Prácticas Microbiología MEHU-UPAO

2. MICROSCOPÍA Y COLORACIÓN DE GRAM

MICROSCOPÍA
OBJETIVOS:
Explicar y reconocer las partes, su utilidad, así como funcionamiento y cuidados que se deben
tener para el manejo correcto del microscopio óptico compuesto.
Identificar diferentes preparados con bacterias, comparar los aumentos utilizados.
Valorar la importancia del microscopio óptico compuesto en la microbiología.

INTRODUCCIÓN:
El ojo humano tiene una capacidad limitada, podemos observar dos puntos separados hasta una
décima de milímetro, por ello es que la existencia de los microrganismos paso desapercibida durante
muchos siglos, el desarrollo de herramientas e instrumentos basados en lentes que aumentaran el
tamaño de las cosas fue lo que nos llevó al descubrimiento de estos seres microscópicos.

La palabra microscopio, deriva etimológicamente del griego mikrós: pequeño y skoopéo: observación
y fue Jean Faber en 1624 quien lo nombró así, aunque se atribuye a Zacarías Jansen en 1590 su
invención; pero, el impulsor más significativo de la microscopía fue Anton Van Leeuwenhoek (1632-
1723).

Desde el punto de vista de la óptica, existen dos tipos de microscopio, un microscopio simple que
consta de un solo lente (una lupa, por ejemplo) y el microscopio compuesto que tiene más de uno,
el microscopio propiamente dicho es un ejemplo.

Actualmente existen diferentes tipos de microscopios, dentro de los cuales tenemos a los
microscopios de luz, los microscopios electrónicos, los microscopios laser y los de efecto túnel; en
donde, dependiendo de la fuente de energía ser formarán imágenes de los especímenes a diferentes
grados de resolución, es decir, mientras más corta sea la longitud de onda de la fuente de energía
(y por consiguiente mayor energía) mayor nivel de detalle se tendrá en la imagen que se obtenga.

De manera general, los microscopios ópticos compuestos (funcionan con luz), son los que más se
utilizan en los laboratorios de ciencias biológicas y microbiología.

Esencialmente están compuestos por un sistema óptico, las lentes, el condensador y el diafragma,
así como la fuente lumínica (algunos autores llaman a estas tres últimas partes, sistema de
iluminación); un sistema mecánico, el cual es el encargado de soportar y mover todas las piezas del
instrumento, por lo tanto, poder dirigir adecuadamente la observación.

Un factor importante en cada microscopio, es el límite de resolución, el cual es la mínima distancia

a la cual un microscopio puede observar dos puntos separados, así también el poder de resolución,
viene a ser la capacidad de observar dos puntos separados a una menor distancia y como vimos
anteriormente está influenciada de manera inversamente proporcional por la longitud de onda de luz
utilizada.
 Figura 2.1. Límites de resolución del ojo humano y los microscopios

En los laboratorios de nuestra universidad, cada microscopio tiene 4 objetivos, tres a seco: el
panorámico, 4X; el de mediano aumento, 10X; y el de gran aumento 40X; además tenemos el de
inmersión, 100X, en el cual se utiliza entre la muestra y su lente frontal, aceite de cedro o aceite de
inmersión para evitar distorsión por refracción de las ondas de luz.

(Panorámico)

Figura 2.2. Objetivos a seco

 Figura 2.3. Funcionamiento de un objetivo de Inmersión

Los otros juegos de lentes además de los objetivos son los oculares, que en nuestro medio
generalmente tienen una ampliación de 10X; el aumento total al que se observa una muestra está
dado por la multiplicación del aumento de los oculares por el del objetivo utilizado.

Los microscopios con que cuenta actualmente el laboratorio de microbiología son Olimpus CX31,
como el que observamos en el siguiente esquema donde se mencionan sus partes.
 Oculares (10X)

Cabezal

Revólver

Objetivos

Pinza
Platina

Diafragma
Tornillos que mueven
la muestra (carrito)

Tornillo
macrométrico

Tornillo
micrométrico

Figura 2.4. Partes del microscopio

Materiales:
o Microscopio óptico compuesto
o Papel lente (Papel de seda)
o Aceite de inmersión
o Preparados microscópicos

Procedimiento
Explicar y reconocer las partes de un microscopio y seguir las indicaciones del profesor para hacer
un enfoque adecuado de las preparaciones.

Realizar esquemas de lo observado a diferentes aumentos.

COLORACIÓN DE GRAM
Objetivos:
Aprender a elaborar un preparado en fresco
Aprender la técnica correcta para realizar un frotis a partir de un cultivo de microorganismos.
Fundamentar los conceptos de colorante y coloración o tinción.
Elaborar preparaciones de microorganismos, fijarlas y teñirlas con las técnicas de coloración
simple; la coloración de Gram; la coloración de Shaeffer y Fulton; y la coloración de Ziehl
Neelsen.

Introducción:
La mayoría de los microorganismos carecen de color, por lo que no es posible observar con claridad
su forma o agrupación. Para poder realizar una observación detallada de su forma es necesario
teñirlos.

A lo largo de la historia se ha utilizado muchas sustancias tanto naturales como sintéticas, para
colorear tanto, tejidos como microorganismos, desafortunadamente algunas ocasiones el uso solo
de colorantes no dio resultados satisfactorios, por lo que se implementó el uso de sustancias
denominadas mordientes, las cuales ayudan a la tinción y la hacen más eficiente.

Las tinciones no solo permiten observar células, en ocasiones, nos permiten apreciar estructuras
internas, generalmente en eucariotas, en procariotas podemos observar endosporas u corpúsculos
metacromáticos.

Los colorantes, que son las sustancias que ceden color a las estructuras por colorear, tienen en su
estructura molecular generalmente dos partes, una llamada cromóforo que es la que da color y otra
llamada auxócromo la cual le ayuda a interaccionar con la superficie a teñir.

Un paso fundamental, antes de aplicar cualquier técnica de tinción, es elaborar correctamente la

preparación que puede ser de dos tipos: “en fresco”, en donde se coloca la muestra tal y como se
obtiene de su fuente original para su observación, o una preparación fija, en la cual la muestra
biológica debe sufrir un tratamiento para que conserve sus características morfológicas, a este
proceso se le llama fijación; para fijar una muestra se aplican métodos fijos como el calor o la
deshidratación, o productos químicos como etanol, ácido acético, formaldehído o glutaraldehído.

Una tinción simple es aquella en la que solo se aplica un colorante, por lo general las soluciones de
colorantes se hacen acuosas y a baja concentración.

Existen además coloraciones diferenciales, tinciones selectivas y tinciones vitales. En el primer caso,
se utiliza más de un colorante y permite diferenciar a las células coloreadas por la afinidad de un
colorante a alguna estructura específica, de este tipo es la tinción de Gram.

La tinción de Gram, fue diseñada por Hans Christian Gram en 1884; y es actualmente una de las
principales técnicas que se usan en la bacteriología para poder diferenciar a dos grupos
taxonómicos, las bacterias grampositivas y las gramnegativas, se fundamenta básicamente en la
estructura de la pared celular de cada una de ellas siendo la de las primeras más simple y reaccionan
positivamente al colorante cristal violeta; mientras que la pared celular de las gramnegativas es más
compleja pero no logran mantener al colorante principal y han de ser teñidas con un colorante de
contraste como es la safranina, como mordiente se utiliza lugol, y como decolorante alcohol acetona.
También existe otra tinción llamada de Ziehl-Neelsen que tiene un gran valor para el diagnóstico de
la tuberculosis.
Por otra parte, una tinción selectiva es cuando la técnica permite observar alguna estructura
específica de una célula, por ejemplo, la tinción de Shaeffer y Fulton para visualizar esporas, o la
tinción de Rojo Congo para observar la cápsula.

Figura 2.5. Cocos grampositivos (Estreptococos) y bacilos gramnegativos – Tinción de Gram -

Existen también otro tipo de tinciones en las cuales se tiñen microorganismos de modo que estos se
mantienen viables, así podemos observar sus movimientos o alguna otra característica especial, a
esto se le llama coloración vital.

Una vez que se ha realizado un buen preparado, y una buena coloración procedemos a su
observación en donde podemos encontrar y describir características morfológicas y de agrupación
de los microorganismos.
 Figura 2.6. Formas microbianas más frecuentes

Materiales:
o Microscopio óptico
o Papel lente
o Aceite de inmersión
o Láminas portaobjetos
o Láminas cubreobjetos
o Pipetas Pasteur descartables
o Soluciones de cristal violeta, safranina, lugol, alcohol-acetona, azul de metileno, y verde de
malaquita
o Cultivo de Escherichia coli
o Cultivo de Staphylococcus aureus
o Cultivo de Bacillus megaterium.
o Suspensión de protozoarios

Procedimientos:
Preparado en fresco

✓ Lavar y eliminar las cargas eléctricas del portaobjetos con la flama del mechero.
✓ Colocar en el portaobjetos una gota de agua utilizando el asa bacteriológica.
✓ Esterilice el asa a la flama del mechero, esperar que se enfríe. Tomar una muestra pequeña
del crecimiento microbiano y colocarla junto a la gota de agua.
✓ Con movimientos circulares del asa, distribuir uniformemente la muestra de la colonia sobre
la superficie del portaobjetos.
✓ Cubrir con un cubreobjetos
✓ Observar al microscopio con objetivos a seco, según indicaciones del profesor.
 ✓ Si la muestra es una suspensión de protozoarios, colocar una a dos gotas de la suspensión
sobre una lámina portaobjetos, cubrir con una lámina cubreobjetos, enfocar y observar al
microscopio con objetivos a seco.

Figura 2.7. Preparado en fresco

Preparación de los frotis

✓ Lavar y eliminar las cargas eléctricas del portaobjetos con la flama del mechero.
✓ Colocar en el portaobjetos una gota de agua utilizando el asa bacteriológica.
✓ Esterilice el asa a la flama del mechero, esperar que se enfríe. Tomar una muestra pequeña
del crecimiento microbiano y colocarla junto a la gota de agua.
✓ Con movimientos circulares del asa, distribuir uniformemente la muestra de la colonia sobre
la superficie del portaobjetos.
✓ Secar y fijar el frotis a la llama del mechero pasando el portaobjetos repetidamente por este
rápidamente, evitar que el portaobjetos se caliente en exceso.
✓ Hasta este momento lo que hemos realizado es obtener un frotis, es decir, una muestra en
seco, deshidratada.
 Figura 2.8. Preparación y fijación de frotis bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos

Tinción simple

✓ Cubrir un frotis de S. aureus con azul de metileno y esperar dos minutos.

✓ Eliminar el exceso de colorante y enjuagar con agua de caño (seguir las indicaciones del
profesor)
✓ Dejar secar el frotis al aire, observar al microscopio, diagramar.

Tinción de Gram

✓ Realizar un frotis mezclando E. coli y S. aureus.

✓ Cubrir el frotis con cristal violeta durante un minuto.
✓ Enjuagar con agua de caño.
✓ Cubrir el frotis con lugol durante un minuto.
✓ Enjuagar con agua de caño.
✓ Agregar alcohol-acetona sobre el frotis hasta que se observe la aparición de “hilos” de
colorante y enjuagar con agua de caño rápidamente (seguir las instrucciones del profesor).
✓ Cubrir el frotis con safranina durante 20 a 30 segundos.
✓ Enjuagar con agua de caño.
✓ Dejar secar el frotis al aire, observar al microscopio, diagramar.
 LUGOL

ALCHOLO-ACETONA

Figura 2.9. Técnica de la tinción de Gram

Tinción de Shaeffer y Fulton

✓ Cubrir un frotis de Bacillus megaterium con verde de malaquita y calentar suavemente hasta
la emisión de vapores durante 5 minutos, adicionar más colorante para evitar que el
colorante se seque.
✓ Enjuagar con agua de caño.
✓ Cubrir con safranina y esperar un minuto.
✓ Enjuagar con agua de caño y dejarlos secar al aire, observar al microscopio diagramar.

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Figura 2.10. Tinción de Shaeffer y Fulton

Tinción de Ziehl Neelsen
Coloración
✓ Colocar sobre el soporte las láminas fijadas conservando el orden numérico con el
extendido hacia arriba y manteniendo una separación de al menos 1 cm entre ellas.
✓ Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada, dispensar
el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero.
✓ Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de
los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden
los primeros vapores blancos.
✓ En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.
✓ En el término de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisión
de vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el
bacilo y se fije a sus lípidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede
destruirse y colorearse mal.
✓ Levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más cercano al
operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o un grifo.
Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución
de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior.
✓ Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos
que se utilizarán a continuación.

Decoloración
✓ Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar
aproximadamente 3 minutos.
✓ Enjuagar con abundante agua a baja presión.
✓ Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a
lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cúmulos rojos o coloración
rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante, dejarla actuar entre uno y
tres minutos y enjuagar nuevamente.
✓ Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos.

Coloración de fondo
✓ Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno. Dejar actuar durante un
minuto.
✓ Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión y limpiar la parte
inferior con un algodón si ha quedado coloreada.
✓ Observar si las láminas conservan la numeración clara y visible. Si no es así volver
a numerarlas.
✓ Dejar secar las láminas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical
en un soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el
extendido.
✓ Observar al microscopio
 Figura 2.11. Técnica de la tinción de Ziehl Neelsen

Referencias bibliográficas:
Aquiahuati Ramos MA, Pérez Chabela ML. Manual de prácticas del laboratorio de Microbiología
general [Internet]. México D.F.: Departamento de biotecnología, Universidad Autónoma
Metropolitana; 2004. Disponible en:
http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAHUATL_RAMOS_MARIA_D
E_LOS_ANGELES_Manual_de_practicas_de.pdf

Organización Panamericana de la Salud (OPS). Manual para el diagnóstico bacteriológico de la

tuberculosis, parte 1: Baciloscopia. OPS oficina regional de la OMS. 2008.
Prescott ML, Harley JP, Klein DA. Microbiología. 5a ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana; 2002.

Madigan MT, Martinko JM, Bender KS, Buckley DH, Stahl DA. Brock, Biología de los
microorganismos. 14va. ed. Madrid: Pearson; 2015.