INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA

DE BIOTECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MOLECULAR

PRCTICA 4: Agrotransformacin

GRUPO: 4BM2

PROFESORES:

MORENO ZAVALA FABIOLA // PEREZ SOLIS ERICK EMMANUEL

EQUIPO 2

INTEGRANTES:

Cervantes Martnez Alejandra

Hernndez Tllez Tonatiuh

Ruvalcaba Ugalde Amlcar

Sandoval Guilln Daniel Alejandro

FECHA DE ENTREGA:
MARTES 23 DE OCTUBRE DEL 2017
 [LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MOLECULAR] 23 de octubre de 2017

PRCTICA 4: TRANSFORMACIN POR Agrobacterium rhizogenes.

OBJETIVO GENERAL:
Conocer y aplicar la metodologa para llevar a cabo la modificacin gentica nuclear
de plantas utilizando Agrobacterium rhizogenes A4.

OBJETIVOS ESPECFICOS:
Conocer el principio bsico de la modificacin gentica nuclear de plantas utilizando
un vector binario.
Conocer y llevar a cabo la metodologa bsica para la obtencin de plntulas
modificadas genticamente.
Conocer y llevar a cabo la metodologa para la identificacin de plantas modificadas
genticamente.

HIPTESIS

Si se realiza el protocolo de infeccin con Agrobacterium rhizogenes a una planta

dicotilednea, entonces existe una alta probabilidad de que ste logre transferirle
parte de su material gentico, induciendo la sntesis de opinas para favorecer sus
condiciones de crecimiento.
Si se realiza el protocolo de infeccin con Agrobacterium rhizogenes a una planta
dicoticotilednea, entonces la probabilidad de que ste le transfiera parte de su
material gentico es baja en comparacin con el caso mencionado anteriormente.
Si previo a la aplicacin del protocolo de infeccin no se realiza debidamente la
limpieza del tejido vegetal con alcohol y cloro, entonces puede existir un riesgo muy
alto de que aparezcan contaminaciones en el sistema de cultivo, impidiendo a su vez
que A. rhizogenes logre transferir a ste parte de su material gentico.
Si al completar el protocolo de infeccin no se remueve del sistema de cultivo a A.
rhizogenes con algn antibitico como la cefotaxima, entonces la presencia de dicho
microorganismo impedir el crecimiento del tejido vegetal, esto debido a la ventaja
que tiene ste en la competencia por los nutrientes.

INTRODUCCIN
La transformacin gentica de especies vegetales es un mecanismo ampliamente utilizado
dentro del campo del fitomejoramiento. Este sistema permite insertar genes forneos
dentro de un tejido vegetal receptor para la creacin de plantas genticamente
modificadas, conocidas tambin como plantas transgnicas (Blanco et al. 2003).
2
Para realizar la transformacin gentica es utilizada la tcnica de infeccin por
Agrobacterium. Este mecanismo de la biologa molecular, para la transformacin de plantas
fue conocido a mediados de los aos 70 (Gelvin, 2000) y hoy en da se utiliza principalmente

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por su facilidad y alto porcentaje de transformacin en una gran variedad de especies

vegetales.
En esta prctica se trabajar con Agrobacterium rhizogenes. El mecanismo de infeccin
comienza cuando percibe seales qumicas de las clulas vegetales daadas, las cuales son
consideradas como inductoras de la respuesta de virulencia. Algunas de estas seales con
compuestos fenlicos como la acetosiringona, -hydroxyacetosiringona, coniferyl alcohol y
vainillina; sin embargo, tambin pueden ser azcares neutros y cidos. Dichas seales son
percibidas por la protena sensora VirA, quien es autofosforilada. Ante ello, ocurre la
autofosforilacin de la protena VirG. El sistema de dos componentes VirA/VirG permite
transmitir la seal de dao vegetal para activar el loci de los genes vir (los cuales codifican
para factores esenciales para la transferencia e integracin del T-ADN dentro del genoma
de la planta) y provocar la unin bacteria-planta.

Posteriormente se da el procesamiento del plsmido, que para el caso de Agrobacterium

rhizogenes, es el plsmido Ri (inductor de races). La cadena de T-ADN (ADN de
transferencia) es escindida por VrD2/VirD1 y exportada en cis por VirD2 a travs del canal
VirB2/D4 formado entre la bacteria y la planta. Una vez el T-ADN presente en el citoplasma
de la planta, es empacado por VirE2. Esta accin permite tener un T-ADN maduro, el cual
migrar hacia el ncleo de la clula husped para inducir la produccin de opinas,
compuestos no aminoacdicos capaces de suministrar la fuente de carbono necesaria para
el desarrollo de Agrobacterium rhizogenes.

El objetivo de la transformacin de clulas vegetales es el mejoramiento de especies y

aumento de su valor, por la produccin de plantas resistentes a plagas y enfermedades,
tolerantes a herbicidas, as como productos alimenticios de mejor calidad y plantas que son
utilizadas como biorreactores para la sntesis de frmacos y aditivos alimenticios.
En esta prctica se presenta la metodologa para la infeccin y agrotransformacin de la
planta de chile y tomate, as como los resultados obtenidos.

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METODOLOGA

Protocolo de desinfeccin Protocolo de agrotransformacin

Extraer una plntula sin

Colocar las semillas contaminacin. (Evitar la
en un saco (gasas) deshidratacin con 4ml
de agua sobre la caja)

Sumergir en 100ml de Cortar explantes de

alcohol al 70% por 30 raz, tallo y hojas de
segundos (agitar 0.5cm x 0.5cm con
constantemente) bistur y pinzas

Sumergir en 100ml de Resuspender el

cloro al 10% por 10 cultivo de A.
min (agitar rhizogenes A4 en
constantemente) 10ml del medio YEB

Enjuagar con agua Incubar los explantes

estril (trabajar en en la suspensin de A.
condiciones de rhizogenes A4 por
esterilidad 15min agitando suave

Con ayuda de un Recuperar los

bistur romper el saco explantes (escurrir
(sobre caja Petri para evitar residuos
estril) de medio de cultivo)

4
Colocar los explantes en
Colocar 5 o 6 semillas
medio NBM e incubar a
en frascos con medio
25C con luz por 48 horas
MS e incubara 25C con
luz para que germinen | Prctica 4: Agrotransformacin
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RESULTADOS

A cada equipo se le asignaron varias semillas , mismas que fue cultivada en medio MS. En
el caso del equipo 2, las semillas sembradas fueron tomate y chile, desde la primera semana
se observ un crecimiento importante de las races, como se muestra en la siguiente
imagen:

Ilustracin 1. Races en medio MS.

Posteriormente se disectaron las hojas obtenidas para obtener explantes, mismos que
fueron incubados con la suspensin de Agrobacterium rhizogenes y sembrados en placas
con medio MS. Dichas placas se muestran a continuacin:

Ilustracin 2. Placa 2 con explantes en

Ilustracin 3. Placa 1 con explantes en medio MS.
medio MS.
DISCUSIN

En esta prctica, se emple a Agrobacterium rhizogenes A4 como el vector, en el cual, fue

transmitido el gen de GFP (protena verde fluorescente) usando un plsmido llamado
pCambia con kanamicina como antibitico de seleccin. A continuacin se muestra la
estructura general del plsmido pCambia:

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Ilustracin 4. Plsmido pCambia usado en la transformacin por Agrobacterium

rhizogenes.

Agrobacterium rhizogenes, como tal, es una bacteria Gram negativa, patgena de plantas,
causante de la enfermedad races en cabellera o hairy root que estimula la proliferacin
de races en el sitio de infeccin.

Es importante mencionar que uno de los principales problemas que se presentan cuando
se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos
tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente
generado por explante-medio de cultivo-condiciones fsicas de incubacin es altamente
propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos que pueden provocar
la destruccin de los cultivos (), debido a esto, antes de la agrotransformacin fue necesario
utilizar un protocolo de desinfeccin de semillas para asegurar que se obtuvieran que a
partir de su germinacin se obtuvieran plntulas libres de contaminantes.

El procedimiento ms utilizado consiste en una doble desinfeccin mediante la inmersin

de las semillas en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio
1 -3%, durante 3 a 30 minutos; la adicin de agentes tensoactivos junto con el desinfectante
es una prctica recomendada. Entre los ms usados figuran Tween-20 (0,01 0.1%)1. Cabe
mencionar que en la prctica se sigui un protocolo parecido, solamente que a segunda
6

1
Levitus, G; Echenique, V; Rubinstein, C; Hopp, E; Mroginsky, L. (s.f.). Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal
II. ArgenBio. 19-20 pp.
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desinfeccin se realiz con cloro comercial al 10% y ah mismo se le agreg una gota de
Tween 20.

Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados
con agua destilada estril. En este ltimo punto hay que aconsejar que se utilice agua
destilada estril de reciente preparacin, dado que est demostrado que el almacenaje
prolongado del agua estril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias.

Una transformacin exitosa de una planta con Agrobacterium rhizogenes produce races
pilosas y deber poder verse verde fluorescente bajo luz UV (debido a la introduccin de
GFP). Sin embargo, existen varios estudios en donde se menciona que Agrobacterium sp.,
es capaz de infectar nicamente a semillas dicotiledneas. El tomate es una semilla
dicotilednea, por lo cual el hecho de que no se observara crecimiento se pudo deber en
gran parte a la contaminacin presente en ambas placas. La placa nmero 1 (ilustracin 1)
se contamin mayormente, por lo cual qued descartada.

Por otra parte, la excesiva presencia de Agrobacterium rhizogenes en el tejido vegetal pudo
haber influenciado en el crecimiento y regeneracin de este tejido, lo cual se soluciona
realizando subcultivos de la misma muestra para suprimir el crecimiento y efecto de este
vector. Dichos subcultivos, no slo son importantes para suprimir o inhibir a este patgeno,
sino que por tica profesional es importante evitar cualquier diseminacin o contacto con
el mismo.

La adicin de un antibitico efectivo y barato en un subucultivo siempre es la mejor opcin.

Los antibiticos ms usados para este fin son la cefatoxima (200-300 mg/L) y la carbenicilina
(500 mg/L) aunque son caros y tienen un ligero impacto en la regeneracin del tejido
vegetal.

Existe un antibitico ms que inhibe el crecimiento de Agrobacterium rhizogenes. Es barato

y adems permite el crecimiento y regeneracin vegetal, teniendo la misma actividad que
los antibiticos anteriores. Este antibitico se llama Timentina (200-500 mg/L en proporcin
50:1 100:1 w/w tricarcilina: cido clavulnico) y es una penicilina semisinttica, producto
de la combinacin de tricarcilina y cido clavulnico2. Este ltimo es empleado para inhibir
a las -lactamasas que producen la inactivacin del antibitico.

La transformacin de la planta, si no fue observada a travs del crecimiento de races

pilosas, puede ser comprobada a travs de la tcnica de PCR.

Se puede tratar uno de los explantes aplicando los reactivos caractersticos de esta prueba
para que al momento de correr la muestra en el gel de electroforesis, si se ve una banda
correspondiente al plsmido Ri, significa que la transformacin fue exitosa.
7

2
Cheng, Z., et al. (1997). Timentin as an alternative antibiotic for supression of Agrobacterium tumefaciens in
genetic transformation. Plant Cell Reports. 1998 (17). 646-649 pp.
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La importancia de usar como vector a Agrobacterium rhizogenes radica en que se ha visto

que para que ocurra la integracin y movilizacin del T-ADN en el genoma vegetal, son
necesarios nicamente los bordes derecho e izquierdo del mismo. A partir de ello, se han
podido construir vectores desarmados, los cuales suplen genes presentes de forma
normal en el plsmido bacteriano (como auxinas, genes asociados a la virulencia, opinas,
etc.) por los genes de inters, mismos que estn ubicados entre los bordes izquierdo y
derecho. Tambin pueden formarse vectores binarios. En ste sistema, se emplean dos
plsmidos. Uno de ellos nicamente posee al T-ADN con los genes que se desean introducir
al husped, y en otro plsmido, se insertan los genes vir asociados con la virulencia.3

Dicho todo lo anterior, es de vital importancia para un Ingeniero Biotecnlogo conocer y

entender el mecanismo de infeccin de Agrobacterium sp., as como hacer un uso
responsable de las nuevas tecnologas en vectores en cualquier rea en el que se
desempee.

CONCLUSIONES

Agrobacterium rhizogenes no infect a ninguna de las dos semillas, tomate y

jalapeo, puesto que ambas con dicotiledneas, esto debido a la contaminacin del
cultivo.
Una de las placas con explantes no se contamin pero tampoco presento
crecimiento, esto pudo deberse a que no se llev a cabo la infeccin de la planta.
Resulta necesario hacer subcultivos con antibiticos que inhiban el crecimiento de
Agrobacterium rhizogenes, tales como la carbenicilina, cefotaxima y tricarcilina.

REFERENCIAS CONSULTADAS

Agrobacterium tumefaciens: un ingeniero gentico por naturaleza.Universidad

Nacional Abierta y a Distancia. Consultado el 7 de Julio del 2015 se sitio web:
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203027/MODULO_Y_PROTOCOLO_EXE/l
eccin_20_agrobacterium__tumefaciens_un_ingeniero_gentico_por_naturaleza.ht
ml
Blanco, M; Valverde, R; Gmez, L (2003). OPTIMIZACIN DE LA TRANSFORMACIN
GENTICA CON Agrobacterium rhizogenes. Laboratorio de Biotecnologa de Plantas,
Centro de Investigaciones Agronmicas, Universidad de Costa Rica. 27(1): 19-28
Cheng, Z., et al. (1997). Timentin as an alternative antibiotic for supression of
Agrobacterium tumefaciens in genetic transformation. Plant Cell Reports. 1998 (17).
646-649.
8
3
Agrobacterium tumefaciens: un ingeniero gentico por naturaleza.Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Consultado
el 7 de Julio del 2015 se sitio web:
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203027/MODULO_Y_PROTOCOLO_EXE/leccin_20_agrobacterium__tumefacie
ns_un_ingeniero_gentico_por_naturaleza.html
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Gelvin, S. (2000). Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and
integration. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 51: 223-256.
Humara, J; Lpez, M; Ordas, R (1999). Induction of a virulence response in
Agrobacterium tumefaciens by exudates of Pinus pinea cotyledons. Plant Cell, Tissue
and Organ Culture 55: 175-181.
Levitus, G; Echenique, V; Rubinstein, C; Hopp, E; Mroginsky, L. (s.f.). Biotecnologa y
Mejoramiento Vegetal II. ArgenBio. 19-20 pp.
Stachel, S; Nester, E; Zambryski, P (1986). A plant cell factor induces Agrobacterium
tumefaciens vir gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 379-383

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