetamida (ICH2CONH2), en el tripsinógeno inactivo. La reordenación de la estructura ter-
modifican el residuo de la cisteína esencial del centro activo e ciaria da lugar a la forma activa de la tripsina. A continuación, la
inhiben así de modo irreversible la actividad catalítica de algunas tripsina activa digiere proteolíticamente otros zimógenos (p. ej.,
enzimas. Los metales pesados, como las sales de mercurio y de procarboxipeptidasa, proelastasa y quimotripsinógeno), así como
plomo, también inhiben enzimas con residuos sulfhidrilo en el otras moléculas de tripsinógeno (cap. 10). Durante la coagulación
centro activo. Los aductos de mercurio a menudo son reversibles sanguínea y la fibrinólisis (disolución de los coágulos) se observan
mediante compuestos tioles. En la ingestión accidental de metales cascadas proteolíticas similares (cap. 7).
pesados, como antídoto a veces se administran huevos o clara de Puesto que el páncreas es un órgano importante en el control de
huevo; la proteína de la clara del huevo, la ovoalbúmina, es rica en la glucosa sanguínea, una activación no regulada de estas enzimas
grupos sulfhidrilo, atrapa los iones de metales libres e impide que produciría su inflamación y destrucción (pancreatitis), causando
se absorban en el tracto gastrointestinal. posiblemente la destrucción de células b y el desarrollo de diabetes.
En muchos casos se utilizan inhibidores irreversibles para
identificar los residuos aminoácidos del centro activo que parti-
cipan en la catálisis enzimática y, asimismo, para conocer mejor Regulación alostérica de las enzimas que
su mecanismo de acción. Por secuenciación o análisis espectro- catalizan los pasos limitantes en las vías
métrico de masas del péptido modificado, es posible identificar
metabólicas
el residuo aminoácido específico que ha sido modificado por el
inhibidor y que participa en la catálisis.
La curva de saturación de sustrato de una enzima «isostérica»
(forma única) es de tipo hiperbólico (v. fig. 6-5A). En cambio, las
enzimas alostéricas a menudo presentan unas curvas de velo-
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD cidad de reacción-concentración de sustrato [S] en forma de S
ENZIMÁTICA (fig. 6-10). Una molécula de efector alostérico se fija a la enzima en
un sitio distinto y físicamente alejado del centro de fijación del
En las vías metabólicas de múltiples pasos, la velocidad global sustrato y afecta a la unión del sustrato (Km) y/o la Kcat. En algu-
está limitada por el paso más lento. Por tanto, para regular la vía nos casos, el sustrato puede ejercer efectos alostéricos, lo que
metabólica, lo mejor es controlar las enzimas clave que partici- se conoce como «efecto homotrópico». Si el efector alostérico
pan en este «paso limitante de la velocidad». Por regla general, es distinto del sustrato, se conoce como «efecto heterotrópico».
en estos procesos participan cinco mecanismos independientes Los efectos homotrópicos se observan cuando la reacción de
en la regulación de la actividad enzimática: una molécula de sustrato con una enzima multimérica afecta
a la fijación de una segunda molécula de sustrato en un centro
■ La expresión de la proteína enzimática a consecuencia de activo distinto de la enzima. La interacción entre las subunida-
los cambios genéticos que tienen lugar en respuesta a las des hace que la fijación del sustrato sea «cooperativa» y que la
variaciones del entorno celular o de las demandas metabólicas. curva v-[S] tenga forma de S. Este efecto es, en esencia, idéntico
■ Las enzimas pueden ser activadas o inactivadas de modo al descrito para la fijación del O2 a la hemoglobina (cap. 5), con
irreversible por enzimas proteolíticas. la excepción de que, en el caso de las enzimas, la fijación del sus-
■ Las enzimas pueden ser activadas o inactivadas de modo trato ocasiona una reacción catalizada por una enzima.
reversible por modificaciones covalentes (p. ej., fosforilación).
■ La regulación alostérica modula la actividad de las enzimas
clave a través de la fijación reversible de pequeñas moléculas
en lugares distintos del centro activo; este proceso es
relativamente rápido y, por tanto, representa la primera
respuesta de las células a los cambios de condiciones.
■ La degradación de las enzimas por proteasas intracelulares en
el lisosoma (o por proteasomas en el citosol) también determina
sus vidas medias y, en consecuencia, la actividad enzimática
durante un período de tiempo mucho más prolongado.

Activación proteolítica
de las enzimas digestivas
Algunas enzimas se almacenan en un compartimento u orgánulo
específico (p. ej., vesículas exocitóticas en las células), en forma de Fig. 6-10  Regulación alostérica de la ATCasa. Curva de velocidad
precursores inactivos conocidos como proenzimas o zimógenos. (v) frente a concentración de sustrato en presencia de un activador o
de un inhibidor alostérico. La aspartato-transcarbamoilasa (ATCasa) es
Varias enzimas digestivas se almacenan como zimógenos inactivos
un ejemplo de enzima alostérica. El aspartato (sustrato) regula homo-
en el páncreas. Los zimógenos son secretados al jugo pancreático trópicamente la actividad de la ATCasa, dando una cinética sigmoidal.
después de una comida y se activan en el tracto gastrointestinal; La CTP, un producto metabólico final, inhibe heterotrópicamente la
el tripsinógeno se convierte en tripsina por acción de la entero- ATCasa; en cambio, el ATP, un precursor, activa heterotrópicamente
peptidasa intestinal. La enteropeptidasa (que se encuentra en la esta enzima. La ATCasa se estudia con mayor detalle en el capítulo 30
superficie interna del duodeno) hidroliza un péptido N-terminal (comparar fig. 5-7).
 Regulación de la actividad enzimática 69

LA HEMOFILIA ESTÁ CAUSADA  OS ANÁLOGOS DE LOS

L
POR UN DEFECTO EN LA NUCLEÓSIDOS SE UTILIZAN
ACTIVACIÓN DEL ZIMÓGENO COMO ANTIVÍRICOS

Un niño acude al hospital a causa de una hemorragia muscular Los análogos de los nucleósidos (p. ej., aciclovir y ganciclovir) se
que afecta al nervio femoral. Los resultados de laboratorio indi- han utilizado en el tratamiento de las infecciones por el virus del
can un trastorno de la coagulación sanguínea, hemofilia A herpes simple (VHS), el virus de la varicela-zóster (VZV) y el cito-
(causada por deficiencia del factor VIII). Se administra factor VIII megalovirus (CMV). Se trata de profármacos que son activados
al paciente para normalizar la coagulación. por fosforilación y que ponen fin a la síntesis de ADN vírico inhi-
biendo en el virus la reacción de la ADN-polimerasa. La timidina-
Comentario. La formación de un coágulo sanguíneo es el cinasa (TK) (más adecuadamente, una nucleósido-cinasa) de los
resultado final de una cascada de reacciones de activación de virus fosforila estos compuestos hasta su forma de monofosfato.
zimógeno. En el proceso participan más de una docena de A continuación, las cinasas celulares añaden fosfatos y forman
proteínas diferentes, conocidas como factores de coagulación. los compuestos trifosfato activos, que durante la replicación del
En el paso final, el coágulo sanguíneo se forma por la conver- ADN son inhibidores competitivos de la ADN-polimerasa vírica
sión de una proteína soluble, el fibrinógeno (factor I), en un (cap. 31). Mientras la TK vírica tiene una baja especificidad de
producto fibroso insoluble (fibrina) que actúa como matriz del sustrato y fosforila eficazmente a los análogos de los nucleósi-
coágulo. Este último paso está catalizado por una serina pro- dos, las nucleósido-cinasas celulares tienen una alta especificidad
teasa, la trombina (factor IIa). La hemofilia es un trastorno de de sustrato y apenas los fosforilan. Por tanto, las células infecta-
la coagulación sanguínea causado por un defecto en alguno de das por virus tienden a detenerse en un estadio específico del
los factores de la secuencia de la coagulación. La hemofilia A, la ciclo celular, el punto G2-M (cap. 43); en cambio, las células no
forma más común de la hemofilia (85%), se debe a un defecto infectadas son resistentes a los análogos de los nucleósidos.
del factor de coagulación VIII (v. cap. 7).

Fig. 6-11  Representación esque-

mática de la regulación alostérica.
(A) En la regulación homotrópica, el
sustrato actúa como un efector alos-
térico. Se presentan dos modelos.
En el modelo concertado, todas las
subunidades pasan simultáneamente
del estado T (tenso; baja afinidad
por el sustrato) al estado R (relajado;
alta afinidad por el sustrato); en el
modelo secuencial, cambian uno a
uno con cada reacción de fijación de
sustrato. (B) En la regulación hetero­
trópica, el efector es distinto del
sustrato y se fija en un centro estruc-
turalmente distinto de la enzima. Los
efectores positivo y negativo esta-
bilizan la enzima en el estado R y el
estado T, respectivamente.
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valores de H son superiores a 1 en los casos de cooperatividad

Cooperatividad positiva y negativa
positiva e inferiores a 1 en los de cooperatividad negativa. En la
La cooperatividad positiva indica que la reacción de un sustrato mayoría de las enzimas alostéricas, las concentraciones de sus-
con un centro activo facilita la reacción de otro sustrato en otro trato intracelulares están equilibradas cerca de la [S]0,5, de modo
centro activo. Por el contrario, la cooperatividad negativa indica que la actividad de la enzima responde a ligeras variaciones en
que la reacción de un sustrato con un centro activo dificulta la concentración de sustrato.
la reacción de otro sustrato en otro centro activo. Dado que la El modelo empleado más a menudo para explicar el comporta-
afinidad de la enzima varía con la concentración de sustrato, miento alostérico, el llamado «modelo concertado», fue estable-
no puede describirse mediante una cinética simple basada en cido por Monod, Wyman y Changeaux (fig. 6-11). Lo mismo que
la ecuación de Michaelis-Menten. En su lugar, se caracteriza ocurre cuando el O2 se fija a la hemoglobina, en ausencia de sus-
por una concentración de sustrato que produce la mitad de la trato la enzima tiene una baja afinidad por éste y se encuentra
velocidad máxima, [S]0,5, y el coeficiente de Hill (H) (cap. 5). Los en el estado T (estado tenso). La otra conformación de la enzima
70 Proteínas catalíticas-enzimas

I NTOXICACIÓN POR
INSECTICIDAS

Un hombre de 55 años ha estado pulverizando un campo de

arroz con un insecticida con fluorofosfatos orgánicos. Presenta
un cuadro clínico brusco, con cefalea frontal, dolor ocular y
disnea (los signos característicos de la exposición excesiva a Fig. 6-12 El análisis con glucosa oxidasa/peroxidasa para la glu-
fluorofosfatos orgánicos). Una vez en el hospital, se le trata cosa sanguínea. El color producido en este análisis es directamente
con una inyección intravenosa de 2 mg de sulfato de atropina, proporcional a la concentración de glucosa sanguínea.
tras lo que se recupera gradualmente.

Comentario. Los fluorofosfatos orgánicos forman unos com- un cromógeno y obtener un cromóforo coloreado. El color obte-
plejos fosforilo-enzima covalentes con serina proteasas y este- nido es directamente proporcional al contenido de glucosa de la
rasas, como la acetilcolinesterasa, que inhiben las enzimas de muestra. Existen versiones fluorométricas de este análisis con
forma irreversible. Durante la actividad neuromuscular, la ace- una alta sensibilidad y en un analizador comercial se utiliza un
tilcolinesterasa pone fin a la acción de la acetilcolina (cap. 42) electrodo de oxígeno para medir la velocidad de descenso de la
hidrolizándola a acetato y colina. La inhibición de esta enzima concentración de oxígeno en la muestra, que también es directa-
prolonga la acción de la acetilcolina y ocasiona una estimu- mente proporcional a la concentración de glucosa.
lación neuromuscular constante. La atropina no afecta a la
actividad de la acetilcolinesterasa, sino que bloquea de forma
competitiva la unión de acetilcolina y la estimulación muscular
en la unión neuromuscular.
Tiras reactivas y glucómetros
Los diabéticos normalmente miden su azúcar en sangre varias
veces al día con tiras reactivas y medidores de glucosa. Las tiras
es el estado R (estado relajado). La fijación de una molécula de reactivas están impregnadas con un reactivo de glucosa oxi-
efector alostérico cambia la fracción de la enzima de un estado dasa-peroxidasa (GOP). En la versión manual de este análisis,
a otro. Las enzimas pasan al estado R por fijación de las molé- la intensidad del cambio de color en una tira reactiva está rela-
culas del efector alostérico positivo, pero son estabilizadas en la cionada con la concentración de glucosa, normalmente en una
forma T por las moléculas del efector alostérico negativo. En este escala de 1 a 4. Los glucómetros modernos utilizan una pequeña
modelo, en el estado R todos los centros activos son iguales y, gota de sangre (∼1 ml) y electrodos amperométricos para medir
además, todos tienen una afinidad por el sustrato mayor que en la corriente producida por la reacción redox catalizada por la
el estado T. Puesto que la transición entre el estado T y el estado glucosa deshidrogenasa (GDH), que oxida la glucosa a ácido
R ocurre al mismo tiempo para todas las subunidades, éste es el glucónico, pero reduce una coenzima en lugar del oxígeno. Estos
denominado «modelo concertado» (en dos estados). Asimismo, análisis suelen utilizarse cuando es necesario obtener medicio-
Koshland, Nèmethy y Filmer han propuesto un modelo alterna- nes rápidas o frecuentes de la glucemia. Cuando se compararon
tivo, el denominado «modelo secuencial» (en múltiples estados). los análisis con GOP y GDH a grandes alturas en una escalada
Dicho modelo postula que cada subunidad cambia independien- al Kilimanjaro, el análisis con GOP, que depende del oxígeno
temente hasta adoptar una conformación distinta, y también ambiental, mostró un mayor error. Estos métodos fueron menos
que subunidades diferentes tienen distintas afinidades por el sus- exactos a temperaturas bajas y a una gran altitud.
trato. Actualmente se sabe que los dos modelos son aplicables a
enzimas diferentes.
Análisis cinéticos
MEDICIÓN ENZIMÁTICA DE LA En el análisis descrito en la figura 6-12 y representado gráfi-
GLUCOSA SANGUÍNEA camente para varias concentraciones de glucosa en la figura
6-13A, se deja continuar la reacción hasta su punto final, es
decir, hasta que se ha oxidado toda la glucosa, y después se mide
Análisis con glucosa oxidasa-peroxidasa el cambio de color. El color que resulta se representa luego frente
a un estándar para determinar la concentración de la glucosa
En el laboratorio clínico actual, la glucosa en plasma y orina sanguínea (fig. 6-13B). Los analizadores cinéticos de alto ren-
se mide con métodos enzimáticos automatizados. En el análisis dimiento calculan la concentración de glucosa en una muestra
más habitual se utiliza una mezcla de glucosa oxidasa y pero- por medición de la velocidad inicial de la reacción. Por ejemplo,
xidasa (fig. 6-12). La glucosa oxidasa es muy específica para la el análisis de las curvas cinéticas de la figura 6-13A indica que
glucosa, pero sólo oxida el b-anómero del azúcar, que representa el punto final y la velocidad del análisis con glucosa oxidasa
∼64% de la glucosa en disolución. Por tanto, la mezcla del aná- dependen de la concentración de glucosa. Por tanto, el ana-
lisis se suplementa con mutarrotasa, que cataliza rápidamente lizador puede medir el cambio en la absorbancia (o algún otro
la interconversión de los anómeros, mejorando la sensibilidad parámetro) en las primeras fases de la reacción y compararla
del análisis ∼50%. El H2O2 producto de la reacción con la oxi- con la de una solución estándar para calcular la concentración
dasa se utiliza luego en la reacción con peroxidasa para oxidar de glucosa (fig. 6-13C). Estos análisis se realizan en analizadores
 Páginas web 71

Fig. 6-13  Análisis con glucosa oxidasa/peroxi-

dasa; análisis con punto final frente a cinéticos.
(A) Análisis gráfico de un análisis a punto final.
(B) Las absorbancias finales (punto final) se represen-
tan como una función de la concentración de glucosa,
produciendo una línea recta. (C) Las velocidades
iniciales de las reacciones se calculan con múltiples
mediciones al inicio del análisis (líneas de puntos en
A) y se representan frente a la concentración de glu-
cosa. Cuando se obtienen gráficas no lineales, se ana-
lizan con un ordenador.

de inyección de flujo o centrífugos para asegurar el rápido mez- regulación participan modificaciones covalentes y no covalentes
clado de los reactivos y la muestra. Los analizadores cinéticos que permiten conseguir un control metabólico eficiente.
son intrínsecamente más rápidos que los análisis a punto final La actividad enzimática puede ser inhibida (o activada) por
porque calculan la concentración de glucosa antes de que el compuestos sintéticos (fármacos), compuestos exógenos (toxinas)
análisis llegue al punto final. Estos análisis funcionan porque la y compuestos endógenos (efectores alostéricos). Los análisis
glucosa oxidasa y la glucosa deshidrogenasa tienen una Km alta cinéticos de las reacciones enzimáticas son útiles para valorar
para la glucosa. A las concentraciones de glucosa halladas en la el papel biológico de las enzimas y conocer sus mecanismos de
sangre, la velocidad de la reacción con oxidasa es proporcional reacción. Además, los análisis de enzimas en sangre también son
a la concentración de glucosa, es decir, en la región de primer útiles para diagnosticar algunas enfermedades.
orden de la ecuación de Michaelis-Menten donde la concentra-
ción de sustrato es menor que la Km (v. fig. 6-5A).

Lecturas recomendadas
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inhibidor de una enzima que cataliza la reacción limitante

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Comentar el impacto de estos ratones en el desarrollo de
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