BV Practica 5

Biotecnología Vegetal
Grado de Biotecnología-Curso 3º
Curso Académico 2022-2023
Práctica 5. Transformación genética de explantes de hoja

mediante Agrobacterium tumefaciens
1. Introducción
La transformación genética consiste en la introducción de genes específicos y/o en la
modificación de los ya existentes en el genoma de las plantas. El proceso de
transformación implica la elaboración de las construcciones génicas con las secuencias
de interés, disponer de un protocolo de regeneración in vitro de la planta y de
transformación, además de comprobar, con posterioridad, la integración del gen, su
expresión y herencia. Generalmente, junto a los genes de interés se introducen otros
genes de selección o informadores, para la detección del material transformado.
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria de suelo que es capaz de introducir algunos

genes (T-DNA) del plásmido Ti en el genoma de la planta. Los genes del T-DNA se
integran, son reconocidos por la planta y se transcriben. Esta capacidad se utiliza para
transformar plantas utilizando diferentes construcciones génicas que son introducidas
en Agrobacterium y con el que se infecta a la planta. El método consiste en la infección
de explantes con una cepa de la bacteria transformada y la regeneración in vitro a partir
de las células transformadas.
Las plantas son consideradas un buen sistema para la expresión de proteínas lo que
permite usarlas como biofactorías. El uso de plantas como biofactorías tiene
importantes ventajas en comparación con otras técnicas utilizadas, como son: Bajo
coste, funcionalidad y grandes cantidades de la proteína. Actualmente, el
Agrobacterium está siendo usado para producir proteínas quiméricas o recombinantes
en organismos vivos. Sin embargo, los genes no se integran dentro del genoma de la
planta por lo tanto no se heredan en las siguientes generaciones. La bacteria aprovecha
la maquinaria celular para producir nuestra proteína de interés, la cual está fusionada a
un gen reportero. Unos de los genes reporteros más usado es la GFP (Green Fluorescent
Protein) que procede una medusa bioluminiscente (Aequorea victoria) (Roger Y. Tsien,
1998).
2. Objetivos de la práctica
En la práctica se realizarán los diferentes pasos de la infección con Agrobacterium de
explantes de hoja de tabaco y evaluaremos la eficiencia de transformación, una vez que
se obtenga la regeneración. A su vez, realizaremos una agroinfiltración en Nicotiana
benthamiana.
3. Material
Plantas axénicas de tabaco Placas Petri
Plantas de Nicotiana benthamiana Jeringas
Cultivo de Agrobacterium Pinzas
Medio de organogénesis (+/-Kan) Papel de filtro estéril
Medio LB (cultivo de Agro) Mecheros de alcohol
Medio de inducción Etanol al 95%
Bisturí Parafilm
4. Procedimiento
4.1.1. Obtención de explantes
Se utilizan hojas de Nicotiana tabacum cultivadas in vitro en cámara de crecimiento.
a) Abrir el frasco del cultivo, flamear la boca y con cuidado extraer una hoja de la planta
cortándola por la base. Colocarla sobre un papel de filtro estéril y volver a cerrar el
frasco.
b) Cortar las hojas en trozos pequeños (1 x 1 cm) evitando el nervio central.
4.1.2. Cocultivo con Agrobacterium
Tomar el medio de cultivo de Agrobacterium en crecimiento exponencial con una DO de

0,1 a 600 nm, crecido durante las 3 h previas en medio LB y al que se le añade
acetosiringona (cultivo de infección).
a) Conforme se van obteniendo los explantes se sumergen en el cultivo de infección

donde se mantienen durante 10 minutos (agitando de vez en cuando).
b) Pasado ese tiempo, se sacan los explantes del medio y se colocan sobre un papel de
filtro estéril y, secando sólo el exceso de medio de infección, se inoculan en las placas
Petri con el medio de organogénesis con el haz hacia arriba.
c) Volvemos a repetir el proceso con nuevos explantes y así sucesivamente hasta que
hemos completado las tres placas de cultivo: 2 con medio organogénico con kanamicina
y 1 sin antibiótico de selección (control).
Las placas selladas con parafilm se colocarán en la cámara de crecimiento bajo

condiciones controladas.
4.1.3. Reconocimiento de explantes transformados
Bajo las condiciones de cultivo, si el medio es adecuado para la regeneración, se

producirá organogénesis en los explantes colocados en el medio sin kanamicina. En las
placas con kanamicina solo se producirá organogénesis a partir de las células que hayan
incorporado el gen de resistencia al antibiótico. Por ello, sólo se observará
organogénesis en los explantes transformados.
4.2. Agroinflitración en Nicotina benthamiana

La agroinfiltracion consiste en la infiltración de cepas de Agrobacterium utilizando un
plásmido viral que contiene los genes que se quieren expresar en la planta lo que
permite que el transgén se introduzca en el núcleo celular.
a) Inoculamos una colonia procedente de la transformación del Agrobacterium en 12-

15 ml de YEB que contiene los antibióticos apropiados para la selección especifica de
nuestra construcción. Las dejamos crece a 28 ºC en agitación hasta alcanzar saturación.
Es necesario incluir C+ y el P19.
b) Centrifugamos a 4000rpm RT durante 20 minutos. Eliminamos el sobrenadante y

resuspendemos en la solución de inducción y envolver los tubos con papel de aluminio.
Poner de 2-3 h a RT en agitación suave (80rpm).
c) Medir la DO a 600 nm, calcular la cantidad de necesaria de Agrobacterium y P19 para

tener una concentración final de 1x y 2x, respectivamente, en un volumen de 10 ml.
d) Una vez seleccionada una planta sana de N. benthamiana y del tamaño apropiado
para nuestro propósito hacemos una pequeña herida con una aguja estéril por el envés
de las hojas (ni las más viejas ni las más jóvenes) en las que vayamos a llevar a cabo la
infiltración.
e) Infiltramos por la herida recién hecha, por el envés de las hojas con una jeringuilla de 1 ml sin
aguja.
Pasadas 24 ó 48h desde la infiltración en las hojas se puede recoger el tejido para su
observación al microscopio.
5. Resultados
1. Describir la forma de regeneración obtenida en la placa control.
2. Contabilizar el número de explantes en los que se produce organogénesis con medio

selectivo. Calcular el porcentaje de transformación (nº de explantes con organogénesis/
nº total de explantes). Describir la forma de regeneración obtenida en la placa control.
6. Bibliografía
1.- Roger Y. Tsien, 1998. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of
Biochemistry Vol. 67:509-544; doi.org/10.1146/

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Se utilizan hojas de Nicotiana tabacum cultivadas in vitro en cámara de crecimiento.

b) Cortar las hojas en trozos pequeños (1 x 1 cm) evitando el nervio central.

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Tomar el medio de cultivo de Agrobacterium en crecimiento exponencial con una DO de

a) Conforme se van obteniendo los explantes se sumergen en el cultivo de infección

Las placas selladas con parafilm se colocarán en la cámara de crecimiento bajo

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Bajo las condiciones de cultivo, si el medio es adecuado para la regeneración, se

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a) Inoculamos una colonia procedente de la transformación del Agrobacterium en 12-

b) Centrifugamos a 4000rpm RT durante 20 minutos. Eliminamos el sobrenadante y

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