UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA

FACULTAD DE SALUD Y BIENESTAR

CARRERA DE MEDICINA

BIOLOGIA MOLECULAR Y
GENETICA:
Estructura y Análisis de
Ácidos Nucleicos. DOCENTE:

Freddy Castillo Solano.

BIOQUIMICO FARMACEUTICO
MAGISTER EN BIOTECNOLOGIA MOLECULAR
 INTRODUCCION

➢ Durante décadas, el ADN fue en gran parte un tema académico y no la fuente de la conversación en la mesa de la cena en el
hogar promedio.
➢ 1995 O.J Simpson asesinato y detección de huellas dactilares DNA.
➢ 1997 Clonación de la Oveja Dolly.
➢ 2001 anuncian el primer borrador de Proyecto GENOMA HUMANO.
 INTRODUCCION: PERSPECTIVA HISTORICA
➢ Los Últimos años han marcado el inicio de la conciencia publica de la Biología Molecular:
➢ Sin embargo el punto inicial de este campo apareció a mediados de siglo cuando JAMES WATSON y
FRANCIS CRICK sugieren la estructura del ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA).
 En el material genético deben existir 4 características
principales.

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA

I. Replicación. Distribución equitativa del Material
genético
II. Almacenamiento de la información genética. Que

MOLECULAR
sea capaz de Codificar la casi infinita variedad de
productos génicos.
III. Expresión de la Información genética. Flujo de la
información genética: Transcripción y Traducción.
IV. Variación: Mutación.
 Hasta 1944 las observaciones favorecían a las proteínas como
material genético
➢ Entre 1940-1944 se pensaba que eran las proteínas
las que llevaban la información genética.
➢ FRIEDRICH MIESCHER en 1869 descubrió un
nuevo acido, una sustancia que contenía fosforo y a
la cual la llamo NUCLEINA
➢ El termino ACIDO NUCLEICO fue acuñado por
RICHARD ALTMANN en 1889.
➢ 20 años después se distinguió el DNA y el RNA.
➢ Una precisa observación en 1928 e Investigaciones
en 1944 indicaban que el DNA podría ser el portador
de la información Genética
➢ Se demostró que el DNA reside en los
CROMOSOMAS. Friedrich Miescher
Hasta 1944 las observaciones favorecían a las proteínas como
material genético

 También se llego a pensar que los cromosomas no

carecían de actividad génica debido a que el DNA esta
compuesto de 4 nucleótidos.
 Phoebus A. Levene en 1910. HIPOTESIS DEL
TETRANUCLEOTIDO, según esta hipótesis todos
los organismos tienen un grupo idéntico de estos 4
nucleotidos.
 En 1940 Erwing Chargaff demostró que la propuesta
de Levene era incorrecta. Cada organismo tienen
composición distinta de nucleótidos.
 PRUEBAS A FAVOR DEL DNA COMO
MATERIAL GENETICO.

➢ 1944. Oswald Avery, Colin Macleod Maclyn McCarty

establecen una NATUREZA QUÍMICA de un PRINCIPIO
TRANSFORMANTE en bacterias.
➢ Esta constituyo la primera prueba experimental directa
que el DNA es la molécula responsable de la herencia
➢ Marca el inicio de la BIOLOGIA Y GENETICA MOLECULAR
LA OBSERVACION DE FREDERICK GRIFFITH (1928).

 1927. Frederick Griffith fue medico del ministerio de

sanidad británico trabajo con diferentes cepas de
Diplococcus pneumoniae, en la actualidad a esta bacteria
se la conoce como Streptococcus pneumoniae.
 Aparece el termino “TRANSFORMACIÓN BACTERIANA”
EL PRINCIPIO DE LA TRANSFORMACION ES EL DNA.

➢ Los Hallazgos de Griffith

formaron las bases para las
investigaciones de Avery,
MacLeod y McCarty en 1944
en el instituto Rockefeller en
Nueva York.

➢ Ellos determinaron que la

base química de la
transformación era el DNA.
EL PRINCIPIO DE LA TRANSFORMACION ES EL
DNA.
 EL PRINCIPIO DE LA
TRANSFORMACION ES
EL DNA.

La transformación se ha demostrado en
• Haemophilus influenzae,
• Bacillus subtilis
• Shigella paradysenteriae
• Escherichia Coli
LA INFORMACIÓN GENÉTICA ES TRANSMITIDA SOLO
POR EL DNA.
LA INFORMACIÓN GENÉTICA ES TRANSMITIDA SOLO POR EL
DNA.
LA INFORMACIÓN
GENÉTICA ES
TRANSMITIDA
SOLO POR EL DNA.
LA INFORMACIÓN GENÉTICA ES TRANSMITIDA SOLO
POR EL DNA.
 ESTRUCTURA DEL DNA.

Los Genetistas descubrieron las reglas que gobiernan la transmisión de las características genéticas y la
relación entre genes y cromosomas.

En el decenio de 1940 se formulo una pregunta muy

interesante:

CUAL ES LA NATURALEZA QUIMICA DEL GEN?

 ESTRUCTURA DEL DNA y
RNA

• Tanto el DNA como el RNA son muy similares. Esto

es muy importante para coordinar actividades durante
la EXPRESION GENICA.
 ESTRUCTURA DEL DNA

 “Para entender la actividad de una

macromolécula compleja (Sea proteína,
polisacárido, lípido o acido nucleico)”, es esencial
conocer la forma en que se integra esta
molécula”.
 “Varios
laboratorios de Estados unidos e Inglaterra
estaba descifrando el misterio de la estructura del
DNA a principios de 1950”
 ESTRUCTURA DEL DNA: James Watson y
Francis Crick 1953, Universidad de Cambridge
 ESTRUCTURA DEL DNA: Composición de Bases.

➢ La unidad básica para construir el DNA es un NUCLEOTIDO: que consta de un AZUCAR+GRUPO FOSFATO+BASE NITROGENADA.

➢ En los ácidos nucleicos existen 2 tipos de purinas y 3 tipos de pirimidinas:

➢ PURINAS: Adenina y Guanina

➢ PIRIIMIDINAS: Timina, Citosina y Uracilo

➢ Los Nucleótidos tienen una estructura Polarizada : En un extremo donde se localiza el fosfato se conoce como EXTREMO 5´ (EXTREMO CINCO PRIMA) mientras el otro extremo es el 3´ PRIMA TERMINAL.

➢ Análisis de Difracción de rayos X indicaban que la distancia entre los nucleótidos de aquellos que estaban apilados era de unos 3.4 A (0,34nm).
 ESTRUCTURA DEL DNA: Composición de Bases.

• El nombre de los ácidos nucleicos viene dado por el azúcar pentósido que presentan:
• ARN contiene Ribosa
• DNA contiene desoxirribosa
• La desoxirribosa contiene un átomo de HIDROGENO en lugar de un HIDROXILO en el C-2
ESTRUCTURA DEL DNA: Composición de Bases.
ESTRUCTURA DEL DNA: Composición de Bases: Polinucleótidos

 Cadenas cortas formadas por Aproximadamente

30 nucleótidos se las conoce como
OLIGONUCLEOTIDOS.
 Y las cadenas mas largas de nucleótidos se las
llama POLINUCLEOTIDOS.
 Los Nucleótidos se unen por enlaces 3´-
5´FOSFODIESTER.
 Las Cadenas largas de nucleótidos justifican el
gran peso molecular del DNA y explican su
propiedad mas importante “ALMACENAMIENTO
DE GRANDES CANTIDADES DE
INFORMACION GENETICA”.
 ESTRUCTURA DEL DNA: Composición de
Bases.
 LA DIRECCIONALIDAD ES UNA PROPIEDAD EXTREMADAMENTE IMPORTANTE DE
LA MOLECULA DE DNA

➢ Es importante para el entendimiento de aspectos como REPLICACION,

TRANSCRIPCION, LECTURA DE UNA SECUENCIA DE DNA y PARA LLEVAR A
CABO EXPERIMENTOS EN EL LABORATORIO.
➢ Por convención una secuencia de DNA se escribe de 5´a 3´
ESTRUCTURA DEL DNA: Composición de
Bases.
 Por muchos años se pensó que el DNA poseía una estructura simple de
repeticiones tetranucleotídicas.

➢ En 1950, Erwin Chargaff, de la Universidad de Columbia Notifico un notable

hallazgo que elimino por fin la teoría del TETRANUCLEOTIDO. (ANÁLISIS DE
COMPOSICIÓN DE BASES)
➢ El Ensayo se hizo mediante Hidrolisis de las bases nitrogenadas de los
grupos fosfato y posterior Cromatografía
ESTRUCTURA DEL DNA: Composición de Bases.
➢ “Si la teoría del Tetranucleótido era correcta la proporción de cada base
en un DNA debía ser casi del 25%”.
➢ Sin embargo Chargaff encontró que la relación de las 4 bases fue muy distinta
de un tipo de organismo a otro y se apartaba de la proporción 1:1:1:1 predicha
para la teoría del Tetranucleótido.
➢ Como ejemplo la relación A:G del DNA Humano fue de 1.56 y en el bacilo
de la tuberculosis fue de 0,4.
➢ NO HABIA DIFERENCIA EN QUE SE UTILIZARA TEJIDO VEGETAL O
ANIMAL COMO FUENTE DEL DNA; LA COMPOSICION DE LAS BASES
PERMANECIA CONSTANTE PARA ESA ESPECIE.
➢ En una muestra el nro de Purinas siempre es igual al numero de
Pirimidinas.
ESTRUCTURA DEL DNA: Composición de Bases.
 MODELO DE WATSON Y CRICK: ANÁLISIS DE
DIFRACCION DE RAYOS X
➢ Es necesario entender la estructura del DNA para entender su actividad biológica.
 La molécula se integra por dos cadenas de nucleótidos
 Tiene forma de espiral (hélice dextrogira).
 Antiparalelas (Si una cadena de DNA va en dirección 5´ a 3´ la cadena compañera va en dirección 3´a 5´).
 Las bases nitrogenadas son perpendiculares al eje longitudinal y se apilan unas sobre otras
 Las dos cadenas se unen mediante puentes de hidrogeno.
 La Distancia del esqueleto del átomo de fosfato al centro del eje es de 1nm
 Los Átomos de nitrógeno
 Tiene un surco mayor (Surco amplio) y un surco menor (surco mas estrecho).
 Presenta complementariedad entre cadenas
 MODELO DE WATSON Y CRICK:
Análisis de DIFRACCION DE RAYOS X

Fotografía de la molécula de DNA utilizando Difracción de Rayos X, la imagen

fue obtenida por la Química Cristalógrafa Rosalind Franklin
MODELO DE WATSON Y CRICK: Puentes de
Hidrogeno en la molécula de DNA
FORMAS ALTERNATIVAS DEL DNA

1. DNA-A: esta es una forma de DNA que

presenta bajo condiciones de alta salinidad o
deshidratación. Es compacto. No se encuentra
en condiciones fisiológicas
2. DNA B: es el DNA que se encuentra en
condiciones fisiológicas
3. DNA P: es mas largo, los grupos fosfato se
hallan en el interior de la Molécula. Tiene
menos enlaces de Hidrogeno
4. DNA-Z: DNA sintético, contiene solo pares de
Bases G y C. Levogira. Tiene una
conformación de ZigZag.
LA ESTRUCTURA DEL RNA ES QUÍMICAMENTE PARECIDA A LA DEL DNA

 Las moléculas de RNA presentan algunas características:

 Tienen el azúcar RIBOSA

 El URACILO REEMPLAZA A LA TIMINA

 Generalmente es de cadena sencilla, excepto:

 “Cuando algunas moléculas de RNA se pliegan sobre si misma para forma dobles cadenas y algunos VIRUS tienen como material genético una
doble hélice de RNA”

 Hay 3 clases principales de RNA: RNA ribosómico, RNA de Transferencia y mRNA

 Los RNA se diferencian por su COEFICIENTE SVEDBERG (S),(Coeficiente de Sedimentación)

 El RNA Ribosómico constituye el 80% del RNA en E.coli.

 Existen otros tipos de RNA: RNA telomerasa, snRNA, RNA anti sentido, microRNA (miRNA) y el RNA de interferencia corto (siRNA)
LA ESTRUCTURA DEL RNA ES QUÍMICAMENTE
PARECIDA A LA DEL DNA
 TECNICAS UTILES EN EL
ANALISIS DEL DNA y RNA

 Absorción de luz Ultravioleta

 Comportamiento de Sedimentación
a. Equilibrio de sedimentación: Gradiente de
densidad y Cloruro de Cesio
b. velocidad de sedimentación: Centrifuga
Analítica y sistema óptico de luz ultravioleta
mide Vel. Coeficiente Svedberg (S)
 Desnaturalización y renaturalización de los
ácidos nucleicos.
 TECNICAS UTILES EN EL ANALISIS
DEL DNA y RNA: desnaturalización
del DNA
• Se debe considerar una de las propiedades mas
relevantes de la doble hélice de DNA: SU CAPACIDAD
PARA SEPARARSE EN LAS DOS CADENAS QUE LO
COMPONEN, UNA PROPIEDAD QUE SE DENOMINA
DESNATURALIZACION un proceso en el cual mediante
aumento de la temperatura se puede separar la
molécula de DNA.
• La temperatura que corresponde a la mitad del cambio
de la absorbancia se llama TEMPERATURA DE FUSION.
• Un alto contenido de GC en el DNA tienen una alta Tm.
• En 1960 Julius Marmur y sus colaboradores de la
Universidad de Harvard demostraron la
RENATURALIZACION de la molécula de DNA.
 DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DEL DNA:

Importancia:
• Reacción en cadena de la
polimerasa-PCR.
• Técnicas de Hibridación de
ácidos nucleicos.
DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DEL
DNA: HIBRIDACION MOLECULAR y FISH

HIBRIDACION IN SITU CON FLUORESCENCIA

HIBRIDACION MOLECULAR
(FISH). Identificación de DNA centromérico
 DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DEL
DNA: HIBRIDACION MOLECULAR y FISH

LOCALIZACION DE UN CARIOTIPO ESPECTRAL LOCALIZACION DE

GEN HUMANO-FISH (SKY, spectral karyotyping) TELOMEROS-FISH
DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DEL DNA: HIBRIDACION
MOLECULAR y FISH
TRISOMIA DEL
CROMOSOMA 21 CELULA NORMAL

SONDA-CROMOSOMA 18 SONDA-CROMOSOMA 13 SONDA-CROMSOMA 21

 ELECTROFORESIS DE DNA Y RNA
Se aplica a estudios de proteínas, DNA y RNA

 Cuando se aplica estudios de DNA y RNA, permiten la separación
de DNA y RNA de distintos tamaños
 “En general la Electroforesis separa o resuelve moléculas de una
mezcla haciéndolas migrar en un campo eléctrico”.
 En la electroforesis se utilizan geles de POLIACRILAMIDA O
AGAROSA
 Para la visualización de las moléculas de DNA en el Gel, se
utilizan colorantes fluorescentes como el BROMURO DE ETIDIO
o EL SYBR-SAFE.
 La electroforesis es muy importante en técnicas como
SOUTHERN BLOT, NORTHEN BLOT, WESTERN BLOT.
ELECTROFORESIS DE DNA Y RNA: BROMURO DE ETIDIO AGENTE INTERCALANTE
ELECTROFORESIS DE DNA Y RNA