Guía de Ecotoxicología 2022-2

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL NORTE
FACULTAD DE INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL
Guía de prácticas – Ecotoxicología*
2022
* Versión actualizada de “Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica y Toxicología” de Juan Carlos Ramos Gorbeña
Guía de prácticas de laboratorio - Ecotoxicología
CONTENIDO
Practica N°1:
DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS
Practica N° 2:
DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE PROTEÍNAS
Practica N° 3:
ACCIÓN ENZIMÁTICA DE LA CATALASA EN CELULA PROCARIOTA Y EUCARIOTA
Practica N° 4:
EFECTOS DE LA CLORACION DEL AGUA EN BACTERIAS Y PROTOZOARIOS
Práctica N° 05 - 06
BIOENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE CEBADA
(Hordeum vulgare)
EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD DE LOS SUELOS DE ÁREAS MINERAS SOBRE
“LOMBRIZ DE TIERRA” Eisenia foetida
DETERMINACIÓN DEL EFECTO TOXICO Y GENOTOXICO DEL CROMO MEDIANTE
EL ALLIUM TEST
Práctica N° 11
INHIBICION DEL DESARROLLO DE Saccharomyces cerevisae POR ACCION DEL
CONSERVANTE ALIMENTARIO BENZOATO DE SODIO
Práctica N° 12
PRUEBAS DE TOXICIDAD AGUDA EN “PLANARIA DE AGUA DULCE” Girardia
festae (Borelli, 1898) UTILIZANDO EFLUENTES INDUSTRIALES
Práctica N° 01
DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS
Introducción.
A los carbohidratos se les conoce también como glúcidos que deriva de la palabra "glucosa" que
proviene del vocablo griego glykys que significa dulce, aunque solamente lo son algunos
monosacáridos y disacáridos. Los carbohidratos están compuestos principalmente por carbono,
hidrógeno y oxígeno: Cn(H2O)n. en este nivel se incluyen sustancias que cumplen funciones
importantes como componentes de plantas y animales, proporcionando estructura en los
primeros y constituyéndose en fuente de energía en los segundos. Los carbohidratos son
polihidroxialdehídos, polihidroxicetonas o compuestos que, por hidrólisis, se convierten en
aquellos. La clasificación establecida va de acuerdo con el comportamiento seguido por el
carbohidrato cuando es sometido a hidrólisis ácida. De esta manera tenemos básicamente tres
grupos:
Monosacáridos. Se incluyen carbohidratos no hidrolizables a compuestos más simples. Estos

compuestos contienen de 3 a 8 carbonos (triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, etc.). De este
grupo se destaca por su importancia y abundancia en los organismos vivos la glucosa.
Oligosacáridos. Una vez sometidos a hidrólisis, los miembros de este grupo generan por lo
regular mínimo dos moléculas de monosacáridos y máximo diez. En este grupo encontramos
compuestos que exhiben un sabor dulce y por esta razón se le conoce con el término azúcares.
Los de mayor importancia desde el punto de vista biológico son la maltosa, la sacarosa, la lactosa
y la celobiosa.
Polisacáridos: Son macromoléculas que al hidrolizarse dan lugar a más de diez moléculas de
monosacáridos. Ejemplos de este grupo son el almidón y la celulosa.
Para determinar la presencia de carbohidratos en muestras de biológicas o de alimentos se

emplea la Reacción de Benedict que permite identificar los azúcares reductores, como lactosa,
la glucosa, la maltosa, y celobiosa.
En soluciones alcalinas pueden reducir el ion cúprico Cu2+ de color azul a ion cuproso Cu+ de
color rojo. Este ion cuproso Cu+ se oxida y precipita en forma de Oxido cuproso (Cu2O), lo que
proporciona la coloración positiva de la reacción que va desde un color verde, amarillo,
anaranjado o rojizo.
El reactivo de Benedict consta de los siguientes compuestos:

Sulfato cúprico;
Hidrato de sulfato de sodio
Carbonato Anhidro de Sodio.
Hidróxido de sodio NaOH.
Objetivos:
Determinar en forma cualitativa la presencia de carbohidratos a través
de la reacción de Benedict.
Materiales y reactivos
• Tubos de ensayo
• Pinzas para tubos de ensayo
• Bañomaría/cocina eléctrica
• Beaker
• Pipetas de 5 mL
• Pipeteador para pipetas
• Solución de glucosa al 5 %
• Solución de sacarosa al 5%
• Suspensión de almidón al 5%
• Néctar de fruta
• Leguminosa cocida
• Stevia (Stevia rebaudiana)
• Leche tarro
• Leche deslactosada
• Homogenizado de hígado
• Reactivo de Benedict
• Lugol
Procedimiento
Para determinar cualitativamente la presencia de carbohidratos en una muestra debemos
emplear sustancias que reaccionen específicamente con ellos.
Determinación de glucosa (monosacáridos)
Reactivos Tubos
1 2 3 4 5 6
Solución de glucosa al 5% (mL) 2 2 2
Néctar de fruta/otro (mL) 2 2 2
Lugol (gotas) 1-5 1 1
Reactivo de Benedict (mL) 1 1
Control Agua (mL) 1 1
Coloca los tubos 2, 3, 5 y 6 al baño de agua hirviendo durante 5 minutos
Observar las reacciones que se dan en cada uno de los tubos de ensayo, registrar
los datos, dibujar o tomar fotografía o video para el informe correspondiente.
Determinación de sacarosa y lactosa (disacáridos)
Reactivos Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8
Solución de sacarosa al 5% (mL) 2 2
Solución de Stevia al 5 % /otro (mL) 2 2
Leche (mL) 2 2
Leche deslactosada (mL) 2 2
Reactivo de Benedict (mL) 1 1 1 1
Control Agua (mL) 1 1 1 1
Coloca los tubos al baño de agua hirviendo durante 5 minutos.
Determinación del almidón y el glucógeno (polisacáridos)
Reactivos Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Solución de almidón al 5% (mL) 2 2 2
Homogenizado de hígado (mL) 2 2 2
Homogenizado de Frejol cocido(mL) 2 2 2
Lugol (gotas) 1-5 1 1 1
Reactivo de Benedict (mL) 1 1 1
Control Agua (mL) 1 1 1
Coloca los tubos 2, 3, 5, 6, 8 y 9 al baño de agua hirviendo durante 5 minutos.
Práctica N° 02
DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE PROTEÍNAS
Introducción.
Las proteínas desempeñan una amplia variedad de funciones en plantas y animales. Estas
funciones se pueden agrupar en dos clases: dinámicas y estructurales (estáticas). Entre las
funciones dinámicas de las proteínas se encuentran el transporte de sustancias, el control
metabólico, la contracción, la comunicación y la catálisis de transformaciones químicas. En
cuanto a sus funciones estructurales, las proteínas proporcionan la matriz para los tejidos óseo
y conjuntivo que dan igualmente forma al organismo. Las proteínas son polímeros de
aaminoácidos. Es interesante anotar que todos los tipos diferentes de proteínas se sintetizan
inicialmente como polímeros de 20 aminoácidos, conocidos como aminoácidos comunes.
Además de los aminoácidos comunes, en las proteínas se encuentran aminoácidos derivados,
formados a partir de los comunes, normalmente mediante una reacción catalizada por una
enzima.
Los aminoácidos comunes tienen en común un átomo de carbono central, denominado

carbonoa, al que están unidos covalentemente un grupo ácido carboxílico (-COOH), un grupo
amino (NH2) y un átomo de hidrógeno (-H). Además de esto, al átomo de carbono se le une una
cadena lateral, designada como R, la cual es diferente para cada uno de los aminoácidos
comunes. A pH fisiológico, tanto el grupo carboxilo como el amino se encuentran ionizados.
Con base en su polaridad, algunos aminoácidos son solubles en agua (aminoácidos

hidrofilicos polares); otros por el contrario son poco solubles en agua y completamente
solubles en solventes orgánicos (aminoácidos hidrofóbicos no polares). Los aminoácidos se
unen para formar las proteínas mediante un enlace covalente llamada enlace peptídico. Una
reacción empleada para el reconocimiento de enlaces peptídicos es la reacción con Biuret.
Este reactivo está constituido por sulfato de cobre (CuSO4) en solución acuosa alcalina,
característica debida a la presencia de hidróxido de sodio o de potasio (NaOH, KOH,
respectivamente).
El resultado de esta reacción es un compuesto de color violeta bastante notorio e ideal para
una determinación cualitativa. Este producto obedece a la formación de un complejo de
coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno
que forma parte de los enlaces peptídicos, por lo cual es de esperarse que el reactivo de
Biuret no reaccione con aminoácidos libres.
Objetivos:
Determinar en forma cualitativa la presencia de proteínas y establecer algunas
propiedades químicas y físicas.
Materiales y reactivos
Tubos de ensayo Sacarosa 5%
Pinzas para tubos de ensayo Solución de albumina 30%
Bañomaría/cocina eléctrica Solución de gelatina natural al 10%
Beaker Plasma sanguíneo diluido al 20%
Pipetas de 5 mL Homogenizado de carne
Pipeteador para pipetas Reactivo de Biuret
Agua de botella Solución de ácido acético glacial
Aceite de oliva HCl 10N
Leche NaCl al 20%
Leche de soya
Procedimiento
Para determinar cualitativamente la presencia de proteínas en una muestra
debemos emplear sustancias que reaccionen específicamente con ellos.
Determinación de Proteínas
Tubos
Reactivos/muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Aceite de oliva (mL) 2
Homogenizado de carne (mL) 2
Plasma sanguíneo diluido al 20% (mL) 2
Solución de gelatina natural al 10% (mL) 2
Solución de albumina 30% (mL) 2
Leche (mL) 2
Leche de Soya 2
Sacarosa 5% (mL) 2
Control Agua (mL) 2
Reactivo de Biuret (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Agitar los tubos y dejar en reposo durante 3 minutos
Observar las reacciones que se dan en cada uno de los tubos de ensayo, registrar los datos,
dibujar o tomar fotografía o video para el informe correspondiente.
Coagulación de Proteínas
Tubos
Reactivos/Muestras 1 2 3 4 5
Solución de albumina 30% (mL) 3 3 3 3 3
Temperatura de coagulación 80°C
Solución de ácido acético glacial (gotas) 3
*HCl 10N (mL) 1
NaCl al 20% (mL) 2
Control Agua (mL) 2
Nota:
Reemplazar el HCl 10N con de ácido Lactico (3 gotas*)
*Las gotas añadir por las paredes del tubo
Observar las reacciones que se dan en cada uno de los tubos de ensayo, registrar los datos,
dibujar o tomar fotografía o video para el informe correspondiente.
Práctica N° 03
AC CIÓN ENZIMÁTICA DE LA CATALASA EN
CELULA PROCARIOTA Y EUCARIOTA
INTRODUCCIÓN.
La Catalasa es una enzima homoproteica, encargada de descomponer el peróxido de

hidrogeno (H2O2) en elementos menores como agua y oxígeno. Está presente en la mayoría
de organismos vivos como animales, plantas y bacterias aerobias estrictas, facultativas y
anaerobias facultativas. El peróxido de hidrógenos se forma como uno de los productos
finales de la oxidación del metabolismo celular aerobio de los carbohidratos su
acumulación es toxica para los organismos. Por ello la catalasa convierte el peróxido de
hidrogeno en agua y oxígeno, según la siguiente reacción:
La prueba de la catalasa se realiza en lámina o tubo, se utiliza para diferenciar a los géneros
Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Micrococcus (+), así como también a Bacillus (+)
de Clostridium (-).
Objetivos.
▪ Determinar la presencia de la enzima catalasa en célula procariota y eucariota
Materiales y reactivos.
Tubo de ensayo 16 x 150 mm. Pro pipetas.

Laminas portaobjetos Beaker 150 mL.
Picetas con agua destilada. Agua oxigenada
Gradillas para tubos 16 x 150 mm Hígado fresco de pollo.
Morteros con pilón. Papa
Goteros de plástico. Cultivos bacterianos (Staphylococcus sp
y Streptococcus sp)
Procedimientos:
Actividad de la catalasa en célula procariota (Célula Bacteriana)
Colocar sobre un portaobjetos una colonia bacteriana y agregar unas gotas de H202 al 3 %.
Observar el desprendimiento de burbujas (catalasa +).
Actividad de la catalasa en célula eucariota (Célula Animal y Vegetal)

Colocar en un mortero el hígado de pollo, triturarlo y repartir en 5 tubos en partes iguales.
Agregar a cada tubo agua oxigenada en concentraciones crecientes: 0, 25, 50, 75 y 100% y
observar el desprendimiento de oxígeno en cada tubo. Anotar el tiempo (en segundos) de
formación de espuma en cada muestra.
Elaborar una gráfica en papel milimetrado la variación de la concentración de sustrato vs.

Tiempo que dura la reacción de la enzima catalasa
Nota: Observar las reacciones que se dan en cada uno de los tubos de ensayo, registrar los
datos, dibujar o tomar fotografía o video para el informe correspondiente.
Práctica N° 04
EFECTOS DE LA CLORACION DEL AGUA EN BACTERIAS Y PROTOZOARIOS
INTRODUCCION:
La razón fundamental de la necesidad de desinfectar el agua destinada al consumo humano y

uso doméstico es asegurar la inactivación, de los agentes patógenos para el hombre
transmitidos por esta. Así, el tratamiento adecuado y la desinfección fiable del agua, constituyen
una intervención fundamental de la salud pública (Craun, 1996) que, si se aplica como es debido,
reduce la incidencia de la mayor parte de las enfermedades transmitidas por el agua, entre las
que cabe destacar la fiebre tifoidea y paratifoidea, el cólera, la hepatitis infecciosa, la
poliomielitis, amebiasis, campilobacteriosis, enteritis causadas por rotavirus y diarreas causadas
por cepas de E. coli, entre otras.(OMS, 1995; OMS/OPS, 1995; WHO, 2002; National Center for
Infectious Diseases, 2004).
El cloro es uno de los desinfectantes del agua más antiguo, y de uso común en América Latina y
el Caribe considerándose uno de los desinfectantes más efectivos para el agua potable, además
de uno de los más económicos. (OPS/OMS, 1995). El cloro se encuentra a la venta en diferentes
formulaciones y presentaciones, relativamente sencillas de aplicar al agua, siendo un bactericida
y virucida eficaz en la mayoría de las situaciones que, además, proporciona un residual que
puede medirse fácilmente y ayuda a proteger el agua contra la recontaminación microbiana.
(OPS/OMS, 1995)
Los agentes patógenos bacterianos presentes en el agua pueden controlarse eficazmente

mediante una cloración fiable siempre que esta esté clara. Esto es importante, si tenemos en
cuenta que los agentes bacterianos son responsables de hasta el 45% de los casos de diarrea en
los niños de países en desarrollo. De igual manera Vibrio cholerae, causante de la reciente
epidemia en América Latina es susceptible al cloro. (OPS/OMS, 1993). Sin embargo, con relación
a los protozoos, Giardia lamblia considerada entre los agentes patógenos más resistentes a la
desinfección, sus quistes pueden persistir en el agua clorada, a las dosificaciones, temperaturas
y tiempos de contacto normalmente usados en la cloración del agua para fines potables. (Nitt,
1996).
El cloro está disponible en tres formas: como gas, y en dos componentes químicos: hipoclorito
de calcio Ca (OCl)2 sólido granular o en tabletas e hipoclorito de sodio NaOCl, líquido
blanqueador. El cloro gas es el agente más seguro y económico de estas tres formas.
Seguro
El cloro gas no es ni inflamable ni explosivo. Es abastecido en contenedores de acero pesados
diseñados exclusivamente para dar máxima protección para los cuidados y usos normales. Los
hipocloritos de calcio y sodio son de hecho más propensos a ocasionar lesiones o daños
comparados con el cloro gas, debido a que existe muy poco conocimiento concerniente al uso
seguro de estos productos y debido a que son empleados muy a la ligera. La palabra “GAS”
siempre suena más aterradora.
Económico
El cloro gaseoso tiene 100% de cloro puro, un cilindro de cloro de 68 kilos de capacidad, contiene
68 kilos de cloro activo. En contraste, el hipoclorito de calcio sólo contiene 6065% de cloro puro
por peso, y el hipoclorito de sodio, por la regulación de insumos controlados hasta el 8%. En
consecuencia, comparando el contenido de cloro activo de las tres formas de cloro, el cloro
gaseoso contiene el mayor porcentaje, además, el cloro gaseoso nunca pierde fuerza o
concentración, aunque haya sido guardado por mucho tiempo, por el contrario, los hipocloritos
pierden concentración de cloro activo por cuestiones de almacenamiento.
OBJETIVOS:
• Determinar la toxicidad del hipoclorito de sodio comercial en bacterias y protozoarios.
MATERIALES:
Materiales:
• Goteros de plástico.
• Placas Petri.
• Picetas con agua destilada.
• Vasos precipitados.
• Pipetas de 1, 5 y 10 mL. Microscopio.
• Propipetas
• Hematocitometro o Cámara de Neubauer
• Tubos de ensayo 15x160mm
• Concentraciones de hipoclorito de sodio comercial 0, 0.2, 0.4, 0.5, 0.7, 1.0 y 2.0%
• Placas Petri con agar Plate count para Heterótrofos
• Placas Petri con agar Mc conkey para Coliformes Totales
PROCEDIMIENTOS
a. Evaluación de la toxicidad del cloro comercial en bacterias mediante el control

microbiológico
Métodos recuento en placa por técnica de diseminación en superficie de agar,
1. Preparar en frascos de 250 mL las diferentes concentraciones del hipoclorito de

sodio comercial (según la formula) para posteriormente distribuirlos en los tubos
de ensayo.
2. Colocar 1 mL de la muestra sin cloración (control) sobre la superficie del agar en la
placa Petri para heterótrofos y luego con la espátula Drigalsky hacer la distribución
de la muestra por toda la superficie del agar, dejar reposar por 5 minutos, para una
adecuada absorción de la muestra, e incubar a 37°C. durante 24 – 48 horas.
3. Colocar 1 mL de las muestras con diferentes concentraciones de cloro
(experimentales) con 10 minutos de contacto (muestra/concentración de cloro)
sobre la superficie del agar en la placa Petri para heterótrofos y luego con la
espátula Drigalsky hacer la distribución de la muestra por toda la superficie del agar,
dejar reposar por 5 minutos, para una adecuada absorción de la muestra, e incubar
a 37°C. durante 24 – 48 horas.
4. Colocar 1 mL de las muestras con diferentes concentraciones de cloro
(experimentales) con 10 minutos de contacto (muestra/concentración de cloro)
sobre la superficie del agar en la placa Petri para Coliformes Totales y luego con la
espátula Drigalsky hacer la distribución de la muestra por toda la superficie del agar,
dejar reposar por 5 minutos, para una adecuada absorción de la muestra, e incubar
a 37°C. durante 24 – 48 horas.
Anotar los resultados.
b. Evaluación de la toxicidad del cloro comercial en protozoarios mediante la observación al

microscopio con cámara de Newbauer.
Métodos recuento utilizando Cámara de Neubauer
1. Preparar en frascos de 250 mL las diferentes concentraciones del hipoclorito de

sodio comercial (según la formula) para posteriormente distribuirlos en los tubos
de ensayo.
2. Colocar 1 mL de las muestras de agua (protozoarios) en las diferentes
concentraciones de cloro (control y experimentales) exponerlo por 10 minutos de
contacto (muestra de agua/concentración de cloro) para luego proceder al
recuento con la cámara de Neubauer.
Procedimiento para la utilización de la Cámara de Neubauer
Introducción de la muestra en la cámara de Neubauer
Se toman 10 µL de la mezcla preparada en el paso 2 con la micropipeta.
1. Se coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer, y se coloca en posición

horizontal sobre la mesa, en un lugar donde nos sea cómodo pipetear.
2. Se introduce una punta desechable en el extremo de la micropipeta,
3. Se ajusta la micropipeta para succionar 10 µL de líquido. Generalmente este ajuste se
realiza girando el botón del embolo para seleccionar el volumen deseado.
4. Se introduce la punta de la micropipeta en la muestra.
5. Se pulsa el pistón o embolo superior de la pipeta suavemente hasta que se siente como
el pistón llega al final de su recorrido.
6. Se saca la punta de la pipeta de la muestra, y siempre manteniéndola en posición
vertical se lleva hasta la cámara de Neubauer.
7. Se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de la cámara
de Neubauer. Se trata de dejar que el líquido penetre entre la cámara y el cubreobjetos
desde el lateral, por capilaridad.
8. Se suelta el pistón suavemente mientras se supervisa que el líquido está entrando
correctamente y de forma uniforme en la cámara.
9. En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo no haya
salido bien, repetir la operación
Preparación y enfoque del microscopio.
1. Colocar la cámara de Neubauer en la bandeja del microscopio. Si el microscopio dispone

de pinza de sujeción, fijar la cámara con ella.
2. Encender la luz del microscopio.
3. Enfocar el microscopio hasta que pueden verse nítidas las células mirando por el
binocular.
4. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. En este ejemplo vamos a
contar 4 cuadros grandes de una cámara de Neubauer. Ver Figura.1
5. Realizar el recuento de células en el primer cuadro.
6. Anotar en una hoja de resultados la cantidad de células contadas en el primer cuadro.
7. Repetir el proceso para el resto de los cuadros que deseamos contar, anotando el
resultado de cada uno de ellos. Cuantos más cuadros contemos, más precisión
obtendremos en nuestra medida.
La fórmula para recuento con cuadros grandes en cámara de Neubauer

Fórmula para la preparación de soluciones de cloro
Donde:
V = Volumen de cloro a agregar
Cd = Concentración deseada de la solución
Vd = Volumen de solución a preparar
Cc = Concentración conocida del cloro que se está utilizando
Ejemplo 1:
Deseamos preparar 1 Litro o 1000 mL de una solución de cloro comercial al 2% (Vd = 1L; Cd= 2%)
Tenemos cloro comercial al 5% (Cc = 5%) Utilizando la fórmula:
V = (2% x 1000mL)/5%= 400 mL
Se debe agregar 400 mL de cloro comercial y completar con agua hasta 1000mL
BIOENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE
CEBADA (Hordeum vulgare)
INTRODUCCIÓN
Para el efecto de toxicología ambiental las exposiciones se clasifican en exposiciones crónicas,

subcrónicas y agudas. Las exposiciones crónicas duran entre el 10 % y el 100% de la vida del
organismo, las exposiciones subcrónicas son menores al 10% del periodo vital y las exposiciones
agudas suceden en un solo evento y abarcan periodos cortos como de horas y días. Las pruebas
de toxicidad aguda ayudan a identificar el potencial toxicológico de compuestos químicos
comerciales o presentes en el ambiente. Este tipo de pruebas son más factibles de hacer debido
a que el tiempo de exposición es corto. El bioensayo de toxicidad con semillas es una prueba
estática de toxicidad aguda (144 horas de exposición) en el que se pueden evaluar los efectos
fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinación de las
semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Como
puntos finales para la evaluación de los efectos fitotóxicos, se determina la inhibición en la
germinación y la inhibición en la elongación de la radícula y del hipocotilo (Figura 1). Es
importante destacar que durante el período de germinación y los primeros días de desarrollo
de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia
tóxica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por
lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos. La evaluación del
desarrollo de la radícula y del hipocotilo, constituyen indicadores representativos para
determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta.
A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación del efecto en la

elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas permite ponderar el efecto tóxico de
compuestos solubles presentes en niveles de concentración tan bajos que no son suficientes
para inhibir la germinación, pero que sin embargo pueden retardar o inhibir completamente los
procesos de elongación de la radícula o del hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de
acción del compuesto. De esta manera, la inhibición en la elongación de la radícula e hipocotilo
constituyen indicadores subletales muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en
vegetales, aportando información complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en
la germinación. Este ensayo puede ser aplicado para la evaluación de la toxicidad de
compuestos puros solubles, de aguas superficiales (lagos, ríos), aguas subterráneas, aguas para
consumo humano, aguas residuales domésticas e industriales, además de lixiviados de suelos,
sedimentos, lodos u otras matrices sólidas (Bowers et al, 1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989).
Figura 1. Proceso de germinación y morfología de la semilla de cebada (Hordeum vulgare)

OBJETIVO
Evaluar los efectos fitotóxicos del sulfato de cobre durante el proceso de germinación de las
semillas de cebada.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
• Semillas de cebada
• Placas Petri
• Fiolas de 100 y 1000 mL
• Pipetas volumétricas de 1, 5 y 10 mL
• Vernier o regla
• Pinzas/tijeras
• Toallas de papel
• Bolsas plásticas
• Papel de filtro
• Algodón
• Sulfato de cobre pentahidratado
PROCEDIMIENTO
• Colocar en la base de la placa Petri rotulada (P1 …..P5) un disco de papel filtro.
• Añadir en cada placa Petri 5mL de las siguientes diluciones, de manera homogénea:
P1 Control negativo 1: agua embotellada

P2 Control positivo: 20 mg/L de CuSO4
P3 Experimental 1: 2,5mg/L de CuSO4
P4 Experimental 2: 5mg/L de CuSO4
P5 Experimental 3: 10 mg/L de CuSO4
• Rotular cada placa Petri con los siguientes datos: concentración de la solución, fecha y
hora de inicio y término, asignatura y grupo.
• Con la ayuda de una pinza colocar 10 semillas en cada placa Petri, uniformemente
distribuidas en toda el área de la placa Petri. Tapar las cajas.
• Colocar las placas Petri en bolsas de plástico negras, para evitar la pérdida de humedad
por evaporación y para facilitar la germinación, debido a que las semillas son
fotoblásticas negativas.
• Incubar a temperatura ambiental (18°C y 23°C) durante 144 horas.
RESULTADOS
El efecto medido en este bioensayo es la inhibición de la elongación de la radícula, hipocotilo y

de la germinación. Como resultado final se espera obtener la CE50 o CI50 o % de inhibición. Los
valores serán aceptados si el porcentaje de germinación es superior al 90% en el control
negativo.
a. Observar cuidadosamente cada semilla de la placa Petri y anotar cualquier

indicador de fitotoxicidad como necrosis, pelos poco desarrollados,
radículas con crecimiento ensortijado. La necrosis se manifiesta como
manchas de color pardas, blancas o marrones.
b. Utilizando el vernier medir la longitud de la radícula y del hipocotilo de cada
plántula.
c. La medida de la elongación de la radícula se considera desde el nudo hasta
el ápice radicular. La medida de elongación del hipocotilo se considera
desde el nudo hasta el sitio de inserción de los dos cotiledones.
CÁLCULOS
Para la expresión de resultados se realizarán los siguientes cálculos:
a. Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del hipocotilo

de las plántulas de cada repetición.
b. Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo con el
promedio de elongación para cada dilución respecto del promedio de
elongación del control negativo
c. Porcentaje de inhibición de la germinación
d. Con los datos anteriores realizar una gráfica dosis-respuesta, colocando en el
eje de las ordenadas el porcentaje de inhibición y en el eje de las abscisas la
concentración.
EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD DE LOS SUELOS DE ÁREAS MINERAS SOBRE
“LOMBRIZ DE TIERRA” Eisenia foetida
INTRODUCCIÓN
El ecosistema terrestre constituye un recurso esencial de nuestro ambiente. Una de las
principales funciones del suelo a nivel ecológico está relacionada con la descomposición de la
materia orgánica y con la mineralización de nutrientes, producida por los invertebrados y
microorganismos del suelo (Tarradellas et al 1997). La protección del suelo y sus comunidades
resulta un objetivo primordial en las políticas ambientales en todo el mundo (Römbke et al
2005a; Filser et al 2008).
Los bioensayos con lombrices son ampliamente reconocidos como prueba para evaluar la
toxicidad de suelos contaminados (Dorn et al., 1998). De acuerdo a la clasificación de Jamieson
(1988), las lombrices de tierra se reparten en 11 familias (excluyendo 4 familias de hábitos
semiacuáticos), las cuales presentan una distribución particular (Edwards & Bohlen 1996).
Las lombrices de tierra, junto con otros organismos macro descomponedores, están entre los
organismos más importantes del suelo. Esto se debe a la capacidad de descomponer la materia
orgánica, reciclamiento de nutrientes y formación de suelo (Raty & Huhta, 2004). Esta
importante función puede ser afectada por la presencia de elementos químicos tóxicos en el
suelo (Spurgeon et al., 1994).
El cobre y el arsénico son importantes contaminantes ambientales asociados principalmente a

las actividades mineras (De Gregori et al., 2003). Estos alteran las características naturales de los
suelos en sectores cercanos a dichas actividades y pueden provocar efectos adversos sobre los
organismos vivos del suelo. El cobre y el arsénico pueden ser tóxicos para todos los organismos
dependiendo de las concentraciones en que se encuentren (Adriano, 2001). Una aproximación
en la evaluación de los efectos de los agentes tóxicos en suelos se realiza mediante bioensayos
de toxicidad. Para ello se han desarrollado metodologías estandarizadas (Organisation for
Economic Cooperation and Development, 1984, 2000), las cuales se llevan a cabo para
determinar los efectos agudos y crónicos en lombrices de tierra. Estas pruebas evalúan la
contaminación del suelo, a través de indicadores como mortalidad, reproducción u otra
respuesta subletal en los organismos de prueba. Se ha encontrado que las lombrices de tierra
son menos sensibles a suelos recolectados en terreno que a suelos artificialmente
contaminados. Esto se debe a una mayor biodisponibilidad de elementos en los últimos
(Spurgeon & Hopkin, 1995, 1996). Es por esto que el uso de suelos recolectados en terreno
refleja, de mejor manera, la interacción entre los elementos del suelo con los organismos
asociados a éste en condiciones naturales.
OBJETIVO
Determinar la toxicidad de los suelos agrícolas de áreas mineras sobre “lombriz de tierra” Eisenia
foetida.
MATERIALES
Lombriz de tierra Eisenia foetida. Propipeta

Tierra de zona minera Papel filtro
Tierra fértil Balanza
Vasos precipitados 1000 mL Termómetro
Vaso precipitado de 100 mL
Probeta 100 mL
Pipetas de 10 mL
PROCEDIMIENTO
• Colocar 500g de tierra fértil (comercial) en vaso precipitado de 1000 mL, en otros dos
recientes iguales añadir 500g de tierra de la zona minera, todas deben tener humedad
al 40% y deben estar por duplicado.
• Para el acondicionamiento de las lombrices estas serán alimentadas una semana antes
del ensayo con una preparación de alimento consistente en 5g de estiércol de vaca o
humus más 5 mL de agua destilada.
• Después del acondicionamiento, se colocarán 10 lombrices de tierra en cada recipiente,

las lombrices antes de ser colocadas en los recipientes deben ser lavadas con agua
destilada, secadas con papel filtro y pesadas cada una de ellas.
• Los recipientes con las lombrices deben estar a temperatura ambiental 18°C –
23°C, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y mantener la humedad de la tierra
constante (añadir 30 mL de agua por semana) durante 3 semanas.
RESULTADOS
El efecto medido en este bioensayo es la toxicidad crónica producida por la tierra sobre las
lombrices de tierra. Como resultado final se espera obtener la CE50 o CI50 o % de mortandad. Los
valores serán aceptados si el porcentaje de sobrevivencia es superior al 90% en el control
negativo.
a) Observar cuidadosamente cada recipiente del bioensayo y anotar cualquier
indicador de toxicidad como necrosis, muerte del individuo, etc.
b) Utilizando una balanza realizar el pesaje de cada una de las lombrices.
CÁLCULOS
a. Promedio y desviación estándar de los pesos para cada repetición.

b. Porcentaje de mortandad con respecto al control negativo.
DETERMINACIÓN DEL EFECTO TOXICO Y GENOTOXICO DEL CROMO
MEDIANTE EL ALLIUM TEST
INTRODUCCION
El cromo se puede presentar en forma trivalente y hexavalente. El cromo hexavalente en toxico
y corrosivo y permeable a las membranas biológicas. Bajo las dos formas, el cromo afecta la
oxidación bioquímica de los residuos líquidos, presentándose situaciones de riesgo cuando el
Cr3+ esta en concentraciones superiores a 50 µg/L y el Cr6+ superiores a 5 µg/L (CEPAL, 1993).
Una de las formas de conocer este riesgo potencial es el uso de bioensayos mediante los cuales
se evalúa, como una medida de alerta, la toxicidad de los compuestos y elementos químicos
predominantes en los efluentes industriales (Fiskesjö, 1993; Reichart, 1993).
En la actualidad se promueve el desarrollo sostenible, el cual debe involucrar la preservación y

protección del ambiente (Declaración de Rio, 1992) y, dentro de este marco, el cuidado de la
calidad e inocuidad del agua que será usada para diversos fines: el más importante el del agua
de bebida (Declaración de Dublín, 1992).
Para el control y la vigilancia del cumplimiento de los límites máximos permisibles es necesario
medir las cargas de los vertimientos referidos a tóxicos específicos o a indicadores de su
presencia por algunos de sus efectos (OPS/CEPIS, 1995).
En países desarrollados, sus normas de control ambiental incluyen mediciones específicas y, en

forma alternativa, bioensayos para la caracterización de efluentes industriales. Estas últimas
pruebas han sido incorporadas debido a su bajo costo y rapidez comparado con el análisis
químico de elementos específicos (OPS/CEPIS, 1995).
En diversos países, instituciones responsables de la protección ambiental, como la
Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA), la Organización para la
Cooperación y Desarrollo económico (OCE) y la Federación para Alimentos y Drogas (FDA)

proponen el uso de bioensayos como pruebas útiles para la detección, evaluación y control de
sustancias toxicas que son evacuadas a las fuentes de agua a través de efluentes industriales.
Asimismo, reconocen que los bioensayos constituyen una valiosa herramienta que debe ser
incorporada en los programas de monitoreo de aguas, que permiten disminuir las mediciones
específicas y que predicen el riesgo potencial que representan las sustancias toxicas evacuadas
a las fuentes de agua (OPS/CEPIS, 1995).
En el Perú y otros países de América latina, los efluentes de las industrias del cuero representan
niveles de cromo entre 70 y 110 mg/L (Zarate, 1991); por lo mismo requieren que no causen
daño a los organismos responsables de la oxidación biológica y la autopurificación del agua.
La evaluación del efecto citotóxico y genotóxico de una sustancia o elemento comienza con
el fenómeno biológico denominado mitosis. La mitosis es el proceso de la división celular
(del griego mito: filamento), por medio del cual se duplica los cromosomas del núcleo
celular, dividiéndose también el citoplasma, para formar dos células hijas, con similar
material genético y citoplasmático que la célula progenitora.
Las etapas de la mitosis en divide en:

a) Profase:
• La cromatina se condensa haciéndose visible los cromosomas.
• En cada cromosoma se observan sus dos cromátides.
• Los centriolos migran hacia los polos de la célula y emiten los ásteres que
formaran el huso acromático.
• La membrana nuclear sufre una ruptura, momento clave de la finalización
de esta fase.
b) Metafase:
• Los centriolos llegan a los polos y el huso acromático se encuentra
totalmente formado.
• Los cromosomas se ubican sobre las fibras del huso acromático mediante
sus centrómeros (cinetocoro) localizándose en la placa ecuatorial del huso.
• Los cromosomas alcanzan su máximo grosor en esta etapa.
c) Anafase:
• Los cromosomas se dividen longitudinalmente debido a la contracción de las
fibras del huso acromático, logrando la separación de las cromátides
hermanas.
• Las cromátides hermanas se dividen y migran hacia los polos opuestos por
el acortamiento de los microtúbulos del huso acromático.
• Al finalizar esta fase se inicia la citocinesis.
d) Telofase:
• Los cromosomas llegan a los polos del huso acromático.
• Se reconstituyen los núcleos de las nuevas células (formación de membrana
nuclear y reparación de los nucléolos).
• Se desorganiza el huso acromático.
• Termina la citocinesis.
El proceso de reproducción celular conocido con el nombre de mitosis, puede ser estudiado
eligiendo un material constituido por células que se hallen en continua división. Esta
condición la reúnen los meristemos terminales o primarios, tales como los que se
encuentran en el ápice de las raíces del bulbo de cebolla cuya base se mantenga en contacto
con el agua durante 4 ó 5 días, nos proporciona abundante cantidad de raíces jóvenes para
observar las diferentes etapas de la mitosis.
Modificado: Fuente: www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/Practica_2.htm
OBJETIVOS:
• Determinar el efecto citotóxico y genotóxico del cromo mediante el Allium
Test.
MATERIALES Y REACTIVOS
Raíz de cebolla Alliun cepa Solución de carnoy

Microscopios Ácido clorhídrico al 10% (se remplaza con ácido láctico conc.)
Portaobjetos Carmín acético o Acetocarmín
Cubreobjetos Dicromato de potasio
Bisturí o cuchilla Esmalte de uñas
Pinzas Aceite de inmersión
Frascos vacíos de néctar Agua destilada
PROCEDIMIENTO
Preparación de la Sustancia química

Para este bioensayo se utilizará dicromato de potasio (K2Cr2O7) como agente toxico. La solución
en sus diferentes concentraciones se prepara con agua destilada en concentraciones de 0.5, 1.0,
1.5, 2.0 y 5.0 mg/L.
Desarrollo del bioensayo

El Allium Test consiste en la exposición de los bulbos de la “cebolla” Allium cepa frente a las
diferentes concentraciones de la sustancia química a ser evaluada. Los efectos que se producen
a nivel de las raíces de Allium cepa, son de dos tipos:
• El efecto toxico que se manifiesta por la inhibición del crecimiento de la raíz o producen
la muerte de las células meristimáticas. Para observar el efecto toxico macroscópico
usaremos como indicador el crecimiento de la raíz, comparándolo con el ensayo
control.
• El efecto genotóxico que se manifiesta por causar daño a las siguientes generaciones
de células. Para estimar el daño genotóxico se aplicará la fórmula para determinar el
Índice Mitótico, además de las comparaciones que se realizará con el ensayo Control
para observar las aberraciones cromosómicas. Esta observación del efecto genotóxico
se aplicará usando el microscopio óptico con objetivo de 40X.
Procedimiento del Bioensayo: Efecto Toxico

a) Cinco o seis días antes de comenzar el experimento, escoja un bulbo de cebolla fresca
y elimine mediante un raspado con una cuchilla, las raíces secas que se hallan en la base
del bulbo. En un frasco boca ancha o un vaso desechable coloque la cebolla como
aparece en la figura N°1. Vierta la concentración respectiva de la solución de cromo
(0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 5.0 mg/L.) en el frasco, hasta tocar la base de la cebolla. Mantenga
la base de la cebolla húmeda y nivele la solución de cromo diariamente.
b) Colocar los frascos de los ensayos en ambiente oscuro, temperatura ambiental entre
18°C – 22°C durante 48 horas.
c) Después de las 48 horas de incubación se procede a la medición de la longitud de las
raíces.
Procedimiento del Bioensayo: Efecto Genotóxico

a) Cinco o seis días antes de comenzar el experimento, escoja un bulbo de cebolla fresca
y elimine mediante un raspado con una cuchilla, las raíces secas que se hallan en la base
del bulbo. En un frasco boca ancha o un vaso desechable coloque la cebolla como
aparece en la figura N°1. Vierta agua en el frasco, hasta tocar la base de la cebolla.
Mantenga la base de la cebolla húmeda y cambie el agua diariamente.
b) Cuando las raíces nuevas alcancen 3 cm. aproximadamente de longitud, extraiga la
cebolla del recipiente y corte el último centímetro de la punta.
c) Deposite estas raíces en la solución fijadora Carnoy (3 metanol: 1 ácido acético) durante
20 minutos.
d) Traslade las raíces a un recipiente que contiene ácido clorhídrico al 10% durante 10
minutos. Este tiempo varía según el tipo de célula.
e) Coloque las raíces en un recipiente con agua y lávela por cinco minutos.
f) Traslade las raíces a un recipiente con acetocarmín. Este colorante las debe cubrir
totalmente durante 20 minutos.
g) Saque la raíz del recipiente que contiene acetocarmín y póngala en un portaobjeto.
h) Corte nuevamente la raíz, dejando el extremo inferior (ápice) y deseche el otro.
i) Coloque en ángulo recto el cubreobjetos, bájelo lentamente hasta que se pose en el
preparado, y luego haga una leve presión con el dedo hasta conseguir una extensión
del preparado.
j) Sobre la preparación colocar unas tiras de papel toalla. Poner el dedo pulgar sobre el
papel toalla en la zona del cubreobjetos y hacer una suave presión, evitando que el
cubre objeto resbale, después más intensa, para aplastar la muestra, técnica conocida
como squash. Si la preparación está bien asentada no hay peligro de rotura por mucha
presión que se realice.
k) Aspirar con el papel toalla el excedente de colorante.
l) Observe al microscopio con el objetivo de menor aumento y situar la zona más idónea.
Cuando lo tenga localizada las células aisladas pasar al objetivo de 40X, para poder
apreciar mejor y contabilizar.
Procedimiento de lectura del ensayo de genotóxico
Se observarán los siguientes parámetros:
Índice Mitótico: Numero de divisiones celulares por 1000 células observadas
Caracterización de la mitosis: en 100 observaciones por lamina, se observarán el número de

profase, metafase, anafase y telofase
Para observar el efecto genotoxico se contara el numero de celulas que presenta aberraciones
cromosomicas como ligazones cromosomicas, C-mitosis y cromosomas fragmentados.
ESQUEMAS DEL EXPERIMENTO:
En este esquema nos muestra de una manera clara y explícita de la manera de que se debe de
desarrollar esta actividad.
Figura N°1
Anota para tu informe de práctica los siguientes puntos:
• Observaciones.
• Resultados.
• Conclusiones.
• Bibliografía.
Práctica N° 11
INHIBICION DEL DESARROLLO DE Saccharomyces cerevisae POR ACCION DEL
CONSERVANTE ALIMENTARIO BENZOATO DE SODIO
INTRODUCCION
Se definen como conservadores a las sustancias químicas que al ser añadidas intencionalmente
al alimento, tienden a prevenir o retardar el deterioro causado a los alimentos por
microorganismos, en esta clasificación se prefiere excluir el azúcar, alcohol, vinagre y especias,
a pesar de que se han usado desde la antigüedad para este fin, tal vez porque su función sea
más importante respecto al sabor que imparten. No se consideran a los antioxidantes, ya que
estos se consideran como factores de control de reacciones químicas y no de control
microbiológico. También se excluyen plaguicidas ya que estos son agentes que no se añaden
intencionalmente, siendo entonces contaminantes si es que se encuentran presentes en
alimentos (Valle, 2000).
Un conservador ideal sería aquel que inhibe hongos, levaduras y bacterias, que no sea tóxico
para el ser humano, fácilmente biotransformable por el hígado, no acumulable en el medio
ambiente, o en organismos vivos, soluble en agua, estable, que no imparta sabor, ni olor y que
sea de bajo costo. Es por demás mencionar que tal compuesto no existe; sin embargo, hay que
recordar que el uso de conservadores no debe de ser un sustituto de las "Buenas Prácticas de
Manufactura", no deben ser usados para ocultar los defectos de proceso o hacer pasar por
buenos, alimentos descompuestos (Robach, 1980). Entre los principales conservadores está:
benzoatos, parabenos, propionatos y sorbatos (Valle, 2000).
El benzoato de sodio es un inhibidor de la actividad celular de los microorganismos como son

los mohos, levaduras y bacterias. Ésta sal del ácido benzoico, es blanca, cristalina o granulada,
soluble en agua y ligeramente soluble en alcohol. La sal es antiséptica y en cantidades elevadas
es tóxica. Puede ser producido por reacción de hidróxido sódico con ácido benzoico (Lück y
Jager, 1995).
El ácido benzoico se utiliza en su forma como tal y en forma de benzoato de sodio, que tiene
mayor solubilidad en agua. Este es uno de los agentes químicos que se utiliza desde hace mas
tiempo n la industria de los alimentos, fármacos y cosméticos. La sal d sodio del ácido benzoico
fue el primer conservante químico aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos (FDA)
de los Estados Unidos. El ácido benzoico se encuentra de modo natural en arándanos, ciruelas,
canela, manzanas y fresas (Barbosa, et al. 1999)
La acción antimicrobiana del ácido benzoico se basa en diversas intervenciones sobre el sistema
enzimático de la célula de los microrganismos. En muchas bacterias y levaduras resultan
inhibidas las enzimas que controlan el metabolismo del ácido acético y la fosforilación oxidativa.
El ácido benzoico parece intervenir en varios sitios del ciclo del ácido cítrico, especialmente en
el ácido β-cetoglutarico y el ácido succínico deshidrogenasa, el ácido benzoico parece que tiene
acción sobre la tirosinasa. Además de sus efectos inactivadores de enzimas, el ácido benzoico
actúa también sobre la pared celular. Para que pueda ejercer su efecto dentro de la célula, el
ácido tiene que penetrar a través de la pared celular. Cuando esto ocurre, la parte no disociada
es la que tiene la mayor acción antimicrobiana y penetra con facilidad en la célula (Lück y Jager.
2000).
La DL50 es de 1,7 a 3,7 g/Kg, rata, oral. Ratones alimentados con benzoatos durante 45 días al 3
%, se les causa ataxia, convulsiones, disturbios en el sistema nervioso central y necrosis cerebral.
Por otro lado 1 g de benzoato durante 90 días en humanos, no se observaron efectos negativos
ni teratogénesis. Se eliminan en orina. Esta permitido mundialmente a niveles de 0,15- 0,25 %.
Actúa en la pared celular microbiana e inhibe diferentes enzimas del Ciclo de Krebs. Es efectivo
contra hongos (micotoxinas). Se le emplea para la conservación de grasas, huevo, pescado,
vegetales, pulpas de frutas, bebidas, etc. (Valle, 2000).
Sin embargo, su uso puede producir algunos efectos adversos sobre la salud. Hay personas
sensibles a estas sustancias que por simple contacto con la piel manifiestan síntomas típicos de
una alergia, principalmente en forma de urticaria. Este aditivo también se ha asociado a la
irritación de la mucosa gástrica y a la aparición de otras reacciones alérgicas. El Comité Mixto
FAO/OMS estima como límite una ingesta diaria (IDA) de ácido benzoico y benzoato de sodio de
5 mg/kg de peso y día (Fuentes, et al.
2010).
OBJETIVO
Determinar la toxicidad del benzoato de sodio sobre el desarrollo de Saccharomyces
cerevisae.
MATERIALES
Frascos de 250 mL Espátula de vidrio Drigalsky
Placas Petri Glucosa
Probeta 100 mL Agar Sabouraud
Vaso precipitado 250 mL Benzoato de sodio
Pipetas de 1, 5 y 10 mL Agua de manzana casera estéril
Tubos de ensayo 16 x150 mm Levadura Saccharomyces cerevisae
PROCEDIMIENTOS
• Activar la “levadura” Saccharomyces cerevisae comercial que se encuentra liofilizada 10
g en 90 mL de caldo glucosado 50%, para su posterior utilización en los ensayos control
y experimental.
• En 6 frascos de 250 mL estériles distribuir 100 mL de agua de manzana estéril en cada

uno de ellos; el primer frasco será el ensayo control (C) y los otros 5 frascos serán los
experimentales (E1…..E5).
• El frasco del ensayo control no se añade la sustancia química benzoato de sodio, para
cada uno de los 5 frascos de ensayo experimental se ha de añadir el benzoato de sodio
en los porcentajes indicados de la siguiente manera: 0.1, 0.3, 0.5, 1 y 3%
respectivamente.
• Entonces a cada uno de los 6 frasco del ensayo se añade 1 mL del cultivo activado de la
levadura, se homogeniza y se procede a obtener el primer dato mediante la Técnica de
Recuento en Placa de Agar por Diseminación, que consiste en lo siguiente:
1. Obtención de diluciones seriadas

a. Según el número de microorganismos esperado y sobre la base de la dilución
inicial de 10 g en 90 mL. (dilución 10-1), preparar diluciones decimales de 10-2,
10-3, 10-4, etc., usando pipetas o puntas estériles para cada dilución, tomando 1
mL de la solución anterior en 9 mL de agua peptonada, y evitando que se forme
espuma.
b. Mezclar mecánicamente o manualmente cada dilución agitándola 25 veces en
7 segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ángulo
de abertura aproximado de 60° entre brazo y antebrazo.
2. Siembra de las placas por extensión en superficie.

a. Transferir con una pipeta estéril 0,1 mL de cada dilución de la muestra a placas
de Petri con el medio de cultivo ya solidificado y seco.
Nota: se recomienda sembrar al menos dos placas por cada dilución.
b. Extender cuidadosamente el inóculo sobre la superficie con la ayuda de una

varilla de vidrio acodada y estéril (asa de Driglasky).
Esperar a que se seque el inóculo en la superficie del agar.
3. Incubación.
a. Incubar las placas a la temperatura necesaria y durante el tiempo necesario,
siempre en posición invertida.
4. Recuento de las colonias.

a. Pasado el tiempo de incubación examinar las placas. Las colonias aparecerán
en la masa del agar. Cada colonia representa los descendientes de una bacteria
o, lo que es más correcto, de una unidad formadora de colonia (UFC).
b. Elegir de entre todas las placas las dos correspondientes a aquella dilución que
presenten un número de entre 30 y 300 colonias /placa (esto proporciona una
precisión estadística suficiente y no es engorroso de hacer).
c. Para realizar el contaje, se utiliza un contador de colonias; se pone la placa de

Petri abierta con la superficie de vidrio hacia arriba y, si es preciso, se divide en
sectores marcando mediante un lápiz marcador a lo largo de los diámetros.
5. Cálculo y Expresión de los resultados

a. El número de unidades formadoras de colonia o UFC/g de alimento o muestra
original será:
Número de UFC/g = Número de colonias X factor de dilución X 10
Tener en cuenta que en la expresión anterior "Número de colonias" = media del

número de colonias contadas en cada una de las placas de la dilución elegida.
"Factor dilución" = inverso de la dilución elegida.

Obtener el valor del recuento total de microorganimos expresado de la
siguiente manera:
El informe debe decir:
Recuento de microorganismos (tipo): N UFC. /g o mL
Redondeo
Cuando se dan los valores del recuento en placa (N) deben utilizarse
únicamente dos cifras significativas. Estas dos cifras corresponden a los dígitos
primero y segundo (empezando por la izquierda) de la media de las colonias
halladas. Los dígitos restantes tienen que ser sustituidos por ceros. Por ejemplo,
si el valor calculado es de 523.000, este ha de darse como 520.000 (52 X 104). Si
el tercer dígito empezando por la izquierda es 5 o superior, se le añade una
unidad al segundo dígito (se redondea). Por ejemplo, si el valor calculado es
83.600, este debe hacerse como 84.000 (84 X 103).
Cuando no se encuentran colonias en ninguna de las placas sembradas,

expresar el recuento como inferior a (<) 1 multiplicado por 10 y por el factor de
la dilución más concentrada.
Ejemplos:
• Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 y

no aparece ninguna colonia en ninguna de las placas el resultado
será: <1 X 10 X 10= <100 UFC/ g o mL de alimento.
• Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-2, 10-3 , 10-4 y 10-5 y
no aparece ninguna colonia en ninguna de las placas el resultado
será: <1 X 10 X 102= <1000 UFC/ g o mL de alimento.
Cuando se encuentran más de 300 colonias en todas las placas sembradas,

expresar el recuento como superior a (>) 300 multiplicado por 10 y por el factor
de la dilución más diluida.
Ejemplos:

en todas las placas hay más de 300 colonias el resultado será:
>300 X 10 X 104= >30000000 = 30 X 106 UFC/ g o mL de alimento.

en todas las placas hay más de 300 colonias el resultado será:
>300 X 10 X 105= >300000000 = 30 X 107 UFC/ g o mL de alimento.
• Después de las 48 horas de incubación a temperatura 25°C,
volver a repetir la técnica para el recuento y obtener el dato final.
RESULTADOS
El efecto medido en este bioensayo es la toxicidad crónica producida por el conservante químico
alimentario benzoato de sodio en sus diferentes concentraciones utilizadas sobre la célula
eucariota “levadura” Saccharomyces cerevisae. Como resultado final se espera obtener la CI50 o
% de mortalidad.
a) Observar cuidadosamente cada recipiente del bioensayo, homogenizar cada 24 horas y

anotar cualquier indicador de toxicidad como turbidez, etc.
b) Utilizando los datos iniciales y finales de la técnica del recuento de las levaduras
expuesta al benzoato de sodio proceder con los resultados
CÁLCULOS
a) Promedio y desviación estándar de los recuentos para cada repetición.

b) Porcentaje de mortalidad con respecto al control negativo.
Práctica N° 12
PRUEBAS DE TOXICIDAD AGUDA EN “PLANARIA DE AGUA DULCE” Girardia festae

(Borelli, 1898) UTILIZANDO EFLUENTES INDUSTRIALES
INTRODUCCION
La valoración de la contaminación en el medio natural ha tomado gran importancia durante las
últimas décadas, fundamentalmente por el auge industrial que ha desarrollado el hombre a
nivel mundial, dando como resultado tanto el vertimiento accidental de desechos durante su
manejo, transporte o procesos de tratamiento, como también abiertamente en forma de
efluentes residuales (Ramírez, 1989).
La contaminación de los mares causa vastos problemas que solamente una acción internacional
podría resolver. La prevención de la contaminación de los mares tiende primordialmente a
proteger la salud pública y los organismos vivos, especialmente los crustáceos, peces y moluscos
(FAO, 1981).
Las pruebas de toxicidad acuática son utilizadas para detectar y evaluar los efectos potenciales
toxicológicos sobre los organismos acuáticos. Estas pruebas proporcionan información de
referencia que se puede utilizar para evaluar los riesgos de los agentes químicos del organismo
y las condiciones de exposición (Rand, et al. 1985).
Los bioensayos, según la FAO comprenden:

La prueba en la cual un tejido vivo, un organismo o un grupo de organismos es usado como
agente para la determinación de la potencia de alguna sustancia fisiológicamente activa de
acción desconocida. Por tanto, los estudios toxicológicos mediante bioensayos y pruebas de
toxicidad proporcionan información valiosa en el proceso de evaluación de los riesgos
ambientales (Alcázar, 1980).
OBJETIVO
Evaluar el efecto toxico de los efluentes industriales en “planaria de agua dulce” Girardia festae.
MATERIALES
“planaria de agua dulce” Girardia festae Propipeta

Efluente industrial Papel filtro
Agua de la zona de captura de la planaria Balanza
Vasos precipitados 1000 mL Termómetro
Vaso precipitado de 100 mL pH-metro
Probeta 100 mL Aireador de aire
Pipetas de 10 mL Microscopio estereoscópico
Placas Petri Lupa
Erlenmeyer 500 mL
Gotero
Lamina portaobjetos
PROCEDIMIENTO
Colecta de material biológico: “planaria de agua dulce” Girardia festae
• Determinar el área física de la recolección, cercana a la orilla del rio o laguna.
• Se utilizará hígado de pollo fresco, el cual se colocará cercano a las rocas del agua de
rio, hábitat de la planaria. Se esperará el tiempo necesario para que las planarias sea
atraídas por el hígado mediante quimiotaxis.
• Luego se trasladará las planarias capturadas al laboratorio de biología para su

acondicionamiento reemplazando el agua de rio por agua de la red pública libre de cloro
y estéril o agua embotellada de mesa sin gas (previamente oxigenada), se preparará con
anticipación a la recolección de las planarias.
• Las planarias serán colocadas individualmente en envases plásticos o vidrio de 250 mL

de capacidad bajo condiciones ambientales de laboratorio.
• Las planarias para su acondicionamiento serán alimentadas semanalmente con trocitos

de hígado de pollo, en recipiente diferente al que se encuentran viviendo, para evitar la
descomposición del agua y la muerte de las planarias.
• Las planarias no serán alimentaras 48 horas previas al ensayo experimental.
Preparación de las concentraciones de los efluentes industriales

Para las diluciones de las concentraciones experimentales de los efluentes industriales se
preparará las siguientes concentraciones al 100%, 50%, 25%, 10%, y 5%, se ha de
combinar con agua embotellada de mesa sin gas. Para el caso del ensayo control se
utilizará agua de la red pública libre de cloro y estéril o agua embotellada de mesa sin
gas.
Preparación para el desarrollo de la prueba de ecotoxicidad

• Colocar 500 mL de cada una de las diluciones de las concentraciones Experimentales de
los efluentes industriales (100%, 50%, 25%, 10%, y 5%) y Control en vasos precipitado
de 1000 mL debidamente rotulados, con su respectiva conexión de oxígeno.
• Para el acondicionamiento de las planarias estas serán alimentadas una semana antes
del ensayo con trocitos de hígado de pollo, en recipiente diferente al que se encuentran
viviendo, para evitar la descomposición del agua y la muerte de las planarias.
• Después del acondicionamiento, se colocarán 10 planarias de agua dulce en cada

recipiente, las planarias antes de ser colocadas en los recipientes deben ser lavadas con
agua destilada, secadas con papel filtro, pesadas y medidas cada una de ellas.
• Los recipientes con las planarias deben estar a temperatura ambiental de laboratorio
entre 18°C – 23°C, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y observación del mismo
a las 24, 48 y 72 horas.
RESULTADOS
El efecto medido en este bioensayo es la toxicidad crónica producida por el efluente industrial
en diferentes concentraciones sobre las planarias de agua dulce. Como resultado final se espera
obtener la CI50 o % de mortalidad.
a) Observar cuidadosamente cada recipiente del bioensayo y anotar cualquier

indicador de toxicidad como necrosis, muerte del individuo, etc.
b) Utilizando una balanza realizar el pesaje de cada una de las planarias de agua
dulce.
CÁLCULOS
a) Promedio y desviación estándar de los pesos y medidas para cada repetición.

b) Porcentaje de mortandad con respecto al control.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
• Alcázar F. Toxicidad y efectividad del dispersante SEAF-014 MOLYPAC Ltda. Dpto.
de Oceanología. Univ. Chile. Sede Valparaíso, Montemar (Chile); 1980.
• Ávila, G.; Gaete, H.; Morales, M. y Neaman, A. 2007. Reproduction of Eisenia foetida in
agricultural soils from mining áreas contaminated with copper and arsenic. Pesq.
agropec. bras., Brasília, v.42, n.3, p.435-441.
• Badilla-Ohlbaum, R.; Ginocchio, R.; Rodríguez, P.H.; Céspedes, A.; González, S.; Allen,
H.E.; Lagos, G.E. 2001. Relationship between soil copper content and copper content of
selected crop plants in Central Chile. Environmental Toxicology and Chemistry, v.20,
p.2749-2757, 2001.
• De Gregori, I.; Fuentes, E.; Rojas, M.; Pinochet, H.; Potin-Gautier, M. 2003. Monitoring
of copper, arsenic and antimony levels in agricultural soils impacted and non-impacted
by mining activities, from three regions in Chile. Journal of Environmental Monitoring,
v.5, p.287-295, 2003.
• FAO. Manual de métodos de investigación del medio ambiente acuático. Parte 4a. Base
para la elección de ensayos biológicos para evaluar la contaminación marina. FAO. Doc.
Téc. Pesca 1981; 164:1-34.
• Guecheva, T, Henriques, J A & Erdtmann, B. 2001. Genotoxic effects of copper sulphate

in freshwater planarian in vivo, studied with the single-cell gel test (comet assay).
• Herrero, O. 2004. Evaluación de la mutagenicidad y genotoxicidad. Centro de Ciencias

Medioambientales – SCIS. Madrid – España.
• Iannacone, J & Lamas, G. 2003. Efectos toxicológicos de extractos de molle (Schinus

molle) y lantana (Lantana camara) sobtre Chrysoperla externa (Neuroptera:
Chrysopidae), Trichogramma pintoi (Hymenoptera: Trichogrammatidae) y Copidosoma
koehleri (Hymenoptera: Encyrtidae) en el Perú. Agricultura Técnica (Chile), vol. 63, pp.
347-360.
• Lanno, R.; Wells, J.; Conder, J.; Bradham, K.; Basta, N. 2003. The bioavailability of
chemicals in soil for earthworms. Ecotoxicology and Environmental Safety, v.57, p.39-
47, 2003.
• Muñoz Zambrano, María E.; Morón Cortijo, Cecilia G. 2005. Manual de procedimientos
de laboratorio en técnicas básicas de hematología. Lima: Ministerio de Salud, Instituto
Nacional de Salud, 2005. 88 p. (Serie de Normas Técnicas; 40).
• Ramírez A. Fundamentos cuantitativos para realizar ensayos biológicos y pruebas de

toxicidad. Curso Regional de Entrenamiento PNUMA / PAC / FAO / COI / INDERENA
sobre Ensayos Biológicos de Toxicidad como Bases Técnicas para Formular Criterios de
Calidad en el Gran Caribe. Cartagena (Bol.), Colombia, junio 11-25; 1989.
• Ramos Gorbeña, JC. 2011. Guía de Practicas de Laboratorio de Microbiología de los

Alimentos y el Agua. Universidad Ricardo Palma. Lima – Perú.
• Ramos Gorbeña, JC. 2015. Guía de Practicas de Laboratorio de Biología. Universidad

Ricardo Palma. Lima – Perú.
• Rand GM, Petrocelli SM. Fundamentals of aquatic toxicology: Methods and applications.
Hemisphere Publ. Corp. Washington (USA); 1985.
• Spurgeon, D.J.; Hopkin, S.P.; Jones, D.T. 1994. Effects of cadmium, copper, lead and zinc
on growth, reproduction and survival of the earthworm Eisenia foetida (Savigny):
assessing the environmental impact of point-source metal contamination in terrestrial
ecosystems. Environmental Pollution, v.84, p.123130, 1994.
• Valle Vega, P. 2000. Toxicologia de Alimentos. Centro Nacional de Salud Ambiental.

Mexico – DC. ISBN 92-75 37004-4.
• Villamarín-Jiménez S, Chacón-Castro MF, Álvarez-León R. Pruebas de toxicidad aguda CL

(I) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales a la Bahía
de Cartagena, Colombia. Biosalud. 2013;12(2):24-39.

Guía de Ecotoxicología 2022-2

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Guía de Ecotoxicología 2022-2

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Guía de Ecotoxicología 2022-2

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL NORTE

CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

Guía de prácticas – Ecotoxicología*

DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS

Monosacáridos. Se incluyen carbohidratos no hidrolizables a compuestos más simples. Estos

Para determinar la presencia de carbohidratos en muestras de biológicas o de alimentos se

El reactivo de Benedict consta de los siguientes compuestos:

Determinación de glucosa (monosacáridos)

Solución de glucosa al 5% (mL) 2 2 2

Néctar de fruta/otro (mL) 2 2 2

Lugol (gotas) 1-5 1 1

Reactivo de Benedict (mL) 1 1

Control Agua (mL) 1 1

Coloca los tubos 2, 3, 5 y 6 al baño de agua hirviendo durante 5 minutos

Determinación de sacarosa y lactosa (disacáridos)

Solución de sacarosa al 5% (mL) 2 2

Solución de Stevia al 5 % /otro (mL) 2 2

Leche deslactosada (mL) 2 2

Reactivo de Benedict (mL) 1 1 1 1

Control Agua (mL) 1 1 1 1

Coloca los tubos al baño de agua hirviendo durante 5 minutos.

Determinación del almidón y el glucógeno (polisacáridos)

Solución de almidón al 5% (mL) 2 2 2

Homogenizado de hígado (mL) 2 2 2

Homogenizado de Frejol cocido(mL) 2 2 2

Lugol (gotas) 1-5 1 1 1

Reactivo de Benedict (mL) 1 1 1

Control Agua (mL) 1 1 1

Coloca los tubos 2, 3, 5, 6, 8 y 9 al baño de agua hirviendo durante 5 minutos.

DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE PROTEÍNAS

Los aminoácidos comunes tienen en común un átomo de carbono central, denominado

Con base en su polaridad, algunos aminoácidos son solubles en agua (aminoácidos

Aceite de oliva (mL) 2

Homogenizado de carne (mL) 2

Plasma sanguíneo diluido al 20% (mL) 2

Solución de gelatina natural al 10% (mL) 2

Solución de albumina 30% (mL) 2

Control Agua (mL) 2

Reactivo de Biuret (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Agitar los tubos y dejar en reposo durante 3 minutos

Solución de albumina 30% (mL) 3 3 3 3 3

Temperatura de coagulación 80°C

Solución de ácido acético glacial (gotas) 3

*HCl 10N (mL) 1

NaCl al 20% (mL) 2

Control Agua (mL) 2

La Catalasa es una enzima homoproteica, encargada de descomponer el peróxido de

▪ Determinar la presencia de la enzima catalasa en célula procariota y eucariota

Tubo de ensayo 16 x 150 mm. Pro pipetas.

Actividad de la catalasa en célula eucariota (Célula Animal y Vegetal)

Elaborar una gráfica en papel milimetrado la variación de la concentración de sustrato vs.

La razón fundamental de la necesidad de desinfectar el agua destinada al consumo humano y

Los agentes patógenos bacterianos presentes en el agua pueden controlarse eficazmente

a. Evaluación de la toxicidad del cloro comercial en bacterias mediante el control

Métodos recuento en placa por técnica de diseminación en superficie de agar,

1. Preparar en frascos de 250 mL las diferentes concentraciones del hipoclorito de

Anotar los resultados.

b. Evaluación de la toxicidad del cloro comercial en protozoarios mediante la observación al

Métodos recuento utilizando Cámara de Neubauer

1. Preparar en frascos de 250 mL las diferentes concentraciones del hipoclorito de