Umsnh: Practica 03

UMSNH
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo
Licenciatura en Biotecnología
LABORATORIO 03 BIOQUIMICA Y BIOTECNOLOGIA
PRACTICA 03
-Técnicas de aislamiento microbiano-
-Martha Patricia Chávez Moctezuma -
1907982K
-Jesús Alexis Cervantes Ramírez-
4to semestre .-------------------------------------------. Sección 02
REPORTE 03
ENTREGA: 28/03/2023
Jesús Alexis Cervantes Ramírez

SECCION 02
Introducción
En el laboratorio de microbiología, bacteriología, etc… tras el manejo de medios de cultivo
para la inoculación de bacterias es necesario llevar a cabo correctamente diversas técnicas
asépticas para evitar la contaminación de estos medios.
En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se encuentran
diversos microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es
decir la separación de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra.
Existen diversos métodos para conseguir esta separación, la mayoría de ellos basados en
la inmovilización de las células microbianas en la superficie de los medios de cultivo sólidos.
Al depositar una célula bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, ésta
quedará inmovilizada en ese punto y en él se reproducirá por absorción de los nutrientes
del medio. Las nuevas células generadas permanecerán igualmente inmóviles y tras
sucesivas generaciones conformarán lo que denominamos una "colonia" que no es más
que un montón de células derivadas de una sola célula madre inicial, es decir, un clon de
la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es visible al ojo humano y
presenta diferentes características según el microorganismo que la genera. Esto nos
permite distinguir las diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en la muestra
sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un nuevo medio de cultivo
estéril, a estos cultivos los consideraremos "puros" por poseer un sólo tipo de
microorganismo.
• Siembra por estrías en caja Petri o tubo de ensaye.
• Vaciado en placas donde se obtienen colonias tanto en la superficie como en partes

profundas del medio inoculado.
• Cultivo por dilución y agitación.
• Aislamiento de bacterias con una varilla angular de vidrio.
• Aislamiento de microbios extraídos com un aplicador de algodón.
• Siembra por picadura.
Objetivo
Aprender las técnicas fundamentales empleadas para la transferencia y aislamiento de
microorganismos.
Materiales y reactivos
Materiales y equipo.
Tubos de ensaye com caldo nutritivo
Tubos de ensaye com agar nutritivo
(superfície inclinada)
Cajas petri com agar EMB
Tubos de ensaye com médio SIM
(superfície horizontal)
Cajas petri com agar nutritivo

SECCION 02
Tubos de ensaye co S-110
Asa y aguja de inocular

Mechero
Algodón
Masking tape
Kleen pack
Muestra mixta
CULTIVOS: E. Colli, S. Epidermidis,
Proteus Vulgaris, Pseudomonas
aeruginosa.
Procedimiento
Técnica aséptica:
1.- Limpiar perfectamente la mesa de trabajo con solución desinfectante.
2.- Lavarse las manos con jabón y después frotárselas con un algodón con alcohol lejos del
fuego.
3.- Colocar los tubos y demás material en una posición adecuada en la que se puedan
alcanzar sin dificultad y sin peligro de quemarse.
4.- Trabajar siempre junto al mechero, ya que este proporciona una zona de esterilidad de
aproximadamente 20 cm. de radio.
5.- Antes de realizar cualquier siembra, esterilizar el asa o aguja a fuego directo hasta el
rojo vivo de la base a la punta y enfriar cerca del mechero.
6.- Para tomar el inóculo de siembra debe tocar con el asa una colonia seleccionada o
asada si es líquido. Inocular y volver esterilizar.
7.- Durante la siembra, deben permanecer cerradas las puertas y ventanas y no se debe
hablar o generar corrientes de aire.
Técnicas de sembrado.
1.-Inoculación de medios líquidos:
a) Tomar con una mano el tubo que contenga el cultivo y otro con caldo nutritivo estéril.
b) Con la otra mano, tomar el asa y esterilizarla hasta el rojo vivo de base a punta dejar
enfriar. Quitar y sostener los tapones de los tubos con los dedos libres de la mano que
sujeta el asa, tener cuidado de no acercarlo demasiado al mechero.
c) Flamear los bordes de ambos tubos, introducir el asa al cultivo y tocar una colonia si el
medio es sólido tomando una pequeña muestra sin rasgar el medio.
d) Introducir el asa con el inóculo dentro del tubo con el caldo y agitar el asa en círculos.

SECCION 02
e) Retirar el asa, flamear nuevamente los bordes de los tubos y colocar los tapones.
f) Esterilizar el asa de la base a la punta.
g) Etiquetar el tubo inoculado (medio de cultivo empleado, microorganismo inoculado,
número de equipo, sección y fecha)
h) Guardar a temperatura ambiente.
2.- Inoculación en medio inclinado:
a) Tomar un tubo que contenga el cultivo y otro con el medio inclinado.
b) Sujetar los tubos, remover los tapones y realizar los pasos asépticos como se explicó
anteriormente.
c) Esterilizar el asa de la base a la punta, dejar enfriar y tomar un inóculo del medio de
cultivo.
d) Introducir el asa hasta el fondo del tubo y deslizarla a manera de estrías sobre la
superficie del medio hasta el extremo externo, sin repetir la operación.
e) Flamear los bordes de los tubos y taparlos.
f) Esterilizar el asa como se indicó anteriormente.
g) Etiquetar el tubo inoculado.
h) Incubar.
3.-Cultivo por picadura:
a) Tomar el tubo que contenga el cultivo y otro con medio de cultivo SIM.
b) Realizar los pasos de flameado y remoción de tapones.
c) Esterilizar la aguja de la base ala punta, enfriar y tomar una muestra de cultivo.
d) Introducir la aguja en el medio sin llegar al fondo del tubo, sacarla por el mismo trayecto
de la entrada sin repetir la operación.
e) Flamear los bordes de los tubos y taparlos.
f) Esterilizar la aguja como lo realizó anteriormente.
g) Etiquetar el tubo.
h) Incubar.
4.-Siembra por estrías en caja de Petri
Aislamiento primario de bacterias:
Todo el proceso se realizará en zona estéril, junto al mechero y abriendo la caja sólo que
sea necesario. Los pasos son los siguientes:
a) Esterilizar el asa de siembra como se ha indicado y tomar una asada de la muestra mixta.

SECCION 02
b) Tomar la caja de Petri, reposarla sobre la palma de la mano, abrir la tapa con el pulgar y
el dedo medio.
c) Colocar el inóculo en el borde del agar y hacer una estría inicial sin despegar el asa,
presionando, pero sin perforar el agar, hasta cubrir aproximadamente una cuarta parte de
la caja como se indica en la figura 12.
d) Bajar la tapa de la caja y esterilizar el asa.
e) Girar la caja de petri un cuarto de vuelta, levantar la tapa, enfriar el asa tocando la
superficie de agar, lejos de la estría recién hecha.
f) Tocar una vez más la superficie de la estría recién hecha con el asa y hacer un segundo
grupo de estrías. Tener cuidado de no cruzar ninguna de las estrías originales.
g) Tapar la caja y repetir los pasos d, e y f
h) Sellar la caja con kleen pack
i) Etiquetar con marcador indeleble la caja (medio de cultivo utilizado, muestra empleada,
No. de equipo, sección y fecha)
j) Incubar la caja de manera invertida.
Si se trata de un cultivo puro, se puede sembrar por estrías en un tubo de ensaye con
superficie inclinada o bien en una caja de petri realizando únicamente una estría en toda la
superficie.
Para obtener un cultivo axénico:
(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero,
(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra,
(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri,
(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo
grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una
cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células
aisladas.
(e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que
el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar
por estrías una segunda placa.
5.- Aislamiento de microbios extraídos con un aplicador de algodón
a) Introducir el aplicador de algodón a un cultivo mixto.
b) Trazar con el algodón unas líneas inoculando una pequeña zona en el borde de una caja
de Petri con agar nutritivo.
c) Cubrir la caja, sumergir el aplicador en solución desinfectante de cloro 1%.

SECCION 02
d) Esterilizar el asa como lo has realizado y pasarla al sector inoculado con el algodón,
realizando estrías por cuadrantes.
e) Esterilizar el asa, invertir la caja e incubar.
Resultados
Característica Agar nutritivo Agar nutritivo
Película NO NO
Turbidez SI SI
Sedimento SI SI
Pigmento (Traslucido sin (Traslucido sin
pigmento) pigmento)
Color SIN COLOR SIN COLOR
Discusión
Se logró concluir la práctica con algunos inconvenientes como la escases del medio de
cultivo S-110 o los errores cometidos en la inoculación del medio SIM puesto que este
medio es muy frágil y debe manejarse meticulosamente.
Conclusión
Tras la realización de esta práctica aprendimos y comprendimos la vital importancia
de una buena técnica aséptica requerida tanto como para el material a utilizar como
en la superficie en la que se trabajará para evitar posibles contaminaciones, así
como también obtuvimos los conocimientos necesarios para la aplicación de varias
técnicas de transferencia y aislamiento microbiano comprendiendo sus ventajas y
desventajas para seleccionar la técnica que mejor se adapte a la problemática a
resolver.
Bibliografía
RAFÍA Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da
edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. Difco y BBL. 2003. Manual de
Medios de Cultivo Microbiológicos. Merck. 2002. Microbiology
Tortora, F. C. 2001. Microbiology. Addison Wesley Longman

SECCION 02

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• Vaciado en placas donde se obtienen colonias tanto en la superficie como en partes

• Cultivo por dilución y agitación.

• Aislamiento de bacterias con una varilla angular de vidrio.

• Aislamiento de microbios extraídos com un aplicador de algodón.

• Siembra por picadura.

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Asa y aguja de inocular

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Medios de Cultivo Microbiológicos. Merck. 2002. Microbiology

Tortora, F. C. 2001. Microbiology. Addison Wesley Longman

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